ADN Sódico de origen Vegetal. Vegetal. INCI Name:
SODIUM DNA. DNA. (source: wheat germ).
Identificación: Media Mediante nte la reacc reacción ión de Dishe Dishe (dife (difenil nilamin amina a en medio medio ácido ácido:: AcH/S04H2) producción producción de colo colorr azul zul al calent lenta ar en BM : prese presenci ncia a de desoxirribosa como nucleótidos concatenados (reacciona cada vez que halla dos purinas adyacentes). Para un volumen final de reacción de 3 ml (1ml de muestra y 2 ml de reactivo) la sensibilidad para un ADN vegetal es por lo menos de 0,5 mg. Cuantificación: Método de Dische El Método de Dishe se puede utilizar para cuantificar exactamente si solo se comparan ADNs de igual origen, mismo grado de pureza y misma forma de prepara preparación. ción. Sin embargo embargo puede dar dar una buena idea de homogene homogeneidad idad de partidas partidas,, y activida actividad d frentre frentre a muestra muestras s de distinto origen. origen. Es una técnica técnica sencilla al alcance de cualquier laboratorio de control de calidad. a-Muestra a-Muestra (ADN Na vegetal.Biogel 2%): diluir con agua destilada destilada 1/10. b-Blanco: agua destilada. Reactivo de trabajo (Dishe): En el momento de realizar la medición mezlar en el siguiente orden, todos p.a. 1-100 ml de Acido Acético Glaciar. 2-2,75ml de Acido Sulfúrico. 3- 1 gramo de Difenilamina base. (la droga pura es blanca) La solución es incolora o muy ligeramente amarilla. Dist Distin inta tas s part partid idas as de AcH AcH o disti distint ntas as marc marcas as,, dan dan dist distin inta tas s coef coefici icien ente tes s de absorbancia/gramo y diferentes color de blanco (Burton). Manejar con cuidado. Usar propipeta.
Utiliza Utilizarr un patro patron n tratad tratado o de la misma misma forma forma que que la muest muestra ra con con una una diluci dilucion on adecuada a la concentración. Blanco Muestra Patron
Agua destilada destilada
2 ml
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ADN Biogel 1 o 0,5 % ---
2 ml
2 ml
Reactivo de Dishe
5 ml
5 ml
5 ml
Vortexear inmediatamente al agregado agregado del reactivo.
Llevar a BM hirviente durante 10 minutos. Dejar enfríar. Leer a 600 nm, llevando a cero con el blanco, usando cubeta de cuarzo de 1 cm de paso. Comparar Patron frente a la Muestra. En la literatura no hallamos validaciones actualizadas, nuestra experiencia nos indica: Error intra ensayo: Menor del 5%. Error inter ensayo: Alrededor de 20 %. Literatura: Dische, Z (1930). Mikrochemie, 8, 4. Burton et Al (1956). Bioch. 62, 315. En esta cita se indican las interferencias que aumentan o disminuyen el color en la reacción. Methods in Enzimology: Vol III. pp 680. Metodologías más modernas, aunque más complicadas para identificar ADN y cuantificarlo se encuentran en: Molecular Cloning. Second Edition. E.5 Ethidium Bromide fluorescent Quantitation of the Amount of Double stranded DNA. Los métodos espectroscópicos en el producto final, si bien permiten a diluciones adecuadas (1/20) observar el pico a 260 nm característico, es de destacar que los conservadores empleados pueden interferir en el cálculo de la relación 260/280. Viscosidad: Método Brookfield:
Rango aceptado 50-1000 cps (Pin 2
25°C 30 RPM).
El producto tiene un período de uso util de por lo menos un año a partir de la fecha de fabricación.
Técnica para detección y verificación rápida de la presencia de ADN de alta polimerización en el producto.
Reactivos: alcohol etílico 96°. 1)
Colocar en una probeta de 500 ml, 300 ml de alcohol etílico 96°. Arrojar en forma decidida, sin salpicar sobre el acohol, 100 ml del ADNNa Biogel 2%. No mover. No agitar.
2) Se observará que el ADN de alta polimerización comienza a desprenderse desde el fondo y se dirije hacia la superficie del líquido. No mover. No agitar. Dejar reposar 3 horas como mínimo. Lo ideal son 24 horas.
3)
Se formará una fibra algodonosa, blanca que se desprende de una masa algo amarillenta desde el fondo. Sobre este material (secado por exprimido, nunca bajo estufa) se puede realizar, previa disolución en agua destilada: (es lenta, dejar 24 horas hidratar) a) Identificación de Desoxirribosa: Método de Dishe. (color azul). b) Espectrofotometría y Relación 260/280. c) Medir proteínas (Lowry).
4) Volcal el líquido remanente en la probeta sobre otra probeta vacía y limpia de 500 ml. Se verá que se recupera aún más ADN de este material (este material contiene ADN de más bajo peso molecular). Dejar reposar si es posible 24 horas. El ADN que se desprende puede analizarse de la misma forma. El ADN muy fragmentado es un polvillo que enturbia la solución.
