UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
2012 BIOTECNOLOGÍA
Chacaltana Lozano Carlo
PROFESOR: M.Sc. José Gavidia Valencia 20/02/2012
Biotecnología A. H. Scragg La federación Europea de Biotecnología definió a la biotecnología como “el uso integrado de la ingeniería, la bioquímica y la microbiología para conseguir la aplicación tecnológica (industrial) de la capacidad de los microorganismos, células de tejido cultivado y sus partes”. En resumen la biotecnología es la aplicación de agentes biológicos ya sea en la
industria manufacturera o en operaciones de servicio. El termino biotecnología puede significar que se trata de una disciplina individual, pero la esencia de la biotecnología en su naturaleza multidisciplinaria, la cual requiere amplias aportaciones de la ciencia y la ingeniería. Esto quizá se ilustre mejor en la figura 1.1 es debido a estos requerimientos multidisciplinarios de la biotecnología que este libro, y el curso del cual se derivo, se diseño para presentar el tema a los ingenieros quienes por lo general tienen muy poco contacto con la biociencias. La terminología propia de cualquier materia puede ser obstáculo para entenderla. A menudo se piensa que la biotecnología consiste solo en la ingeniería genética y anticuerpos monoclonales. Tener una definición tan simple sería un error puesto que ignora la mayor parte de la biotecnología, incluyendo algunas de las áreas más exitosas. En la tabla 1.1 se da una lista con ejemplos de algunos productos se la biotecnología. En contradicción con la creencia popular, la biotecnología no es un tema de creación reciente, sino que data de los sumerios y los egipcios, 6000 a 4000 años antes de Cristo. La escala de tiempo en evolución de la biotecnología se ilustra bien en la tabla preparada por Howink (1984), la tabla 1.2. la evolución de la biotecnología se puede dividir en cinco eras.
1.1 LA ERA ANTERIOR A PASTER Esta se basaba en los alimentos y bebidas fermentadas tradicionales sin ningún conocimiento de biología. La producción de cerveza fue producida por los sumerios hace aproximadamente 6000 años a. C. fueron los chinos quienes inventaron la destilación en el año 14 d. C. para la producción de bebidas con alto contenido de
alcohol. El uso de levaduras para formar dióxido de carbono y, así, esponjar el pan, se introdujo también en Egipto 4000años a. C. en esta época se crearon otros usos de los microorganismos, en la formación del acido acético a partir del etanol (vinagre), la elaboración de queso y yogurts. Sin embargo, no fue sino hasta el siglo XVII, que Antonio van leeuwenhoek demostró por primera vez la presencia de microorganismos.
Tabla 1.1 Ejemplos de productos de diferentes categorías en la biotecnología (según Cooney, 1983). Masa celular
Levadura de Baker, proteína celular.
Componentes celulares
Proteínas intracelulares.
Productos biosintéticos
Antibióticos, vitaminas, aminoácidos, ácidos orgánicos.
Productos catabólicos
Etanol, metano y acido láctico.
Bioconversión
Jarabe de maíz rico en fructosa, acido 6 amino penicilanico.
Tratamiento
de Lodo activado, digestión anaerobia.
desechos
calendario de eventos (según Houwink, 1984) Tabla 1.2 Biotecnología – calendario La era prepasteur, antes de 1985
Bebidas alcohólicas (cerveza y vino)
Productos lácteos (queso, yogurt)
Otros alimentos fermentados
La era de pasteur, 1865-1940
Etanol, butanol, acetona, glicerol
Ácidos orgánicos (acido cítrico)
Tratamiento aerobio de aguas residuales
La era de los antibióticos, 1940-1960
Penicilinas: tecnología de la fermentación sumergida
Gran variedad de antibióticos
Tecnología de la estructura de la célula animal, vacunas contra virus
Transformaciones microbiológicas de esteroides
La era post antibióticos, 1960-1975
Aminoácidos
Proteína celular (SCP)
Tecnología de las células y las enzimas inmovilizadas (glucosa isomerasa)
Tratamiento anaerobio de aguas de desecho (biogas)
Polisacáridos bacterianos (goma de xantán)
Gasohol
La era de la nueva biotecnología 1975-
Tecnología de los hibridosomas: anticuerpos monoclonales
Prueba diagnóstica con anticuerpos monoclonales (1980)
Ingeniería genética (1974)
Vacuna de origen animal contra la diarrea (1982)
Insulina humana (1982)
1.2 LA ERA PASTEUR El trabajo de Pasteur mostro por primera vez que los microoranismos eran los agentes activos en procesos como la producción de cerveza, vino y la descomposición de los alimentos. A este trabajo lo secundaron escasos progresos en el estudio de los microorganismos hasta el comienzo del siglo XIX, cuando se introdujeron los procesos microbiológicos para la producción de acetona, butanol, glicerol y acido cítrico. Quizá fue el descubrimiento de weizman, realizado en 1913-1915 en manchester, de un proceso microbiológico para la producción de acetona y butanol por clostridium acetobutylicum, el que anunció el comienzo real de la biotecnología. Este proceso solo se optimizo en los años 50. Otro proceso importante creado en manchester fue el uso de lodos activados para tratar aguas negras, el cual comenzó en 1914. La primera guerra mundial impulso la producción microbiológica del glicerol a partir de la glucosa en Alemania.
1.3 LA ERA DE LOS ANTIBIOTICOS La investigación entre 1920 y 1940 gradualmente dio como resultado una mejor comprensión de la biología, y se reconoció a las enzimas catalizan los procesos biológicos. Así mismo, los estudios en genética introdujeron el concepto de que genes individuales llevan información para formar enzimas particulares. Aunque Flemming descubrió la penicilina en 1928, no fue sino hasta 1940 que los avances en su aislamiento permitieron su producción en masa. Al principio la penicilina se produjo en botellas, pero se aplicaron ap licaron las tecnologías tecnolo gías de los procesos químicos y de los alimentos, las cuales permitieron que por primera vez el cultivo en gran escala de Penicillum en fermentadores o birreactores. En la actualidad, cada año se producen unas 12 000
toneladas de penicilina. A la producción de penicilina le siguieron una amplia variedad de antibióticos como la estreptomicina y la eritromicina.
1.4 LA ERA DE LOS POSTANTIBIOTICOS Durante este periodo el reconocimiento del metabolismo microbiano permitió una explotación mucho más amplia de las capacidades de una variedad de microorganismos. Estos se usaron para producir las vitaminas B2 B12 y los aminoácidos lisina y acido glutamico (glutamato monosodico), los últimos en volumen de 30 000 y 40 000 toneladas, respectivamente. Esta era también presencio la producción masiva de enzimas para uso industrial, como la adición de las proteasas a los detergentes domésticos y la transformación enzimática de la glucosa a fructosa para producir un high-fructose syrup, HFS jarabe rico en fructosa. En los inicio de los años sesenta se estuvo de acuerdo en que habría escases de proteínas, en particular en los países de tercer mundo. Entonces, se buscaron otras fuentes de proteínas; estas incluyeron microorganismos como algas, bacterias y levaduras. En 1964 el profesor Wilson del instituto de tecnología de Massachusetts (MIT) acuño la palabra single-cell protein, SCP “proteína celular” para denominar las proteínas microbianas. Los microorganismos tienen la capacidad de crecer en una vasta composición de compuestos. Estas fuentes se dividen en dos grupos principales, renovables y no renovables. Los recursos renovables son mucho de los productos de desechos agrícolas como el bagazo (residuo de la caña de azúcar), el almidón y la celulosa. Muchas compañía grandes, participaron en la creación de estos procesos. La mayoría de las investigaciones se enfoco al mejoramiento de estos desechos agrícolas para producir alimentos para animales, pero una compañía, la Rank Hovis Mcdougall , procedió a cultivar un moho para producir un alimento para humanos. Tuvieron que pasar 20 años para asegurarse de que el producto conocido como microproteina fuese apto para el consumo humano. Las fuentes no renovables investigadas para usarlas en la producción de proteína celular fueron, principalmente, subproductos de la industria petroquímica, como los alcanos, el metano o el metanol. De nuevo fueron las compañías petroquímicas, quienes participaron en la investigación. La British Petroleum (BP) investigo el uso de los alcanos en la obtención de proteína celular a
partir de levaduras (tropina), en tanto que las industrias Shell y la Imperial Chemical Industries Lid (ICI), (ICI), utilizaron metano y metanol respectivamente.
Solo el proceso ICI alcanzo una escala comercial con el cultivo de la bacteria methilophilus methylotrophus en metanol, en un proceso continuo con un volumen de
1.5 millones de litros. El mejoramiento de este y otros procesos, condujera al avance considerable en la tecnología de la fermentación. Sin embargo, la disponibilidad de proteínas de soya barata ha hecho que el proceso SCP sea incontestable y, según parece, par ece, el mundo actual no tiene déficit de proteína. La era pos antibiótica también presencio el mejoramiento de la fermentación en la producción de etanol para que fuera utilizado como combustible (gasohol), provocado por la crisis del petróleo en 1974. Otros productos formados por microorganismos son los polisacáridos extracelulares, como la goma de xantano, usada para reemplazar la goma natural en los alimentos y en los lodos de perforación. Al mismo tiempo se ha creado los cultivos de células vegetales y animales para la producción de compuestos especiales. Los microorganismos se han usado también como auxiliares en la lixiviación de minerales como el Zinc y el cobre a partir de minerales de grado menor.
1.5 LA NUEVA BIOTECNOLOGIA Las nuevas biotecnologías se consideran a menudo como la biotecnología misma. Sus principales avances han sido los anticuerpos monoclonales y la ingeniería genética. Los anticuerpos monoclonales son los productos de la tecnología del hibridoma. Esta se basa en la fusión de las células animales, las del sistema inmune que, por lo general, no pueden ser se r cultivadas in vitro, con células cancerosas que si pueden hacerlo. h acerlo. Las líneas de células hibridas que se forman, tiene la capacidad de crecer y producir anticuerpos altamente específicos, los cuales se conocen como anticuerpos monoclonales. La producción de anticuerpos monoclonales ha sido rápida, desde su descubrimiento en 1975 y, actualmente, hay más de 50 en el mercado. Se han utilizado en pruebas de diagnostico rápido, fármacos de acción específica, purificación, y su comercialización es cada vez mayor. La ingeniería genética se puede definir en forma simple con la capacidad para transferir genes de un organismo a otro, para cruzar la barrera que no se podrían mediante los
métodos genéticos ordinarios. El avance de esta técnica dependió de tres descubrimientos independientes. El primero fue el descubrimiento de las enzimas de restricción, las cuales pueden cortar el ADN en sitios específicos para producir fragmentos discretos. El segundo descubrimiento fue al presenciar, en las bacterias, de ciertas moléculas de DNA circular con reproducción independiente (plásmidos), las cuales se pueden cortar con enzimas de restricción y posteriormente repararse (reunirse) para incluir otros fragmentos fr agmentos de DNA. El tercer descubrimiento descub rimiento fue el método de tratar las bacterias para que puedan captar el DNA de un plásmido y, por tanto, contener nuevos genes (transformados). Estos tres descubrimientos han permitido la evolución de la ingeniería genética, la cual ha mostrado tan rápido crecimiento que ha formado la base de muchas compañías nuevas. nuevas .
Tabla 1.3 Eventos principales en la comercialización de nuevas biotecnologías. 1973
Primer gen clonado
1974
Primera exposición de un gen clonado en diferentes especies de bacterias.
1975
Anticuerpos monoclonales.
1976
Primera firma (Genetech) en explotar la tecnología del DNA recombinante (rDNA)
1980
Informe sobre biotecnología en el Reino Unido (Spink)
1981
Primer paquete de diagnostico con anticuerpos monoclonales aprobado en los Estados Unidos.
1982
Primera vacuna de origen animal producida por rDNA (colibacilosis) aprobada en Europa. Primer producto farmacéutico del rDNA, insulina humana.
Tabla 1.4 Nuevas técnicas en el avance de la biotecnología (según Dunnhill y Rudd1984) Cultivo de tejidos, células vegetales y animales. Fusión de protoplastos. Modificación estructural de proteínas (ingeniería de proteínas). Células y enzimas inmovilizadas.
Biosensores. Uso de las computadoras en fermentaciones. Nuevos diseños de biorreactores.
La técnica ha mostrado aplicación en el campo de la medicina en la generación de muchos sistemas diagnósticos, la producción de insulina humana y la hormona de crecimiento por bacterias y la producción de diversas vacunas. La ingeniería genética también ha tenido influencia en la agricultura y en la industria alimentaria. En la tabla 1.3 se muestra algunos conceptos de los principales sucesos que ha tenido lugar en la comercialización de la ingeniería genética. En la figura 1.4 se muestran otras técnicas que se están investigando en áreas importantes de la biotecnología. Estas incluyen: el cultivo de células vegetales y animales, las células o enzimas inmovilizadas , los sensores biológicos, un sensor que detecta materiales biológicos o una sonda que contiene materiales biológicos, la modificación estructural de proteínas (ingeniería de proteínas), el uso de computadoras en las fermentaciones y nuevos biorreactores. Este libro está basado en un curso breve de “biotecnología básica para ingenieros”, impartido en el wolfson institute of biotechnology (instituto de biotecnología de Wolfson). El curso intenta, en una semana, presentar a los ingenieros, directores y a otros profesionales no-biólogos, la caracterización principal de la biología y como se relaciona con la biotecnología, e incluso con otras prácticas y conferencias de personas eminentes que trabajan en la industria. No se debe esperar que el libro cubra la biotecnología en su totalidad, por ejemplo, no incluye una sección sobre anticuerpos monoclonales, pero debe servir como una introducción a un área fascinante y excitante como lo es la biotecnología.
BIBLIOGRAFIA Brown, C. M. Campbell, I., and Priest, F. G. (1987). Introduction to biotechnology. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Bu`Cock, J. and Kristiansen, B. (1987). Basic Biotechnology. Academic Press, London. Cooney, C. L. (1983).Bioreactors desing and operation. Science, 219,728.
Higgins, I. J., Best, D.J,. and Jones, J. (1985). Biotechnology. Blackwell Scientific Publications. Oxford. Dunnill.P. And Rudd, M. (1984). Biotecnology and British Industry. A report to the Biotechnology Directorate, SERC, London. Houwink (1984). A realistic view on biotechnology. European Federation of Biotechnology. Dechema, Frankfurt. Prave, p., Faust, U., SIttig, W., and Sukatsch, D. A. (1987). Basic Biotechnology. VCH, Weinheim. Smith, J. E. (1985). Biotechnology Principles. Van Nostrand Reinhold, England.
2.- ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR 2.1.- INTRODUCCION:
Todos los organismos vivientes, ya sean bacterias, levaduras, animales o vegetales, comparten muchas características comunes. Todos los organismos con la posible excepción de los virus, tienen una composición común que consisten en ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos ribonucleicos (RNA) y proteínas.la molécula de DNA es la que constitúyelos genes, los que a su vez contienen toda la información requerida para formar y controlar el organismo. La información contenida en el DNA se transfiere al resto del organismo para ejercer su función de la manera como la información almacenada en un disco de computadora necesita ser leída. El flujo de información desde el DNA hacia el resto de la célula esta mediada por moléculas de RNA, las cuales finalmente dirigen la síntesis de proteínas que, como componentes estructurales o como enzimas, dirigen y controlan muchas de las funciones del organismo. El proceso de transferir la información genética del DNA a las moléculas de RNA se conoce como transcripción: la transferencia de información desde la molécula molécula de RNA a las proteínas se conoce como traducción. Además de contener estos tres tipos de moléculas, los organismos realizan ciertas reacciones químicas comunes conocidas colectivamente como metabolismo. Para crecer y dividirse, se necesita un organismo para sintetizar sus propios constituyentes celulares a partir de substancias químicas externas y, para lograr esto, a menudo organismos diferentes difer entes tienen vías enzimáticas similares y una estructura celular básica. 2.2.- LOS COMIENZOS COMIENZOS DE LA MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA La microbiología es el estudio de los organismos que son demasiado pequeños para verlos a simple vista (menores de 0.1 mm) y que fueron descubiertos en el siglo XVII por Robert.
ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR.
ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO, DNA.
Transcripción ACIDO RIBONUCLEICO, RNA. Traducción Proteínas Tabla 2.1. Evolución de la microbiología Hook publica la micrographia, en la cual describe e ilustra la estructura celular del cerebro. Leeuwenhoek mejora las lentes del microscopio y descubre diversas formas de vida unicelular. Lázaro Spallanzani aporta evidencias de que los microorganismos no surgen espontáneamente. Wohler sintetiza la urea desmintiendo el punto de vista de que los compuestos orgánicos solo pueden ser sintetizados por organismos vivos. C. Cagniard-latour, th. Schwann y F. Kutzinzing proponen de manera independiente que las levaduras que aparecen durante la fermentacion son plantas microscópicas y son las causantes de esta. Schileiden y Schwann dan argumentos convincentes para la doctrina celular. Pasteur propone que todos los procesos fermentativos son el resultado de actividad microbiana y descubre los organismos anaerobios. Tyndall creó un método de esterilización por calentamiento discontinuo. Roberto Koch demuestra la causa bacteriológica o etiología del ántrax. Roberto Koch y su grupo introducen las técnicas de cultivo puro, incluyendo la caja de petri inventadas por Ricardo Petri. TIPOS DE ORGANIZACIÓN CELULAR
Hooke y Antony Van Leeuwenhock (tabla 2.1). Con el uso de microscopio simples. Leeuwenhoek describió diversos microorganismos, incluyendo las bacterias, con extraordinaria exactitud. Sin embargo, no fue sino hasta la mitad del siglo XVIII que Spatlanzani concluyo que dichos organismos eran llevados por el aire hacia las infusiones y que no se originaban espontáneamente. Pasteur demostró más tarde la presencia de microorganismo en el aire y que al excluirlo, las infusiones podían mantenerse estériles por periodos considerables. Antes de esto, Schwann y otros investigadores habían propuesto que los organismos están constituidos por células y que la fermentación alcohólica era causada por la presencia de células de levadura. Unos 20 años después, al estudiar un número considerable de fermentaciones, Pasteur propuso que todos los procesos fermentativos eran el resultado de la actividad microbiana y que podían proceder sin oxigeno. Mientras tanto, en Inglaterra, Tyndall había confirmado que los organismos provenientes del aire eran las causantes de las infecciones microbianas y que estas no se formaban por generación espontanea. Alrededor de 1876, Roberto Koch fundo la microbiología medico, quien mostro la causa bacteriana o etiología del ántrax. Esto fue confirmado después por Pasteur de manera independiente. Estos experimentos no solo demostraron que las bacterias eran la causa de ciertas enfermedades, sino que cada tipo producía una enfermedad específica, es decir, que existe especificidad biológica. El trabajo de kosh estableció muchos de los fundamentos de las técnicas de esterilidad que son la base de la microbiología moderna. La inoculación de bacterias sobre un medio solido, de modo que cada colonia formada que se hubiese originado de una bacteria individual, permitiéndose el uso y estudio de cultivos puros. Al principio el medio se solidificaba mediante la adición de gelatina, pero más tarde esta substituyo por agar, un extracto por polisacáridos obtenido de algas marinas. El medio solido de coloco entonces e una caja de petri, inventada por el italiano Petri y que ahora es de uso universal. 2.3.- TIPOS DE ORGANIZACIÓN CELULAR
Los organismos vivos se pueden dividir en dos reinos, los vegetales y animales multicelulares y los protistas y los virus (tabla 2.289). La estructura celular de ambos reinos ha permitido la división de los tipos celulares en dos grupos (sin incluir los virus). Tabla 2.2. Grupos componentes de los reinos de organismos Plantas
Animales
Multicelulares que muestran Semillas de plantas amplias diferencias.
Helechos
Vertebrados invertebrados
Musgos y hepáticas Protistas Unicelulares, cenocíticos o Algas multicelulares sin diferencian.
Protozoarios Hongos (levaduras) Bacterias y virus
Tabla 2.3. Diferencias entre células procariotas y eucariotas. PROCARIOTAS
EUCARIOTAS
Numero de cromosomas
1
>1
Membrana nuclear
-
+
DNA nuclear unido a histonas
-
+
DNA en organeros
-
+
ESTRUCTURAS GENETICAS
ESTRUCTURAS CITOPLASMATICAS
Naturaleza
de
los
ribosomas 70s
citoplasmáticos. Naturaleza de los ribosomas de los organelos. Mitocondrias CANTIDADES RELATIVAS DE DNA.
80s
Ninguna
70s
-
+
-
+
-5x10-15 g (1)
3x1012 o 0.5 x 10 12
Estos grupos son los eucariotas y procariotas; la diferencia entre ellos depende principalmente si los cromosomas (DNA) están contenidos en un núcleo n úcleo bien definido. En la tabla 2.3 se listan las principales diferencias entre los procariotas y los eucariotas en términos de su estructura celular y de contenido de DNA. Los procariotas contienen un solo cromosoma, en tanto que los eucariotas contienen muchos cromosomas, en tanto que los eucariotas contienen muchos cromosomas en una estructura unida a una membrana. El núcleo, en los eucariotas, el DNA contenido en los cromosomas esta unido a historias, proteínas básicas ausentes en los procariotas. proc ariotas. El DNA del núcleo en los eucariotas no es el único DNA presente en la célula, puesto que otras estructuras unidas a membranas, los mitocondrias y los cloroplastos, también contienen DNA, en estructuras rodeadas de membrana, conocidas como organelos, no se encuentran en procariotas. Los organelos también contienen a las estructuras capaces de sintetizar proteínas. Las cuales incluyen a los ribosomas de los procariotas (70 s), en tanto que los ribosomas toplasmicos miden 80 s (son unidades Svedberg). Los virus se incluyen con frecuencia en el grupo de los protistas. Los virus fueron detectados en 1892 por Iwanowski, quien demostró que el virus del mosaico de tabaco pasaba atreves de un filtro a prueba de bacterias y no podía ser cultivado por la genética, pero dependen de las células huésped preexistentes para su reproducción. En incapacidad para existir sin usar otras células, ha originado muchos argumentos cuanto así los virus son o no organismos vivos. Los virus afectan vegetales, animales y bacterias. 2.4.- PROCARIOTAS
Los procariotas representas las células más pequeñas del reino protista, el cual consiste en bacterias y algas verde- azules. az ules. El resto, algas, levaduras, hongos y protozoarios, protozoar ios, son: PROCARIOTAS Tabla 2.4. Características físicas y químicas de las células bacterianas. características
bacterias
levaduras
Forma de las
Bastón, esferas y
Elipsoides, esferas, Micelios, esferas.
células
espirales.
micelios, cadenas.
Tamaño de las
0.5-3 um
1-5%
células Presencia de esporas
Por ejemplo bacillus(aerobio)
mohos
5-15um, de diámetro; 50-5000um de largo.
En algunas
En algunos.
45-55%
25-55%
5-12%
5-10%
10-50%
10-50%
Por ejemplo, clostridium(anaeróbico)
COMPOSICION
65-75%
Proteína(N x 6.25)(nitrógeno total)
15-25%
Acido nucleído (RNA y DNA) Carbohidratos y li8pidos 1um=10-3 mm
5-30%
Eucariotas. En la tabla 2.4. Se comparan los protistas, las bacterias, los mohos y las levaduras, en cuanto a su forma, tamaño y composición. Las células bacterianas se presentan como bastones, b astones, esferas, cadenas y espirales (figura 2.2), que en general son s on más pequeñas que las levaduras y los mohos. Los tres grupos contienen organismos que pueden formar esporas cuando las condiciones son desfavorables. La composición de las bacterias nos muestra que contienen más proteínas y menos lípidos o carbohidratos que las levaduras o los mohos. Las diferentes formas de las bacterias se usan en las primeras etapas de la identificación, pero debido a la falta de otras características, se usan las nutricionales para una identificación más detallada. Según su fuente de energía, las bacterias y las algas verdeazules se pueden clasificar en cuatro categorías: 1) Organismos fotoautotrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energía y utilizan dióxido de carbono como una fuente de carbono. Este grupo incluye las algas verde-azules, pero también ciertas algas fotosintéticas (bacterias sulfurosas purpuras y verdes), así como c omo plantas superiores y algas verdes eucarísticas. e ucarísticas. 2) Organismos foto heterótrofos, los cuales dependen de la luz como fuente de energía, pero usan compuestos orgánicos como fuentes de carbono. Estos son las bacterias purpuras no sulfurosas. 3) Organismos quimioautotrofos, que dependen de varios compuestos químicos para obtener su energía, pero usan dióxido de carbono como una fuente de carbono. Esta capacidad se asocia con la de usar compuestos inorgánicos reducidos como H2S o HN3 para producir energía y está restringida a las bacterias. 4) Organismos quimiheterotrofos, que dependen y obtienen su energía su energía y moléculas de carbono de fuentes orgánicas. Estos representan el grupo más grande de bacterias y eucariotas y es muy diverso.
ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR
COCO
DOS COCOS
Por ejemplo, Micrococcus
Diplococcus
cocos en cadena Neisseria
Algas verde-azules
mixobacterias
Bacilo
Bacterias
Eubacterias
bacilo en cadena
Espiroqueta
Flagelos Escherichia coli
Bacillus megatrium
Rhodospinllum
Desulfovibrio
Bacteria anclada
Flagelo polar
Flagelo multiple
Caulobacter
Pseudomona fluorescencia
Proteus vulgaris
Si se combinan las características estructurales, la forma de movimiento y los grupos nutricionales, los procariotas se pueden dividir en cuatro grupos principales (tabla 2.5). De estos, las eubacterias son el más grande y de mayor interés en la biotecnología. En la figura 2.3. Se muestra un diagrama representativo de las células procarioticas. 2.4.1.- PARED CELULAR El citoplasma bacteriano está encerrado por una pared celular rígida altamente Estructurada que determina la forma de la célula. La eliminación de esta pared provoca, Tabla 2.5. Los cuatro grupos de procariotas.
espiroquetas Movimiento Pared celular
Por desplazamiento Desplazamiento
Filamento
o ninguno gruesa, delgada, flexible
axial delgado, flagelos
rígida
flexible.
rígida.
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
Ninguno
Endosporas
-
+
-
+
-
+
+
+
CELULAR Organización unicelular
+ +
filamentos micelio +
-
Mediante
FORMA DE LAS CÉLULAS Bastones. Esferas Espirales Células en reposo nutricional
+ + + -
Microquistes
Acinetas
Grupo -
Fotoautotrofo Fotoheterotrofos Quimioautotrofo Quimiheterotrofos.
+ + +
+
o
Que la célula adquiera una forma esférica conocida como protoplasto cuando la membrana celular tiene poca resistencia intrínseca. Si el protoplasma se coloca en un medio hipertónico, una solución más diluida que el citoplasma, se provoca una rápita captación de agua y, finalmente, la ruptura de la membrada. En las algas verde-azules, la pared celular se compone básicamente de celulosa, en tanto que en las bacterias la pared está formada por un polímero Único de amino-azúcar, peptidoglucano o murena. La composición química y la estructura del peptidoglicano, se muestran variaciones considerables entre diferentes organismos, aunque su estructura básica es la misma.
detinción que divida a las bacterias en los los grupos Gram-negativas. La composición general de la pared de las Gram positiva y gran negativa se muestra en la figura 2.5. Las bacterias Gram Positiva tienen una estructura básica de peptidoglucano unida a ácido teicoico, en tanto que las bacterias gran negativas tienen una membrana fuera de la capa de peptidoglunano que consiste en una bicapa de fosfolípidos fos folípidos con lipoplisacaridos y proteínas. La difencia entre las bacterias gram negativa y gram positiva detectadas por la tIntaciónGram, se puede correlacionar con otras características (tabla 2.7) como la
sensibilidad a la penicilina y a la digestión con lisozima. La penicilina es de muchos antibióticos que se sabe inhiben la síntesis te peptidoglucano al unirse a la enzima responsable del cruzamiento de las cadenas. Puesto que ninguna otra actividad biocinética es afectada, el crecimiento de las células continua, pero son incapaces de producir paredes celulares adecuadas y, por lo tanto, producen formas anormales y finalmente se lisan. Las células humanas y animales no contienen peptidoglucano por lo que son afectadas. La enzima lisozomaticas encontradas en la clara de huevo, las lágrimas y otras secreciones, rompen el enlace entre las unidades de ácido N-acetilmuránico y N-acetilglucosamina (figura 2.4).
En la parte exterior de la pared celular de algunas bacterias, se encuentran polisacáridos de alto peso molecular formando un gel hidrofilico, conocido como capsula (figura 2.3).El espesor de la capsula puede variar enormemente desde 10 nm hasta 1.o um, y puede varias de acuerdo con el aspecto fisiológico de la célula. La capsula no tienen una función bien definida, sin embargo muchos patógenos están encapsulados y os componentes de la capsula pueden ser antigénicos. N-acetilmuránico
N-acetilglucosamina
lisozima
Figura 2.4
Table 2.6 Tintcion de Gram
Procedimeinto
Tiempo
Gram +
Gram – *color cristal violeta y lavar
30s
purpura
purpura
con agua *colocsr yoduro de gran y lavar
30s
purpura
purpura con agua, secar con papel secante *aplicarle etanol al 95% y lavar con 20s
purpura
sin color
purpura
amarillo
agua, secar con papel secante *contrateñir con un color contraste, 15s por ejemplo amarillo
Tabla 2.7 Correlacionn de la tintacion de Gram con otras propiedades
Gram positiva
Sensibilidad a la penicilina
+
Digetsion por lisozima
Gram negativa
± +
-
Espesor de la pared
20-80nm
10nm
Contenido de lípidos de la pared
0-3%
11-22%
Acidoteicoico
+
-
Gram variedad de aminoácidos en la pared -
+
Ejemplo Escherichiacoli
Bacillus
(1nm = 10-6 mm)
2.4.2 Membrana citoplásmatica Debajo de la pared celular bacteriana esta una membrana de unos 40-80 °A de espesor. La membrana actúa como una barrera semipermeable que controla la captación y la liberación de materiales, ayudando a determinar la composición del citoplasma. Alrededor del año 1990 se descubrió el primer indicio de que los lípidos, moléculas orgánicas pequeñas insolubles en agua que incluyen a las grasas y aceites puedan ser un constituyente de las membranas biológicas. En las décadas de los años cincuenta, J.D Robertson propuso que la membranaconsistía en una capa externa de polisacáridos, una capa interna de proteínas, entre estas, una bicapa de lípidos conocida como unidad de membrana. La bicapa lípido consistía en fosfolípidos, moléculas de glicerol con extremo hidrófilo ( el fosfato) y un extremo hidrofilico (tallo de ácidos grasos), arreglados como una capa doble (figura 2.6). Hidrofilico (fosfatos)
BICAPA LIPIDICA bic
Hidrofo
FIGURA 2.6 Sin embargo, los adelantos de la microscopia electrónica (crio-fractura) revelaron un cuadro más complejo con proteínas asociadas a la membrana. Además, aparentemente las proteínas no están fijas en la capa de lípidos, sino que q ue están libres para moverse en la forma lateral. Estos descubrimientos surgieron el modelo actual para al membranas, el mosaicos fluido (figura2.7), el cual se aplica a membranas de todos los tipos.
Figura 2.7.Modelo del mosaico fluido para la membrana celular
En las bacterias, las membranas citoplasmáticas es la única estructura membranosa real, aunque existen una membrana similar en los eucariotas alrededor de estructuras como el núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos.
2.4.3 Flagelos Las bacterias pueden moverse en respuesta a varios estímulos o a compuestos químicos al alejarse de los estímulos o al acercarse a ellos. Se ha demostrado que muchos nutrientes simples, como los azucares y los aminoácidos provocan respuesta en las bacterias. El medio de locomoción principal de las bacterias es el flagelo. Éste es un cuerpo basal embebido en las membranas citoplasmática, una región en forma de gancho que se conecta a la base con un eje flexible y delgado (figura 2.8).El flagelo se compone de hebras de una proteína llamada flagelina. El ordenamiento de los flagelos en las bacterias determina s tipo de movimiento, a menudo se puede usase en su clasificación.
Figura 2.8 Cuando son vistos en el microscopio electrónico, pueden observarse otros apéndices sobre la bacteria, que consiste en delgados flagelos filamentosos conocidos como fimbrias o pilis, los cuales participan en la transferencia de material genético.
2.4.4 Esporas
El citoplasma de las bacterias contiene muy poca estructura separadas de uno o dos agregados de material nuclear. Sin embrago, se puede hallar una estructura que solo está en las bacterias Gram-negativa, la endoesporas. Cuando la condiciones son difíciles, o bien, en alguna etapa de ¿l ciclo de desarrollo, las bacteria forman una espora refractiva a partir de una invaginación de la membrana citoplasmáticas. La gruesa pared de las esporas les confiere resistencia al calor i a la desecación (figura 2.9).
Figura 2.9 Endoespora bacteriana
2.5 EUCARIOTAS .La célulaeucarísticaestá representada por plantas, animales, levaduras, algas y hongos. A pesar de la gran diversidad entre estas células, hay muchas características comunes comune s a ellas(figura 2.10), lo cual incluye un alto grado de complejidad interna. Las principales carteristasson :
2.5.1 Pared celular En los hongos, las levaduras y las algas. La celular está encerrada en una pared celular rígida que consiste principalmente en polisacáridos, los cuales le confieren una forma fija y la protegen del dalo mecánico y osmótico. La pared estabiliza la estructura celular y , en cuanto a los procariotas, pueden usarse como una característica taxonomía. Las levaduras
pueden tener forma casi esférica u oblonga ob longa y se divide pro gemación o fisión ( figura 2.11) 2.1 1) , en tanto que el crecimiento micelial se realiza por elongación, el cual puede incluir ramificación.
2.5.2 Estructuras de la membrana Las eucariotas están limitadas por una membrana de estructura similar a las de los procariotas. En cuanto a los eucariotas varían mucho muc ho en tamaño de las estructuras que rodena la membrana dentro de la célula (tabla 2.8).
2.5.3 Núcleo Las características mas sobresalientes de las células eucariotas es el núcleo, el cual contiene el DNA de la celular y esta limitado por la membrana. Dentro del núcleo se pueden ver áreas más densas, ricas en RNA, conocidas como nucléolos.
Figura 2.10 Estructura general de lsd células eucariotas.
2.5.4 Mitocondrias
La célula eucariota contiene estas estructuras, las cuales, a menudo son grandes, cilíndricas, encerradas por una membrana doble y contiene invaginaciones numerosas conocidas como crestas. La mitocondrias es le sitios principal de generación de energía y contiene su propio sistema sintetizado de proteínas y su propio DNA (figura 2.12)
2.5.5 Cloroplasto El cloroplasto también es una estructura rodeada por una membrana y , al igual que las mitocondrias. Contiene un sistema separado para la síntesis de pretinas y su propio
DNA. Como su nombre lo indica, los cloroplastos contiene el pigmento clorofila y en ellos se lleva a cabo la fotosíntesis.
2.5.6 Otras estructuras membranosas En la tabla 2.8. se describe un amplia variedad de otras estructuras membranosas, descritas en la misma, seencuentra en asl eucariotas: su origen se describeen la figura 2.13. El retículo endoplasma tico es una compleja de membranas que participan ne le almacenamiento y transporte intracelular de varios productos. El retículo endoplasma tico también puede tener muchos ribosomas unidos a su superficie y ser participe en la síntesis y secreción de proteínas. La mayoría de eucariotas contiene un complejo de membranas denominadas aparato o cuerpo de Golgi, algunas veces nombrado dictiosoma. Al igual que el retículo endoplasmático Tabla 2.8 Estructuras membranosas en eucariotas
Estructura
Función
Núcleo
Contiene la información genética de la célula (DNA)
Retículo endoplasmático
Una red complicada de membranas que funciona como sitio de la síntesis de proteínas.
Aparato de Golgi
Complejo de vesículas y membranas. Algunas veces llamado dictiosoma, responsable de la secreción desde la célula.
Lisosoma
Sacos membranosos que contienen enzimas digestivas.
Peroxisoma
Vesículas limitadas por membranas que contienen catalasa
Mitocondrias
Sitio de generación de energía, contiene su propio DNA
Cloroplastos
Sitio de fotosíntesis, se presentan solo en las plantas verdes, contiene su propio DNA
Plastidios
Las estructuras membranosas de plantas pueden contener aceites o pigmentos
el aparato de Golgi participa en la secreción de substancias de la célula en partículas enzimas. Las vacuolas se encuentran en muchos tipos de células, especialmente en plastas. A menudo se usan para almacenar enzimas o productos que podrían se disruptivos o tóxicos para la célula (las vacuolas pueden llegar a ocupar de 80 a 90% del volumen celular total). Muchas de las estructuras citoplásmicas descritas están en equilibrio dinámico y son sintetizadas y degradadas según sea requerido. Las diferentes estructuras parecen derivarse, ya sea directa o indirectamente, del retículo endoplasmático de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 2.13.
Figura 2.12 Mitocondria Envoltura
Retículo
Aparato de
Membrana
endo endo lasm lasmát átic ico o
Golgi
plasmatica
Lisosomas
Peroxisomas
Vesículas endociticas
Figura 2.13 Origen de algunas algunas estructuras membranosas membranosas
PROCESOS QUIMICOS DE LA CELULA
3.1 Introducción
En el capitulo anterior se considero la estructura de los sistemas celulares y los diferentes tipos de células que se encuentran en la naturaleza. Ahora es necesario considerar la constitución química de los componentes celulares principales, y como se sintetizan las unidades básicas de construcción de las estructuras a partir de los nutrientes disponibles en un medio de crecimiento adecuado. En este capítulo se examinara la química de las células vivas y se sentarán las bases para la comprensión de los capítulos posteriores, así como las rutas para la generación de la energía por estas reacciones biosintéticas.
3.2 Composición elemental
Todas las células vivas, incluyendo los microorganismos, requieren ciertos nutrientes para su crecimiento y desarrollo. Los nutrientes deben contener los elementos químicos que constituyen los materiales y estructuras celulares, así como aquellos elementos que son requeridos para el transporte a través de la membrana, la actividad enzimática y la generación de la energía necesaria para los procesos biosintéticos. El agua constituye el 80 y 90% del peso total. El resto de la célula se compone de carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, azufre y fosfato (en concentraciones mayores de 10-4M), además de unos 18 elementos más que con frecuencia se presentan en cantidades mínimas. La tabla 3.1 lista lo diez elementos principales encontrados en las células microbianas con detalles sobre su origen y requerimiento de la célula. El carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno, azufre y fosfato, constituyen la base de los componentes celulares como proteínas, lípidos, estructuras de membrana y ácidos
nucleicos. Sin embargo, estos elementos forman parte de componente relativamente estables y solo reaccionan lentamente con algun otro. Las reacciones químicas entre estos compuestos necesitan catalizadores biológicos denominados enzimas. Estas son proteínas que a menudo requieren de ciertos iones o elementos traza como componentes estructurales para ser catalíticamente activo (tabla3.2) las enzimas se mencionan con un sufijo después de la reacción o del sustrato. La mayor parte de los elementos se presentan como sales en los medios naturales como el suelo y el agua. Sin embargo, con frecuencia se necesita añadir fuentes solubles de estos elementos a los medios de cultivo de laboratorio o industriales. Algunos Algunos microorganismos, como por ejemplo Escherichia coli, pueden crecer en mezclas simples de estas es tas sales junto con una fuente de carbono y energía, mientras que otros, como Lactobacilli, necesitan otros compuestos que no pueden sintetizar por sí mismo. Los constituyentes inorgánicos de varios microorganismos se muestran en la tabla 3.3. Los microorganismos muestran cierta diversidad en cuanto a los componentes que pueden usar como fuentes de C, H, O, N y S. Así el azufre generalmente es tomado por las células como sulfato y residuos de sulfuro para propósitos biosintéticos. Sin embargo, algunas bacterias como Thiobacilli pueden crecer en compuestos con azufre reducidos como sulfuro, azufre elemental o tiosulfato que las usan como donadores de electrones, en tanto que los metanógenos crecen solamente en presencia de sulfuro de hidrogeno. El nitrógeno se presenta en la naturaleza en muchas formas como el amoniaco (NH3), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), compuestos orgánicos que contienen nitrógeno y nitrógeno molecular. La mayoría de los microorganismos pueden utilizar NH4+, el cual con frecuencia es el substrato preferido. Algunos organismos pueden usar NO3- el cual primero debe ser reducido a NH4+ antes de incorporarlo al material celular. El NO2-, un producto de la respiración anaerobia, que utiliza NO3- como aceptor de electrones ( Nitrosomonas Nitrosomonas sp.), pueden ser reducidos a NH4+ o a N2 por algunas bacterias desnitrificantes, o bien oxidado a NO3- por Nitrobacter sp. Nitrobacter sp. Ciertas bacterias “fijadoras de nitrógeno” pueden usar nitrógeno molecular como fuente de nitrógeno ( Rhizobium Rhizobium sp.), mientras que muchos microorganismos pueden utilizar complejos, fuentes orgánicas de nitrógenos, entre las que están los aminoácidos, ácidos nucleicos y aminas metiladas.
Los microorganismos pueden usar C, H y O, ya sea en forma de compuestos orgánicos o inorgánicos, incluyendo CO2, H2, H2S, NH4+, NO3-, NO2-, SO42-, etc. Con la posible excepción de liginica y ciertos polímeros orgánicos hechos por el hombre, casi todos los componentes con carbono son substratos potenciales para el crecimiento de microorganismos.
Elemento
Fuente
Función metabólica
C
Compuestos orgánicos, Co2
O
O2, H2O, compuestos orgánicos, CO2
H
H2, H2O, compuestos orgánicos
N
NH4+, NO3, N2, compuestos orgánicos
S
SO4 -, HS, S, S203, compuestos
Componentes de la cisteína,
orgánicos
metionica, pirofosfato de tiamina,
Componentes principales del material celular
coenzima A, biotina y ácido α-lipoico.
P
HPO4
-
Componentes de los ácidos nucleicos, ATP y otros nucleótidos, y fosfolipidos
K
K +
Principal catión orgánico dentro de la célula, cofactor de algunas enzimas.
Mg
Mg
+
Cofactor de muchas enzimas (particularmente cinasas), presente en paredes y membranas celulares
Ca
Ca
+
Cofactor de enzimas; presente en exoenzimas importantes, por ejemplo, amilasas, proteasas; componente importante de las endosporas
Fe
Fe +, Fe
+
Componente de los citocromos; proteínas fierro-azufres, por p or ejemplo, ferredoxinas; cofactor de muchas enzimas (por ejemplo, hidratasas)
Tabla 3.1 Elementos principales requeridos por las células microbianas
Elemento
Fuente
Función metabólica
Zn
Zn +
Componentes de la alcohol deshidrogenasa, fosfatasa alcalina, aldolasa, RNA y NA polimerasa.
Mn
Mn
+
Componente de la superóxido dismutasa bacteriana, PEP, carboxicinasa, citrato sintasa.
Na
Na+
Cl
Cl-
Mo
MoO4
Requerido por bacterias halofílicas -
Componentes de la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato deshidrogenasa.
Se
SeO3
Co
Co +
-
Componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasa. Componente de la vitamina B12 y enzimas con vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa)
Cu
Cu +
Cr
CrO4
Ni
Ni
+
Componente del citocromo oxidasa y oxigenasas +
Componente de algunas formato deshidrogenasas Componente de la ureasa y del crecimiento autótrofo de bacterias que oxidan hidrogeno.
Tabla 3.2 Elementos trazas requeridos por las las células microbianas
Elemento
Bacterias
Hongo (g/100Gg
Levadura
de esp seco) P
2.0-3.0
0.4-4.5
0.8-2.6
S
0.2-1.0
0.1-0.5
0.01-0.24
K
1.0-4.5
0.2-2.5
1.0-4.0
Mg
0.1-0.5
0.1-0.3
0.1-0.5
Na
0.5-1.0
0.02-0.5
0.01-0.1
Ca
0.01-1.1
0.1-1.4
0.1-0.3
Fe
0.02-0.2
0.1-0.2
0.01-0.5
Cu
0.01-0.02
-
0.002-0.01
Mn
0.001-0.01
-
0.0005-0.007
Mo
0.001-0.01
-
0.0001-0.0002
7-12
2-8
5-10
Total de cenizas
Tabla 3.3 Constituyentes inorgánicos de varios microorganismos microorganismos
3.3 Los nutrientes como fuentes de energía:
Los nutrientes requeridos por microorganismos no son para reacciones biosintéticas que dan lugar al crecimiento celular, sino también funcionan como fuentes de energía para “alimentar” los procesos biosintéticos metabólicos que demandan energía. Los
microorganismos se pueden clasificar por la naturaleza de las fuentes de carbono y energía que pueden utilizar. Los organismos que utilizan luz como fuente de energía se denominan fotótrofos, mientras que aquellos que obtienen su energía de reacciones químicas se denominan quimiótrofos.
3.3.1 Fotótrofos:
Es común que los fotótrofos utilicen CO2 como fuente celular de carbono, en cuyo caso se denominan fotoautótrofos. Durante el crecimiento, el CO” debe ser reducido al nivel de la
materia celular usando donadores de electrones que con frecuencia son inorgánicos, tales como el hidrogeno molecular o compuestos de azufre reducidos. Cuando los organismos crecen de esta manera se denominan fotolitótrofos (tabla 3.4). Alternativamente, algunos fotótrofos (tabla3.4) pueden usar la luz como fuente de energía para su crecimiento y fuentes de carbono carbon o orgánicas como succinato o acetato. acetato . En este caso, el substrato orgánico aporta los electrones para las reacciones de reducción y el organismo crece como fotoorganótrofo. El substrato orgánico aporta también carbono celular en lugar de CO2. En consecuencia, los organismos crecen como heterótrofos. Así, la autotrofía y la heterotrofía reflejan la naturaleza de la fuente de carbono, en tanto que el litótrofo y el organótrofo reflejan la naturaleza del aceptor de electrones.
Tipo Fotolitotrofía
Donador de
Fuente de
electrones
carbono
H2O, H2S, S, H2
CO2
Organismo Plantas, algas verde azules, Chromatiaceae, Chlorobiaceae
Fotoorganotrofía
Orgánico
CO2
Rhodospirillaceae
Tabla 3.4 Crecimiento fototrófico fototrófico
3.3.2 Quimiótrofos:
Muchos microorganismos obtienen energía (ATP) para su crecimiento mediante reacciones de óxido reducción de la forma:
Xred + Aox
Xox + Ared
Donde un substrato se reduce a expensas del otro. La mayoría de las levaduras, hongos y organismos superiores utilizan donadores de electrones orgánicos (Xred) y O2 como aceptor de electrones. Las bacterias, sin embargo, pueden usar NO3-, SO42- o CO32- como aceptor de electrones en lo que se denomina respiración anaerobia, compuestos orgánicos (fermentación anaerobia) u O2 (respiración). El donador de electrones, Xred, puede ser orgánico o inorgánico (por ejemplo H2, H2S, Fe2+, NO2- o NH4+). Los organismos que utilizan un donador de electrones orgánico se conocen como quimioorganótrofos, en tanto que los que utilizan donadores inorgánicos se llaman quimiolitótrofos (tabla 3.5). Los quimiolitótrofos también son quimioautotrofos, ya que generalmente usan CO2 como fuente de carbono y no metabolizan un compuesto organico. Sin embargo, también puede crecer en forma aeróbica como quimioorganótrofos (por ejemplo las bacterias que oxidan hidrogeno y algunos thiobacilli), mientras que Nitrosomonas y Thiobacillus Thiooxidans son quimiolitótrofos obligados.
Tipo Quimiolitotrofía
Donador de
Aceptores de
electrones
electrones
H2S, S, H2, Fe
+
CO2,O2, NO3-
Organismo Bacterias oxidantes del hidrogeno, tiobacilos, Th. Desnitrificantes, Ntrosomas, metanogeno.
Quimioorganotrofía
Orgánico
O2, NO3-, SO4 -, Pseudomonads, bacillin Organico
levaduras, bacillus lincheniformis, bacterias
reductoras del sulfato, bacilos del acido lactico Tabla 3.5 Crecimiento quimiotrófico quimiotrófico
3.4 Otros requerimientos para el crecimiento:
La mayoría de las levaduras y las algas pueden sintetizar los componentes orgánicos necesarios para su crecimiento a partir de la fuente de carbono. Muchas bacterias no pueden hacer esto y necesitan la presencia de factores de crecimiento específicos en el medio, además de una fuente de carbono y energía. El requerimiento más común son las vitaminas, las cuales se necesitan en cantidades extremadamente pequeñas como cofactores para varias enzimas. Así, Clostridium kluyveri requiere un medio complementado con biotina y acido p-aminobenzoico. Ciertas bacterias lácticas tienen necesidades muy estrictas de prácticamente todos sus aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. En consecuencia, estos organismos realmente pueden crecer en un medio en el que no se conoce la concentración de uno de estos nutrientes necesarios para el crecimiento. El grado de crecimiento esta relacionado directamente con la concentración del nutriente esencial. Esto constituye la base del ensayo microbiológico. En la tabla 3.6 se listan algunas vitaminas y compuestos relacionados que a menudo se necesitan para el crecimiento.
Tabla 3.6 Vitaminas y compuestos relacionados requeridos para el crecimiento Compuesto
Función metabólica
Acido p-aminobenzoico Precursor del Tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de carbono. Biotina
Coenzima que participa en las reacciones de carboxilacion.
Acido fólico
Tetrahidrofolato necesario en la transferencia de unidades de carbono.
Acido nicotínico
Precursor de NAD y NADP.
Acido pantoténico
Precursor de coenzima A(portador de grupos acilo)
Piridoxina (vit. B₂)
Fosfato Fosfato de de pirido piridoxal xal usado usado en reacc reaccion iones es de trans transamin aminaci ación ón y decarb decarboxi oxilac lacii
Riboflavina (vit. B₆)
Componente de los grupos prostéticos FMN y FAD de las flavoproteínas.
Tiamina (vit. B₁)
Componente del pirofosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y transcetolasas.
Cian Cianoc ocob obal alam amiina (vit (vit.. B Coenzima que interviene en reacciones de rearreglo(glutamato mutasa). Vitamina K
Precursor de la menaquinona un portador de electrones (por ejemplo, fumarato reductasa).
Coenzima M
Interviene en la metanogénesis.
3.5 COMPONENTES ESTRUCTURALES BÁSICOS DE LA CÉLULA Las células microbianas, como todos los sistemas vivos con excepción de los virus, se componen de carbohidratos, grasas, lípidos y ácidos nucleicos. Estos materiales se forman a partir de las unidades básicas de construcción o productos metabólicos primarios, a saber, monohidratos, ácidos grasos, aminoácidos y nucleótidos (o nucleósidos) y, por otras reacciones metabólicas, se convierten en los componentes estructurales principales de células, como paredes celulares, membranas, enzimas, proteínas estructurales y DNA o RNA.
3.51 Carbohidratos Son compuestos orgánicos con fórmula general (CH₂O)n, donde n>3. Existen dos formas principales de carbohidratos, los monosacáridos mon osacáridos y los polisacáridos. Los monosacáridos o azúcares simples, son los carbohidratos más pequeños que contienen entre 3 y 9 átomos de carbono y son las unidades de construcción de los polisacáridos. La D-glucosa (hace girar la luz polarizada en el plano de la dirección +) es el monosacárido mas común. Se compone de 6 átomos de carbono carbo no y, al igual que otros azúcares, es un derivado polihidroxialcohol (figura 3.1)
Aldolasas Aldolasas
Cetosas
CHO TRIOSA
CH 2OH
HCOH
C=O CH 2OH
CH 2OH D-gliceraldehído PENTOSA
Dihidroxiacetona CH 2OH
CHO
COH HCOH
C=O
H COH
HCOH
HCOH
HOC H CH 2OH
CH 2OH D-ribosa
HEXOSA
D-ribulosa
CHO
CHO
HOC H
HOC H HCOH
HCOH
HCOH
HCOH
D-manosa
C=O HOC H
HOC HOC H
HCOH
HCOH COH
HCOH
CH 2OH
CH 2OH
CH2OH D-glucosa
HCOH COH HOC HOC H
HOC H
HCOH
CH2OH
CHO CHO
D-galactosa
CH 2OH
D-fructuosa
Figura igura 3.1 Azúcares Az úcares aldosas aldosas y cetosas
Para muchos microorganismos la D-glucosa es el compuesto base que se metaboliza para formar los demás componentes celulares. La mayoría de los microrganismos (particularmente las levaduras), pueden crecer en glucosa, la cual se transporta a través de la membrana hacia la célula de difusión pasiva, transporte activo o translocación de grupo. Cuando hay polisacáridos en el medio, es común que sean hidrolizados a unidades de glucosa por enzimas extracelulares (invertasas, celulasas, amilasas, aminoglucosidasas) antes de ser transportados hacia la célula. Los monosacáridos se clasifican como aldosas o cetosas (figura 3.1). Así, la glucosa es una aldohexosa (aldo=azúcar aldehído; hexosa=6 átomos de carbono). Hay dos formas de glucosa (y otros azucares) llamadas formas D- y L- (figura 3.2 (a)),
CH2OH
CHO H
C
OH
HO
C
H
H
C
H
C
HO H
C
CH3
OH
HO
C
H
OH
HO
C
CH2OH D-glucosa
a)
H
CH 2OH
L-glucosa
formas de cadena recta
α-D-glucosa
b)
C H
β-D-glucosa
formas en anillo (piranosas)
Figura 3.2 Formas estructurales d e la glucosa que son imágenes especulares entre si. Los azucares de origen natural por lo general son de la forma D-. La D-glucosa se presenta principalmente como una estructura de anillo, denominada la forma piranosa (figura 3.2 (b)), en la que α- y β- representan la posición del grupo – OH OH del átomo
de carbono 1. La unión de otros grupos químicos a la estructura básica, da lugar a una variedad de derivados de azúcar que incluye alcoholes (glicerol, sorbitol, etc.), ácidos (acido glucónico, acido glucorónico), fosfatos (glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato), desoxiazúcares (desoxirribosa, figura 3.3) y aminoazúcares (glucosamina, galactosamina, acido N-acetilmurámico). Estos son componentes importantes comunes de la estructura de la célula microbiana.
HOCH
O
HOCH
H
H H OH H OH OH D-ribosa
H
H
O
H H
OH
OH H
D-desoxirribosa
Figura Figura 3.3 3.3 Azúc ares pentosas importantes
Bajo la influencia de enzimas, los monosacáridos se pueden condensar entre si para formar polisacáridos. El grupo – OH OH sujeto al átomo de carbono en la posición 1 de la molécula de glucosa, es relativamente reactivo y se puede condensar con el grupo – OH OH en la posición 4 ó 6 de otro azúcar par producir un disacárido con un enlace α- (o β-) 1,4 glucosídico (figura 3.4)
α-D-glucosa
α-D-glucosa
α-maltosa
Figura 3.4 Formación de enlaces (α-1, 4) glucosídicos Si las unidades de glucosa se polimerizan aun más mediante la formación de enlaces α-1, 4-
glucosídicos se obtiene un polímero de cadena recta con un peso molecular de hasta 500.000, denominado amilosa (un componente del almidón: figura 3.5). La amilopectina (el componente principal del almidón) se compone de unidades de α-D-glucosa unidas por enlaces α-1, 6-
glucosídicos. La molécula completa de almidón (un polisacárido común de almacenamiento) es una combinación de amilosa y amilopectina (figura 3.5). El glicógeno, un polímero común de almacenamiento en bacterias y levadura, tiene una composición similar al almidón, excepto que esta mucho mas ramificado que la amilopectina, con ramificaciones α-1, 6 que aparecen cada 8-10 residuos de glucosa.
El dextrano es otro polisacárido importante de almacenamiento microbiano, similar al almidón y al glucógeno, que esta formado de unidades de D-glucosa unidas principalmente por enlaces α-1, 6-glucosidicos. Sin embargo, los puntos de ramificación son característicos de las especies y
pueden ser enlaces α-1, 2, α-1, 3 o α-1, 4. Los dextranos forman soluciones viscosas que tienen
aplicaciones amplias en la industria como lubricantes, en la separación de moléculas orgánicas por filtración y cromatografía de intercambio iónico, etc.
Un polisacárido estructural importante es la celulosa, la cual contiene más del 50% del carbono orgánico total de la biosfera. La madera contiene aproximadamente 50% de celulosa, en tanto que el algodón es casi celulosa pura. Se compone de unidades de D-glucosa unidas por enlaces β-1, 4 (figura 3.6) y es el componente principal de las células
Figura 3.6 Estructura de la celulosa. vegetales y las algas. El potencial de la hidrolisis física o enzimática de la celulosa (papel de desecho, periódico, viruta, residuos de cosecha) seguidas de una fermentación posterior para la producción de biomasa o alcohol, representa repr esenta uno de los mayores desafíos a la industria biotecnológica. Las paredes celulares bacterianas están formadas de un péptido polisacárido complejo llamado peptidoglicano o mureína (figura 2.7). Esteconsiste en cadenas paralelas de polisacárido compuestas de un disacárido de N-acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurámico unidos por enlaces β-1, 4-glucosidicos. En el grupo hidroxilo del acido láctico unido al ácido murámico, se
encuentra una cadena lateral de tetrapéptido compuesta de L-alanina, D-alanina, acido Dglutámico y acido diaminopimélico o L-lisina (figura 3.7. La D-alanina terminal de la cadena péptida lateral de un polisacárido
Figura 3.7 Componente peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas. puede unirse con la cadena peptídica de otra cadena c adena de polisacárido, ya sea directamente o a través tr avés de otra cadena polipetídica corta (en Staphylococcus aureus, esta cadena de polipéptido se compone de 5 unidades de glicina). Por lo tanto, el peptidoglicano consiste en cadenas de polisacáridos paralelas con muchas uniones entre las cadena que le confiere fuerza y rigidez a al pared celular. La enzima lisozima hidroliza los enlaces β-1, 4 del peptidoglicano para producir disacáridos de N-
acetil-D-glucosamina y acido N-acetilmurámico a los cuales están unidos los péptidos (figura 3.7). Este es uno de los métodos usados para obtener protoplastos de bacterias gram +. La penicilina, un antibiótico importante, inhibe la formación de los entrecruzamientos peptídicos de las cadenas de polisacáridos, formando así paredes celulares débiles.
3.52 Grasas y lípidos Los lípidos son compuestos orgánicos insoluble en agua localizados en todas las células vivientes, pero son solubles en solventes no polares como el benceno y el éter.
Tienen cuatro funciones principales: 1)como componentes estructurales de las membranas: 2) como materiales de almacenamiento intracelular cuya oxidación produce energía para el crecimiento; 3) como fuente de combustible (energía) transportable; 4) como componente protector de paredes celulares de las bacterias, b acterias, las hojas de las plantas y la piel de los vertebrados. vertebr ados. Las grasas y lípidos se componen de ácidos grasos de los cuales se han aislado más de 70 tipos diferentes. Los ácidos grasos se componen de una cadena larga de hidrocarburo con un grupo de carboxilo terminal con la forma general mostrada en la figura3.8, donde n esta, por lo general, entre 12 y 20. La cadena de hidrocarburo puede O H3C
(CH (CH 2)n C OH
Figura 3.8 Fórmula general de los ácidos grasos. ser saturada (sin enlaces dobles) o insaturada (uno o mas enlaces dobles). Los ácidos grasos difieren principalmente en la longitud de la cadena y en el número y en la posición de los dobles enlaces. Algunos de los ácidos grasos más importantes y comunes se muestran en la tabla 3.7. Casi todos los ácidos grasos naturales tienen un numero par de átomos de carbono y se llaman saturados si no tienen dobles en laces. Los ácidos grasos insaturados presentan uno o más dobles enlaces (tabla 3.7). Si bien las plantas y animales superiores tienen predominantemente ácidos grasos insaturados de 14 a 22 átomos de carbono; los microorganismos, y en particular las bacterias tienen tipos más simples de 12 a 18 átomos de carbono car bono y ácidos grasos insaturados C₁₆ o C₁₈. En las bacterias no se han encontrado ácidos grasos con más de un enlace doble. Los ácidos grasos solo se encuentran en pequeñas cantidades en forma libre. Se localizan en materiales estructurales y de almacenamiento como esteres de glicerol (glicéridos o acilgliceroles) o como fosfoésteres de glicerol (fosfoglicéridos o fosfolípidos). Los glicéridos son la forma de almacenaje principal de grasas en los microorganismos, plantas y animales. Tabla 3.7 Algunos de los ácidos grasos naturales comunes.
Estructura de átomos de carbono
Nombre común
Temperatura de ebullición (°C)
Saturado 12
CH₃(CH₂)₁₀COOH
Acido láurico
44.2
14
CH₃(CH₂)₁₂COOH
Acido mirístico
53.9
16 CH₃(CH₂)₁₄COOH
Acido palmítico
63.1
18
Acido esteárico
69.6
20 CH₃(CH₂)₁₈COOH
Acido araquídico
76.5
24 CH₃(CH₂)₂₂COOH
Acido lignocérico
86.0
Palmitoleico
-0.5
Oleioco
13.4
Linoleico
-0.5
Linolénico
-11.0
Araquidónico
-49.5
CH₃(CH₂)₁₆COOH
Insaturados 16
CH₃(CH₂)₅CH= CH₃(CH₂)₇COOH
18
CH₃(CH₂)₅CH=
CH₃(CH₂)₇COOH 18
CH₃(CH₂)₅CH=
CHCH₂CH=CH(CH₂)₇COOH 18
CH₃CH₂CH=CHCH₂
CH=CHCH₂CH=CH (CH₂)₇COOH 20
CH₃(CH₂)₄CH=CH
CH₂CH=CHCH₂CH= CHCH₂CH=CH(CH₂)₃ COOH
Hay tres clases de glicéridos, dependiendo del número de ácidos grasos (o grupos acilo) esterificados en la molécula de glicerol (figura 3.9):
1-monoacilglicerol (monoglicérido);
1, 2-diacilglicerol (diacilglicérido);
1, 2, 3-triacilglicerol (triglicérido).
Los más comunes en la naturaleza son los triacilgliceroles. La clase de triacilglicerol depende del tipo y posición de los ácidos grasos esterificados en relación relación con el glicerol, por ejemplo, triesteroilglicerol. Los fosfoglicéridos se encuentran casi exclusivamente en las membranas celulares, siendo escaso en grasas de almacenamiento. Son similares en estructura a los glicéridos excepto que uno de los grupos alcoholes primarios del glicerol esta fosforilado mas que esterificado con un acido graso. Así, el componente básico de los fosfolípidos es el glicerol-1-fosfato o el glicerol-3-fosfato, al cual están unidos dos ácidos grasos. Los fosfoglicéridos (figura 3.10) poseen una cabeza polar (hidrofílica) y otras dos cabezas hidrocarbonadas no polares (hidrofóbicas) y, por tanto, se denominan lípidos antipáticos. Así, en solución acuosa, es fácil que formen micelas con las regiones polares de un grupo de fosfoglicéridos en contacto con el agua, en tanto que las cadenas
Procesos químicos de la célula
Laterales no polares se agrupan entre sí (figura 3.11.). En interfases aire-agua, los fosfogliceridos formaran monocapas, mientras que en solución, particularmente en aperturas que separan dos compartimentos acuosos, forman con facilidad bicapas de aproximadamente 70 Å de espesor (figura 3.11). Estas bicapas son muy similares a las de las membranas celulares, las cuales permiten el paso libre de agua pero son impermeables a varios iones. En la tabla 3.8 se listan algunos de los fosfogliceridos más comunes de los microorganismos.
3.5.3 Esteroides Los lípidos complejos, los cuales no son saponificables, incluyen a la clase bioquímicamente importante de los esteroides. Los esteroides se obtienen de d e una estructura básica (figura 3.12). Los animales sintetizan un gran número n úmero de esteroides, los cuales tienen
diversos papeles fisiológicos y bioquímicos, incluyendo a su función como hormonas. Algunos ejemplos son: colesterol, cortisona y testosterona.
3.5.4 Proteínas Las proteínas son las moléculas orgánicas mas abundantes de las células vivas, comprendiendo entre el 30% y el 70% del peso seco total de las células. Son componentes celulares muy importantes puesto que son copiados de la información genética de la célula y, posteriormente, dirigen la maquinaria metabólica de ella. ella.
Componentes estructurales básicos de la célula
Las proteínas se componen invariablemente de carbono, oxigeno y nitrógeno; casi todos contienen azufre. Además, algunas proteínas contienen otros elementos como fierro, fosforo, zinc y cobre. El peso molecular de las proteínas varía desde 5000 hasta más de 40 millones. Sin embargo, ciertas cadenas peptídicas, como las que se asocian con el peptidoglucano,
constan de pocos aminoácidos con pesos moleculares tan bajos como 240. Las proteínas y péptidos se componen de α-aminoácidos, los cuales representan las unidades de
construcción de las proteínas. Existen 20 α-aminoácidos comunes (tabla 3.9) unidos entre si mediante enlaces peptídicos (figura 3.13) para formar polímeros grandes, no ramificados o cadenas polipetídicas. Los enlaces peptídicos se forman por una reacción de condensación
entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de un segundo aminoácido (figura 3.13). El numero y secuencia de los residuos aminoácidos en una cadena polipeptídica (proteína) determinan la función y la actividad catalítica (si existe). El peso molecular promedio de un aminoácido es 138. Sin embargo, puesto que se pierde una molécula de agua en la formación de un enlace peptídico, el peso molecular promedio de un residuo de aminoácido en una proteína es de 120. Las proteínas se dividen en dos categorías principales: proteínas simples y conjugadas. Las proteínas simples se componen solamente de aminoácidos con aproximadamente 50% de carbono, 7% de hidrogeno, 23% de oxigeno, 16% de nitrógeno y más de 3% de azufre. Las proteínas conjugadas contienen, además de los aminoácidos, otro material orgánico o inorgánico llamado el grupo prostético de la proteína. Estas proteínas conjugadas se clasifican de acuerdo a la composición química del grupo prostético. Así, las nucleoproteínas contienen acido nucleico; las lipoproteínas contienen lípido o fosfolípido; las glicoproteínas contienen carbohidratos; las hemoproteínas contienen una estructura de porfirina asociada con fierro; las flavoproteínas contienen grupos flavin y las metaloproteínas contienen iones metálicos. La estructura y, en consecuencia, la función de una molécula de proteína, está gobernada no solo por su composición de aminoácidos, sino también por su forma tridimensional característica o conformación. Muchos de los aminoácidos tienen cadenas laterales ya sea hidrofóbicas (no polares) o hidrofílicas (polares), que determina la manera en la cual se dobla una molécula de proteína. Además, el aminoácido cisteína contiene un grupo sulfhidrilo (- SH) que puede reaccionar con otra cisteína para formar un enlace sulfhidril covalente (figura 3.14). estos enlaces, junto con fuerzas de van der waals, puentes de
hidrogeno e interacciones polares, son los causantes de la conformación tridimensional de una proteína. Existen dos conformaciones principales de las proteínas (figura 3.15): 1) Fibrosas 2) Globulares Las proteínas fibrosas son más fuertes físicamente y son insolubles en agua o soluciones acuosas diluidas. Se componen de cadenas polipetídicas arregladas en paralelo a lo largo de un solo eje para formar fibras grandes o laminas (figura 3.15). Representan los componentes estructurales básicos del pelo (queratina), cuero, uñas, colágeno y tendones de los animales superiores, así como de los flagelos, cilios y pilis de los microorganismos. Las proteínas globulares consisten en cadenas polipetídicas estrechamente empaquetadas dobladas en formas esféricas o globulares (figura 3.15). Por lo general, son solubles en solución acuosa y se difunden con rapidez. En consecuencia, son bastante móviles en el citoplasma celular y, a menudo, tienen una función catalítica (enzimas). Por lo tanto, la mayoría de las enzimas y proteínas de transporte son proteínas globulares. Se observa que hay tres niveles diferentes de estructura proteínica, las cuales se pueden resumir como sigue:
Componentes estructurales básicos de la célula
1) estructura primaria. Secuencia de los residuos de aminoácidos unidos por medio de enlaces peptídicos. 2) Estructura secundaria. Se refiere a la forma de la extensión o del enrollamiento helicoidal de la cadena polipeptídica, en particular en las proteínas fibrosas, la cual es resultado principalmente del establecimiento de puentes de hidrogeno entre los aminoácidos. 3) Estructura terciaria. Se refiere al doblamiento y curvatura de la cadena para formar proteínas globulares inducidas por enlaces disulfuro disulf uro covalentes, puentes de hidrogeno o enlaces salinos e interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas.
4) Estructura cuaternaria. Es la manera en la que las cadenas polipetídicas individuales se reúnen para formar una proteína multimérica. Los enlaces responsables del establecimiento de la estructura cuaternaria son similares a los mencionados en 3). Las proteínas que tienen más de una cadena polipeptídica se denominan proteínas o protómero. multiméricas u oligométricas, y cada polipéptido se conoce como subunidad o
Procesos químicos de la célula
En general, la mayoría de las proteínas grandes tienen dos o más subunidades que pueden o no poseer ningún enlace covalente entre ellas. Ejemplo de proteínas oligoméricas son las enzimas, hexocinasa de las levaduras (4 subunidades), triptófano sintetasa (4 subunidades), lactato deshidrogenasa (4subunidades) y la sintetasa de ácidos grasos (21 subunidades), aunque la ribonucleasa y la lisozima poseen una sola subunidad. De ordinario, las subunidades están asociadas estrechamente, aunque puede no haber enlaces
covalentes. En consecuencia, la proteína actúa como una sola molécula y, de hecho, casi siempre se requieren todas las subunidades para el funcionamiento óptimo de la proteína. En la tabla 3.10 se listan algunas de las proteínas que se encuentran más comúnmente en la naturaleza y su función. Una de las clases principales de proteínas son las enzimas, las cuales funcionan como catalizadores biológicos. Esta clase de proteínas se considerara con más detalle en el capítulo sobre “Cinética enzimática”.
3.5.5 Ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos se componen de nucleótidos y participan en el almacenamiento, replicación, transcripción y transferencia de la información genética. Los nucleótidos también tienen funciones importantes en el metabolismo, particularmente en reacciones de transformación de energía. Los nucleótidos sirven como enzimas portadoras de energía, como coenzimas en la transferencia de acido acético, azucares, aminas y otras moléculas y como enzimas en reacciones de oxido reducción. Los mononucleótidos se componen de una base nitrogenada, un azúcar de 5 carbonos y acido fosfórico. Hay dos clases de bases nitrogenadas: las pirimidinas y las purinas. En los nucleótidos se encuentran comúnmente tres bases pirimídicas: uracilo, timina y citocina (figura 3.16) y, en una cantidad menor 5-metilcitocina y 5-hidroximetilcitocina. Hay dos bases púricas principales, a saber: adenina y guanina (figura 3.16) y formas menores como 2-metiladenina y 1-metilguanina. Los nucleósidos son similares a los nucleótidos excepto que carecen del grupo fosfato unido en la posición 5 del anillo de la ribosa (azúcar de 5 carbonos). Hay dos tipos de nucleósidos: los ribonucleósidos que contienen D-ribosa como el componente azúcar y los 2´-desoxirribonucleosidos, que contienen 2-desoxi-D-ribosa (figura 3.17). los cuatro ribonucleósidos principales son la 2´-desoxiadenosina, 2´-desoxiaguanosina, 2´desoxicitidina y 2´-desoxitimidina. Estos nucleósidos no se encuentran en cantidades apreciables en forma libre dentro de las células.
Los nucleótidos son ésteres de nucleósido con acido fosfórico y, otra vez, son de dos tipos, a saber: los ribonucleótidos, que contienen D-ribosa y los desoxirribonucleótidos, los cuales contienen 2´-desoxi-D-ribosa. Es común encontrar a los nucleótidos en forma libre en el interior de las células. Los ribonucleótidos son los constituyentes principales (“bloques de construcción”) de ácidos ribonucleicos (RNA) y los desoxirribonucleótidos
de los ácidos desoxirribonucleicos (DNA). El grupo de acido fosfórico, en general, se encuentra unido en la posición 5 de la D-ribosa o de la 2´-desoxi-D-ribosa, pero puede asociarse con las posiciones 2´o 3´e incluso formar grupos de acido fosfórico cíclicos, en forma notable, la adenosina-3´, 5´-monofosfato (AMP cíclico), cíclico), la cual cual es un compuesto importante en la regulación del metabolismo (figura 3.18). Los ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos pueden existir dentro de la célula como 5´monofosfatos (nucleótidos), 5´-difosfatos y 5´-trifosfatos (figura 3.19). Estos grupos fosfato forman complejos con Mg2+ y Ca2+ dentro de la célula y tiene funciones muy importantes. La ATP (adenosina-5-trifosfato) es el portador primario de energía en la célula, que transfiere energía desde reacciones catabólicas (oxidativas) a reacciones anabólicas (biosintéticas) (ver capitulo 6). Los nucleósidos di- y tri- fosfatos sirven también como portadores de moléculas especificas. Así, la UDP (uridina difosfato) es un portador específico de residuos azúcar en la síntesis de polisacáridos, esto es, como UDP-glucosa para la biosíntesis de glucógeno. Los nucleósidos trifosfato funcionan también como precursores de unidades de mononucleótidos para la síntesis de DNA y RNA. Existe gran cantidad de otros mononucleótidos importantes que contienen bases que no se encuentran en los ácidos nucleicos. La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y su forma fosforilada (NADP), así como la flavina mononucleótido (FMN) y la flavina adenina dinucleótido (FAD) (figura 3.20 y 3.21), son compuesto cuya función
Proteína
Localización o función
Enzimas
Ribonucleasa
Hidroliza RNA
Citocromo C
Transfiere electrones
Tripsina
Hidroliza algunas proteínas
Hexocinasa
Fosforila glucosa y azucares relacionados
Amilasa
Hidroliza almidón y glucógeno
Proteínas de almacenamiento
Ovoalbúmina
Proteína de la clara de huevo
Lactoalbúmina (caseína)
Proteína de la leche
Proteínas de transporte
Hemoglobina
Transporta O2 en la sangre
Mioglobina
Transporta O2 en el músculo
Albumina de suero
Transporta ácidos grasos en la sangre
Proteínas contráctiles
Miosina
Filamentos estacionarios en las miofibrillas
Actina
Filamentos móviles en las miofibrillas
Dineína (flagelina)
Cilios y flagelos
Proteínas protectoras
Anticuerpos
Forman complejos con proteínas extrañas
trombina
Componente del mecanismo de coagulación de la sangre.
Toxinas
toxina de clostridiumbotulinum
Causas de envenenamiento de alimentos por bacterias
toxina diftérica
Causa de la difteria
venenos de serpiente
Enzimas que hidrolizan a fosfoglicéridos
Hormonas
Insulina
Regula el metabolismo de la glucosa
Hormona de crecimiento
Estimula el crecimiento óseo
Proteínas estructurales
Glicoproteínas
Paredes y cubiertas celulares
Proteínas de la estructura de la
Componente de las membranas
membrana α – queratina queratina
Piel, plumas, uñas, pezuñas, etc.
esclerotina
Exoesqueletos de insectos
proteínas de la cubierta viral
Cubierta alrededor del cromosoma
colágeno
Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso, cartílago)
Tabla 3.10
algunas proteínas comunes y su función.
Principal es actuar como cofactores o enzimas en reacciones de óxido reducción en el interior de la célula. Otro mononucleótido importante es la coenzima A (CoA-SH) (figura 3.22), la cual contiene adenina y la vitamina ácido pantoténico. La CoA interviene en la transferencia de grupos acetato y ácidos grasos en relaciones celulares, por ejemplo, en la formación de citrato catalizada por la enzima citrato sintasa:
El DNA (ácido desoxirribonucleico) es un biopolímero no repetitivo que contiene toda la información genética celular (en ciertos virus esta función la tiene el RNA). Durante la división celular, cada célula hija recibe una copia exacta y completa de DNA parental. En los procariotas (baterías, algas verde azules) hay una molécula de DNA única que forma un solo cromosoma, el cual tiene un peso molecular superior a 2 x 109 y constituye
aproximadamente el 1% del peso seco de la célula. En los eucariotas (levaduras, hongos, animales y plantas superiores) generalmente existen algunos cromosomas (moléculas de DNA) los cuales, en células diploides, se presentan en el núcleo en forma combinada con proteínas básicas llamadas histonas. Además del DNA nuclear, las células eucariotas contienen DNA satélite, especialmente en las mitocondrias y en los
cloroplastos, el cual es diferente del DNA nuclear. El DNA procariótico de ordinario está unido a un pliegue o invaginación de la membrana celular llamado mesosoma en la región nuclear (los procariotas no poseen un núcleo verdadero). No hay proteínas asociadas con DNA. Los procariotas también pueden tener material extracrosomal denominado plasmidos o episomas, de los cuales se tratará en capítulos posteriores sobre biología molecular.
Todas las moléculas de DNA están formadas en cuatro unidades de mononucleótidos fosfodiéster (figura 3.23) para formar una principales unidas entre sí por enlaces 3’, 5’ – fosfodiéster cadena de polinucleótido larga y sin ramificaciones. Dos de tales cadenas, las cuales son
complementarias una de la otra, se combinan para formar una estructura de doble hélice en la que las dos cadenas permanecen juntas por la formación de puentes de hidrogeno entre pares de bases complementarias. Así, la adenina de una cadena siempre está unida por puentes de hidrogeno con la timidina de la segunda cadena y la citosina se une por puentes de hidrogeno a la guanina. Los enlaces de hidrogeno estabilizan a la molécula de doble hélice del DNA y, puesto que las bases G-C se unen por tres de tales enlaces en comparación con dos entre las bases A-T, mientras mayor es la cantidad de pares de bases guanosina-citocina (G-C), la molécula de DNA es más estable (figura 3.24). Dentro de la célula el RNA (ácido ribonucleico) existe en tres formas, a saber: RNA mensajero (mRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA ribosomal (rRNA). Todas consisten en una cadena
individual de polirribonucleótido compuesta en cuatro ribonucleótidos principales (aunque el tRNA contiene además algunos ribonucleótidos inusuales que incluyen a los ácidos pseudouridílico y ribotimidílico). En los procariotas todos los RNAs se encuentran en el citoplasma, en tanto que en los eucariotas el rRNA se localiza en el citoplasma (en los ribosomas) y el mRNA y el tRNA se encuentran en el núcleo, mitocondrias, cloroplastos y citoplasma. El mRNA se sintetiza por transcripción enzimática de una hebra de la molécula de DNA. Las bases que constituyen la hebra individual de mRNA son complementarias a dicha hebra
(excepto que el uracilo reemplaza a la timina). Después de la transcripción, el mRNA pasa a los ribosomas donde sirve como molde para el ordenamiento secuencial de los aminoácidos durante la síntesis de proteínas. Los tripletes de nucleótidos (codones) a lo largo de la hebra de mRNA determinan un aminoácido específico.
Los tRNAs son moléculas pequeñas (23000 – 30000 30000 de peso molecular) que actúan como portadores de aminoácidos específicos. esp ecíficos. Durante la síntesis de proteínas, cada uno de los 20 aminoácidos más comunes tiene al menos un tRNA específico que lo conduce hasta el
mRNA que se encuentra unido al ribosoma. Una vez allí, el tRNA transfiere el aminoácido correspondiente a la cadena polipeptídica en crecimiento. El rRNA constituye hasta el 65% del peso de los ribosomas y se divide en tres tipos, a saber: rRNA 23S, 16S y 5S, dependiendo de su capacidad para sedimentar en la centrifugación. Durante la síntesis de proteínas, el mRNA se une al ribosoma, y un tRNA se adhiere al mRNA y transfiere su aminoácido a la cadena polipeptídica polipeptídica en crecimiento; el ribosoma se mueve entonces a lo largo
delmRNA hasta el codón próximo que da la información para el aminoácido siguiente. La síntesis de proteínas se explicara con más detalle más adelante, sin embargo, la verdadera función de los diferentes tipos de rRNA se desconoce aún.
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BIOLOGÍA MOLECULAR 4.1 LOCALIZACION Y ESTRUCTURA DEL MATERIAL HEREDITARIO 4.1.1. Introducción El DNA es la ubicación de la información hereditaria y está contenido en estructuras conocidas como cromosomas. Las células contienen cromosomas que se duplican antes de la división celular. En este capítulo se analiza la estructura del DNA de procariotas y eucariotas, y el mecanismo mediante el cual se duplica el DNA durante el crecimiento y división celular. Se estudia la naturaleza del código genético, tal como es el mecanismo mediante el que la estructura del DNA imparte la información que da como resultado la síntesis de proteínas. Se explica también la base molecular del gen, los tipos de mutación y los mecanismos de mutagénesis.
4.1.2. El material genético es DNA En 1944, Avery demostró que el DNA (ácido desoxirribonucleico) es el material que transfiere información genética de una herencia a otra. Ahora se sabe que, con pocas excepciones, el DNA es la información hereditaria de los sistemas biológicos. El DNA es un polímero cuyas unidades están constituidas por cuatro nucleótidos distintos. Cada nucleótido consta de tres componentes: 1)Una unidad de desoxirribosa. 2)Un grupo fosfato.3)una base nitrogenada que puede ser una purina (adenina o guanina) o una pirimidina (citosina o timina). La molécula de DNA tiene polaridad porque los nucleótidos están unidos por su residuo fosfato, cada uno de los cuales une el átomo de carbono 3´de una molécula de desoxirribosa, con el átomo de carbono 5´de la siguiente molécula de desoxirribosa. Lo anterior de un enlace fosfodiéster 3´-5´y, por convención, las secuencias de DNA se escriben con el radical fosforil libre a la izquierda. Las secuencias del lado 5´de un nucleótido a menudo se denominan “cuesta arriba” y las del lado 3´se denominan “cuesta abajo”. Además de las bases comunes descritas anteriormente, pueden surgir algunas bases
raras mediante la adición de grupos metil e hidroxi, como la base hidroximetilcitosina que reemplaza a la citosina en algunos bacteriófagos.
4.1.3. Generalmente el DNA es una hélice doble Los primeros experimentos químicos demostraron que la adenina y la timina, así como la guanina y la citosina, se presentan en cantidades equimolares en el DNA. Con esta información y con datos obtenidos por cristalografía de rayos X, Watson y Crick pudieron proponer su modelo tridimensional para la estructura del DNA. Concluyeron que la cadena de polinucleótidos es una doble hélice, el diámetro de la cadena es de 2nm, la cadena cambia de dirección cada 3-4nm, la distancia entre bases es de 0.34nm y la hélice se compone de dos cadenas de polinucleótidos.(figura 4.1 y 4.2). El esqueleto de las dos cadenas que se enrollan entre sí están formadas por grupos azúcarfosfato de polaridad opuesta. Las bases están dispuestas en ángulos rectos con respecto al esqueleto hacia el centro de la molécula, lo que permite la unión de la guanina con la citosina y de la adenina con la timina mediante enlace hidrógeno. El hecho de que las bases se unan sólo en estas combinaciones es una característica del DNA.
4.1.4. Las moléculas de DNA varían en longitud y empaquetamiento Las moléculas deDNA sólo se pueden analizar con ayuda de un microscopio electrónico y se ha encontrado que aparecen de diversas formas en diferentes organismos. El DNA de los procariotas es de forma circular y se dice que estos organismos tienen un solo cromosoma. cromos oma. El contenido de DNA en estas bacterias es bajo como en las células de Escherichia coli (3.8X 103 pares de kilobases). Los eucariotas eucar iotas tienen complejidad genética mayor y grandes cantidades de DNA. Las moléculas de DNA lineal tienen la forma de los cromosomas que están ubicados en el núcleo. Los eucariotas inferiores, como los hongos, tienen poca cantidad de DNA. Por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae tiene 34 pequeños cromosomas con aproximadamente 14 X 103 pares de kilobases por célula. La cantidad de DNA tiende a aumentar en los organismos más complejos, por ejemplo, las células del hombre contienen 5.6 X 106 pares de kilobases, pero, en particular, las plantas y los anfibios parecen tener mucho más DNA. La rana tiene 45 X 106 pares. Los cromosomas de los eucariotas tienen estructuras características determinadas por las proteínas (histonas) asociadas al DNA. Tanto las moléculas de DNA circular como las de los cromosomas lineales, se enrollan varias veces sobre sí mismas, lo cual reduce la
longitud de la estructura, misma que es estabilizada por las proteínas asociadas. En las células humanas el DNA se extenderá hasta 230nm de longitud, pero en el núcleo está empaquetado en un organelo cuyo diámetro es de aproximadamente 5 X 10 -3nm. El empaquetamiento del DNA de los cromosomas eucarióticos está asociado con muchas proteínas, siendo las más estudiadas las histonas las cuales son responsables respo nsables de la estructura de la cromatina (fibras de nucleoproteínas) y en el transcurso de la evolución se han conservado en gran medida.
Figura 4.1. Asociación de bases de dos cadenas de DNA( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).
4.2. LA REPLICACIÓN DEL DNA ES SEMICONSERVATIVA Cuando una célula se divide en dos, cada una de las hijas contiene el complemento total de información genética (excepto en las divisiones que originan óvulos y espermatozoides). El DNA debe replicarse en forma precisa; lo cual se logra mediante la separación de las dos cadenas, seguidas por la asociación de los nucleótidos de las hebras sencillas con las bases complementarias mediante puentes de hidrogeno ( figura 4.2).
Esto significa la asociación de la guanina con la citosina y la de la cadena sencilla, los primeros se unen entre sí. La síntesis del DNA nuevo la realizan las enzimas conocidas como DNA polimerasas. El DNA se sintetiza en forma continua sobre una cadena del DNA (cadena 3´- 5´) conocida como cadena principal, empero, la cadena 3´-5´está mal orientada para la l a síntesis continua mediante la enzima DNA polimerasa. En esta cadena c adena de DNA, la síntesis ocurre en fragmentos de aproximadamente 100 nucleótidos, llamados fragmentos de Okasaki (figura 4.3). La replicación del DNA significa, por lo tanto, la asociación de una cadena original con una nueva y se dice es semiconservativa. Hay otras enzimas que participan en la síntesis de DNA. Entre éstas están el ácido ribonucleico (RNA), polimerasas y nucleasas, ya que las moléculas de acido ribonucleico actúan como iniciadoras de la replicación del DNA, y la DNA ligasa que sirve para unir entre sí fragmentos de Okasaki adyacentes. Hay otras enzimas encargadas de relajar el enrollamiento del DNA para permitir la replicación en las horquillas de replicación. El proceso de tal actividad es más complicado en los eucariotas debido a la estructura cromosómica más compleja. En E. coli, la replicación del DNA comienza en un sitio específico del cromosoma llamado Ori C. Este es un tramo de 440 pares de bases (pb) cuya función normal da por resultado la
replicación del DNA lejos de este origen en ambas direcciones. El análisis de otros sitios de iniciación de replicación de DNA procariótico han revelado regiones conservadas repetidas de 12 pb con zonas espaciadoras de 16 pb. Probablemente éstas permiten la unión de las proteínas al DNA en las secuencias conservadas y la iniciación de la replicación del DNA. Aunque la replicación del DNA en los eucariotas se comprende menos, se han hecho algunos adelantos mediante el uso de la levadura Saccharomyces cerevisiaecomo sistema modelo. A partir de este organismo se han aislado secuencias que permiten replicar pequeñas moléculas circulares de DNA llamadas plásmidos. Las secuencias se cuencias se denominan Autonomously Replicating Sequences, ARS, (Secuencias de replicación autónoma), es
posible que funcionen de forma similar a Ori C.
Figura 4.2. Mediante la replicación semiconservativa del DNA se generan hélices hijas idénticas dobles. ( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).
Figura 4.3. Síntesis continua y discontinua de dos hebras de DNA durante la replicación.
4.3 ÁCIDO RIBONUCLEICO (RNA) La expresión de la información genética contenida en el DNA es transmitida por una molécula de RNA mensajero. Ésta transfiere la información del DNA al sitio donde se efectúa la síntesis de proteínas, los ribosomas.la diferencia entre el RNA y el DNA es que en el RNA la base uridina ésta en lugar de la timina, la azúcar ribosa reemplaza a la desoxirribosa y, por lo general, es una molécula de una sola hebra, aunque sus bases se pueden asociar mediante puentes de hidrógeno para dar origen a regiones internas in ternas de doble hebra.
4.3.1. Transcripción del DNA El RNA mensajero que transfiere la información genética es transcrito del DNA mediante una enzima RNA polimerasa dependiente del DNA. Para que esto ocurra las cadenas de DNA deben separarse sólo una cadena, se usa como molde con las bases de RNA unidas por puentes de hidrógeno hidró geno con el DNA. La RNA polimerasa dependiente del DNA, cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre las unidades nucleotídicas que parten del extremo 5´del DNA (figura 4.4). E.coli posee posee sólo una de estas polimerasas, pero los eucariotas tiene por lo menos cuatro clases, que posiblemente reconocen secuencias distintas de unión o iniciación.
La RNA polimerasa de E. coli, que ha sido objeto de estudios detallados, es un tetrámero (cuatro subunidades). Se necesita un polipéptido adicional denominado sigma para la iniciación exacta; algunas veces, se requiere de un factor, rho, para terminar la transcripción.
Figura 4.4. Una cadena de RNA se sintetiza ( transcribe) sobre una región local de hebra sencilla de DNA.( Tomado de Watson, J.D..Tooze. J. y Kurtz.D.T.(1983).
4.3.2. Tipos de RNA El RNA mensajero (mRNA) es sólo uno de varios tipos de moléculas de RNA que se encuentran en la célula. El tamaño del RNA varía entre procariotas y eucariotas. En los primeros, a menudo se codifican varios mensajes en una sola molécula de m RNA, pero en los eucariotas los transcritos primarios, los m RNA, a menudo son mucho más grandes que el m RNA maduro final, el cual es el resultado del proceso del m RNA. Una característica importante del m RNA es que no sólo contiene información para proteínas específicas, sino también otras secuencias laterales que intervienen en el mecanismo de la síntesis de proteínas. El RNA ribosomal (r RNA) es el componente estructural principal de los ribosomas, que son el sitio de la síntesis de proteínas. En los procariotas hay tres moléculas distintas de r RNA, en tanto que en los eucariotas hay cuatro. Hay múltiples copias de las especies de r RNA en el DNA, que junto con las proteínas conforman las subunidades grandes y pequeñas de los ribosomas.
El RNA de transferencia (r RNA), es el más pequeño de los RNA, con aproximadamente 80 nucleótidos. En una célula existen alrededor de40 a 60 especies diferentes de t RNA. Éste se distingue de los otro RNA por contener frecuentemente nucleótidos poco comunes. Los t RNA tienen similitudes estructurales considerables; la estructura secundaria incluye configuraciones asociadas internas. Cada t RNA contiene una secuencia característica conocida como anticodón situada en el extremo de un lazo no asociado en un extremo de la molécula. El anticodón se asocia con ciertas secuencias del m RNA. En el extremo 3´del t RNA está una secuencia CCA, a la cual se pueden unir aminoácidos específicos. Las moléculas de t RNA portadoras de aminoácidos, junto con el mensaje transcrito en el m RNA, permiten que la información genética se traduzca en los ribosomas en una proteína.
4.4. EL CODIGO GENETICO En la descripción del material hereditario, su replicación y transcripción y el sitio de la traducción, no se hizo mención de la naturaleza del código genético en sí. La unidad funcional del DNA es el gen y en este contexto el código genético de ( o clave genética) un gen individual dirige la síntesis de una proteína especifica mediante la transcripción hacia el m RNA, seguida por la traducción hacia una proteína en los ribosomas. Los genes también llevan la información para las moléculas de RNA. El código en si se determina por una secuencia de tres nucleótidos (un triplete) para cada aminoácido. Como esto produce 64 combinaciones posibles y hay 20 aminoácidos, entonces algunos aminoácidos son codificados por más de un triplete. El triplete que da la clave a un aminoácido, como en el m RNA, se conoce como codón. Las posibles combinaciones del código genético se muestran en la tabla 4.1 para los codones de los 20 aminoácidos presentes en las proteínas. Además, se usan tres codones como señales de detención durante la traducción, los cuales se denominan codones sin sentido. Los codones son llevados por el m RNA y la información complementaria, o anticodón, se encuentra en la hebra transcrita del DNA y también en el t RNA. Los
A la izquierda se muestra la primera letra de cada uno de los 64 tripletes, arriba la segunda letra y a la derecha la tercera letra. Los tres tripletes designados como terna son los de terminación de la cadena. La tabla ilustra claramente de la degeneración del código se debe en gran medida a la irrelevancia de la base en la tercera porción. (Tomado de SmithKeary(1977) Genetic structure and funtion. Macmillan.) Codones indicados en la tabla 4.1 muestran que las dos primeras bases tienen el efecto mayor al especificar un aminoácido particular, pero que la tercera base puede variar a menudo sin afectar al sentido del codón. Por ejemplo, tanto el codón UUU como el UUC, conducen a la incorporación del aminoácido fenilalanina.
El codón AUG para la metionina casi siempre se usa como codón de iniciación para que el primer aminoácido sea incorporado en un polipéptido con una sucesión de tripletes que especifica a los aminoácidos hasta que se llegue a un codón sin sentido y se termina la traducción. 4.4.1 Traducción de la información genética El codón de iniciación de la traducción es AUG, el cual es el único codón para la metionina, pero hay dos moléculas de tRNA que tiene el anticodón para AUB ( es decir, CAU). Uno de estos se usa siempre para la iniciación en los procariotas (RNAm met). El cual lleva una N-formilmetionina; para insertar la metionina en posiciones internas en los polipeptidos se usa un tRNA diferente (tRNA met). En los eucariotas también existen dos moléculas de tRNA para la metionina, pero la forma de iniciación no está formulada. En general el aminoácido N-terminal de las proteínas maduras no es metionina, lo cual indica que este residuo es separado de la proteína despues de la traducción. El proceso de iniciación incluye la unión de un tRNA de iniciación para la metionina con el mRNA, junto con la presencia de cofactores (figura 4.5). a continuación el complejo se une con la subunidad pequeña del ribosoma mediante la asociación de las bases de la región 5’
del mRNA y el rRNA 18S (en eucariotas) o 16S (en procariotas). La reacción de iniciación va seguida por el periodo de elongación del polipéptido. Esto significa que la smoleculas posteriores de tRNA se asocie con los codones subsecuentes. Cuando un codón nuevo se asocia con el tRNA, el residuo de aminoácidos se tranfiere al grupo amino del aminoácido entrante. Luego, el denominado tRNA previo sin carga se disocia y un tRNA se deja con un polipéptido en crecimiento. Esta reacción se lleva a cabo a una rapidez de unos 100 residuos por segundo. La fase final de la traducción ocurre cuando se llega a un codón sin sentido y no hay tRNA correspondiente. Luego, el polipéptido es hidrolisado lejos del ultimo tRNA; se disocia el mRNA y las subunidades ribosomales. En la práctica es común encontrar varios ribosomas espaciados en una molecula de mRNA separados por unas 80-100 bases. Esas estructuras se denominan polisomas.
4.5 MUTACIÓN Una vez que se ha descrito el material hereditario, su código y su traducción, es más fácil entender la naturaleza de las mutaciones. Estas se originan debido a perturbaciones en el código genético y ocasionan cambios en la regulación o funcionamiento de las proteínas. Por ejemplo, un tipo de mutación simple se origina cuando se altera la secuencia de nucleótidos, ocasionando un cambio en el sentido del codón. Hay muchas formas de clasificar la mutación, estas ilustran los mecanismos y efectos de las mutaciones. El estadio de la mutación y el marco conceptual para comprender el proceso de la mutagénesis se basan principalmente en el estudio de los procariotas procar iotas y sus virus. Los eucariontes eucar iontes inferiores, en particular Saccharomyces
cerevisiae, también ha aportado evidencia moleculares
comparativas que muestran algunas diferencias entre eucariontes y procariontes. Por ejemplo, diferentes sistemas celulares inician mecanismos de reparación de DNA, que mantiene al DNA, si este se daña. Son útiles dos conceptos acerca del origen de las mutaciones, que son,: que las mutaciones pueden surgir por mala replicación de DNA, es decir, por errores en la replicación del DNA, o bien, por una mala reparación, es decir, por errores durante la reparación del DNA dañado. Parece ser que la replicación del DNA es mas discriminatoria en los eucariontes, como también la reparación del daño del DNA inducido por agentes mutagénicos. Por lo tanto existe una tendencia de fagos a procariotas y a eucariotas inferiores hacia la presencia de reparación errónea como fuente de mutación.
4.5.1 Mutaciones cromosómicas Las mutaciones se pueden clasificar como mutaciones puntuales o mutaciones cromosómicas. Las mutaciones cromosómicas son cambios bruscos ya sea en el numero o estructura de los cromosomas, en tanto que las mutaciones puntuales son cambios pequeños a través de los nucleótidos. El daño al DNA causado por agentes mutagénicos puede ocasionar errores en la transmisión hereditaria de cromosomas completos y, por lo tanto, puede causar la pérdida o ganancia de estos. También puede suceder que los cromosomas se rompan, y estos tengan afinidad por otros cromosomas rotos dando lugar a liberaciones cromosómicas. Estas pueden
ocasionar la transferencia de un cromosoma a otro (translocación); la perdida de material genético (delección); o bien, la inversión de una porción del cromosoma si ocurren dos rupturas en el mismo cromosoma. 4.5.2 Mutación por sustitución de bases Los cambios en la secuencia de nucleótidos pueden alterar el sentido del código genético dando como resultado un aminoácido diferente en un polipéptido o un polipéptido truncado si el cambio es de un codón con sentido a uno sin sentido.Los efectos de tal mutación, es decir, el fenotipo, dependen del lugar de la mutación. Es evidente que una mutación sin sentido que produce una proteína truncada, causará la ausencia de la actividad proteínica particular, amenos que la mutación tenga lugar cerca del extremo normal del polipéptido. Las mutaciones sin sentido que producen un cambio en un aminoácido de un polipéptido tendrán un efecto que depende de la posición del aminoácido en la proteína. Es claro que los cambios en el lugar activo o en una posición que afecta la estructura dela proteína tendrán mayor efecto. Algunos cambios causaran unja disminución en la actividad de la proteína dando como resultado una mutación rezumante. Sin embargo, algunas mutaciones por substitución de bases no producen un cambio en el sentido debido a los codones múltiples de algunos aminoácidos. Es obvio que estas no tienen efecto sobre el producto proteínico. 4.5.3 Mutación por cambio en el marco de lectura Estas mutaciones son el resultado de inserciones o delecciones de bases, estas alteran el marco de lectura del DNA y alteran la secuencia de codones posterior. El efecto de la mutación por cambio en el marco de lectura es dar una proteína no funcional, por ejemplo (figura 4.6);
ABC
ABC
ABC
ABC
ABC
Wild-tipo de secuencia
ABC
AAB
CAB
CAB
CAB
Inserción
ABC
BCA
BCA
BCA
BCA
Eliminación
Figura 4.6
Estas mutaciones pueden ocurrir, por supuesto, con múltiplos de una base. Los múltiplos de tres bases deben ser añadidos o eliminados, así el marco de lectura no se altera, pero los aminoácidos se añaden o eliminan en el polipéptido final. 4.5.4 Mutación espontánea e inducida Las mutación puede surgir ya sea espontáneamente o debido a la inducción con un agente mutagénico. La mutación espontanea puede ocurrir debido ala radiación de fondo, errores en la replicación de DNA o inclusive por modificaciones tautoméricas de
entonces para precipitar mRNA para la proteina de interes mientras se produce en el ribosoma. Así, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describió y se obtiene una copia de cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen secuencias interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la producción de cDNA es crítica en la representación de secuencias codificadoras cuando es necasaria la expresion en
los organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y proceso de secuencias no codificadoras.
4.6.4. Mapeo con la nucleasa S1:
El análisis de la enzima de restricción permite indicar la posición de los genes al cortarlos, o bien, sus secuencias laterales efectuarán su expresión cuando se analice la formación de producto génico en los fragmentos. Las secuencias secu encias laterales intervienen en funciones tales como la regulación, la unión de la RNA polimerasa y la unión ribosómica. La nucleasa S1 digiere únicamente DNA o RNA de una sola hebra. El mapeo con la mucleasa S1 es una herramienta muy útil para ubicar el sito de transcripción en el DNA. Mediante la hibridación de una RNA transcriptasa a DNA de una sola hebra, se produce un hibrido resistente a la digestión por la nucleasa S1. Así, es posible desnaturalizar el híbrido DNA-RNA y analizar y separar el DNA.
4.6.5 Electroforesis en gel:
En forma rutinaria, las moléculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel. El gel es una red compleja de moléculas poliméricas y distancia que el DNA migra a
Biología molecular
cada 256 pares de bases. Por lo tanto, es probable ya que un gen típico de procariotas tiene de 1 a 2 pares de kilobases (1000 bases), que por lo menos algunas endonucleasas de restricción que reconocen 6 pares de bases, no corten tal secuencia. En los eucariotas los genes pueden ser más grandes y contener secuencias interpuestas llamadas intrones, que pueden causar complicaciones.
4.6.3 Aislamiento de cDNA
Se puede obtener genes determinados mediante la elaboración de DNA complementario a un RNA mensajero (mRNA) particular. Este enfoque se utiliza ampliamente en estudios con plantas y mamíferos. El mRNA se puede aislar fácilmente debido a su extremo poliadenilado de hasta 200 nucleótidos de longitud.
Ingeniería genética
El RNA crudo se pasa a través de una columna que contiene secuencias de poli U o poli T unidas a un soporte sólido, que une a las secuencias de polo A del mRNA. Así, la transcriptasa reversa puede usarse para sintetizar una molécula de DNA de una sola hebra la cual se puede convertir posteriormente a una hebra doble mediante una DNA polimerasa (figura 4.9). El cDNA se puede incorporar en vectores para su amplificación y análisis. En ciertos casos los anticuerpos monoclonales se pueden usar para aislar un mRNA solo a partir de los componentes celulares. Los anticuerpos monoclonales se obtienen, se inyectan a un ratón o a un conejo con la proteína para la que se requiere el cDNA. El animal se sacrifica posteriormente para obtener las células del bazo, las cuales se fusionan con células de mieloma. Las células denominadas hibridomas producen un anticuerpo muy específico para la proteína blanco (figura 4.10). El anticuerpo anticuerp o se utiliza entonces para precipitar mRNA para la proteína de interés mientras se produce en el ribosoma.
Biología molecular
Así, el mRNA se separa del anticuerpo como ya se describió y se obtiene una copia de cDNA. Puesto que los genes de los eucariotas superiores a menudo contienen secuencias interpuestas no codificadoras llamadas intrones, la producción de cDNA es crítica en la representación de secuencias codificadoras cuando es necesaria la expresión en los organismos inferiores. Lo anterior evita los problemas asociados con el reconocimiento y proceso de secuencias no codificadoras. codificador as.
4.6.4 Mapeo con la nucleasa S1
El análisis de la enzima de restricción permite indicar la posición de los genes al cortarlos, o bien, a sus secuencias laterales efectuaran su expresión cuando se analice la formación de producto génico en los fragmentos. Las secuencias laterales intervienen en funciones tales como la regulación, la unión de la RNA polimerasa y la unión ribosómica.
La nucleasa S1 dirige únicamente DNA O RNA de una sola hebra.El mapeo con la nucleasa S1 es una herramienta muy útil para ubicar el sitio de transcripción en el DNA.
Mediante la hibridación de una RNA transcripatasa a DNA de una sola hebra, se produce un hibrido resistente a la digestión por la nucleasa S1. Así, es posible desnaturalizar el hibrido DNA-RNA y analizar y separar el DNA.
4.6.5 Electroforesis en gel En forma rutinaria, las moléculas de DNA se analizan mediante electroforesis en gel.El gel es una red compleja de moléculas poliméricas y la distancia que le DNA migran a
través del gel refleja su tamaño, el cual se puede estimar usando fragmento de DNA marcador como referencia. La agarosa se usa en le análisis de moléculas de varios cientos hasta 20 000 pares de bases, en tanto que la poliacrilamida se usa para fragmentos de DNA
mas pequeños. El DNA se observa usando luz UV después de teñirlo con bromuro de etidio (figura 4.11).
4.6.6 Hibridación de ácidos nucleicos La homología entre moléculas de ácidos nucleicos se puede determinar mediante la unión irreversible del DNA o del RNA a un material que generalmente consiste en filtros de nitrocelulosa, seguida por la hibridación usando sondas de DNA o RNA marcadas radiactivamente. L a transferencia southern describe el proceso de hibridación de una sonda de DNA de cadena sencilla con DNA, en tanto que la transferencia northern hibrida al DNA de una sola hebra.Por otra parte, la técnica complementaria con el RNA que han sido transferidos al papel de nitrocelulosa o a otras membranas ( figura 4.12).
4.6.7 Determinación de secuencias de bases La secuencia de bases del DNA se puede determinar usando uno de dos métodos. En uno de ellos, creado por Maxam y Gilbert, se necesita el rompimiento de la hebra en bases específicas, como lo que seobtienemoléculas de tamaño característico. El segundo método,
mas requiere la síntesis de DNA en presencia de los nucleótidos, pero con la adición de un nucleótido análogo que irrumpe la síntesis (un trifosfato de disoxinucleósido). Ambos métodos utilizan una cantidad limitante de DNA o reactivo de terminación, por lo que la frecuencia d estos eventos es aleatoria y ocurre ne cada sitio disponible en el DNA. Las moléculas de tamaño diferente son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida y se observan mediante auto radiografía del DNA marcado radiactivamente. 4.6.8 vectores para la transferencia de DNA clonado Los fragmentos de DNA de interés se manipulan en pequeñas moléculas circulares de DNA llamado plásmidos o en virus. La mayor parte de las manipulaciones del DNA requieren la bacteria E. coli, para la transferencia hacia otros organismos huésped después de la amplificación y el análisis. Los plásmidos de las moléculas de DNA de doble hebra que contienen la información de origen de una replicación y varias proteínas, en las bacterias estas proteínas a menudo están asociados a la resistencia, por ejemplo a los antibióticos. En este caso, los plásmidos llevan la información de proteínas que rompen el antibiótico. Los plásmidos se aíslan y modifican para su uso en la experimentación exp erimentación con DNA. Un ejemplo de un plásmido de uso común es el pBR322 (figura.4.13). El plásmido consta de 4362 pares de bases y lleva genes resistentes a la ampicilina y la tetraciclina. Su mapa de restricción está perfectamente caracterizado con un sitio para la enzima Bam HI en el gen resistente a la tetraciclina y un sitio Pst I en el gen existente a la ampicilina. El DNA recombinante se puede preparar mediante la ruptura de uno de estos sitios de restricción. Lo anterior produce extremos cohesivos y se puede asociar, mediante puentes de hidrógeno, hidró geno, un fragmento de DNA de otra fuente fu ente obtenido con la misma enzima. Por último, el DNA es unido covalentemente por medio de la enzima DNA ligasa. Si el DNA del plásmido (pBR322) y el de la fuente se cortan con Bam HI y se ligan entonces esto se inactiva al gen de resistencia de la tetraciclina y la introducción del plásmido recombinante r ecombinante en E. coli da lugar a que la bacteria sea sensible a la tetraciclina y resistente a la ampicilina. las bacterias que no hayan incorporado el plásmido se eliminan exponiéndolas a ampicilina; entre las colonias resistentes a estos antibióticos, aquellas que son resistentes a la tetraciclina contienen insertos de DNA. los plásmidos que contienen genes de interés tendrían que ser aislados de insertos obtenidos
del DNA celular total o de cDNA cDNA obtenido a partir de mRNA, Éstos pueden determinarse si se dispone de una sonda para el gen de interés al realizar la hibridación de la colonia. El DNA de colonias individuales se hibrida en filtros de nitrocelulosa. O también, es posible seleccionar un plásmido si se puede detectar su proteína característica, por ejemplo, al rescatar una bacteria mutante por medio del DNA extraño que sustituye a una enzima. Este tipo de elección depende de la expresión de los genes en el huésped extraño, la cual no siempre se efectúa, especialmente cuando se trata de genes eucarióticos incorporados a bacterias. Esto se debe a que los mecanismos de expresión difieren, y también a que los genes eucarióticos pueden contener secuencias interpuestas denominadas "intrones". 4.6.9 Bacteriófagos Los bacteriófagos (fagos) son virus bacterianos que se usan como vectores. Ellos infectan ciertas capas de bacterias
y presentan algunas ventajas sobre los plásmidos. La
característica principal es que pueden contener fragmentos de DNA recombinante, lo cual reduce el número de aislados necesarios para representar a los genes de los eucariotas superiores. El fago lambda, como sus derivados, se usa mucho, y hasta un tercio de su DNA se puede reemplazar con DNA extraño. El DNA circular de una sola hebra, el cual se puede obtener del fago M13, y sus derivados, también se usan frecuentemente en el método didesoxi (Sanger) para e análisis de a secuencia de DNA. En el fago lambda hay secuencias específicas de DNA denominadas sitios cos que permiten el empaquetamiento del DNA. Dichos sitios se han clonado en plásmidos para producir cósmidos. Estos vectores contienen diferentes sitios de restricción y marcadores de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden llevar fragmentos de DNA grandes de 30 a 45 kilobases cuando el DNA está empaquetado en forma similar al DNA del fago lambda. Los cósmidos tiene el potencial para llevar moléculas de DNA grandes. 4.6.10 virus Los virus eucarióticos se usan como vectores de clonación, este es el caso del virus SV40 usado con algunas células de mamíferos. 4.6.11 Sistemas huésped para DNA recombinante Las manipulaciones de DNA recombinante se efectúan en bacterias (E. coli), pero en ocasiones los genes pueden ser transferidos de nuevo a otros huéspedes. En algunos casos,
se han creado vectores de vía colateral que pueden funcionar en dos tipos de huésped. Un ejemplo se encuentra en la levadura Saccharomyces cerevisiae, en la cual una parte del plásmido pBR322 y otra parte del plásmido denominado 2 um (de la levadura), se entrelazan con un gen de levaduras. Esto puede funcionar en E. coli con la selección de bacterias que llevan plásmidos en base a la resistencia de los antibióticos y en la levaduras por la presencia de genes gene s para los cuales la célula de levadura levadur a huésped es defectuosa. Esto Es to permite que las células de la levadura que llevan el plásmido sean seleccionadas, ya que éste deja que ellas crezcan. Existen plásmidos vectores para otras bacterias y levaduras, así como para algas, plantas y células de mamífero. Estos vectores son de importancia práctica, ya que muchos organismos proporcionan características novedosas que se optimizan mejor in situ, en vez de tratar de llevarlas a un sistema extraño (heterólogo). Otra característica de E. coli, es que no se utiliza en ninguna fermentación industrial tradicional. Las bacterias que se acostumbran utilizar son: Bacillus sp. Para la producción de enzimas, actinomicetos para la producción de antibióticos o corineformes para la obtención de aminoácidos. Existen sistemas de vectores para Bacillus subtilis, que incluyen vectores de vía colateral E. coli-B. sublitis y otros semejantes para Stretomyces. El interés en las últimas especies se debe a que con ellas se produce la mayor variedad de antibióticos. Se espera mejorar los rendimientos de estos antibióticos y modificarlos. Las especies de Pseudomonas también son recomendables como huéspedes para los plásmidos recombinantes. Estos organismos son de interés debido a su capacidad para degradar muchos contaminantes de la atmósfera. 4.6.12 Huéspedes eucarióticos Ha surgido interés en cuanto a los sistemas de gran clonación de levaduras tanto para la producción de compuestos de importancia comercial como para el mejoramiento de la utilización de sustratos. Las técnicas también han demostrado ser muy valiosas en el uso de levadura como un sistema modelo para el análisis de de células eucarióticas. En cuanto a la aplicación práctica, se ha puesto mucho interés en el uso de la levadura como huésped en la producción de compuestos valiosos por medio de la ingeniería genética, debido a la experiencia acumulada por la fermentación de levaduras. Se han obtenido varios tipos de vectores para levaduras, los cuales también se replican en E. coli (figura 4.14). Las manipulaciones del DNA se hacen en E. coli, donde la selección
se basa en la resistencia de antibióticos. Los plásmidos tienen sitios diana únicos para varias enzimas de restricción, así como marcadores elegibles para las levaduras, los cuales pueden rescatar por complementación células huéspedes hué spedes mutantes. Los plásmidos episomales de levaduras (YEp), contienen una parte del plásmido 2um de la levadura unida aun plásmido bacteriano y al marcador elegible para la levadura (figura 4.13). En una célula haya aproximadamente 50 a 100 copias del plásmido 2um; los vectores híbridos también están presentes como plásmidos en copias múltiples que son mantenidos bajo selección. Los vectores de este tipo tienen una alta eficiencia de transformación. trans formación.
Figura 4.14 Cuatro plásmidos de levaduras. Un plásmido integrante contiene un marcador que las levaduras eligen peo ningún origen de la replicación para ellas. Estos plásmidos serán estables solamente si se integran en los cromosomas de las levaduras. Un plásmido episomal contiene un marcador elegible para las levaduras y un segmento de DNA del círculo 2u. El DNA de este círculo contiene el origen de replicación y también los genes "rep", los cuales mantienen estable al plásmido extra cromosómico a un número de copias relativamente bajo. Un plásmido replicante contiene un segmento de DNA (la secuencia ARS) que le permite replicarse de manera autónoma en células de levaduras; sin embargo, la secuencia ARS que contienen plásmidos no son estables ya que no existe un mecanismo para mantener tales plásmidos extracromosómicos a alto número de copias durante la mitosis. Su estabilidad se logra al añadir una secuencia CEN, un segmento de DNA de uno de los centrómeros de levadura que se unen al huso durante la mitosis. La secuencia CEN asegura la segregación estable del plásmido extracromosómico durante la mitosis. (Tomado de Watson, J. D. Tooze, J. y Kurtz, D. T. (1983) Recombinante DNA: A short course. Scientific American Books.)
También se han obtenido los plásmidos constitutivos de las levaduras (YIp), los cuales también carecen de secuencias del plásmido 2um pero contienen secuencias para el rescate de mutantes en las levaduras mutantes, así como para la selección y replicación 4en E. coli. Debido a que no tienen un origen de replicación transforman las células de las levaduras mediante integración en el DNA cromosomal, y realizan la transformación a una rapidez que es varias órdenes de magnitud menor que la de los plásmidos YEp. En contraste, la transformación mediante vectores YIp es estable, y por lo general, el número de vectores en las células transformadas es 1. Se han obtenido plásmidos replicantes de levaduras (YRp), que contienen secuencias de estas, lo cual les confiere la capacidad de replicarse de manera autónoma. En otros aspectos, estos vectores son semejantes a los vectores YIp. el número de copias de los vectores YRp en células transformadoras es bajo (aproximadamente 10) y son inestables. Los cromosomas contienen una región denominada centrómero, la cual es importante en la distribución efectiva de los cromosomas con las células hijas en la división celular. Los plásmidos centroméricos de las levaduras. vCp contienen centrómeros, así como secuencias, que permiten la replicación en las levaduras y en E. coli. El número de copias de estos plásmidos circulares es bajo y son estables aunque no tanto como los cromosomas lineales naturales. 4.6.13 Vectores de expresión Las secuencias de nucleótidos ubicadas a cada lado de las secuencias codificantes de los genes, contienen estructuras importantes para la expresión y regulación de éste. en la región 5' de las células eucarióticas y procarióticas están las secuencias de DNA que enlazan las proteínas. Estas incluyen a la secuencia de Pribnow, o bien, TATAAT de los procariotas, donde empieza la transcripción, la cual va precedida por la secuencia TTGACA, que es el sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa. Las regiones 5' se conocen como promotores y la posición de estos elementos es crucial para la expresión del gen. En los eucariotas opera un sistema similar que consiste en una secuencia TATAAA de GolbergHogness a unos 25 pb hacia arriba del sitio de iniciación, con un segundo elemento CAAT ubicado a unos 80 pb hacia arriba que también puede ser importante. En los procariotas, la secuencia AGAGGU, conocida como secuencias de Shine-Delgarno, es importante en la colocación correcta del mRNA en los ribosomas.
Las secuencias hacia abajo del gen también son importantes para la expresión. en los procariotas, la terminación de la transcripción ocurre en secuencias específicas es pecíficas que pueden formar una estructura secundaria rizada. En los eucariotas es importante una secuencia AAUAA, ya que se añade un extremo poli-A de aproximadamente 100 a 200 residuos, sin embargo, se tiene que saber más acerca de las señales de terminación. La importancia de las regiones 3' (hacia abajo) y en particular, la regiones 5' (hacia arriba) de los genes, ha dado como resultado la incorporación de taleselementos en los denominados vectores de expresión. La región 5' hacia arriba contiene elementos que dan por resultado la expresión característica de los genes. Estas regiones han sido tomadas de genes altamente expresados y se han usado para expresar otras proteínas incluyendo proteínas de importancia comercial. En las levaduras, éstas han sido usadas, por ejemplo, con el promotor de la 3-fosfoglicerato cinasa para expresar el interferon alfa del hombre (figura 4.14). Las concentraciones de las proteínas no son tan altas como lo serían si estuviese presente en el vector el gen PGR de las levaduras, debido a que la carga de la célula de producir grandes cantidades tales de proteínas que, entre otras cosas, pueden efectuar la viabilidad. Idealmente. La secuencia promotora usada debe ser controlable de modo que la síntesis de proteína en concentración alta se accione en el momento adecuado. Este tipo de regulación se puede obtener usando, por ejemplo, promotores de proteínas de choque térmico, o bien, como se ha logrado en las levaduras, un promotor de fosfatasa ácida, el cual funciona a 28 ºC pero no a 35ºC. Esto permite obtener suficiente biomasa antes de pasar a la síntesis del producto 4.6.14 Vectores de secreción Otra característica de aplicación potencial es el uso de vectores de secreción que permiten exportar el producto y su recolección a partir de caldo de fermentación más que de la masa celular. Esto tiene aplicación posible en sistemas celulares inmovilizados. Estos vectores de secreción se pueden desarrollar en muchos sistemas. En las levaduras, se basan en todas la proteínas secretadas conocidas e incorporan la terminal amino principal de tales proteínas que se requiere para el proceso previo a la secreción. La hormona sexual de levaduras, denominada factor alfa, se ha utilizado para lograr la secreción, pero para ser que las levaduras también pueden reconocer y procesar señales de secreción colocadas en genes de
interferon de eucariotas superiores. La levadura que más se usa y estudia aquí es la Saccharomyces cerevisiae, sin embargo, recientemente se han creado sistemas de transformación para otras levaduras como Schizosaccharomyces pombe, Klyveromyces lactis, Klyveromyces fragalis, Hansenula polymorpha. Algunas de estas especies pueden ser más
adecuadas en la expresión de ciertos genes o bien, pueden serlo usando substratos más baratos. Por ejemplo Hansenula polymorpha puede crecer en metanol y Klyveromyces con lactosa (suero) como fuentes de carbono. En comparación con las levaduras, hubo un menor avance de los sistemas de clonación génicos en hongos filamentosos. La transformación se ha logrado con varios hongos filamentosos y es de interés en cuanto a la secreción de producto en alta concentración. En las plantas, también se han obtenido sistemas de clonación de genes. Se han construido plásmidos que se replican autónomamente para la alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardii. Este sistema promete la producción por medio de un crecimiento fotosintético.
En estos últimos dos años hubo un avance rápido en los sistemas de clonación en las plantas superiores. Este problema se solucionó al investigar vectores posibles basados en virus y plásmidos vegetales. La solución que se basa en los plásmidos Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, inductora de tumores vegetales parte de este plásmido y se
incorpora en el DNA vegetal; el DNA extraño incorporado en esta parte de este plásmido usando enzimas de restricción y la DNA ligasa se incorporan junto con el DNA Ti. Esto ha abierto amplias posibilidades para el mejoramiento de los vegetales, no obstante, el plásmido Ti solo se puede insertar de manera natural en un número limitado de especies vegetales, las cuales no incluyen algunos de los cultivos más importantes. Los sistemas de vectores para estas especies aún se encuentran en investigación y entre sus posibles aplicaciones se encuentran la manipulación de vías biosintéticas, la incorporación de resistencia a herbicidas y el mejoramiento del valor nutricional de las cosechas. Se puede introducir DNa extraño en el DNA de las células de mamífero mediante la microinyección directa en el embrión. La obtención de sistemas de clonación de genes en cultivos de células de mamífero es de la mayor importancia ya que pueden ser la base de procesos de fermentación comerciales.
Las células transformantes pueden ser detectadas con facilidad luego de la incubación con DNA total si existe una forma de seleccionarlas. La detección de transformantes se basó inicialmente en la complementación de células deficientes en una función determinada, con el gen activo correspondiente. La contrasformación de un gen deseable unido a un marcador seleccionable, por ejemplo, de resistencia a antibióticos, puede superar este problema y permitir la integración en los cromosomas. En la actualidad se cuenta con vectores virales para células de mamífero, la mayoría se basa en el virus circular SV40. Se han obtenido derivados que contienen un replicón de E. coli unido al suyo que contiene la expresión en el cual se pueden insertar y expresar los genes extraños. Estos vectores de vía colateral pueden usar de nuevo E coli para manipulaciones de DNA con transferencia de líneas de células mono, en las cuales se efectúa el análisis de su expresión o efecto. La función episomal de este y otros vectores virales limita el número de huéspedes, pero se puede usar para la integración cromosómica de las células. RESUMEN 1). La tecnología de la ingeniería genética depende de la fragmentación del DNA mediante las enzimas de restricción y de su unión en combinaciones distintas como los vectores. 2). Los genes se clonan mediante el aislamiento de vectores que llevan genes normales, capaces de rescatar o "complementar" células defectuosas. En forma alternativa, es posible aislar el mRNA y producir una copia de DNA usando transcriptasa inversa. 3). El análisis de DNA se puede realizar mediante el examen del mapa de los sitios de la enzima de restricción usando electroforesis en gel para separa fragmentos de DNA de diferente tamaño, examinando la homología entre secuencias de nucleótidos mediante la hibridación de una sonda de DNA, marcada radiactivamente con DNA unido a filtros; analizando la secuencia con base en la interrupción de las hebras de DNA en posición de bases conocidas y determinándolas por diferencias difer encias de tamaño en geles de poliacrilamida. 4). Los vectores se usan para mover en DNA de una célula a otra por el proceso se transformación. 5). La selección de transformantes puede efectuarse por la recuperación del plásmido o por resistencia a una toxina celular. 6). Existen sistemas de clonación para bacterias, levaduras, hongos filamentosos, algas, plantas superiores y células de mamíferos. Para la explotación biotecnológica de la
ingeniería genética es importante el refinamiento de la técnica para ampliar la variedad de huéspedes, el control de la expresión de genes y el número y la estabilidad de los plásmidos. BIBLIOGRAFÍA Glover, D. M. (1984) Gene Cloning The Mechanics of DNA Manipulation. Chaptman and Hall. London. Old, R. and Primrose, S. B. (1985) Principles of Gene Manipulation (Trird Edition).Blackwell Scientific Publication, Oxford and Palo alto. Oliver, S. G. and Ward. J. M (1985) A dictionary ok Genetic Engineering. Cambridge University Press. Cambridge. Watson, J. D. Tooze, J. and Kurtz, D. T. (1983) Recombinant DNA: A short course. Scientific American; Books.
