PREDIÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA Poliphenol oxidase DE EUTERPE OLERACEA (AÇAIZEIRO) DE B.A.S de SOUZA 1, F.B.S de SOUZA 1, N.A.N. de ALENCAR 2, C.N. ALVES2 e D. do S.B. BRASIL1 1 2
Universidade Federal do Pará, Laboratório de Informática
Universidade Federal do Pará, Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos E-mail para contato:
[email protected] RESUMO – A palmeira Euterpe oleracea (Mart.), conhecida popularmente como açaizeiro apresenta produtos de elevado potencial econômico, com destaque para o palmito e o suco extraído do fruto. A palmeira de açaí é nativa da América do Sul e produz uma fruta pequena, preto-roxo comestível que tornou-se um alimento funcional muito popular, devido o seu potencial antioxidante. A proteína Polifenol oxidase é uma das enzimas mais bem estudadas em frutas e vegetais porém pouco se sabe a respeito de sua função fisiológica nas nas plantas. plantas. Estudos evidenciam que P. oxidase fornece algum grau de proteção contra patógenos e insetos, outros estudos demonstram que a proteína pode estar envolvida na síntese de pigmentos vegetais e lignanas. A atividade catalítica de P. oxidase tem significativa importância em termos econômicos e nutricionais em relação à qualidade de vários tipos de frutas e hortaliças, pelo fato de resultar na alteração de cor, sabor e textura, além da perda do valor nutritivo. A enzima catalisa a conversão de monofenóis a odifenois e dihidrofenois a o-quinonas, que são compostos altamente reativos e que formam polímeros, tais reações são acompanhadas por um escurecimento conspícuo do tecido, afetando o aspecto visual de frutas, legumes e produtos associados, diminuindo o seu apelo ao consumidor. A oleracea (açaizeiro) foi homologia da proteína Poliphenol oxidase de de Euterpe oleracea realizada utilizando o servidor SWISS MODEL através do qual pôde-se propor a estrutura da proteína-alvo ( target ) partindo de sua sequência primária obtida por MAZZAFERA MA ZZAFERA et al. (2005) e de estruturas homólogas tridimensionais. O segundo passo foi determinar os moldes (templates) que estivessem diretamente relacionados relacionados ao alvo através de uma maior identidade e similaridade entre eles, esse alinhamento foi realizado no servidor PDB (Protein Data Bank), obteve-se como melhor molde a proteína Poliphenol oxidase de Vitis vinifera com 38% de identidade.
1. INTRODUÇÃO A palmeira Euterpe oleracea (Mart.), conhecida popularmente como açaizeiro apresenta produtos de elevado potencial econômico, com destaque para o palmito e o suco
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extraído do fruto (NASCIMENTO et al., 2010). A palmeira alcança em torno de 15 a 20m de altura e 12 a 18cm de diâmetro e tem preferência por terrenos alagados e áreas úmidas, por isso é encontrada frequentemente às margens dos rios. A árvore tem ocorrência na América do Sul, especificamente na região Norte do Brasil, nos Estados do Pará, Amazonas, Maranhão e Amapá, e estende-se para as Guianas e Venezuela (LORENZI et al., 1996; SOUZA et al., 1996; UDANI et al., 2011). Seu fruto conhecido popularmente como açaí é pequeno, com uma coloração preto-roxo comestível e tornou-se um alimento funcional muito popular, devido ao seu potencial antioxidante (UDANI et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2000). Apresenta formato arredondado e pesa cerca de dois gramas, sendo 17% dele comestível (polpa com casca), o restante corresponde ao caroço contendo a semente oleaginosa. Os frutos tem a sua melhor época de colheita entre agosto e dezembro, quando apresentam melhor qualidade organoléptica (ROGEZ, 2000). A polpa de seus frutos contém elevados teores de compostos fenólicos conhecidos por inibirem a peroxidação lipídica e as lipoxigenases in vitro, através da capacidade em sequestrar radicais livres, assim como hidroxílicos, superóxidos e peroxílicos, os quais reconhecidamente promovem o estresse oxidativo celular (LEONTOWICZ et al., 2007; OKONOGI, et al., 2007; TACHAKITTIRUNGROD et al., 2007). Estudos indicam que tais compostos estão associados com ações anticarcinogênicas (inibição de cólon, esôfago, pulmão, fígado, mama e pele), anti-inflamatórias, anti-hepatotóxica, antiviral, antialérgica, antitrombótica (MAZZA & GIRARD, 1998). No Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento da Embrapa Amazônia Oriental de 2009 estudou-se a cultivar de açaizeiro BRS Pará selecionada para as condições de terra firme, com bons níveis de produtividade de frutos, obteve-se, comparando com a Instrução Normativa nº 1 (BRASIL, 2000), expressivos teores de proteínas e lipídios para a polpa e elevado teor de compostos fenólicos com expressiva atividade antioxidante (COHEN et al., 2009). A semente do açaizeiro corresponde ao fruto desprovido de epicarpo e mesocarpo com eixo embrionário diminuto e abundante tecido endospermático, de morfologia esférica e representa 73% da massa do fruto completo (Villachica et al., 1996). A polpa do açaí em sua composição fitoquímica é caracterizada por elevada concentração de antocianinas que são da classe dos flavonóides, compostos contendo hidroxilas fenólicas, sendo a cianidina-3-glicosídeo e a cianidina-3-rutinosídeo os principais constituintes (SCHAUSS et al., 2006a; KAHKONEN & HEINONEN, 2003; RAHMAN et al., 2006). Elevado teor de ácidos graxos insaturados foi encontrado na polpa de açaí, em especial os ácidos oleico e linoleico, sendo que em 100g de peso seco de açaí 32,5g são gorduras (saturadas e insaturadas). Dessas gorduras totais, 8,5g estão representadas por ácidos graxos saturados, onde se destaca a presença do ácido palmítico e 24g são representados por ácidos graxos insaturados (SCHAUSS et al., 2006a). O fruto também apresenta 13g de proteína por 100g, sendo fonte de minerais, como potássio, magnésio, cálcio, fósforo e sódio, e vitaminas E e B1 (ROGEZ, 2000). O açaí ainda contém quantidades importantes de fitosteróis, entre eles o betasitosterol, o campestrol e o estigmasterol (SCHAUSS et al., 2006a), e fibras alimentares,
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cerca de 12,5g por 100g de peso seco de açaí (TOIARI et al., 2005). A proteína Polifenol oxidase é uma das enzimas mais bem estudadas em frutas e vegetais porém, pouco se sabe a respeito de sua função fisiológica nas plantas (WALKER et al.,1998; MAYER , 2006). Estudos evidenciam que P. oxidase fornece algum grau de proteção contra patógenos e insetos (THIPYAPONG et al.,2004), outros estudos demonstram que a proteína pode estar envolvida na síntese de pigmentos vegetais (STRACK & SCHLIEMANN, 2001) e lignanas (CHO et al., 2003). O escurecimento enzimático é catalisado por dois grandes grupos de enzimas: as difenol oxidases e as peroxidases. As contribuições relativas destes dois grupos de enzimas para os pigmentos resultantes ainda não foram resolvidas de forma clara e provavelmente é diferente entre organismos (MASON & PETERSON, 1965; PIERPONT, 1969; WALKER, 1995; WALKER & FERRAR, 1995). Este trabalho visa realizar a predição estrutural da proteína Poliphenol oxidase presente na espécie Euterpe oleracea Mart., o que poderá contribuir no avanço da compreensão da função desta proteína na fisiologia da presente espécie.
2. PREDIÇÃO ESTRUTURAL DA PROTEÍNA Poliphenol oxidase DE EUTERPE OLERACEA (AÇAIZEIRO) A homologia da proteína Poliphenol oxidase de Euterpe oleracea (açaizeiro) foi realizada utilizando o servidor SWISS MODEL através do qual pôde-se propor a estrutura da proteína-alvo (target ) partindo de sua sequência primária obtida por MAZZAFERA et al. (2005) e de estruturas homólogas tridimensionais. No servidor UNIPROT realizou-se a pesquisa de uma sequência de proteína sem PDB, obtendo-se a seguinte sequência conforme mostra a Figura 1.
Figura 1- Sequência de peptídeos obtida para a proteína Poliphenol oleracea no servidor UNIPROT.
oxidase de Euterpe
>tr|Q3YJ63|Q3YJ63_9LILI Poliphenol oxidase (Fragment) OS=Euterpe oleracea PE=2 SV=1 HCAYCNEAYDQVGFPGVPVQVHYSWLFLPWHRYYLHFYERILGKLIDDDTFTLPFWNFDSDDG MTMPEIFTNDTSSSLYNANRDTSHYSPAILDYKYSYGNTAGSGLTGKALVLSNLVLHEEDIQADP AAGGAIYGGPAAGRAGGGHYQWVRAAGEHPQRHPHVGGHARISPHRHGRLRHRRRRLHFFQPP LQRRPPLAPLPHVPWQQDRVQRHRLAGRLIHLLRRK
O segundo passo foi determinar os moldes (templates) que estivessem diretamente relacionados ao alvo através de uma maior identidade e similaridade entre eles, esse alinhamento foi realizado no servidor PDB (Protein Data Bank), obteve-se como melhor molde a proteína Poliphenol oxidase de Vitis vinifera com 38% de identidade conforme a Figura 2. 93
Figura 2. PDB 2P3X .
No servidor SWISS MODEL realizou-se a construção de modelos similares ao alvo a partir do alinhamento entre o target e o template, obteve-se o seguinte modelo proposto pelo servidor, conforme a Figura 3.
Figura 3. Modelo proposto.
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3.
VALIDAÇÃO
A avaliação estereoquímica do modelo foi feita através do gráfico de Ramachandran (RAMACHANDRAN; RAMAKRISHNAN; SASISEKHARAN, 1963). O número de resíduos localizados em regiões com ângulos favoráveis, dados em porcentagem, para o modelo foi considerado satisfatório, o modelo gerado do domínio catalítico apresentou 83,5% dos resíduos previstos dentro da região favorável. Esse resultado está apresentado na Figura 4. Esta é uma análise estatística dos número de aminoácidos em cada região e permissões, exceto para resíduos de prolina e glicina (triângulo), pois estes devido a suas flexibilidades apresentam permissões diferente em relação aos demais.
Figura 4 - Gráfico de RAMACHANDRAN obtido através do servidor SWISS-MODEL para validar o modelo 3D de Poliphenol oxidase.
O gráfico de ANOLEA é usado para avaliar a qualidade do modelo, mostra a energia de interação de cada resíduo de uma cadeia de proteína podendo determinar assim
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zonas com elevada energia, geralmente relacionadas a erros estereoquímicos e choques ou interações indevidas. O gráfico de ANOLEA está em processo de validação. Valor de RMSD calculado para o modelo foi de 0,075 Å. Esse resultado demonstra que o desvio médio na construção do modelo foi satisfatório, principalmente por ser uma proteína que apresenta muitas regiões de alça, sendo assim, a estrutura tridimensional proposta satisfaz as condições exigidas durante a evolução, considerando a estabilidade da estrutura das proteínas (ARNOLD et al., 2006). O DFIRE analisa as interações atômicas, provendo pseudo-energias para os modelos as quais indicam a sua qualidade. Este valor para a presente proteína foi de 160,33.
4.
CONCLUSÃO
O presente modelo encontra-se em processo final de validação para posteriormente ser depositado no banco de dados PDB (Protein Data Bank). Através da elaboração do modelo tridimensional da proteína Poliphenol oxidase será possível realizar estudos de ancoragem e dinâmica molecular permitindo o estudo das interações moleculares presentes nesta proteína e com outras substâncias.
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