I
Universidade Camilo Castelo Branco Instituto de Engenharia Biomédica
DÉBORA ALICIA BUENDÍA PALACIOS
OZONIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS PARA USO DERMATOLÓGICO
São José dos Campos - SP 2010
II
Débora Alicia Buendía Palacios
Ozonização e caracterização de óleos vegetais para uso dermatológico
Orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zângaro
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Bioengenharia.
São José dos Campos, SP 2010
II
Débora Alicia Buendía Palacios
Ozonização e caracterização de óleos vegetais para uso dermatológico
Orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zângaro
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Bioengenharia.
São José dos Campos, SP 2010
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IV
V
DEDICATÓRIA
Dedico este trabajo a mi famila, Mis papás: Ariel y Deborita Mis hermanos: Ernesto, Eliana y Diana Mis abuelos (in memoriam): Enrique y Débora, Antonio y Alicia
Que han compartido conmigo alegrías, tristezas, triunfos y sobre todo momentos, simples e inolvidables. Me han enseñado a vivir y a amar sin medida. Se han convertido en el motor que mueve mi alma y no permite que desista ante nada, que me ayuda a crecer, a creer en mí y me da la confianza de que pase lo que pase siempre vamos a estar bien y unidos. No imaginan cuanto los amo!
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AGRADECIMENTOS A Deus que me guia e fortalece. À Universidade Camilo Castelo Branco, pela oportunidade de alcançar uma meta, realização de um objetivo profissional e pela possibilidade de contemplar um horizonte mais amplo. Ao meu orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zângaro, pessoa a qual admiro, pois com muita paciência e sabedoria me ajudou a culminar esta etapa! Ao Professor Dr. Landulfo Silveira Junior, que colaborou e me ensinou com grande disponibilidade. Aos professores: Luis Carlos de Lima, Marcos Tadeu Tavares Pacheco, Marco Antonio de Oliveira, Fernando Ortega, Kátia Calligaris. À Nidia Lucia que sempre foi atenciosa, esteve disposta a ajudar e tornou-se uma amiga. À Helena Maria de Oliveira: amiga, que me escutou, apoiou, animou e ajudou, infinitamente. À minha família que me ama, acredita em mim e sempre está comigo. Aos colegas de estudo: Ariane, Dani, Rogério, Milene, Leandro, Erik. Aos Amigos: Jenny, Sonia, Jozi, Angelita, Gaby, Edna, Judy, Norma, Caro, Natalia, Guille, Zamir, Andrés… A todas as pessoas que colocaram seu grão de areia para que fosse possível a finalização de esta fase, tão importante na minha vida. “Cuando uno enseña lo que sabe, recibe una enorme recompensa: El brillo de unos ojos que han entendido, que han comprendido, que han aprendido algo nuevo y un eterno sentimiento de gratitud…INFINITAS GRACIAS!” Débora.
VII
EPÍGRAFE
“Há homens que lutam um dia, e são bons; Há outros que lutam um ano, e são melhores; Há aqueles que lutam muitos anos, e são muito bons; Porém há os que lutam toda a vida Estes são os imprescindíveis” Bertold Brecht
VIII
OZONIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS VEGETAIS PARA USO DERMATOLÓGICO RESUMO O objetivo deste trabalho é ozonizar 5 óleos vegetais (óleo de girassol, glicerina, azeite de oliva, óleo de soja, e vaselina) e caracterizá-los espectral e morfometricamente. Os óleos vegetais ozonizados são uma excelente opção para armazenar o ozônio facilitar a manipulação do ozônio terapêutico, evitar sua rápida degradação e realizar tratamento de ozônio terapia no ramo extra-hospitalar. Ainda, este trabalho pode contribuir para os profissionais que atuam na área de ozônio terapia, pois o conhecimento das particularidades dos óleos vegetais ozonizados e a reação do ozônio com os óleos e suas vantagens terapêuticas têm se tornado objeto de estudo. A metodologia do trabalho se caracteriza pela observação analítica. Para descrever as características espectrais e morfométricas dos cinco óleos vegetais ozonizados foram utilizadas técnicas ópticas confiáveis, rápidas e não destrutivas, sendo estas: a espectroscopia Raman e a microscopia óptica. Os resultados mostraram mudanças espectrais, observadas na técnica Raman, durante o processo de ozonização o azeite de oliva não evidenciou mudanças, já o óleo de girassol, a glicerina o óleo de soja e a vaselina mudaram mostrando quebra das ligações duplas correspondentes a insaturação e novos produtos derivados da oxidação lipídica. Com a microscopia óptica evidenciou-se a presença de bolhas de ozônio dentro dos óleos vegetais e permitiu definir a estabilidade do produto, sendo o óleo de girassol o mais estável. Palavras chave: ozonioterapia, chave: ozonioterapia, óleos vegetais ozonizados, espectroscopia Raman, microscopia óptica.
IX
OZONIZATION AND CHARACTERIZATION OF VEGETABLE OILS FOR DERMATOLOGICAL USE ABSTRACT The aim of this paper is ozonate 5 vegetable oils (sunflower oil, glycerin, olive oil, soybean oil and vaseline) and characterize them spectrally and morphologically. Ozonized vegetable oils are an excellent option for storing ozone, facilitate therapeutic ozone manipulation, avoiding their rapid degradation and perform ozone therapy at the extra-hospitalary treatments. This work can assist professionals working in the field of ozone therapy, since knowledge of the characteristics of ozonized vegetable oils, the reaction of ozone with the oils and their therapeutic benefits have become an object of study. The methodology of work is characterized by analytical observation. To describe the spectral and morphometric characteristics of five ozonized vegetable oils were used optical techniques reliable, fast and nondestructive, which are: Raman spectroscopy and optical microscopy. m icroscopy. Results showed spectral changes observed by Raman technique during the ozonation process. Olive oil showed no changes, bat sunflower oil, glycerin, soybean oil and vaseline changed showing breakdown of a corresponding unsaturated double bonds of fatty acids and new products of lipid oxidation. With optical microscopy showed the presence of ozone bubbles into vegetable oils and helped define the stability of the product, being the most stable is a ozonized sunflower oil.
Keywords: Keywords: ozonetherapy, ozonized vegetables oils, Raman spectroscopy, optical microscopy.
X
OZONIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ACEITES VEGETALES PARA USO EN DERMATOLOGIA RESUMEN El objetivo de este trabajo es ozonizar 5 aceites vegetales (aceite de girasol, glicerina, aceite de oliva, aceite de soya y vaselina) y caracterizarlos espectral y morfológicamente. Los aceites vegetales ozonizados son una excelente opción para almacenar el ozono, facilitar la manipulación del ozono terapéutico, evitar su rápida degradación y realizar tratamientos de ozono terapia a nivel extra-hospitalario. Este trabajo contribuye para profesionales que actúan en el área de ozono terapia, pues el conocimiento de las particularidades de los aceites vegetales ozonizados, la reacción del ozono con los aceites y sus ventajas terapéuticas se han tornado objeto de estudio. La metodología del trabajo se caracteriza por la observación analítica. Para describir las características espectrales y morfométricas de los cinco aceites vegetales ozonizados fueron utilizadas técnicas ópticas confiables, rápidas y no destructivas, siendo estas: la espectroscopia Raman y la microscopía óptica. Los resultados mostraron cambios espectrales observados por medio de la técnica Raman durante el proceso de ozonización. El aceite de oliva no evidenció cambios; el aceite de girasol, la glicerina, el aceite de soya y la vaselina cambiaron, mostrando ruptura de enlaces dobles correspondientes a la insaturación de ácidos grasos y nuevos productos de oxidación lipídica. Con la microscopía óptica se evidenció la presencia de burbujas de ozono dentro de los aceites vegetales y permitió definir la estabilidad del producto, siendo el aceite más estable el aceite de girasol ozonizado. Palabras clave: ozonoterapia, aceites vegetales ozonizados, espectroscopia Raman, microscopia óptica.
XI
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via parenteral Figura 2. Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via tópica ó regional Figura 3. Sistema para geração de óleos vegetais ozonizados Figura 4. Equipamento gerador de ozônio Figura 5. Sistema para ozonização de óleos vegetais Figura 6. Microfotografias dos óleos vegetais ozonizados Figura 7. Sistema Raman Dispersivo utilizado na coleta dos dados espectrais Figura 8. Microfotografia da amostra do óleo de girassol ozonizado Figura 9. Passos realizados nas microfotografias para análise digital Figura 10. Microfotografia da glicerina ozonizada Figura 11. Microfotografia do azeite de oliva ozonizado Figura 12. Microfotografia do óleo de soja ozonizado e imagem binarizada Figura 13. Microfotografia da vaselina ozonizada e imagem binarizada Figura 14. Histograma de distribuição bolhas para óleo de girassol ozonizado Figura 15. Histograma de distribuição bolhas para glicerina ozonizada Figura 16. Histograma de distribuição bolhas para azeite de oliva ozonizado Figura 17. Histograma de distribuição bolhas para óleo de soja ozonizado Figura 18. Histograma de distribuição bolhas para vaselina ozonizada Figura 19. Curva de distribuição acumulada (FUI) para óleos vegetais ozonizados Figura 20. Espectros Raman dos óleos vegetais ozonizados Figura 21. Espetros do PC1 e PC2 do oleo de girassol ozonizado Figura 22. Espetros do PC1 e PC2 da glicerina ozonizada Figura 23. Espetros do PC1 e PC2 do azeite de oliva ozonizado Figura 24. Espetros do PC1 e PC2 do oleo de soja ozonizado Figura 25. Espetros do PC1 e PC2 do oleo da vaselina ozonizada Figura 26. PC1 e PC2 em função do tempo, dos óleos vegetais ozonizados
25 26 28 34 35 36 38 40 40 41 41 42 42 44 44 45 45 46 46 49 51 52 53 54 55 57
XII
LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1. Catalise do oxigênio em ozônio por raios U.V solares Equação 2. Dose de ozônio com aplicação terapêutica Equação 3. Índice de uniformidade
19 23 31
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LISTA DE TABELAS Tabela 1. Efeitos tóxicos do ozônio nos seres humanos Tabela 2. Concentração terapêutica de ozônio para diferentes enfermidades Tabela 3. Descrição de etapas e comandos utilizados para processamento de imagens em ImageJ Tabela 4. Parâmetros medidos em cada amostra de óleo vegetal ozonizado Tabela 5. Valores de densidade e viscosidade dos óleos vegetais (a 20°C) Tabela 6. Possíveis grupos funcionais novos, derivados do oxigênio no espectro de óleos vegetais ozonizados
20 24 37 43 61 62
XIV
SUMÁRIO 1.
INTRODUÇÃO 1.1. Objetivo geral 1.2. Objetivos específicos 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Ozonioterapia 2.1.1. Geração de ozônio terapêutico e concentrações adequadas 2.1.2. Aplicação do ozônio medicinal 2.2. Óleos vegetais ozonizados 2.2.1. Produção de óleos vegetais ozonizados 2.3. Microscopia óptica 2.4. Espectroscopia Raman 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Tipologia do estudo 3.2. Amostras 3.3. Geração de ozônio 3.4. Ozonização de óleos vegetais 3.5. Microscopia óptica 3.5.1. Aquisição de imagens 3.5.2. Processamento de imagens 3.6. Espectroscopia Raman 3.6.1. Aquisição dos espectros 3.6.2. Tratamento dos espectros 4. RESULTADOS 4.1. Microscopia óptica 4.2. Espectroscopia Raman 5. DISCUSSÃO 6. CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
15 18 18 19 19 22 24 25 26 29 30 32 32 32 32 33 34 34 36 37 38 38 39 39 46 56 61 62
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1. INTRODUÇÃO A História revela que ao longo das últimas décadas, o uso do ozônio vem apresentando inúmeros benefícios no tratamento de diferentes doenças, tanto na medicina tradicional quanto na medicina alternativa. Por mais de 150 anos, milhões de pessoas têm sido favorecidas com os efeitos positivos do ozônio que elimina focos de doenças e permite, por meio de respostas naturais, a melhora do organismo aproveitando a ação do gás. O químico Alemão Christian Frederick Schönbein foi o primeiro a usá-lo com fins industriais em 1840, ele sintetizou-o e deu-lhe o nome de ozônio, depois em 1875 foi usado pelo cientista Von Marum, também para aplicações industriais. Na odontologia foi usado primeiramente pelo Dr. Fisch (1915) e na medicina pelo Dr. Wolf (1914 -1918) durante a primeira guerra mundial, em combatentes, na limpeza e desinfecção de ferimentos. Posteriormente Payr apresentou, em 1935, trabalhos sobre os efeitos cicatrizantes do ozônio no Congresso da Sociedade de Cirurgia de Berlim. Em 1936, Auborg incluiu a ozonioterapia por insuflação retal e, em 1950, Joachim Haüsler desenvolveu um equipamento de uso eletromédico para dosificação do ozônio no âmbito terapêutico. Em 1972, foi fundada a Sociedade Médica Alemã de Ozonioterapia (Bocci, 2005). Em 1980, a mesma declarou que até esse ano foram tratados com ozônio 384.775 pacientes, com um mínimo de 5.579.238 aplicações e taxa de efeitos colaterais de 0.0005% por aplicação, resultando em 279 pessoas afetadas pelo tratamento. Comparativamente, em 1978, nos Estados Unidos, foram internadas 1.500.000 pessoas como consequência do uso de medicamentos prescritos, indicando que a ocorrência de efeitos colaterais do ozônio terapêutico são muito menores com a aplicação correta desta técnica (Nagib, 2006). Em Cuba, por ausência de medicamentos, um grupo interdisciplinar de terapeutas tem usado o ozônio para o tratamento de doenças severas e confirmaram suas múltiplas propriedades farmacológicas. Em 1988, o grupo começou um projeto para demonstrar os mecanismos de ação do ozônio no sangue e no corpo humano. Hoje é totalmente claro que o ozônio se dissolve rapidamente na água, no plasma e em fluidos biológicos, imediatamente reage com as biomoléculas e gera mensageiros importantes como: ROS (espécies reativas do oxigênio) e LOPs (produtos de oxidação lipídica) e desaparece, sua atuação pode
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ser explicada com conhecimentos clássicos de bioquímica, fisiologia e farmacologia. Tem sido testado e demonstrado, em diversas enfermidades, que o ozônio induz a adaptação do estresse oxidativo crônico equilibrando tanto o sistema antioxidante quanto a liberação de proteínas antioxidantes. Assim, esses benefícios do ozônio restauram a saúde e reativam funções biológicas (Bocci, 2005). Como opção para facilitar a manipulação do ozônio terapêutico, melhorar seu armazenamento, evitar sua rápida degradação e permitir um tratamento extrahospitalar, desenvolveu-se uma fórmula de ozônio derivado com óleo vegetal ozonizado. É um produto 100% natural, livre de aditivos, com boa estabilidade e atividade biológica. Foi aprovado pelos ensaios de toxicidade estabelecidos internacionalmente como LD50 oral e intraperitoneal, irritação oftálmica e dérmica, sensibilização, foto toxicidade e teratogenicidade (Rodríguez et al., 1990). Apresenta também excelente atividade biológica local e efeito terapêutico similar ao do ozônio gasoso. A utilização de óleos vegetais ozonizados representa uma alternativa cada vez mais explorada e promissora para o tratamento de múltiplas doenças, causadas por: bactérias, fungos, vírus, e problemas dermatológicos em geral, porém tem limitada evidência científica com respeito às características físico-químicas e estruturais, o que dificulta sua incorporação à prática clínica (Diaz et al., 2008). Foram caracterizados cinco óleos vegetais ozonizados, sendo eles: girassol, glicerina, azeite de oliva, soja e vaselina. Estes óleos foram escolhidos como amostras a ser ozonizados porque são validados para consumo humano e de uso comercial. Consideraram-se suas propriedades terapêuticas e dados bibliográficos destacando suas aplicações farmacológicas, dermatológicas e cosméticas. As técnicas de diagnóstico utilizadas são rápidas, não destrutivas e podem ser empregadas para controle de qualidade, sendo a espectroscopia Raman utilizada para óleos vegetais comestíveis e a microscopia óptica para caracterização de espumas de consumo humano. Permitem avaliar as mudanças apresentadas nos óleos, depois do processo de ozonização, e permitem analisar a estabilidade dos produtos partindo da capacidade dos mesmos de servir como reservatório do gás. A Espectroscopia Raman é uma técnica óptica que fornece em poucos segundos informação qualitativa e quantitativa das frequências vibracionais dos grupos funcionais de qualquer material ou composto orgânico. Diferentes estudos têm validado esta técnica para determinar o grau de insaturação de ácidos graxos em óleos vegetais (Baeten et al., 1998; Sadeghi-Jorabchi et al., 1990). Isso é
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relevante para detectar alterações espectrais nos óleos vegetais ozonizados. Ainda, a técnica Raman permite visualizar e analisar, claramente, o que acontece molecularmente, nos óleos vegetais, quando ozonizados, tanto no referente a reação entre os produtos e mudanças apresentadas, em relação ao tempo de ozonização, presença de aditivos, à dose de ozônio aplicada, e outros aspectos que ressaltam a versatilidade da técnica e a repetibilidade do processo quando necessária. A Espectroscopia Raman tem se tornado útil para o controle de qualidade de óleos comestíveis permitindo determinar a pureza dos mesmos e quantificar o conteúdo de gorduras, e saturação, aspecto que favorece a aplicação da técnica para ser utilizado também no controle de qualidade de óleos vegetais ozonizados. O estudo por microscopia óptica permite verificar a presença de bolhas de ozônio dentro dos óleos vegetais e possibilita realizar a análise morfométrica das mesmas, sua relação com a estrutura do produto e sua qualidade (Castillo Castañeda et al., 2006).
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1.1.
Objetivo geral
Ozonizar e caracterizar cinco óleos vegetais, dirigidos à aplicação dermatológica, utilizando espectroscopia Raman e microscopia óptica. 1.2.
Objetivos específicos
1.2.1. Ozonizar óleos vegetais utilizando o método de inserção de bolhas; 1.2.2. Caracterizar morfometricamente bolhas de ozônio inseridas em diferentes óleos vegetais usando microscopia óptica; 1.2.3. Analisar as características espectrais de óleos vegetais ozonizados utilizando espectroscopia Raman.
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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Ozonioterapia O ozônio é uma molécula com três átomos de oxigênio, podendo ser definido como oxigênio em seu estado mais ativo (Kunz et al., 1999). É considerado uma molécula natural, instável, mas em equilíbrio dinâmico. O ozônio é geralmente encontrado na estratosfera a uma altura de 22 km, em condições ideais é incolor e de odor pungente, considerado um agente oxidante forte, depois do flúor e do persulfato, permitindo-lhe reagir com uma grande classe de compostos. Em altas concentrações, sua cor é azul, sua densidade é 1,66 g/cm 3, seus pontos de fusão e ebulição são 193 e 112ºC respectivamente, é pouco solúvel em água (1,09 g/L a 0ºC). Decompõe-se espontaneamente, seu tempo de vida depende da temperatura, por exemplo: a 30 oC se desintegra em 25 minutos, a 20°C se desintegra em 40 minutos, e a -50°C pode levar até três meses para se decompor. A concentração máxima na estratosfera é de 10 p.p.m (partes por milhão), equivalente a 0,02 µg/mol (Bocci, 2005). Os raios U.V solares são catalisadores na produção do ozônio:
[Eq. 1]
Equação 1: Catálise do oxigênio em ozônio por raios U.V solares. Fonte: Bocci, 2005
A presença do ozônio na atmosfera é muito importante, pois absorve os raios U.V emitidos pelo sol e protege os sistemas biológicos. No entanto, o excesso de solventes, tais como NO (óxido nitroso), derivados do cloro (CFC S), monóxido de carbono (CO) e metano (CHA) dissociam o ozônio existente e evita a formação de novas moléculas de O3. O ozônio puro ou associado a outros componentes, é tóxico para pulmões, olhos, nariz, pele, em particular para a mucosa respiratória (Nagib, 2006). A Tabela 1 mostra os efeitos tóxicos do ozônio em organismos vivos quando inalado.
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Tabela 1: Efeitos tóxicos do ozônio nos seres humanos. Fonte: Bocci, 2005
Concentração de ozônio no ar (p.p.m)
Efeitos tóxicos
0,1
Lacrimação e irritação do sistema pulmonar
1,0 - 2,0
Rinite, dor de cabeça, náusea e refluxo, agrava predisposição a asma.
2,0 - 5,0 (10 - 20 minutos)
Diarréia que se incrementa progressivamente, espasmo bronquial.
5,0 (60 minutos)
Edema pulmonar e ocasionalmente paralisia respiratória.
10,0 (4 horas)
Morte
50,0
Morte instantânea
O ozônio pode ser protetor ou ofensivo para seres humanos dependendo da concentração e via de contato, por isso sua utilização em medicina é controversa, embora existam muitos estudos que demonstrem a eficácia terapêutica. É muito importante não usá-lo em presença de NO 2 (dióxido nítrico), CO2 (dióxido de carbono) e CO (monóxido de carbono). As análises têm ajudado a definir os mecanismos de ação do O 3, quais as doses que representam perigo a saúde e quais as não-prejudiciais. Segundo a OMS (Organização Mundial da Saúde) o limite permitido para o trabalho com ozônio é de 8 h com uma concentração de 0,06 p.p.m (0,12 µ g/L) (Bocci, 2005). De acordo com a patologia apresentada pelo paciente, a ozonioterapia pode ser aplicada por via vaginal, retal (por insuflação), local, hemática, endovenosa, infiltrações, mesoterapia e através de pontos de acupuntura (sistêmica), em água ou óleo. As mudanças químicas que surgem dependem dos altos e baixos nas relações do oxigênio no metabolismo e no ciclo de Krebs, na formação de altas quantidades de prótons necessários para restaurar as capacidades tampão de oxidantes que defendem o sistema dos radicais livres e dos pró-oxidantes. O ozônio é capaz de manter o equilíbrio dinâmico do metabolismo das membranas celulares e o poder desinfetante do mesmo se dá pela sua capacidade e habilidade de destruir,
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neutralizar e suprimir o crescimento de micro-organismos patogênicos. Uma concentração de 0,35 mg/L de ozônio, reduz pelo menos, 5 escalas logarítmicas na população de aproximadamente 1x10 6 bactérias de Eschirichia coli , Nibrio cholerhae , Salmonella typhy , Yersenia enterocolítica , Pseudomona aeruginosa , Aeromona hidrophilae, Disteria monoyitegenes e Staphylococus aureus , quando se compara à concentração de 0,5 mg/mL de cloro se observa a ação similar dos componentes, mas com concentração de ozônio menor que 1 milésimo (Nagib, 2006). Ao tratamento com ozônioterapia são atribuídos efeitos como: Inibição e destruição de micro-organismos patogênicos em qualquer parte do corpo graças ao poder que o O 3 tem de penetrar e difundir-se nos tecidos; •
Aumento da elasticidade ao nível hemático, permitindo maior penetração do oxigênio na micro circulação; •
Produção de 2,3 difosfoglicerato que atua como intermediário da glicólise: processo no qual os açúcares se decompõem para converterem-se em energia e água, elementos necessários para manter os tecidos oxigenados; •
Aumento da formação de peroxidase com papel primordial no metabolismo celular através do sistema redox, devido ao ozônio que se une às cadeias duplas dos ácidos graxos insaturados da porção fosfolipídica da membrana celular dos glóbulos vermelhos; •
Afinidade com o grupo sufidrilo (-SH) característicos nos aminoácidos essenciais, cisteína e metonina, que permite interferir no metabolismo das proteínas, proporcionando um papel imuno-modelador e imuno-restaurador (Valacchi & Bocci, 2000). A ozonioterapia é aceita como uma técnica que consiste na aplicação de doses em baixas quantidades do gás, aplicadas no corpo por diversas vias e que produz no organismo mudanças químicas que dependem da concentração, e seu papel se torna essencial devido à ativação das reações dependentes do oxigênio (Esterbauer, 1991). Nos últimos 40 anos, houve o incremento da prática da ozonioterapia que mostrou excelentes resultados dependendo das técnicas, dos métodos de uso e dos equipamentos utilizados. Diferentes sociedades médicas tem implementado o uso da ozonioterapia, sendo essa terapia avançada nos seguintes países: Alemanha, Cuba, Itália, Espanha, Japão, Rússia, Estados Unidos, Argentina, •
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Chile e México. Da mesma maneira, em todos estes países, existe a preocupação de como é manipulado o ozônio e os efeitos que ele produz (Díaz et al., 2008). 2.1.1. Geração de ozônio terapêutico e concentrações adequadas Os geradores de ozônio devem ser seguros, não tóxicos, reproduzíveis e construídos com materiais resistentes ao gás, como: aço inoxidável 31GL, titânio puro grau dois, vidro, teflon ou poliuretano. É comum que os geradores de ozônio medicinal tenham como princípio dois tubos metálicos, circuncêntricos e separados por um material isolante. A estes dois tubos metálicos é aplicada uma diferença de potencial entre 4 e 13 kV (efeito corona) e por eles passam uma determinada concentração de oxigênio. Essa técnica produz como resultado, um gás contendo 5% ozônio e 95% de O 2. O rendimento de geração de ozônio varia entre 1 a 4% para sistemas de alimentação com ar e de 6 a 14% para sistemas alimentados com oxigênio (Kunz et al., 1999). A concentração de ozônio durante a produção, é dependente dos seguintes fatores: Tensão: maior tensão de polarização implica no aumento da concentração do ozônio; •
Espaço entre eletrodos: a geração de ozônio aumenta com a diminuição da espessura da camada dielétrica, respeitando-se o limite de isolação; •
Fluxo de oxigênio: a concentração de ozônio é diretamente proporcional ao fluxo de oxigênio por unidade de tempo, sendo expresso em volume (L/min) e normalmente regulado por 1/10 L/min. •
O critério de cálculo das doses de ozônio é função de: •
Concentração de ozônio expresso por µg/mL;
Pressão barométrica (mmHg), diferente da normal, por razões de segurança usa-se pressão hiperbárica, •
•
Volume total da mistura de gás composta por oxigênio e ozônio.
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A dose de ozônio é equivalente ao volume de gás (VG) expresso em mL, multiplicado pela concentração de ozônio (CO) expresso em µg/mL, sendo definido conforme a equação 2 (Bocci, 2005): Dose de O3 = VG [mL] x CO [µg/mL]
[Eq. 2]
Equação 2: Dose de ozônio com aplicação terapêutica. Fonte: Bocci, 2005
A dose de ozônio para uso medicinal está entre 1-100 µg/mL, segundo a sociedade médica européia. Os geradores de ozônio medicinal devem produzir concentrações equivalentes a 2, 5, 10, 20, e 30 µg/mL. Para medir a concentração de ozônio em tempo real são aplicadas técnicas fotométricas, isto é possível porque o ozônio tem importante absorção na região espectral próxima a 253 nm e 600 nm. Outro método aceito para medição de concentrações de ozônio (especialmente para óleos ozonizados) é considerado padrão pela IOA (International Ozone Association) na Europa é o iodométrico descrito por Masschelern et al. (1996). É de grande importância em todos os métodos de análise, aplicar o gás de maneira imediata para que não ocorram mudanças (± 1%) na concentração do mesmo (KUNZ et al., 1999). Na Tabela 2 se mostra um guia de concentrações terapêuticas de ozônio para diferentes enfermidades. Tabela 2: Concentração terapêutica de ozônio para diferentes enfermidades. Fonte: Bocci, 2005
Enfermidade
Concentração de O3 (µg/mL) Inicio
Final
Infecciosa
20-25
70
Vascular
20
40
Degenerativa
20
30-40
Respiratória
10
30-40
Auto-imune
50
80
Tumores metastáticos
25
70-90
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2.1.2. Aplicação do ozônio medicinal Existem várias vias de aplicação do ozônio terapêutico, dentre elas as parenterais e tópicas que são mostradas nas figuras 1 e 2. Atualmente, a ozonioterapia é utilizada em diferentes modalidades, o método mais utilizado é a auto-hemoterapia, porém desenvolveram-se outras opções especialmente as de exposição corporal ao ozônio e aplicações tópicas, em que se destaca o uso de óleos ozonizados (Werkmeister, 1995). Bocci (2002) realizou estudos dos efeitos biológicos induzidos pelo ozônio no corpo humano e afirma que o sangue é o melhor veículo para transmitir os mensageiros gerados pelo O 3, em segundo lugar vem a pele, o tecido subcutâneo, músculos e, por fim o lúmen.
Subcutâneo
Intravenoso
Intra-arterial
Administração por via parenteral
Intramuscular
Intraperitoneal
Intralesional
Miofasial
Intra-articular
Intradiscal
Periarticular
Figura 1: Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via parenteral. Fonte: adaptado de Werkmeister, 1995
25
A ozonioterapia é uma técnica amplamente utilizada em diferentes enfermidades e se combinada com as terapias convencionais, os resultados são potencializados. Entre suas principais aplicações destacam-se o tratamento de enfermidades isquêmicas, vasculares, (causadas por arterioscleroses, diabetes, uremia, etc.), cura de feridas crônicas (pé diabético, chagas, fistulas, lesões da pele e boca) e infecções vaginais e retais.
Nasal 30-60s, 20 µg/ml
Oral 30-60s, 20µgrml
Auricular
Uretero-vesilcal 3-5-15 µg/ml
Administração por via tópica
Vaginal 50-100µg/ml
Intravesical
Retal
Cutânea
Dental
Figura 2: Rotas de aplicação do ozônio medicinal por via tópica ou regional. Fonte: adaptado de Werkmeister, 1995
2.2. Óleos vegetais ozonizados O óleo vegetal ozonizado é o produto da reação entre o ozônio e o óleo vegetal em condições apropriadas, sendo considerado um medicamento 100% natural que se apresenta em diferentes formas: líquido oleoso, emulsões, cremes, pomadas, supositórios, cápsulas líquidas, entre outros; tem atividades biológicas locais e
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efeitos terapêuticos similares ao do ozônio gasoso ministrado (SAKASAKI et al., 2006). O óleo ozonizado foi criado por médicos alemães no ano de 1905 com a finalidade de obter formulações de ozônio derivados, que possuem boa estabilidade (Diaz et al., 2008), para: facilitar a manipulação do ozônio gasoso, melhorar seu armazenamento, evitar sua rápida degradação, permitir um tratamento extrahospitalar e diminuir o risco de usá-lo na forma gasosa, em doses altas e inadequadas. O cientista Nicola Tesla aperfeiçoou a técnica borbulhando o ozônio de forma contínua durante três semanas através do óleo, criando um gel natural com ozônio em suspensão. Este produto foi chamado “ozo-oil”. Em 1954, o Dr. William Torska da universidade de A&M no Texas descobriu que o processo de ozonização de óleos vegetais gera uma vasta cadeia de espécies reativas do oxigênio (ROS) C10H1803 (MORALEDA, 2008). Desde o final de 1986 no laboratório de ozônio do Centro Nacional Cubano de Investigações Científicas (CNIC) têm sido realizados diferentes estudos sobre as possibilidades terapêuticas oferecidas pelos óleos ozonizados em diversas enfermidades, dando prioridade à sua ação anti-virica, anti-bacteriana e anti-micótica. Atualmente, existe no mercado Cubano um produto chamado OLEOZÓN®, registrado pela Doutora Renate Viebann. O produto é óleo de girassol ozonizado destinado ao tratamento da tênia perdis, úlceras, bactérias e fungos, entre outros (SECHI et al., 2001). Também existe outro medicamento denominado Bioperoxoil composto por óleos ozonizados com adição de ácido α-lipoico, foi criado na Universidade de Alfenas, na Espanha. No Hospital Universitário de Siena foi produzida uma preparação de óleo de oliva ozonizado, colocando ozônio no óleo em banho-maria pelo menos por 30 minutos ou até dois dias quando se solidifica e este é usado para tratamentos intra-hospitalares e não é comercial. Apesar do óleo ozonizado estar disponível em vários países, não há uma norma de preparação regularizada (Zanardi et al., 2008). 2.2.1 Produção de óleos vegetais ozonizados Os óleos vegetais ozonizados são gerados por meio do método de injeção direta de bolhas a qual consiste em inserir os óleos vegetais puros num recipiente com difusor de gás por onde é injetado o ozônio de uma maneira contínua a um fluxo constante. A Figura 3 mostra o diagrama desta operação.
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O rendimento dos compostos oxigenados dos óleos ozonizados depende das condições de reação como: meio, presença de aditivos, temperatura, tipo de reator, dose de ozônio aplicada e tempo de ozonização (Travagli et al., 2010).
Válvula de alívio de pressão
Recipiente com óleo vegetal
Gerador de ozônio
Fluxo constante de ozònio
Difusor de gás
Figura 3: Sistema para geração de óleos vegetais ozonizados.
O método de produção de óleos ozonizados pode ser diretamente relacionado ao método padronizado para geração de espumas por meio da difusão de gás. Este método é detalhadamente descrito por Kingsley et al. (2001) e Leduc (2007), os quais explicam o processo de oxidação em fase líquida quando um gás à base de oxigênio é injetado no interior do recipiente de um reator de coluna de bolhas que contém um líquido orgânico oxidável. Este é um sistema de alta energia que produz bolhas uniformes de diâmetro pequeno, fortemente impulsionado na forma de jato tendo como resultado uma espuma (Gardiner et al., 1999). Esta técnica é também conhecida como CAF (Compressed Air Foam) e tem sido usada durante várias décadas em poços de petróleo, na indústria de alimentação, cosmética e farmacêutica, entre outras (Magrabi et al., 2002). A estabilidade do produto resultante está fortemente influenciada pelo tamanho das bolhas, assim como a fração de gás líquido (Bawel et al., 1993; Gardiner & Dlugogorski, 1998; Castillo Castañeda et al., 2006), também existem vantagens frente a circularidade das bolhas que é o fator determinante da persistência das mesmas. À medida que as bolhas são menores e circulares, sua distribuição é mais uniforme e alta. Em relação inicial de gás-volume, o óleo será de excelente qualidade, terá uma ótima estabilidade e seu tempo de decomposição será maior. O comportamento ideal dos
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óleos vegetais ozonizados como espuma se dá quando as bolhas de ozônio são mais uniformes, com uma circularidade próxima a 1. Diferentes estudos têm demonstrado que a variação de parâmetros como pressão de injeção do gás e o fluxo do mesmo não são determinantes na qualidade do produto e sim o tempo de borbulhamento, o tamanho dos poros do difusor de bolhas, a dose de ozônio aplicada e o tamanho das bolhas (Castillo Castañeda et al., 2006, Magrabi & Dlugogorski, 1999). A reação do ozônio com óleos vegetais e lipídios ocorre, exclusivamente, nas ligações duplas de carbono-carbono presentes na insaturação dos ácidos graxos (Martínez et al., 2005). São formadas diferentes espécies oxigenadas como: peróxidos, ROS (espécies reativas do oxigênio), aldeídos, ácidos carboxílicos entre outros elementos que são responsáveis pela atividade microbiológica presentes nos óleos vegetais ozonizados. Além de desempenhar no organismo funções que incluem estimulação de vários sistemas enzimáticos de óxido-redução a qual influi, possivelmente, sobre o transporte do oxigênio aos tecidos e à cadeia respiratória mitocondrial, bloqueio de receptores virais e morte das células infectadas por vírus assim como um efeito sinérgico que reforça a capacidade fagocitária (Díaz Gomez & Gavín Sazatornil, 2005; Diaz et al., 2005b; Diaz et al., 2006). Segundo o mecanismo de Criegge que descreve o processo de ozonização de compostos insaturados, durante a reação se formam diferentes produtos oxigenados que ampliam o índice de peróxidos e contribuem com o aumento do conteúdo de oxigênio nas amostras ozonizadas (Bailey, 1978; Rodríguez et al., 1990; Bocci et al., 2005; Díaz Gomez & Gavín Sazatornil, 2005; Díaz et al., 2005b; Díaz et al., 2006; Lee & Chan, 2007; Zanardi et al., 2008) o qual incrementa seu poder benéfico a nível terapêutico. Este método foi exposto pela primeira vez por R. Criegge em 1975, (Bailey, 1978) e, cuidadosamente, detalhado por Lee & Chan (2007). Muitos estudos foram feitos para desenvolver novas técnicas analíticas do óleo ozonizado que implicam a mínima manipulação da amostra e que permitem identificar óleos vegetais e lipídios, porém são escassos na literatura dados sobre os espectros de ácidos graxos ozonizados e análises morfométricas das bolhas no óleo ozonizado. Nas pesquisas realizadas para caracterização de óleos vegetais ozonizados destacam-se técnicas de diagnóstico como: determinação do índice de peróxidos,
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análise elementar e cromatografia gasosa (especialmente para parâmetros de qualidade) (Zanardi et al., 2008; Díaz et al., 2006); Também tem se utilizado métodos espectroscópicos, cromatográficos (Sadowska et al., 2008), 1H NMR (Díaz Gomez & Gavín Sazatornil, 2005), e NMR (Díaz & Gavín, 2007), entre outros. Estas pesquisas coincidem que a reação dos óleos vegetais com o ozônio e seus produtos são identificados de acordo com o mecanismo de Criegge. 2.3. Microscopia Óptica A microscopia óptica é uma ferramenta de grande ajuda que reduz as limitações da visão humana, com esta técnica pode-se observar o tamanho, morfologia, quantidade, distribuição das bolhas de ozônio dentro do óleo vegetal; estes aspectos permitem definir seu padrão micro-estrutural. Geralmente apóia-se de programas específicos para análise digital das imagens captadas (microfotografias) (Campbell & Mougeot, 1993). O trabalho de Castillo Castañeda et al. (2006) propõe uma metodologia baseada na microscopia óptica e o processamento digital de imagens para a extração automatizada de características importantes em um líquido impregnado de bolhas, como é o óleo vegetal ozonizado. A simples observação das imagens permite obter uma descrição qualitativa dos parâmetros do óleo vegetal ozonizado, porém para que estes parâmetros sejam válidos é necessário obter informação quantitativa confiável e seguir um conjunto de etapas sequenciais: aquisição, processamento, análise das imagens e interpretação dos resultados. Normalmente, todo o processo de aquisição de imagens se encontra exposto a condições próprias do experimento que podem reduzir, severamente, a capacidade de extrair características geométricas de forma precisa. Os possíveis problemas apresentados são: sistemas de iluminação deficiente, regiões da imagem fora de foco, escassa uniformidade na cor das partículas, baixa resolução do dispositivo de digitalização; estes problemas são solucionados com aplicação de algoritmos de detecção, contagem e medição de partículas (neste caso, bolhas de ozônio dentro do óleo vegetal). Estes algoritmos são suficientemente robustos para serem aplicados de forma automática a um número considerável de imagens. Os parâmetros utilizados para avaliação de espumas por meio de microscopia óptica e digitalização de imagens são:
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Uniformidade: depende da quantidade de bolhas, do tamanho das mesmas e da relação destes parâmetros. Uma espuma será considerada uniforme quando suas bolhas apresentarem o mesmo tamanho. O índice de uniformidade (FUI) pode ser calculado por meio da equação mostrada na equação 3, descrita por Bayvel & Orzechowski (1993). •
FUI =
φ ( D0,9 ) − φ ( D0,1 ) m
∑ ∆n
[Eq. 3]
i
i =1
Equação 3: Índice de uniformidade numa espuma. Fonte: Bayvel & Orzechowxki (1993)
Onde Φ(D 0,9) e Φ(D 0,1) são valores correspondentes à 90% e à 10% da distribuição acumulada Φ(D ) e ∑∆n i é a somatória do número de bolhas dos m intervalos compreendidos entre Φ(D 0,9) e Φ(D 0,1). O FUI varia sempre entre 0 e 1 sem atingir os extremos, os valores próximos de zero correspondem à baixa uniformidade e os próximos do um correspondem à uniformidade elevada. Persistência: Entende-se como sendo a capacidade do óleo vegetal em reter as bolhas de ozônio e está ligada à média da circularidade das bolhas, quando as bolhas são mais circulares (valor médio próximo a 1) é menor a probabilidade de ruptura das mesmas (Bayvel & Orzechowski, 1993). •
2.4. Espectroscopia Raman O efeito Raman é uma dispersão inelástica da luz, em que se observa uma mudança de frequência em um fóton incidente, quando este interage com o material. Foi definido, em 1928, por Chandrasekhara Vekata Raman, o qual chamou inicialmente de “fluorescência fraca” e mais tarde de “nova radiação” (Clark & Hester, 1985). O resultado prático de uma medida espectroscópica é um espectro que consiste de intensidades versus energia do fóton, expressa em nanômetros (nm), Hertz (Hz), elétron volt (eV) ou centímetros recíprocos (cm -1). Os espectros são um conjunto de picos derivados de aspectos fundamentais, relacionados aos modos vibracionais normais de uma molécula, estes picos aparecem combinados ou
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sobrepostos formando bandas de um espectro. Cada pico ou banda é caracterizado pela: posição máxima do pico (λmax), intensidade do pico máxima e integrada (Imax e lint, respectivamente) e largura a meia altura (FWHM), na qual λmax dá informações sobre o tipo de vibração, Imax fornece informação do número de grupos moleculares vibrando com determinada freqüência e FWHM depende das condições do instrumental utilizado (largura da fenda do espectrômetro, rede de difração, qualidade espectral do feixe de excitação, etc.) e das condições intrínsecas da molécula (número e natureza das interações físicas com a molécula vizinha) (Hollas, 2004). As primeiras aplicações biomédicas da espectroscopia Raman datam do final dos anos 80 e início dos anos 90, a técnica se tornou uma ferramenta potencialmente importante na análise bioquímica de tecidos biológicos. Atualmente, permite o estudo de doenças humanas in vitro por meio da detecção de componentes bioquímicos em diferentes produtos, promovendo diagnósticos em tempos muito curtos e não invasivos (Dou et al., 1997). A espectroscopia Raman tem sido vastamente utilizada para caracterização e análises de óleos vegetais, especialmente na área de controle de qualidade, na qual se tem estabelecido bandas espectrais dos mesmos e identificado claramente seus componentes e o efeito que produz diferentes processos (especialmente frituras) sobre estes óleos. Lee et al. (2007) foi uns dos primeiros a utilizar espectroscopia Raman para o estudo de óleos ozonizados e sustenta que esta técnica é totalmente eficaz e confiável para analisar as reações causadas pelo ozônio a diferentes substâncias (particularmente a óleos vegetais), seja a curto, médio ou longo prazo. Em seu estudo também demonstrou a formação de produtos por oxidação lipídica sendo predominantes os grupos: peróxidos, ozônidos (O-O), carbonílicos (C=O) e hidroxílicos (O-H). Os diagnósticos de processos biológicos e químicos (entre outros) por meio da espectroscopia Raman diminuem o tempo de análises, facilita a manipulação da amostra e tem mostrado excelentes resultados, por essa razão se tem implementado o uso desta técnica em laboratórios, tendo como consequência direta avanços na técnica e no instrumental (Dou et al., 1997).
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3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Tipologia do estudo O presente estudo é observacional analítico, planificado para caracterizar cinco óleos vegetais submetidos à ozonização. Essa caracterização realizou-se por técnicas ópticas, rápidas e não destrutivas. 3.2. Amostras Foram utilizados cinco óleos vegetais comerciais, validados para consumo humano, de marcas conhecidas no Brasil e uso comercial, sendo eles: óleo de girassol, glicerina, azeite de oliva, óleo de soja, e vaselina, todos com apresentação líquida. Para a escolha das amostras, consideraram-se estudos de ozonização realizados anteriormente e os registros sobre sua aplicação nos aspectos farmacológico, dermatológico e cosmético (Rodríguez et al., 1990; de la Cruz, 1997; Carelli, 1998; Devlin, 2004; Zanardi et al., 2008). 3.3. Geração de ozônio O método usado para geração de ozônio, conhecido como efeito corona, foi descrito por Kunz A, et al (1999). O ozônio se produz pela passagem de ar com fluxo constante através de uma câmara hermeticamente selada que contêm dois eletrodos submetidos a uma elevada diferença de potencial que causa a dissociação do oxigênio presente, sendo a formação de ozônio consequência da recombinação de espécies radicais de oxigênio com as moléculas existentes no sistema. O equipamento gerador de ozônio é de marca DISUFIL (Colômbia), modelo Ozonofil JE9000 (Figura 4). Este equipamento é constituído por um compressor que proporciona um fluxo constante de 270 L/h e um reator que utiliza uma tensão de entrada de 5 kV. Dentro da câmara geradora de ozônio, encontram-se duas malhas metálicas de formato tubular concêntricas, separadas por um material dielétrico e neste caso composto por um tubo de vidro. Às malhas metálicas se aplicam a tensão de 5 kV, enquanto o ar do compressor circula pelo interior da câmara. O
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produto final é ozônio com uma concentração de 2,7 µg/L (1,35 p.p.m) quando alimentado com oxigênio e 0,10 µg/L (0,05 p.p.m) quando alimentado com ar (presente caso).
Figura 4: Equipamento gerador de ozônio utilizado (marca DISUFIL, modelo Ozonofil JE9000).
3.4. Ozonização de óleos vegetais Para a ozonização de óleos vegetais utiliza-se um reator de coluna de bolhas, composto por um cilindro de aço inoxidável (Figura 5) com capacidade de 150 mL de fluído. Ele contém um compartimento que aloja uma cápsula porosa de sílica (poros entre 50 µm e 100 µm), uma entrada de ozônio posicionada na parte inferior e a saída do gás na parte superior.
Figura 5: Sistema para ozonização de óleos vegetais.
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Para o procedimento de ozonização de óleos vegetais, utilizou-se 100 mL de cada amostra (óleo de girassol, glicerina, azeite de oliva, óleo de soja, e vaselina; respectivamente) mantidos no reator de bolhas durante um período contínuo de 11 h (cada amostra de óleo, respectivamente) a uma temperatura ambiente de 22°C. 3.5. Microscopia óptica 3.5.1. Aquisição de imagens Foram obtidas microfotografias com um microscópio LEICA DIASTAR QG2-32, com os objetivas de 4X/0,10, 10x/0,22, L20X/0,30 e L40X/0,50, armazenadas em um PC mediante o software QWin (versão V2.5) com formato TIF e com resolução de 764x574 pixels. Foi adquirido um total de 60 imagens (12 imagens para cada óleo ozonizado dividido em grupos de três para cada objetiva), dentre as quais foram selecionadas as que apresentavam maior nitidez, sendo estas, processadas digitalmente. Analisaram-se 20 fotos no total, quatro para cada óleo ozonizado (um por objetiva). A figura 6 (a-t) mostra as microfotografias selecionadas para a análise.
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a) Óleo de girassol ozonizado, objetiva 4X/0,10
b) Óleo de girassol ozonizado, objetiva 10X/0.22
c) Óleo de girassol ozonizado, objetiva 20X/0.30
d) Óleo de girassol ozonizado, objetiva L40X/0.50do
e) Óleo de oliva ozonizado, objetiva 4X/0,10
f) Óleo de oliva ozonizado, objetiva 10X/0.22
g) Óleo de oliva ozonizado, objetiva 20X/0.30
h) Óleo de oliva ozonizado, objetiva L40X/0.50do
i) Óleo de soja ozonizado, objetiva 4X/0,10
j) Óleo de soja ozonizado, objetiva 10X/0.22
k) Óleo de soja ozonizado, objetiva 20X/0.30
l) Óleo de soja ozonizado, objetiva L40X/0.50do
m) Glicerina ozonizada, objetiva 4X/0,10
n) Glicerina ozonizada, objetiva 10X/0.22
o) Glicerina ozonizada, objetiva 20X/0.30
p) Glicerina ozonizada, objetiva L40X/0.50do
q) Vaselina ozonizada, objetiva 4X/0,10
r) Vaselina ozonizada, objetiva 10X/0.22
s) Vaselina ozonizada, objetiva 20X/0.30
t) Vaselina ozonizada, objetiva L40X/0.50do
Figura 6: Microfotografias dos óleos vegetais ozonizados.
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3.5.2. Processamento de imagens O processamento de imagens foi realizado com o software ImageJ (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA), conforme procedimento descrito na tabela 3. Tabela 3: Descrição de etapas e comandos utilizados para processamento de imagens em ImageJ.
Procedimento Abrir imagem Retirar borda da imagem Converter intensidade da cor em cada pixel
Calibrar programa com microscópio para realizar medições
Ajuste para maior visualização de bolhas
Medições
Opção de menu
Comando
File
Open
Seleção retangular
Seleção de imagem
Edit
Clearoutside
Image
Type 8 bit
Open
Seleção de imagem
Seleção de linha
Medir imagem
Analyse
Set scale (ajustar valores, global e ok)
Edit
Invert
Image
Adjust Brigthness/contrast
Image
Adjust Threshold
Analyse
Set measurements (seleccioar medidas a realizar)
Analyse
Analyse particles
Results
Summarize
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3.6. Espectroscopia Raman Foi utilizado um espectrômetro Raman dispersivo (modelo P1-, Lambda Solutions, Inc., MA, USA) que utiliza um laser de diodo multimodo estabilizado, sintonizado em 830 nm e 350 mW de potência de saída (Figura 7). Este sistema possui um cabo de fibras ópticas “Raman probe” para excitação e coleta do sinal Raman da amostra. Este cabo foi posicionado a 5 mm da parede lateral do porta-amostras, que continha o óleo em processo de ozonização, de maneira que as alterações espectrais pudessem ser acessadas via fibra óptica, com repetibilidade da geometria de excitação e coleta do sinal. O espectrômetro do sistema Raman possui resolução de aproximadamente 2 cm-1, com faixa espectral útil entre 800 a 1800 cm -1. A detecção do sinal luminoso espalhado pela amostra é efetuada por uma câmera CCD “back thinned, deepdepletion” 1340X100 pixels refrigerada por elemento termoelétrico (Peltier) ventilado, atingindo uma temperatura de trabalho de -75ºC. O espectrômetro foi calibrado utilizando as posições das bandas principais do naftaleno, que possui bandas intensas e características na região espectral de interesse (“fingerprint”). A calibração espectral de intensidade foi realizada pelo fornecedor do equipamento e consiste na coleta do espectro de uma lâmpada de filamento de tungstênio com espectro rastreado pelo NIST (“National Institute of Standards and Technology”).
Figura 7: Sistema Raman Dispersivo utilizado na coleta dos dados espectrais.
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3.6.1. Aquisição dos espectros A aquisição dos espectros foi realizada com o software RamanSoft, que coletou o espectro Raman a cada 15 min (o espectro possui tempo de leitura de 20s), por um período de 5 horas durante o processo de ozonização. A primeira aquisição para cada amostra foi no tempo zero do processo de ozonização, fornecendo espectro original de cada óleo. As aquisições seguintes tiveram como objetivo, verificar os efeitos do ozônio no espectro dos óleos identificando elementos de oxidação lipídica, observado através das alterações nas bandas espectrais das ligações duplas e ao aparecimento de novas espécies oxigenadas. De maneira a refinar-se os dados, os espectros Raman também foram submetidos à Análise de Componentes Principais. 3.6.2. Tratamento dos espectros Os espectros obtidos passaram por diversas etapas de pré-processamento, que incluem calibração em frequência (eixo deslocamento Raman), subtração do espectro de fluorescência de fundo das amostras (sinal de baixa frequência) e filtragem do ruído de alta frequência. Essas operações facilitam a interpretação dos dados e contribuem para simplificar a análise estatística. A filtragem realizou-se por um filtro digital e implementado com a utilização do software Matlab (The Mathworks, MA, USA, versão 4.2) conforme descrito por Cunha et al. (2003).
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4. RESULTADOS 4.1. Microscopia óptica Na Figura 8 observa-se a microfotografia do óleo de girassol ozonizado, da primeira amostra analisada, na Figura 9 se mostram os passos da digitalização das microfotografias, tendo como exemplo o óleo de girassol.
Figura 8: Microfotografia da amostra do óleo de girassol ozonizado.
Óleo de girassol ozonizado - 8 bits
Óleo de girassol ozonizado após tratamento digital
Óleo de girassol ozonizado Imagem binarizada
Figura 9: Passos realizados nas microfotografias para análise digital.
Nas Figuras 10 a 13 mostram-se as microfotografias da glicerina ozonizada, do azeite de oliva ozonizado, do óleo de soja ozonizado e da vaselina ozonizada, respectivamente, com imagem binarizada das mesmas.
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a)
Glicerina ozonizada
b)
Glicerina ozonizada - Imagem binarizada
Figura 10: Microfotografia da glicerina ozonizada e imagem binarizada.
a)
Azeite de oliva ozonizado
b)
Azeite de oliva ozonizado - Imagem binarizada
Figura 11: Microfotografia do azeite de oliva ozonizado e imagem binarizada.
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a)
Óleo de soja ozonizado
b)
Óleo soja ozonizado - Imagem binarizada
Figura 12: Microfotografia do óleo de soja ozonizado e imagem binarizada.
a)
Vaselina ozonizada
b)
Vaselina ozonizada - Imagem binarizada
Figura 13: Microfotografia da vaselina ozonizada e imagem binarizada.
Na Tabela 4 são mostrados os valores médios encontrados para cada uma das amostras analisadas.
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Tabela 4: Parâmetros medidos em cada amostra de óleo vegetal ozonizado.
Óleo ozonizado
Número de bolhas
Média da área das bolhas (µm)
Média de circularidade das bolhas
Desvio Padrão
Girassol
1167
1,16
0,95
0.11
Glicerina
639
7,68
0,87
0.17
Oliva
1098
1,42
0,97
0.08
Soja
77
0,58
0,87
0.20
Vaselina
543
0,01
0,69
0.19
Nas Figuras 14 a 18, são mostrados os histogramas de distribuição das bolhas de ozônio para cada óleo vegetal.
Figura 14: Distribuição de bolhas para óleo de girassol ozonizado.
43
Figura 15: Distribuição de bolhas para glicerina ozonizada.
Figura 16: Distribuição de bolhas para azeite de oliva ozonizado.
44
Figura 17: Distribuição de bolhas para óleo de soja ozonizado.
Figura 18: Distribuição de bolhas para a vaselina ozonizada.
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Outra forma de visualizar as informações contidas nos histogramas é através da distribuição acumulada, conforme pode ser observado na Figura 19.
Figura 19: Curva de distribuição acumulada (FUI) para óleos vegetais ozonizados.
A região da curva cuja derivada é máxima, explicita uma alta concentração de bolhas de ozônio com grande uniformidade. Analogamente, a região da curva cuja derivada é mínima, explicita uma alta concentração de bolhas de ozônio com pequena uniformidade, ou seja grande variações de diâmetros destas bolhas. A partir da Equação 3, pode-se calcular os índices de uniformidade das bolhas de ozônio para os diferentes óleos, são eles: •
Óleo de girassol: 0,95
•
Glicerina: 0,30
•
Azeite de oliva: 0,92
•
Óleo de soja: 0,81
•
Vaselina: 0,19
46
4.2. Espectroscopia Raman A Figura 20 mostra o espectro Raman normalizado dos óleos vegetais ozonizados: óleo de girassol (20a), glicerina (20b), azeite de oliva (20c), oleo de soja (20d) e vaselina (20e) respectivamente. Nos espectros Raman dos óleos vegetais ozonizados podem ser observados os picos Raman correspondentes ao espectro Raman característico dos óleos vegetais (girassol, glicerina, oliva, soja vaselina) de uso comercial descritos por Silveira Jr., L, et al, (2010). Estes espectros apresentam picos com intensidades atribuídas aos modos vibracionais dos diferentes grupos moleculares de ácidos graxos. Na região compreendida entre 1500-1700 cm -1 é observado um pico em 1567 cm-1 que é característico da vibração C-C de moléculas oleofínicas, na região entre 1100 e 1500 cm -1 encontram-se três picos correspondentes a 1443 cm -1, 1263 cm-1 e 1301 cm-1, o primeiro indica a deformação-vibração de CH do CH 2, e os dois seguintes correspondem a enlaces duplos nos conjugados do cis ou insaturação; na região entre 900-1100 cm-1, se encontram picos característicos da cadeia básica de carbono e vibrações com enlaces de CO. Nas Figuras 21 a 25 podem ser observados os espectros do PC1 e PC2 de cada óleo vegetal ozonizado, em que o PC1 mostra o espectro do componente principal do mesmo, sendo este (em todos os casos) o espectro original do óleo vegetal. O espectro do PC2 é o segundo componente principal, buscando evidenciar as mudanças espectrais dos óleos em função da incorporação de ozônio. Na Figura 26 (a-j) são mostrados os dois primeiros vetores PC dos cinco óleos vegetais ozonizados, objetos do presente estudo. Esses vetores apresentam componentes principais, evidenciando que a intensidade das bandas aumenta com o tempo e mostram as mudanças dos componentes principais dos óleos vegetais em função do tempo de ozonização.
47
a.
b.
c.
d.
e. Figura 20: Espectros Raman dos óleos vegetais ozonizados.
48
Figura 21: Espectros do PC1 e PC2 do óleo de girassol ozonizado.
49
Figura 22: Espectros do PC1 e PC2 da glicerina ozonizada.
50
Figura 23: Espectros do PC1 e PC2 do azeite de oliva ozonizado.
51
Figura 24: Espectros do PC1 e PC2 do óleo de soja ozonizado.
52
Figura 25: Espectros do PC1 e PC2 da vaselina ozonizada.
As diferenças espectrais mais importantes em cada um dos óleos vegetais ozonizados são enumeradas a seguir: Óleo de girassol: Evidenciou-se a presença de um novo pico em 829 cm -1 que correspondente a formação de peróxidos, os picos que determinam as ligações duplas entre C=C foram quebradas isto é determinado pelo decaimento dos picos •
53
encontrados ao redor dos 1443 cm -1, 1263 cm-1 e 1301 cm-1. O pico encontrado nos 1661 cm-1 teve um deslocamento que representa o decaimento da ligação dupla do cis . Glicerina: Apresentou mudanças nas regiões espectrais correspondentes a 800 - 1000 cm-1, 1000 cm-1 - 1200 cm-1 e 1400 - 1600 cm-1, na primeira região têm um deslocamento no pico de 852 cm -1 atribuído ao resultado da ozonólise e ao CH 3, em 1055 cm-1 evidenciou-se também um deslocamento do pico que indica a presença de novos elementos na cadeia básica de carbonos. •
Azeite de oliva: O espectro Raman do azeite de oliva não evidenciou mudanças espectrais, isto é confirmado pelo PCA aplicado ao mesmo. •
Óleo de soja: Na região dos 974 cm-1 - 1081 cm-1 se apresentou um pico nos 1075 cm-1 que pode ser designado ao CO, nos picos correspondentes as ligações duplas de C=C mostraram decaimento (1265 cm -1 – 1300 cm-1), teve um deslocamento no pico correspondente a vibração do CH e CH 2 , e, finalmente, apresentou um decaimento no pico assinado pelas moléculas oleofinicas. •
Vaselina: Os efeitos ocasionados pelo ozônio nos grupos moleculares presentes na vaselina foram de uma baixa intensidade, mesmo assim podem ser observadas mudanças nos picos correspondentes a 912 cm -1, 1044 cm-1, (formação de peróxidos e ozonidos), 1332 cm -1 - 1433 cm-1 (redução de ligações duplas de C=C) e decaimento da intensidade nos 1632 cm -1. A Figura 26 mostra o comportamento dos óleos vegetais, no que tange ao tempo de ozonização. •
54
a. PC1 do oleo de girassol ozonizado
b. PC2 do oleo de girassol ozonizado
c. PC1 da Glicerina ozonizada
d. PC2 da Glicerina ozonizada
e. PC1 do azeite de oliva ozonizado
f. PC2 do azeite de oliva ozonizado 0.40
0.24 ) . n u . b r a ( e d a d i s n e t n I
PC1
0.22 2
R = 0.0008
0.20 0.18
) . n u . b r a ( e d a d i s n e t n I
0.16 0.14 0.12
2
PC2
0.30
R = 0.3625
0.20 0.10 0.00 -0.10 0
50
100
0
250
300
-0.20 -0.30
50
100
150
200
250
-0.50
300
Tempo (min)
Tempo (min)
g. PC1 do óleo de soja ozonizado
h. PC2 do óleo de soja ozonizado 0.60
-0.22 0
e d a d i s n e t n I
200
-0.40
0.10
) . n u . b r a (
150
PC1
50
100
150
200
-0.22
250 2
R = 0.4441
-0.22
-0.22
-0.23
R = 0.0955
0.40 ) . n u . b r a ( e d a d i s n e t n I
-0.22
2
PC2
300
0.20 0.00 0
50
100
150
200
-0.20 -0.40 -0.60
-0.23
-0.80
Tempo (min)
i. PC1 da vaselina ozonizada
Tempo (min)
j. PC2 da vaselina ozonizada
Figura 26: PC1 e PC2 em função do tempo, dos óleos vegetais ozonizados.
250
300
55
O PC 1 corresponde ao espectro de cada óleo vegetal na qual é observada a composição original dos óleos e que estes apresentam um comportamento estável, com exceção da vaselina que mostra um comportamento aleatório. Já no PC2 observou-se o comportamento das mudanças espectrais com relação a adição de ozônio e ao tempo de ozonização. No óleo de girassol as mudanças foram contínuas, e, diretamente proporcionais ao tempo de ozonização. A glicerina mostrou um comportamento exponencial negativo que representa o decaimento do sinal Raman, atingindo a saturação aos 120 minutos de ozonização, aproximadamente. O azeite de oliva não apresentou diferenças espectrais na presença do ozônio, nem em relação ao tempo de ozonização. O óleo de soja apresentou um incremento positivo, atingindo a saturação, aproximadamente, aos 120 minutos de ozonização. A vaselina teve inicialmente um comportamento aleatório, pois as mudanças espectrais se apresentaram entre os 100 e 150 minutos de ozonização, para em seguida decrescer e estabilizar.
56
5. DISCUSSÃO O ozônio tem reconhecidamente uma efetiva ação bactericida, mas sua utilização foi limitada devido as suas propriedades oxidativas, sendo que somente na última década se estabeleceu o parâmetro “dose específica”, visando controlar sua reatividade. O conhecimento de ozônio derivados, com propriedades terapêuticas quando combinado com substratos insaturados, permitiu desenvolver produtos como os óleos vegetais ozonizados que são eficazes e estáveis para o uso terapêutico. Os óleos vegetais ozonizados, objeto deste estudo, encontram-se na forma líquida, impregnados com bolhas de ozônio em suspensão. Para sua análise foram propostas duas técnicas ópticas que se destacam por serem não destrutivas, reproduzíveis, evitando extensas manipulações das amostras, sendo estas a microscopia óptica e a espectroscopia Raman. A dose de ozônio gerada pelo equipamento utilizado foi de 0,05 p.p.m, ou seja, dentro dos limites da dose definida para uso terapêutico. Considerando que a concentração de ozônio gerada é constante, as respostas espectrais e as características morfométricas das bolhas de ozônio, dependem do tempo de ozonização dos óleos (Castillo Castañeda et al., 2006; Travagli et al., 2010). As análises, morfológica e morfométrica das bolhas, podem auxiliar na obtenção de dados importantes para a estabilidade do produto, ou seja, o óleo ozonizado. Neste sentido a quantidade de bolhas em cada amostra, seu tamanho médio e circularidade permitiram definir aspectos como a uniformidade e a persistência que são empregados na hora de avaliar a qualidade final do produto (Campbell & Mougeot, 1993). As ferramentas estatísticas para análise de uniformidade e persistência são geralmente empregadas em estudos de granulometria de partículas sólidas e em análise de atomização de líquidos (Castillo Castañeda et al., 2006; Bayvel & Orzechowski, 1993; Du et al., 2001). Essas ferramentas definem como ideal o produto com bolhas de menor diâmetro e de mesma área (comparado com um padrão), e uma média de circularidade próximo ou igual a 1. Estes parâmetros determinam a capacidade do produto em reter bolhas (Mangas et al., 1999) com consequente menor probabilidade de ruptura das mesmas.
57
No presente trabalho, a uniformidade entende-se como a variabilidade de área das bolhas de ozônio. A primeira idéia de uniformidade foi obtida a partir dos histogramas de distribuição de bolhas mostrados nas Figuras 14 a 18, estes histogramas correspondem as microfotografias dos óleos vegetais ozonizados, nos quais pode ser observado que, para o óleo de girassol a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0,05 µm2 e 0,1 µm2, apresentando nesta faixa, número superior a 400 bolhas de ozônio, já na glicerina evidenciou-se que a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0 e 1 µm2 (>130 bolhas), enquanto no azeite de oliva o intervalo com maior quantidade de bolhas situa-se entre 0,2 e 0,25 µm 2 (>118 bolhas). No óleo de soja a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0,05 µm 2 e 0,1 µm2 (>23 bolhas), coincidindo com o girassol no mesmo intervalo de dimensões, porém, com um número bastante inferior de bolhas. A vaselina teve o maior número de bolhas com área da ordem de 2,5X103 µm2 (>87 bolhas). Neste trabalho, conforme anteriormente evidenciado, a curva de distribuição acumulada (Figura 19), explicita a concentração de bolhas de ozônio com pequena ou grande uniformidade em função da taxa da derivada da curva. Da mesma forma, Du et al. (2001), em seu trabalho sobre caracterização de espumas utiliza também esse tipo de informação para evidenciar as características do seu produto, levando a resultados análogos. No presente trabalho, o melhor índice de uniformidade foi obtido com o óleo de girassol, seguido pelo azeite de oliva e o óleo de soja. O índice de circularidade das bolhas de ozônio nos óleos vegetais podem definir sua persistência no interior destes óleos, conforme mostra Ligier-Belair et al. (1999). Estatisticamente, a circularidade média é um índice que caracteriza um determinado conjunto de bolhas uniformes e determina a persistência destas dentro do substrato. Neste trabalho, maiores valores de circularidade, ou seja, próximos de 1, evidenciaram que maior persistência das bolhas no interior do substrato, neste caso características apresentadas pelo azeite de oliva e óleo de girassol. As diferenças morfométricas das bolhas de O 3 nos óleos vegetais podem ser atribuídas às características reológicas de cada óleo como densidade e viscosidade, uma vez que, análises químicas e moleculares evidenciam que estes óleos apresentam características similares. As características reológicas dos materiais analisados neste trabalho são mostradas na Tabela 5 (Gardiner & Dlugogorski, 1998; Rabelo et al., 2000).
58
Tabela 5: valores de densidade e viscosidade dos óleos vegetais (a 20°C). Fonte: Rabelo et al., 2000
Óleo de girassol
Glicerina
Azeite de oliva
Óleo de soja
Vaselina
Densidade (g/cm3)
0,89
1,2613
8,19
0,819
0,856
Viscosidade (Pa.s)
58,3
1,5
79,7
59
10,08
De posse das definições anteriores e em uma primeira análise, pode-se estabelecer uma relação entre a densidade e os parâmetros morfométricos dos óleos analisados, mostrando que girassol, glicerina e oliva, seriam mais apropriados para armazenar bolhas de ozônio. A escolha da espectroscopia Raman como técnica para caracterização de óleos vegetais ozonizados se fundamenta em estudos anteriores (Sadeghi-Jorabchi et al., 1990; Baeten et al., 1998; Palacios et al., 2000; Lee & Chan, 2007; Silveira et al., 2010) nos quais é utilizada esta técnica para determinar o grau de insaturação em óleos vegetais próprios do consumo humano. Os espectros dos óleos vegetais ozonizados em função do tempo de ozonização são mostrados na Figura 20, sendo as bandas Raman associadas aos modos vibracionais dos grupos funcionais característicos dos ácidos graxos. Uma primeira avaliação destes espectros, não mostra mudanças significativas nos espectros dos óleos ozonizados, tendo sido necessária aplicação da análise multivariada de componentes principais (Figuras 21 a 26). Resultados preliminares indicam que o método Criegge (1975) descreve a reação do ozônio com óleos vegetais e que a espectroscopia Raman pode ser bastante eficiente na detecção de mudanças espectrais resultantes da oxidação lipídica promovida pela presença do ozônio, evidenciando como resultado o consumo das bandas correspondentes às ligações duplas de C=C ou insaturação (1263 cm-1 e 1301 cm-1). Também é possível evidenciar a aparição de novos grupos funcionais derivados do oxigênio e identificados na Tabela 6.
59
Tabela 6: Possíveis grupos funcionais derivados do oxigênio no espectro de óleos vegetais ozonizados. Fonte: Lee & Chan (2007)
Grupo funcional
Região espectral (cm-1)
Assinatura
Peróxido
~800 – 900
O-O - estiramento
Ozônido
~700 – 900
O-O - estiramento
Eter
~830 – 890
C-O-C - estiramento Simétrico
Epóxido
~750 – 950
deformação do anel
Álcool
~800 – 900
C-C-O - estiramento em fase
Os dados da Tabela 6 foram corroborados por Lee & Chan (2007) que demonstrou a presença de ozonidos (O-O) e peróxidos ao redor do pico centrado em 850 cm-1, compostos carbonila na região de 1700 -1800 cm -1 e compostos hidroxílicos nas regiões de 3300 cm -1 e 3600 cm-1. As diferenças espectrais mais importantes nos óleos vegetais ozonizados foram: O decaimento nas intensidades dos picos correspondentes às ligações duplas de C=C, decaimento este observado no óleo de girassol, óleo de soja e vaselina, e a presença de novos grupos moleculares como peróxidos e ozonidos, evidenciados em todos os óleos exceto, no azeite de oliva. Nos espectros de óleos vegetais ozonizados, analisados no presente estudo, foram observados que, o óleo de girassol, o óleo de soja, glicerina e vaselina apresentam mudanças espectrais em função do tempo de ozonização. Fato este não observado com o azeite de oliva. É importante ressaltar que o rendimento e qualidade dos produtos de derivados de ozonização dependem de parâmetros tais como: tipo do gerador de ozônio, tempo de ozonização, presença de água ou catalisadores, fluxo do gás, e tipo de alimentação de gás (oxigênio ou ar). Todos estes parâmetros foram determinantes nos resultados obtidos neste trabalho. No presente estudo, a espectroscopia Raman e a microscopia óptica se complementam, uma vez que a primeira gera informação química (molecular e
60
espectral) e a segunda gera informação física e morfométrica que permitiram analisar pontualmente cada aspecto relevante dos óleos ozonizados.
61
6. CONCLUSÃO No presente estudo, foram ozonizados 5 tipos de óleo, à saber: girassol, soja, oliva, glicerina e vaselina e apresentadas duas técnicas para o estudo e caracterização dos óleos. As técnicas são rápidas, robustas, confiáveis, não destrutivas e permitiram realizar o procedimento com reprodutibilidade. Foi verificado que o ozônio produz mudanças espectrais nos óleos caracterizados. Observou-se ainda que, os óleos vegetais ozonizados mais estáveis são o óleo de girassol e o azeite de oliva, o que os torna mais adequados para funcionar como reservatórios de ozônio terapêutico. A metodologia proposta é eficaz e uma das primeiras a associar a espetroscopia Raman com a microscopia óptica para análise e caracterização de óleos vegetais ozonizados. Estudos posteriores são necessários para evidenciar a ação do ozônio em óleos, em função da sua concentração.
62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAETEN, V.; HOURANT, P.; MORALES, M. T.; APARICIO, R. Oil and fat classification by FT-Raman spectroscopy. J. Agric. Food. Chem. 46(7): 2638-2646, 1998. BAILEY, P. S. Ozonization in Organic Chemistry. Vol. 1: Olefinic Compounds. New York: Academic Press, 1978, p 9. BAYVEL, L.; ORZECHOWSKI, Z. Liquid Atomization International). London: Taylor & Francis, 1993, 475 p.
(Combustion:
An
BOCCI, V. Oxygen-Ozone Therapy, A Critical Evaluation. Norwell: Kluwer Academia Publishers, 2002, 440 p. BOCCI, V. Ozone: A New Medical Drug. Norwell: Springer, 2005, 295 p. CAMPBELL, G. M., MOUGEOT, E. Creation and characterisation of aerated food products. Trends Food Sci. Tech. 10(9): 283-296, 1993. CARELLI, A. A. Análisis cuantitativo de ceras en aceites y grasas. A&G Magazine 10: 244-249, 1998. CASTILLO CASTAÑEDA, E.; COURTOIS, F.; RELKIN, P. Cuantificación de la persistencia y homogeneidad de espumas mediante procesamiento de imágenes. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(2): 147-155, 2006. CLARK, R.J.H., HESTER, R.E. Advances in Infrared and Raman Spectroscopy. Chichester: John Wiley & Sons, 1985, 360 p. CUNHA JR., A. P.; CUNHA, V. P. P.; SILVEIRA, L.; MARTIN, A. A. Modelo de calibração da concentração de metilmetacrilato em solução aquosa utilizando espectroscopia de absorção no ultravioleta. Quím. Nova 26(6): 850-854, 2003.
63
DE LA CRUZ, M. G. F. Plantas medicinais utilizadas por raizeiros: uma abordagem etnobotânica no contexto da saúde e doença. 1997. 175 p. Mestrado (Saúde e Ambiente) – Instituto de Saúde Coletiva, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá - MT. DEVLIN, T. M., Bioquímica: Libro de Texto con Aplicaciones Clínicas. Barcelona: Editorial Reverté, 2004, 1218 p. DÍAZ GOMEZ, M. F.; GAVÍN SAZATORNIL, J. A. Ozonización del aceite de girasol. Seguimiento de la reacción por Resonancia Magnética Nuclear protónica, Rev. CENIC Cienc. Quím. 36(3): 159-162, 2005. DÍAZ M. F.; GAVÍN, J. A.; GÓMEZ, M.; CURTIELLES, V.; HERNÁNDEZ, F. Study of ozonated sunflower oil using 1H NMR and microbiological analysis. Ozone-Sci. Eng. 28(1): 1-5, 2005(a). DÍAZ, M. F.; HERNÁNDEZ, R.; MARTÍNEZ, G.; VIDAL, G; GÓMEZ M.; FERNÁNDEZ, H.; GARCÉS, R. Comparative study of ozonized olive oil and ozonized sunflower oil. J. Braz. Chem. Soc. 17(2): 403-407, 2006. DÍAZ, M. F., GAVÍN, J. A. Characterization by NMR of ozonized methyl linoleate. J. Braz. Chem. Soc. 18(3): 513-518, 2007. DÍAZ, M. F.; ROMAY, C.; ROJAS, E.; GONZÁLEZ, R. Efecto del aceite de teobroma ozonizado sobre la respuesta inflamatoria inducida en el modelo de edema en la oreja de ratón. RECVET - Rev. Electr. Clin. Vet. 3(9): 1:6, 2008. Disponível em http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n090908/090901.pdf, acesso em junho de 2009. DIAZ GOMEZ, M. F.; MARTINEZ TÉLLEZ, G.; MENEAU HERNÁNDEZ, R. I,; ALAIZ, M.; GARCÉZ, R. Estudio analítico de espécies oxigenadas en el aceite de teobroma ozonizado. Quím. Nova 31(3): 610-613, 2008. DOU, X.; YAMAGUCHI, Y.; YAMAMOTO, H.; DOI, S.; OSAKI, Y. A highly sensitive
64
compact Raman system without a spectrometer for quantitative analysis of biological samples. Vibr. Spectrosc. 14(2): 199-205, 1997.
DU, L.; DING, Y.; PROKOP, A.; TANNER, R. D. Measurement of bubble size distribution in protein foam fractionation column using capillary probe with photoelectric sensors. Appl. Biochem. Biotechn. 91-93: 387-404, 2001. ESTERBAUER, H., SCHAUR, R. J.; ZOLLNER, H. Chemistry and biochemistry of 4hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic. Biol. Med. 11(1): 81-128, 1991. GARDINER, B. S.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Prediction of pressure losses in pipe flow of aqueous foams. Ind. Eng. Chem. Res. 38(3): 1099-1106, 1999. GARDINER, B. S.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Rheology of fire-fighting foams. Fire Safety J. 31: 61-75, 1998. HOLLAS, J. M. Modern Spectroscopy. Chichester: John Wiley & Sons, 2004, 452 p. KINSGLEY, J. P.; DAY, R. W; LINZ, L. M. Inyección directa de oxigeno en rector de columna de burbujas. Praxair Technology, Inc, Patente B01J19/00, B01J19/24, B01J10/00, Espanha, 2001. KUNZ, A.; FREIRE, R. S.; ROHWEDDER, J. J. R.; DURAN, N.; MANSILLA, H.; RODRIGUEZ, J. Construção e otimização de um sistema para produção e aplicação de ozônio em escala de laboratório. Quím. Nova 22(3): 425:428, 1999. LEDUC, A. Method of generating stable foam for oil gas well cleanouts. US Patent 7278488, U.S.A., 2007. Disponível em: http://www.google.com/patents/US7278488. Acesso em 10 out 2010. LEE, A. K. Y.; CHAN, C. K. Single particle Raman spectroscopy for investigating atmospheric heterogeneus reactions of organic aerosols. Atmos. Environ. 41(22): 4611-4621, 2007.
65
LIGER-BELAIR, G.; MARCHAL, R.; ROBILLARD, B.; VIGNES-ADLER, M.; MAUJEAN, A.; JEANDET, P. Study of effervescence in glass of champagne: frequencies of bubble formation, growth rates, nd velocities of rising bubbles. Am. J. Enol. Vitic. 50(3): 317323, 1999. MAGRABI, S. A.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Comparative study of drainage characteristics in AFFF and FFFP compressed - air fire - fighting foams. Fire Safety J. 37(1): 21-52, 2002. MAGRABI, S. A.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Bubble size distribution and coarsening of aqueous foams. Chem. Eng. Sci. 54(18): 4007-4022, 1999. MANGAS, J. J.; MORENO, J.; RODRÍGUEZ, R.; PICINELLI, A.; SUÁREZ, B. Analisys of polysaccharides in cider: their effect on sensory foaming properties. J. Agric. Food Chem. 47(1): 152-156. MARTÍNEZ TELLES, G.; HERNÁNDEZ TAPANEZ, R.; DÍAZ GOMEZ, M. Determinación de hidroperóxidos en aceite de girasol ozonizado. Grasas Aceites 56(2): 148-153, 2005. RAKNESS, K.; GORDON, G.; LANGLAIS, B.; MASSCHELEIN, W.; MATSUMOTO, N.; RICHARD, Y.; ROBSON, C. M.; SOMIYA, I. Guideline for measurement of ozone concentration in the process gas from an ozone generator. Ozone-Sci. Eng. 18: 209229, 1996. MORALEDA, M. G. Actividades biológicas de la ozonoterapia y las sustancias naturales ozonizadas, fundamentales y aplicaciones. Disponível em: http://www.naturozone.com. Acesso em dez. de 2008. NAGIB, E. C. Desenvolvimento de técnica operatória minimamente invasiva com instrumento de ultra-baixa rotação e terapia de ozônio, assistida por diagnóstico de cárie com fluorescência induzida por laser. 2006. 159 p. Dissertação (Mestrado em Bioengenharia) – Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do
66
Paraíba, São José dos Campos, SP. PALACIOS, D. A. B; SCHMIDT. E. M. M.; SILVEIRA, L.; ZÂNGARO, R. A. Estudio analítico de aceite de girasol ozonizado por espectroscopia Raman y microscopía óptica. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMÉDICA, 22, 2010, Tiradentes, MG. Anais do XXII Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica. Tiradentes, MG, 2010. 1: 96:99.
PICINELLI, A.; SUÁREZ, B.; GARCÍA, L.; MANGAS, J. J. Changes in phenolic contents during sparkling apple winemaking. Am. J. Enol. Vitic. 51(2): 144-149, 2000. RABELO, J.; BATISTA, E.; CAVALERI, F. W.; MEIRELLES, A. J. A. Viscosity prediction for fatty systems. J. Am. Oil Chem. Soc. 77(12): 1255-1262, 2000. RODRÍGUEZ, M. D.; MENÉNDEZ, S.; GÓMEZ, M. Estudio teratogénico del aceite ozonizado. In: Congreso Ibero latinoamericano de Aplicaciones del Ozono, 1, 1990, Havana, Cuba. Anais do Primer Congreso Ibero Latinoamericano de Aplicaciones del Ozono. Havana, Cuba, 1990. SADEGHI-JORABCHI, H.; HENDRA, P. J.; WILSON, R. H.; BELTON, P. S. Determination of the total unsaturation in oils and margarines by Fourier transform Raman spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 67: 483-486, 1990. SADOWSKA, J.; JOHANSSON, B.; JOHANNESSEN, E.; FRIMAN, R.; BRONIARZPRESS, L.; ROSENHOLM, J. B. Characterization of ozonated vegetable oils by spectroscopic an chromatographic methods. Chem. Phys. Lipids 151(2): 85-91, 2008. SAKAZAKI, F.; KATAOKA, H.; OKUNO, T.; UENO, H.; SEMMA, M.; ICHIKAWA, A.; NAKAMURO, K. Ozonated olive oil enhances the growth of granulation tissue in a mouse model of pressure ulcer. Ozone-Sci. Eng. 29(6): 503-507, 2007. SECHI, L. A.; LEZCANO, I.; NUÑEZ, N.; ESPIM, M.; DUPRE, I.; PINNA, A. Antibacterial
