Laporan Praktikum Uji Protein BAB I PENDAHULUAN
I.1 LATAR BELAKANG Protein adalah komponen dasar dan utama makanan yang diperlukan oleh semua makhluk hidup sebagai bagian dari daging, jaringan kulit, otot, otak, sel darah merah, rambut, dan organ tubuh lainnya yang dibangun dari protein (Sandjaja, 2010). Protein mempunyai fungsi penting yaitu untuk pertumbuhan, memperbaiki sel tubuh yang rusak, bahan pembentuk plasma kelenjar, hormone, dan enzim, cadangan energi jika terjadi kekurangan, menjaga keseimbangan asam basa darah (Sandjaja, 2010). Protein merupakan rangkaian asam-asam amino yang sekuennya ditentukan oleh kode genetik. Beberapa asam amino yang menyusun tidak dapat disintesis dalam tubuh (asam amino esensial) sehingga harus didapatkan dari makanan yang dikonsumsi (Sandjaja, 2010).
Pengadaan dan penyediaan asam amino menjadi sangat penting oleh karena senyawa tersebut digunakan sebagai satuan penyusun protein. Kemampuan jasad hidup untuk membentuk Asam amino tidak sama. Asam amino yang umum terdapat dalam alam akan disintesis oleh sekelompok enzim yang berbeda satu sama lain dan melalui jalur yang berbeda pula (Martoharsono, 2006). Zat antibodi, enzim, dan hormone dalam tubuh juga merupakan protein yang berfungsi mengangkut zat gizi, oksigen dan hasil metabolit ke seluruh tubuh atau ke organ-organ tubuh tertentu. Antibodi atau immunoglobin dapat mengenali dan menghancurkan zat asing. Enzim berperan terhadap proses kimiawi dalam sel. Enzim mengontrol kecepatan dan kelangsungan reaksi dalam sel. Hormone adalah pembawa pesan yang disekresikan untuk respons keadaan tubuh yang menyimpang. Di samping itu, protein dalam keadaan tertentu menjadi sumber energi, di mana tiap gram protein menghasilkan energi 4 kalori (Sandjaja, 2010). Berdasarkan penjelasan di atas, dilakukanlah percobaan tentang protein ini guna mengetahui berbagai hal secara lebih mendalam mengenai salah satu zat gizi yang sangat
berperan
penting
dalam
tubuh.
I.2 TUJUAN PERCOBAAN I.2.1 TUJUAN UMUM 1. Mengetahui unsur-unsur penyusun protein. 2. Mengetahui sifat fisikokimia dari protein. 3. Mengetahui adanya molekul-molekul peptida dari protein. 4. Mengidentifikasi adanya asam amino dalam protein. 5. Mengetahui reaksi-reaksi yang terjadi pada identifikasi asam amino. 6. Mengetahui cara pemisahan suatu asam amino.
I.2.2 TUJUAN KHUSUS 1. Uji Susunan Elementer Protein Mengidentifikasi adanya unsur-unsur penyusun protein. 2. Uji Kelarutan Protein Mengetahui daya kelarutan protein terhadap pelarut tertentu. 3. Uji Pengendapan Protein dengan Garam Mengetahui pengaruh larutan garam alkali dengan garam divalen konsentrasi tinggi terhadap sifat kelarutan protein. 4. Uji Pengendapan Protein dengan Logam dan Asam organik Mengetahui pengaruh llogam berat dan asam organik terhadap sifat kelarutan protein. 5. Uji Biuret Membuktikan adanya molekul-molekul peptida dari protein. 6. Uji Ninhidrin Membuktikan adanya asam amino dalam protein.
7. Uji Xantroprotein Membuktikan adanya asam amino tirosin, triptofan, atau fenilalanin yang terdapat dalam protein. 8. Uji Penentuan Titik Isoelektrik
Mengetahu titik isoelektrik (Ph Isoelektrik) dari protein secara kualitatif.
I.3 PRINSIP PERCOBAAN 1. Uji Susunan Elementer Protein Semua jenis protein tersusun atas unsur-usur karbon (C), hidrogen (H), oksigen (O), dan nitrogen (N). Adapula protein yang mengandung sedikit belerang (S) dan fosfor (P). Dengan metode pembakaran atau pengabuan, akan diperoleh unsur-unsur penyusun protein, yaitu C, H, O, dan N. 2. Uji Kelarutan Protein Protein bersifat amfoter, yaitu dapat bereaksi dengan larutan asam maupun basa. Daya larut protein berbeda di dalam air, asam, dan basa. Sebagian ada yang mudah larut dan ada pula yang sukar larut. Namun, semua protein tidak larut dalam pelarut lemak seperti eter atau kloroform. Apabila protein dipanaskan atau ditambah dengan etanol absolute, maka protein akan menggumpal (terkoagulasi). Hal ini disebabkan etanol menarik mantel air yang melingkupi molekul-molekul protein. 3. Uji Pengendapan Protein dengan Garam Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut salting out.
4. Uji Pengendapan Protein dengan Logam dan Asam Organik Sebagian besar protein dapat diendapkan dengan penambahan asam-asam organik seperti asam pikrat, asam trikloroasetat, dan asam sulfosalisilat. Penambahan asam-asam menyebabkan terbentuknya garam proteinat yang tidak larut. Kemudian, protein dapat pula mengalami denaturasi irrevesibel dengan adanya logam-logam berat seperti Cu2+, Hg2+, atau Pb2+ sehingga mudah mengendap. 5. Uji Biuret Ion Cu2+ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu
(violet). Reaksi biuret positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida. Reaksi pun positif terhadap senyawa-senyawa yang mengandung dua gugus: -CH2NH2, -CSNH2, -C(NH)NH2, dan –CONH2. Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua molekul urea. 6. Uji Ninhidrin Semua asam amino-α bebas akan bereaksi dengan ninhidrin (triketohidrinden hidrat) membentuk aldehid dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan NH3 dan CO2. Di samping itu terbentuk senyawa kompleks berwarna biru, namun prolin dan hidroksiprolin menghasilkan senyawa berwarna kuning yang diduga disebabkan oleh 2 molekul ninhidrin yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. 7. Uji Xantroprotein Reaksi pada uji Xantoprotein didasarkan pada nitrasi inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Jika protein yang mengandung cincin benzena (tirosin, triptofan, dan fenilalanin) ditambahkan asam nitrat pekat, maka akan terbentuk endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya berubah menjadi jingga. 8. Uji Titik Isoelekrik Pada asam-asam amino bebas, protein pun mempunyai titik isoelektrik yang berbeda yang berbeda-beda. Titik isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu di mana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah mutan positif dan muatan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak bila diletakkan dalam medan listrik. Pada pH isoelektrik (pI), daya kelarutan protein minimal, sehingga menyebabkan protein mengendap.
I.4 MANFAAT PERCOBAAN 1. Kita dapat mengetahui unsur penyusun protein. 2. Kita dapat mengetahui sifat fisikokimia dari protein. 3. Kita dapat mengetahui bahwa dalam protein terdapat molekul-molekul peptida. 4. Kita dapat mengetahui bahwa dalam protein terdapat asam amino. 5. Kita dapat mengetahui reaksi yang terjadi pada identifikasi asam amino. 6. Kita dapat mengetahui cara pemisahan suatu asam amino.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Protein adalah makromolekul yang secara fisik dan fungsional kompleks yang melakukan beragam peran penting. Protein mengalami perubahan fisik dan fungsional yang mencerminkan siklus hidup organisme tempat protein berada. Protein biasanya “lahir” saat translasi, mengalami pematangan melalui pengolahan pascatranslasi dan mati setelah diuraikan menjadi asam-asam amino komponennya (Murray dkk, 2006). Protein secara kimia lebih kompleks lagi, tetapi seperti karbohidrat dan lipid, protein juga tersusun dari senyawa gabungan yang sederhana. Semua protein mengandung atom karbon, oksigen, hidrogen, dan nitrogen serta protein-protein yang mengandung sulfur dan fosfor (Sloane, 2004). Adapun struktur protein yaitu terdiri dari rantai polipeptida memilin, melipat, dan membungkus diri ke dalam model yang membentuk protein dengan kesesuaian bentuk (conformation) yang berbeda-beda. Protein struktural atau fibrosa disusun dari makromolekul linear yang panjang. Contohnya meliputi kalogen;mioin (protein otot); fibrin; dan keratin pada rambut, kuku dan kulit. Selain itu juga dikenal protein globular adalah protein yang sangat terpilin dan terlipat dalam bentuk yang hampir sferikal, atau mirip gulungan benang kusut. Contohnya meliputi enzim, hormone, dan protein darah (Sloane, 2004). Protein adalah molekul yang konformasinya dinamis dan dapat mengalami pelipatan (folding) dan penguraian dalam kisaran waktu milidetik, serta dapat mengalami pelipatanpenguraian ratusan atau ribuan kali selama hidupnya. Pelipatan membentuk keadaan asli tidak memerlukan pencarian yang melelahkan terhadap struktur yang mungkin terbentuk. Konsentrasi protein yang sangat tinggi di dalam sel juga dapat memengaruhi kinetika pelipatan protein (Murray dkk, 2006)
Ada empat tingkat organisasi struktur protein diantaranya (Sloane,2004) : 1. Struktur primer adalah rantai polipeptida dan jumlah serta asam amino dalam setiap rantai. 2. Struktur sekunder adalah lilitan rantai peptide yang menyerupai spiral helix atau jenis kesesuaian bentuk lainnya.
(1) Alpha helix adalah lilitan geometris yang seragam dengan 3,6 asam amino menempati setiap lekuk heliks, terbentuk saat terjadi ikatan hidrogen antara asam amino pada lekukan yang berurutan dari spiral. Bentuk tersebut merupakan bentuk dasar struktur protein pada rambut, kulit, dan kuku. (2) Struktur lembaran terlipatterbentuk dari ikatan hidrogen untuk mempertahankan kedekatan rantai-rantai dalam konfigurasi yang terbentuk zig-zag. Lembaran terlipat seperti itu menjadi inti dari protein globular. 3. Struktur tersier berada di atas struktur sekunder biasa dengan sedikit mengubah, melipat, dan mengusutkan rantai peptida yang biasa untuk membentuk model tiga dimensi yang kompleks. 4. Struktur kuarter adalah susunan kompleks yang terdiri dari dua rantai polipeptida atau lebih, yang setiap rantainya bersama dengan struktur primer, sekunder, dan tersier membentuk satu molekul protein yang besar dan aktif secara biologis. (1) Hemoglobin adalah salah satu contoh protein globular yang berstruktur kuarter. Hemoglobin mengandung 574asam amino yang tersusun dalam empat rantai polipeptida. (2) Kalogen adalah contoh protein fibrosa yang berstruktur kuarter. Kalogen memiliki rantai polipeptida yang tersusun dalam triple helix, yaitu strukur tali yang terlilit dengan kuat yang memberikan daya regang yang kuat pada kalogen. Berat molekul protein bias mencapai empat puluh juta; bandingkan dengan berat molekul glukosa yang besarnya 180. Jenis protein sangat banyak, mungkin sampai 1010-1012. Ini dapat dibayangkan bila diketahui bahwa protein terdiri atas sekian kombinasi berbagai jenis dan jumlah asam amino. Ada dua puluh jenis asam amino yang diketahui sampai sekarang yang terdiri atas asam amino esensial (asam amino yang tidak dapat dibuat tubuh dan harus di datangkan dari makanan) dan sebelas asam amino non esensial (Almatsier, 2010). Asam amino yang merupakan monomer (satuan pembentuk) protein amino adalah suatu senyawa yang mempunyai dua gugus fungsi yaitu gugus amino dan gugus karboksil. Pada asam amino, gugus amino terikat pada atom karbon yang berdekatan dengan gugus karboksil dalam asam amino terikat pada atom karbon yang sama (Tim Dosen, 2010). Pada umumnya asam amino yang diisolasi dari protein hidroksilat merupakan alfa-asam amino, yaitu gugus karboksil dan amino terikat pada atom karbon yang sama. Yang membedakan asam amino satu sama lain adalah rantai cabang atau gugus R-nya. R berkisar dari
satu atom hidrogen (H) sebagaimana terdapat pada asam amino paling sederhana glisin ke rantai karbon lebih panjang, yaitu hingga tujuh atom karbon (Almatsier, 2010). Hampir semua asam amino mempunyai fungsi khusus. Triptofan adalah prekursor vitamin niasin dan pengatur sarf serotonin. Metionin memberikan gugus metal guna sintesis kolin dan kreatinin. Di samping itu metionin merupakan prekursor sistein dan ikatan mengandung ikatan sulfur lain. Fenilalanin adalah prekursor tirosin dan bersama membentuk hormo-hormon tiroksin epinefrin. Tirosin merupakan prekursor bahan yang membentuk pigmen kulit dan rambut. Arginin dan sentrulin terlibat dalam sintesis ureum dalam hati (Almatsier, 2010). Glisin mengikat bahan-bahan toksik dan mengubahnya menjadi bahan tidak berbahaya. Glisin juga digunakan dalam sintesis porfirin nukleus hemoglobin dan merupakan bagian dari asam empedu. Histidin diperlukan untuk sintesis histamin. Kreatinin yang disintesis dari arginin, glisin, dan metionin bersama fosfat membentuk kreatinin fosfat, suatu simpanan fosfat berenergi tinggi dalam sel. Glutamine yang dibentuk dari asam glutamate dan asparagin dari asam aspartat merupakan simpanan asam amino di dalam tubuh. Di samping itu asam glutamate adalah prekursor pengantar saraf gamma asam amino-asam butirat (Almatsier, 2010). Sifat fisikokimia protein berbeda satu sama lain, tergantung pada komposisi dan jenis asam amino penyusunnya. Sebagian besar protein bila dilarutkan dalam air akan membentuk dispersi koloid dan tidak dapat berdifusi bila dilewatkan melalui membrane semipermeabel. Beberapa protein mudah larut dalam air, tetapi ada pula yang sukar larut. Namun, semua protein tidak dapat larut dalam pelarut organik seperti eter, kloroform, atau benzena (Sirajuddin dan Najamuddin, 2011). Pada umumnya, protein sangat peka terhadap pengaruh-pengaruh fisik dan zat kimia sehingga mudah mengalami perubahan bentuk. Perubahan atau modifikasi pada struktur molekul protein disebut denaturasi (Sirajuddin dan Najamuddin, 2011). Protein dapat mempertahankan kesesuaian bentuknya asalkan lingkungan fisik dan kimianya dipertahankan. Jika lingkungan berubah, maka protein dapat terurai atau mengalami perubahan; mereka dapat kehilangan struktur sekunder, tersier, dan kuarternya sehingga aktivitas biologisnya juga hilang. Sebagian protein dapat dikembalikan ke bentuk aslinya, jika terdenaturasi tanpa harus menjadi insoluble (tidak dapat larut). Contoh setelah pemanasan ringan, protein dapat kembali ke bentuk aslinya jika kembali ke suhu normal. Perbedaan panas yang besar dapat menyebabkan denaturasi yang menetap. Putih telur (albumin) akan memadat
dan menjadi insoluble jika dipanaskan. Suhu tubuh yang sangat tinggi dapat menyebabkan koagulasi protein selular. Jika suhu tubuh naik sampai di atas 410C-420C, maka degenerasi sel, terutama di otak, mulai terjadi akibat denaturasi protein (Sloane, 2004). Protein mempunyai banyak muatan (polielektrolit) dan bersifat amfoter, yaitu dapat bereaksi dengan asam dan basa. Dengan larutan asam atau ph rendah, gugus amino pada protein akan bereaksi dengan ion H+, sehingga protein bermuatan positif. Sebaliknya, dalam larutan basa gugus karboksilat bereaksi dengan ion OH-, sehingga protein bermuatan negatif. Adanya muatan pada molekul protein menyebabkan protein bergerak dibawah pengaruh medan listrik (Sirajuddin dan Najamuddin, 2011). Setiap jenis protein dalam larutan mempunyai ph tertentu yang disebut titik isoelektrik (TI). Pada ph isoelektrik, molekul protein mempunyai muatan positif atau negatif yang sama, sehingga saling menetralkan atau bermuatan nol. Akibatnya, protein tidak bergerak di bawah pengaruh medan listrik. Pada titik isoelektris, protein akan mengalami pengendapan paling cepat dan prinsip dapat digunakan untuk pemisahan atau pemurnian suatu protein (Sirajuddin dan Najamuddin , 2011). Adapun fungsi protein diantaranya (Almatsier, 2010) : 1. Pertumbuhan dan pemeliharaan : sebelum sel-sel dapat mensintesis protein baru, harus tersedia semua asam amino esensial yang diperlukan dan cukup nitrogen atau ikatan amino (NH2) guna pembentukan asam-asam amino non esensial yang diperlukan. Pertumbuhan atau penambahan otot hanya mungkin bila tersedia cukup campuran asam amino yang sesuai untuk pemeliharaan dan perbaikan. 2. Pembentukan ikatan-ikatan esensial tubuh : hormone-hormon, seperti tiroid, insulin, dan epinefrin adalah protein, demikian pula berbagai enzim. Ikatan-ikatan ini bertindak sebagai katalisator atau membantu perubahan-perubahan biokimia yang terjadi dalam tubuh. 3. Mengatur keseimbangan air : keseimbangan cairan tubuh diperoleh melalui sistem kompleks yang melibatkan protein dan elektrolit. Penumpukan cairan di dalam jaringan dinamakan edema dan tanda awal kekurangan protein. 4. Memelihara netralitas tubuh : protein bertindak sebagai buffer, yaitu bereaksi dengan asam dan basa untuk menjaga ph pada taraf konstan.
5. Pembentukan antibodi : kemampuan tubuh untuk melakukan detoksifikasi terhadap bahan-bahan racun dikontrol oleh enzim-enzim yang terutama terdapat di dalam hati. Seseorang yang menderita kekurangan protein lebih rentan terhadap bahan-bahan racun dan obat-obatan. 6. Mengangkut zat-zat gizi : protein memegang peranan esensisl dalam mengangkut zat-zat gizi dari saluran cerna melalui dinding saluran cerna ke dalam darah, dari darah ke jaringan-jaringan, dan melalui membrane sel ke dalam sel-sel. 7. Sumber energi : sebagai sumber energi, protein ekivalen dengan karbohidrat, karena menghasilkan 4 kkal/g protein. Namun, protein sebagai sumber energi relatif lebih mahal, baik dalam harga maupun dalam jumlah energi yang dibutuhkan untuk metabolism energi. Akibat kekurangan protein Kekurangan protein banyak terdapat pada masyarakat sosial ekonomi rendah. Kekurangan protein murni pada stadium berat menyebabkan kwashiorkor pada anak-anak di bawah lima tahun (balita). Kekurangan protein sering ditemukan secara bersamaan dengan kekurangan energi yang memnyebabkan kondisi yang dinamakan marasmus. Sindroma gabungan antara dua jenis kekurangan protein ini dinamakan Energy-Protein Malnutrition/EPM atau Kurang Energi Protein/KEP atau Kurang Kalori- Protein/KKP. Sindroma ini merupakan salah satu masalah gizi di Indonesia (Almatsier, 2010). Akibat kelebihan protein Protein secara berlebihan tidak menguntungkan tubuh. Makanan yang tinggi protein biasanya tinggi lemak dapat menyebabkan obesitas. Kelebihan protein dapat menimbulkan masalah lain, terutama pada bayi. Kelebihan asam amino memberatkan ginjal dan hati yang harus memetabolisme dan mengeluarkan kelebihan nitrogen. Kelebihan protein akan menimbulkan asidosis, dehidrasi, diare, kenaikan amoniak darah, kenaikan ureum darah, dan demam. BAB III METODOLOGI PERCOBAAN
III.1 ALAT DAN BAHAN 1. Uji Susunan Elementer Protein Alat yang digunakan untuk uji susunan elementer protein adalah tabung reaksi, alat pemanas, cawan porselin, dan gelas obyek.
Bahan yang digunakan untuk uji susunan elementer protein adalah albumin telur, gelatin, larutan NaOH 10%, larutan Pb-asetat 5%, larutan HCl pekat, dan kertas lakmus. 2. Uji Kelarutan Protein Alat yang digunakan untuk uji kelarutan protein adalah tabung reaksi dan pipet ukur. Bahan yang digunakan untuk uji kelarutan protein adalah albumin telur, gelatin, air suling, larutan HCl 10%, larutan NaOH 40%, alkohol 96%, dan kloroform. 3. Uji Pengendapan Protein Dengan Garam Alat yang digunakan untuk uji pengendapan protein dengan garam adalah tabung reaksi, pipet tetes dan pipet ukur. Bahan yang digunakan untuk uji kelarutan protein adalah albumin telur, larutan (NH4)2SO4 jenuh, larutan NaCl 5%, larutan BaCl2 5%, larutan CaCl2 5%, dan larutan MgSO4 5%. 4. Uji Pengendapan Protein Dengan Logam Dan Asam Organik Alat yang digunakan untuk uji pengendapan protein dengan logam dan asam organik adalah tabung reaksi dan pipet ukur/pipet tetes. Bahan yang digunakan untuk uji pengendapan protein dengan logam dan asam organik adalah albumin telur, asam trikloroasetat (TCA) 10%, asam sulfosalisilat 5%, larutan HgCl2 5%, larutan Pb-asetat 5%, dan larutan CuSO4 5%. 5. Uji Biuret Alat yang digunakan untuk uji biuret adalah tabung reaksi, pipet ukur, dan pipet tetes. Bahan yang digunakan untuk uji biuret adalah albumin telur 2%, gelatin 2%, kasein 0,5%, glisin 2%, larutan NaOH 10%, dan larutan CuSO4 0,2%. 6. Uji Ninhidrin Alat yang digunakan untuk uji ninhidrin adalah tabung reaksi, pipet ukur atau pipet tetes, alat pemanas, dan pengatur waktu. Bahan yang digunakan yaitu albumin telur 2%, gelatin 2%, kasein 0,5%, pepton 0,5%, dan pereaksi Ninhidrin 0,1%. 7. Uji Xantroprotein Alat yang digunakan untuk uji xantoprotei adalah tabung reaksi, pipet ukur atau pipet tetes, dan alat pemanas. Bahan yang digunakan untuk uji xantoprotein adalah albumin telur 2%, gelatin 2%, kasein 0,5%, larutan NaOH 10%, dan larutan HNO3 pekat.
8. Uji Titik Isoelektrik Alat yang digunakan yaitu tabung reaksi, pipet ukur, dan pengatur waktu. Bahan yang digunakan yaitu larutan kasein netral dan buffer asetat pH = 3,8;4,7;5,0;5,3;dan 5,9.
III.2 PROSEDUR PERCOBAAN 1. Uji Susunan Elementer Protein 1) Uji Adanya Unsur C, H, dan O 1. Dimasukkan 1 ml albumin telur ke dalam cawan porselin. 2. Ditaruh kaca objek di atasnya, kemudian dipanaskan. 3. Diperhatikan adanya pengembunan pada gelas objek, yang menunjukkan adanya hidrogen (H) dan oksigen (O). 4. Diamati gelas objek, lalu diamati bau yang terjadi. Tercium bau rambut terbakar, yang berarti protein mengandung unsur nitrogen (N). 5. Terjadi pengarangan, berarti ada atom karbon (C). 6. Diulangi percobaan menggunakan serbuk gelatin. 2) Uji Adanya Atom N 1. Dimasukkan 1 ml larutan albumin telur ke dalam tabung reaksi. 2. Ditambahkan 1 ml NaOH 10%, kemudian dipanaskan. 3. Diperhatikan bau ammonia yang terjadi dan diuji uapnya dengan kertas lakmus merah yang telah dibasahi aquades. 4. Terbentuknya bau ammonia menunjukkan adannya N. 5. Diulangi percobaan menggunakan serbuk gelatin. 3) Uji Adanya Atom S 1. Dimasukkan 1 ml albumin telur ke dalam tabung reaksi. 2. Ditambahkan 1 ml NaOH 10%, kemudian dipanaskan. 3. Ditambahkan 4 tetes larutan Pb-asetat. 4. Larutan menghitam, berarti PbS terbentuk, kemudian ditambahkan 4 tetes HCl pekat dengan hati-hati. 5. Diperhatikan bau khas belerang dari belerang yang teroksidasi. 6. Diulangi percobaan menggunakan serbuk gelatin.
2. Uji Kelarutan Protein 1. Disediakan 5 tabung reaksi, masing-masing diisi dengan: air suling, HCl 10%, NaOH 40%, alkohol 96%, dan kloroform sebanyak 1 ml. 2. Ditambahkan 2 ml larutan albumin telur pada setiap tabung. 3. Dikocok dengan alat pengocok tabung, kemudian diamati sifat kelarutannya. 4. Diulangi percobaan dengan menggunakan gelatin. 3. Uji Pengendapan Protein dengan Garam 1. Disediakan 5 tabung reaksi, masing-masing diisi dengan 2 ml albumin telur. 2. Pada tabung 1, 2, 3, 4, dan 5 berturut-turut ditambahkan larutan NaCl 5%, BaCl2 5%, CaCl2 5%, MgSO4 5% dan (NH4)2SO4 jenuh setetes demi setetes sampai timbul endapan. 3. Selanjutnya, ditambahkan kembali larutan-larutan garam secara berlebihan. 4. Tabung dikocok, kemudian diamati perubahan yang terjadi. 4. Uji Pengendapan Protein dengan Logam dan Asam Organik 1. Disediakan 5 tabung reaksi yang bersih, masing-masing diisi dengan 2 ml larutan albumin telur. 2. Pada tabung 1, 2, 3, 4, dan 5 berturut-turut ditambahkan 10 tetes larutan asam trikloroasetat 10%, asam sulfosalisilat 5%, CuSO4 5%, HgCl2 5%, dan Pb-asetat. 3. Tabung dikocok dan diamati setiap perubahan yang terjadi. 5. Uji Biuret 1. Disediakan 4 tabung reaksi yang bersih, lalu masing-masing diisi dengan larutan albumin, kasein, gelatin, dan glisin sebanyak 2 ml. 2. Ditambahkan pada setiap tabung 1 ml NaOH 10% dan 3 tetes CuSO4 0,2%. 3. Dicampur dengan baik. 4. Diamati perubahan warna yang terjadi. 6. Uji Ninhidrin 1. Disediakan 4 tabung reaksi yang bersih, lalu masing-masing diisi dengan larutan albumin, kasein, gelatin, dan pepton sebanyak 2 ml. 2. Ditambahkan 5 tetes pereaksi ninhidrin pada setiap tabung. 3. Kemudian, dipanaskan di atas penangas air hingga mendidih selama 5 menit. 4. Diamati perubahan warna yang terjadi. 7. Uji Xantoprotein
1. Disediakan 4 tabung reaksi yang bersih dan masing-masing diisi dengan larutan albumin, gelatin, dan kasein sebanyak 2 ml. 2. Pada setiap tabung, ditambahkan 1 ml HNO3 pekat. Diperhatikan adanya endapan putih yang terbentuk. 3. Kemudian, dipanaskan selama 1 menit dan diamati terbentuknya warna kuning. 4. Selanjutnya, didinginkan di bawah air kran, lalu ditambahkan NaOH 10% setetes demi setetes melalui dinding tabung hingga terbentuk lapisan. 5. Diperhatikan perubahan warna yang terjadi. Reaksi positif bila pada dinding perbatasan antara protein dan NaOH terbentuk warna jingga. 8. Uji Penentuan Titik Isoelektrik 1. Disiapkan 5 tabung reaksi yang bersih dan kering, lalu masing-masing diisi dengan 1 ml larutan kasein. 2. Pada setiap tabung, ditambahkan larutan buffer asetat masing-masing dari pH: 3,8; 4,7; 5,0; 5,3; dan 5,9. 3. Campuran dikocok dengan baik, lalu dicatat derajat kekeruhannya setelah 0, 10, dan 30 menit. 4. Diperhatikan hasilnya, yaitu pada tabung terbentuk endapan maksimal. 5. Selanjutnya, semua tabung dipanaskan di atas penangas air. 6. Diamati hasilnya. Pembentukan endapan kekeruhan paling cepat atau paling banyak merupakan titik isoelektrik (TI) kasein. IV. 1 TABEL 1. Uji Susunan Elementer Protein 1) Uji Adanya Unsur C, H dan O No.
Zat Uji
1. 2.
Albumin Gelatin
Pengarangan (C) + +
Hasil Pengamatan (+/-) Pengembunan (H dan Bau Rambut (N) O) + + + +
2). Uji Adanya Atom N No.
Perlakuan
1.
Albumin + 1 mL NaOH 10% + dipanaskan
Hasil Pengamatan (+/-) Bau Amoniak Kertas Lakmus Merah (N) (N) +
+
Gelatin + 1 mL NaOH + dipanaskan
2.
+
+
3). Uji Adanya Atom S No. 1.
2.
Hasil Pengamatan (+/-) PbS Belerang (S)
Perlakuan Albumin + 1 mL NaOH 10% + dipanaskan + 4 tetes PbAc + 4 tetes HCl pekat Gelatin + 1 mL NaOH 10% + dipanaskan + 4 tetes PbAc + 4 tetes HCl pekat
+
+
-
-
otein Bahan Albumin Telur Air Suling HCl 10% NaOH 40% Alkohol 96% Kloroform Hasil : Larut/ tidak larut
Tabung 1
Tabung 2
Tabung 3
Tabung 4
Tabung 5
2 mL
2 mL
2 mL
2mL
2 mL
1mL -
1mL -
1mL
-
-
-
-
-
1mL
-
-
1mL
Larut
Larut
Tidak larut
-
Kocok tabung dengan kuat
Larut
Larut
Protein Dengan Garam Bahan
Tabung 1
Tabung 2
Tabung 3
Tabung 4
Albumin telur NaCl 5% BaCl2 5% CaCl2 5% MgSO4 5% (NH4)2SO4 jenuh
2 mL Berlebih -
2 mL Berlebih -
2 mL Berlebih -
2 mL Berlebih
Tabung 5 2 mL -
-
-
-
-
Berlebih
Sedikit sekali
Tidak terbentuk
Banyak endapan
Kocoklah tabung Hasil : Endapan banyak /
Tidak terbentuk
Ada sedikit
sedikit
4. Uji Pengendapan Protein Dengan Logam Dan Asam Organik Bahan Albumin telur TCA 10% Asam sulfosalisilat 5% CuSO4 5% HgCl2 5% Pb-asetat 5% Hasil : endapan banyak / sedikit
Tabung 1 2 mL 10 tetes
Tabung 2 2 mL -
Tabung 3 2 mL -
Tabung 4 2 mL -
-
10 tetes
-
-
-
10 tetes -
10 tetes
Banyak
Sedikit
-
10 tetes Kocoklah tabung
Banyak
Banyak
Banyak
Tabung 5 2 mL -
5. Uji Biuret No. Zat Uji 1 Albumin 2% 2. Gelatin 2% 3. Kasein 0,5% 4. Glisin 2% 6. Uji Ninhidrin No. Zat Uji 1. Albumin 2% 2. Gelatin 2% 3. Kasein 0,5% 4. Pepton 0,5% 7. Uji Xantoprotein
Hasil Uji Biuret Ungu Ungu Ungu Bening
Hasil Uji Ninhidrit Ungu Bening Bening Ungu Kehitaman
Polipeptida (+/-) + + + -
Asam Amino Bebas (+/-) + +
No.
Zat Uji
Hasil Uji Xantoprotein
Tirosin/triptofan/fenilalanin (+/-)
1.
Albumin 2%
Terdapat endapan+ada warna jingga
+
2.
Gelatin 2%
3.
Kasein 0,5%
Tidak ada endapan+Kuning bening Tidak ada
-
endapan+kuning bening
8. Uji Penentuan Titik Isoelektrik pH
PENGAMATAN ENDAPAN, SEDIKIT ATAU BANYAK
1
3,8
Banyak
2
4,7
Tidak ada endapan
3
5,0
Sedikit
4
5,3
Sedikit
5
5,9
Tidak ada endapan
NO. TABUNG
IV.2 PEMBAHASAN 1. Uji Susunan Elementer Protein Pada uji susunan elementer ini bertujuan untuk mengetahui unsur-unsur penyusun protein. Pada uji ini, ada tiga macam pengujian untuk mengetahui penyusun protein, yakni uji adanya unsur C, H, O;uji adanya atom N;dan uji adanya atom S. Adapun bahan uji yang dicobakan yaitu albumin dan gelatin. Pada uji adanya unsur C, H, dan O dengan bahan uji albumin terjadi reaksi pengabuan yang menandakan adanya unsur H (hidrogen) dan O (oksigen). Begitupun saat bahan uji yang digunakan adalah gelatin, juga terjadi reaksi pengabuan. Pada saat melakukan metode pembakaran pada kedua bahan uji, tercium bau rambut terbakar yang menandakan adanya unsur N (nitrogen) disertai terjadinya pengarangan yang menandakan adanya unsur C (karbon). Uji kedua pada uji susunan elementer protein yaitu untuk membuktikan adanya atom N (nitrogen). Pada uji ini, kedua bahan uji direaksikan dengan NaOH 10% yang dipanaskan. Adanya bau amonia menandakan adanya unsur nitrogen pada larutan uji. Uap pada saat pemanasan diuji dengan kertas lakmus warna merah yang sebelumnya telah dibasahi dengan aquades. Hal ini bertujuan untuk mempermudah deteksi sifatnya. Lakmus yang berwarna merah berubah menjadi warna biru. Hal ini disebabkan nitrogen yang menyebabkan bau amonia teroksidasi dan membentuk NH3 yang bersifat basa.
Pada uji susunan elementer untuk mengetahui adanya atom S (sulfur) pada bahan uji yakni albumin dan gelatin, terjadi hasil berbeda untuk setiap bahan uji. Untuk albumin, saat dipanaskan bersama NaOH tidak terjadi perubahan warna. Ketika larutan dicampur dengan Pb-Asetat terjadi perubahan warna hitam yang mengindikasikan terbentuk PbS. Adanya sulfur pada albumin semakin diperkuat saat direaksikan dengan HCl pekat karena adanya asap dengan bau khas belerang dari belerang yang teroksidasi. Berbeda saat gelatin diujicobakan tidak ada perubahan warna hitam yang menandakan tidak terbentuknya PbS dan tidak terciumnya bau khas belerang. 2. Uji Kelarutan Protein Pada uji kelarutan ini, bertujuan untuk mengetahui daya kelarutan protein terhadap pelarut tertentu. Daya larut protein berbeda di dalam air, asam, dan basa. Sebagian ada yang mudah larut dan ada pula yang sukar larut. Namun, semua protein tidak larut dalam pelarut lemak seperti eter dan kloroform. Bahan uji yang digunakan yaitu albumin dan gelatin. Ketika bahan uji direaksikan dengan air suling, HCL 10%, NaOH 40%, dan alkohol 96% terbentuk 1 fase yang menandakan albumin dan gelatin terlarut. Berbeda saat kedua bahan uji direaksikan dengan kloroform, baik albumin dan gelarin tidak larut dalam kloroform, hal ini disebabkan kloroform merupakan pelarut lemak. 3. Uji Pengendapan Protein Dengan Garam Uji ini bertujuan untuk mengetahui larutan garam alkali dan garam divalent konsentrasi tinggi terhadap sifat kelarutan protein. Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein. Bahan uji yang digunakan adalah albumin telur yang akan direaksikan dengan beberapa garam alkali seperti NaCl 5%, BaCl2 5%, dan CaCl2 5% serta garam divalen seperti MgSO4 dan (NH4)2SO4 jenuh. Setiap garam yang direaksikan dengan garam berpotensi memiliki endapan tergantung pada konsentrasi, bilangan oksidasi dan muatan ionnya. Ketika albumin direaksikan dengan larutan (NH4)2SO4 hanya butuh kurang dari 50 tetes sudah banyak yang terbentuk endapan. Sedangkan untuk keempat garam lainnya, butuh lebih dari 50 tetes dan hasil endapan yang terbentuk bervariasi. Untuk BaCl2 ada sedikit endapan dan untuk CaCl2 hanya sedikit sekali yang terbentuk. Untuk MgSO4 dan NaCl tidak terbentuk
endapan. Ada beberapa faktor yang mengakibatkan hal ini terjadi, salah satunya konsentrasi yang masih perlu ditingkatkan. 4. Uji Pengendapan Protein Dengan Logam Dan Asam Organik Uji ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh logam berat dan asam organik terhadap sifat kelarutan protein. Sebagian besar protein dapat diendapkan dengan penambahan asam-asam organik seperti asam pikrat, asam trikloroasetat, dan asam sulfosalisilat yang akan menyebabkan terbentuknya garam proteinat yang tidak larut. Konsentrasi mempengaruhi pengendapan. Saat albumin direksikan dengan TCA 10% terbentuk banyak endapan, hal ini dikarenakan konsentrasi TCA juga lebih tinggi atau dinaikkan. Begitupun saat asam sulfosalisilat direaksikan, juga terbentuk banyak endapan. Ketika CuSO4 direaksikan, air yang terdapat pada protein (albumin) diikat sehingga juga terdapat banyak endapan. Untuk HgCl2 banyak terbentuk endapan. Dan untuk Pb-Asetat hanya sedikit terbentuk endapan. Banyak sedikitnya endapan tergantung dari bilangan oksidasi senyawa, jika bilangan oksidasi sama, maka penentuannya kemudian dilanjutkan dengan melihat kedudukannya dalam sistem periodik. Saat melakukan uji ini, sangat disarankan untuk menggunakan salah satu alat keselamatan laboratorium, yakni masker. Hal ini guna menghindari terhirupnya logam-logam ke dalam tubuh kita, karena logam yang terhirup dapat bersifat radikal bebas di dalam tubuh. 5. Uji Biuret Uji ini bertujuan untuk membuktikan adanya molekul-molekul peptida dari protein. Ion CU2+ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatanikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu (violet). Adapun bahan uji yang digunakan adalah albumin, gelatin, kasein, dan glisin. Saat albumin direaksikan dengan NaOH dan CuSO4 terjadi perubahan warna. Warna ungu yang dibentuk menandakan albumin sebagai protein kompleks dimana ia mempunyai lebih dari dua ikatan peptide. Hasil yang sama (terjadi perubahan warna ungu) juga ditunjukkan oleh gelatin dan kasein. Untuk glisin, ketika direaksikan tidak terjadi perubahan warna (larutan tetap bening). Hal ini menunjukkan bahwa glisin hanya mengandung dua ikatan peptida (dipeptida). 6. Uji Ninhidrin Uji ini dilakukan untuk membuktikan adanya asam amino bebas dalam protein. Semua asam amino atau peptida yang mengandung asam alfa-amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin
membentuk senyawa kompleks berwarna biru. Dalam uji ini, digunakan pereaksi Ninhidrin 0,1% yang berfungsi sebagai oksidator yang mereduksi asam amino. Adapun bahan yang diujikan adalah albumin 2%, gelatin 2%, kasein 0,5%, dan pepton 0,5%. Albumin dan gelatin memiliki perbedaan pada unsur S (belerang) yang terkandung di dalamnya. Untuk albumin dan pepton menunjukkan hasil yang positif dengan perubahan warna biru kehitaman untuk albumin dan ungu kehitaman untuk pepton. Sebelum mengalami perubahan warna, sebelumnya terbentuk hasil antara hidridantin. Setelah mengalami oksidasi, gugus amino terpecah menjadi NH3 dan asam karboksilat. Hidridantin dan amonia yang bereaksi membentuk warna biru dan melepasakan CO2 dan asam karboksilat. Sedangkan untuk gelatin dan kasein menunjukkan hasil negatif dengan tidak adanya perubahan warna (bening). Ada kesalahan dalam uji ini, disebabkan gelatin yang seharusnya menunjukkan hasil yang positif ternyata setelah diujikan menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini dimungkinkan terjadi karena gelatin sudah mengalami denaturasi sehingga sulit diidentifikasi. 7. Uji Xantroprotein Uji xantroprotein bertujuan untuk membuktikan adanya cincin benzena pada protein. Tidak semua protein mengandung asam amino yang mengandung cincin benzena. Reaksi pada uji xantroprotein didasarkan pada nitrasi inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Jika protein yang mengandung cincin benzene ditambahkan asam nitrat pekat, maka akan terbentuk endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya berubah menjadi jingga. Albumin, gelatin, dan kasein adalah bahan yang diujikan. Pada saat albumin dicampur dengan HNO3 pekat dan dipanaskan terbentuk warna kuning dan setelah didinginkan kemudian ditambahkan NaOH terbentuk warna jingga serta terdapat endapan. Hal ini menunjukkan hasil yang positif dimana albumin mengandung cincin benzena. Untuk gelatin ketika direaksikan menunjukkan hasil yang negatif, ini mengindikasikan bahwa gelatin tidak punya ikatan rangkap dua yang bisa beresonansi dalam cincin benzenanya. Sedangkan untuk kasein, juga menunjukkan hasil yang negatif. Pada saat bahan uji kasein yang direaksikan ada kemungkinan terjadi kesalahan, sebab kasein mempunyai cincin benzene yang ikatan rangkapnya bisa beresonansi. Ada berbagai faktor yang dapat mempengaruhinya, konsentrasi yang rendah dan melakukan pengocokan yang dimana pada prosedur kerja tidak dilakukan bisa menjadi penyebabnya.
8. Uji Titik Isoelektrik Pada uji penentuan titik isoelektrik, larutan kasein netral yang dicampurkan dengan larutan buffer asetat yang pH-nya berbeda-beda, menghasilkan endapan yang banyaknya berbeda-beda pula, yaitu pada larutan buffer yang memiliki pH 3,8 membentuk banyak endapan, larutan buffer yang memiliki pH 4,7 tidak menghasilkan endapan, larutan buffer yang memiliki pH 5,0 dan 5,3 membentuk sedikit endapan, dan larutan buffer yang memiliki pH 5,9 tidak menghasilkan endapan. Larutan buffer adalah larutan yang dibuat dari campuran asam lemah dengan garamnya yang berasal dari basa kuat atau basa lemah dengan garamnya yang berasal dari asam kuat. Pada percobaan ini, kita menggunakan kasein netral agar mudah membawa larutan ke-pH yang diinginkan. Larutan buffer yang digunakan dalam hal ini adalah larutan buffer asam, karena salah satu faktor yang mempengaruhi denaturasi adalah penambahan asam, jika yang ditambahkan buffer basa, maka tidak akan terjadi denaturasi. Endapan paling banyak terdapat pada pH 3,8 karena pH inilah yang paling asam diantara larutan buffer yang digunakan dan pH 3,8 inilah yang menjadi titik isoelektrik pada percobaan ini. Semakin mendekati titik isoelektrik, maka endapannya semakin banyak, karena sisi positif dan negatifnya sama, sehingga ketika bertemu akan mengendap. Pada pH 4,7 seharusnya terbentuk endapan yang banyak setelah pH 3,8, tetapi pada pecobaan ini tidak terbentuk endapan yang mungkin terjadi karena adanya kontaminasi pada bahan.
BAB V PENUTUP
V. 1 KESIMPULAN 1. Albumin mengandung unsur-unsur karbon (C), hidrogen (H), oksigen (O), nitrogen (N), dan belerang (S). Sedangkan gelatin hanya mengandung hidrogen (H), oksigen (O), dan nitrogen (N). 2. Albumin bersifat larut dalam air suling (aquades), HCl, NaOH, dan alkohol, sedangkan albumin bersifat tidak larut pada kloroform. 3. Reaksi albumin dengan NaCl 5 %, albumin dengan MgSO4 5 %, semuanya tidak membentuk endapan. Sedangkan reaksi albumin dengan (NH4)2SO4 jenuh membentuk banyak endapan. Untuk BaCl2 5% dan CaCl2 5% membentuk sedikit endapan. 4. Reaksi albumin dengan larutan asam trikloroasetat 10 %, reaksi albumin dengan HgCl2 5 %, reaksi antara albumin dengan asam sulfosalisilat 5 %, reaksi albumin dengan CuSO4 5 % membentuk banyak endapan. Pada reaksi antara albumin dengan Pb-Asetat 5 % terbentuk sedikit endapan. 5. Albumin dan gelatin positif mengandung ikatan polipeptida, sedangkan glisin tidak mengandung ikatan polipeptida. 6. Albumin dan pepton mengandung asam amino bebas, sedangkan gelatin tidak mengandung asam amino bebas. 7. Albumin positif mengandung tirosin, triptofan dan fenilalanin, sedangkan gelatin tidak mengandung tirosin, triptofan dan fenilalanin. 8. Semakin mendekati titik isoelektrik, maka endapannya semakin banyak, karena sisi positif dan negatifnya sama, sehingga ketika bertemu akan mengendap. pH ini berada pada angka 3,8.
V. 2 SARAN Untuk laboratorium sebaiknya laboratorium lebih melengkapkan sarana dan prasarananya, agar praktikan dapat melakukan praktikum dengan semestinya, tanpa ada hambatan. Sebab
dengan tidak diujikannya salah satu percobaan dapat menghalangi praktikan dalam memperoleh pengetahuan yang seharusnya menjadi hak praktikan. DAFTAR PUSTAKA
Almatsier. S. 2010. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama. Martoharsono, S. 2006. Biokimia 2. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press Murray, R. K. dkk. 2009. Biokimia Harper. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Sandjaja. dkk. 2010. Kamus Gizi. Jakarta : Kompas. Sirajuddin, S dan Najamuddin, U. 2011. Penuntun Praktikum Biokimia. Makassar : Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Hasanuddin. Sloane, E. 2004. Anatomi Dan Fisiologi Untuk Pemula. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Tim Dosen Kimia. 2010. Kimia Dasar. Makassar : UPT MKU. Tim Dosen Kimia. 2010. Kimia Dasar 2. Makassar : UPT MKU.
