1. Šta je Biohemija? Biohemija je hemija života, most između biologije i hemije koji proučava kako kompleksne hemijske
reakcije stvaraju život. Biohemija je deo hemije koji konkretno proučava hemijske procese u živim organizmima. Biohemija proučava strukturu i fuknciju celularnih komponenti, kao što su proteini, ugljeni hidrati, lipidi, nukleinske kiseline i ostali biomolekuli. Nedavno, biohemija je počela da se fokusira na proučavanje reakcija u kojima su katalizatori enzimi , i na proučavanje osobina proteina. Druge oblasti koje spadaju pod pojam biohe mije su genetički kod (DNK, RNK), sinteza proteina, transport kroz ćelijsku membranu i transdukcija signala.
Znači zadatak biohemije jeste da odredi kako kolekcija neživih molekula nađenih u živom sist emu, međusobno interaguje tako da formira, održava i obnavlja živo stanje – ćeliju. Svi živi sistemi su veoma kompleksni i visoko organizovani i izgrađeni od osnovne gradivne jedinice – ćelije, koja je sastavljena od velikog broja raznorodnih molekula koji su jako precizno organizovani. Suprotno tome neživi si stemi obično predstavljaju slučajne skupove molekula. Svaki deo nekog živog sistema ima specifičnu namenu ili funkciju – i makroskopski karakteri i intraćelijske strukture; opet za razliku od neživih kod kojih je funkcijska podela molekula irelevantna i be značajna. Živi sistemi imaju sposobnost ekstrakcije energije iz svoje okoline i njene transformacije u oblik potreban za održavanje unutrašnje strukture živog sistema korišćenjem gradivnih elemenata iz spoljašnje sredine, dok se neživa materija obično rasp ada kada apsorbuje energiju u vidu toplote ili svetlosti. Svi živi sistemi imaju sposobnost precizne samostalne replikacije, što je najspecifičniji atribut živog sistema. Oni su sposobni da se reprodukuju u formi identičnoj u masi, obliku i unutrašnjoj strukturi iz generaicje u generaciju. Tu sposobnost neživi sistemi naravno nemaju. Biohemija se dakle, bavi izučavnajem života na molekulskom nivou. Biohemijska istraživanja su pokazala da je sastav živog sistema kvalitativno različit u zavisnosti od sredi ne koju on nastanjuje. Najveći deo hemijskih komponenti živog sistema su organska jedinjenja ugljenika, ugljenika, redukovana ili hidroksilisana, uz koje je često i prisustvo azota; što je potpuno suprotna situacija od one kod nežive prirode. Bez obzira na vrstu živog sistema, većina biomolekula su u njima organizovani u makromolekule sa velikom molekulskom masom – oni predstavljaju proste gradivne blokove koji su međusobno povezani u lance. Uvek postoji neki dinamički odnos između makromolekula i manjih molekula koji ih grade – oni se uvek mogu razložiti do gradivnih jedinica, koje se opet uvek mogu polimerizovati u makromolekule; dok smer u kojem će se te transfomraicje dešavati zavisi od potreba živog sistema.
2. Molekularna logika živih sistema: Aksiomi molekulske logike živih sistema glase: 1. Postoji izuzetna jednostavnost osnovne molekulske organizacije ćelije – hiljade različitih
makromolekula koji su prisutni u ćeliji, su izgrađeni od svega tridesetak prostih gradivnih blokova 2. Svi živi sistemi imaju zajedničkog pr etka – biomolekuli koji čine gradivne blokove su identični kod svih vrsta
1
3. Identitet svakog živog sistema je sačuvan posredovanjem specifičnog seta nukleinskih ki selina i proteina – svaki živi sistem ima set nukleinskih kiselina koji se razlikuje od drugih živih sistema;
sličnost u setu kiselina je veća što su sistemi evolutivno bliži – jedan biomolekul može obavljati više 4. Postoji princip molekulske ekonomije u živim sistemima – jedan različitih funkcija u živom sistemu 5. Živi sistemi formiraju i održavaju svoju osnovnu uređenost na račun okoline – konstantnim protokom energije kroz sebe, živi sistemi održavaju svoju uređenost i istovremeno zadovoljavaju zakone termodinamike – tako procesi koji su odgovorni za održavanje uređenosti živog sistema je u toplotu koja se rasprostire po njegovoj okolini, povećavajući entropiju prevode deo energi je okoline; svaka ćelija predstavlja neekvilibrisan, otvoren sistem – ona se nalazi u stabilnoj dinamičkoj ravnoteži sa okolinom, uz neprestanu razmenu materije i energije
6. Živi sistem funkcioniše kao izotermalna hemijska mašina – biomolekuli koji grade ćeliju se
stabilni samo na određenoj temperaturi i pH vrednosti, pa je ćelija izotermalna – u datom vremenu svi delovi ćelije su na istoj temperaturi (zbog toga ona i ne može da koristi temperaturu kao izvor energije); ćelija se takođe nalazi pod konstantnim pritiskom i održava konstantnu zapreminu, tako ni te promene ne može koristiti za proizvodnju rada; zato ona koristi slobodnu energiju, tip energije koji se može prevesti u rad pod k onstantnom temperaturom, zapreminom i pritiskom 7. Specifičnost interakcija molekula u ćeliji je posledica strukturne komplementarnosti molekula koji interaguju – ćelije funkcionišu zahvaljujući enzimima, biološkim katalizatorima koji imaju
100% efikasnost i nijedan otpadni produkat; više enzima katalizuje više biohemijskih reakcija bez pojave nusproizvoda i takva funkcionalnost se bazira na strukturnoj komplementarnosti molekula enzima i susptrata – enzimi su visoko specifična jedinjenja; efikasnost biohemijskih reakcija je zasnovana i na povezanosti enzimskih reakcija (produkt jedne enzimske reakcije je jako čestu supstrat za drugu) 8. Povezanost enzimskih reakcija daje sredstvo za prenos energije od procesa koji je oslobađaju do procesa koji je koriste – ukupan promet materije i energije u živom sistemu se naziva
metabolizam, metabolizam, i on obuhvata procese razgradnje organskih molekula – katabolizam; katabolizam; i procese biosinteze organskih molekula – anabolizam; u kataboličkim procesima dolazi do oslobađanja
energije, koja će se vezati i koristiti u anaboličkim procesima i na taj način su ove dve vrste procesa povezane 9. Živi sistemi su spobosni da regulišu svoje metaboličke reakcije kao i biosintezu enzima da bi
postigli maksimum efikasnosti i ekonomičnosti – ekonomičnosti – kontrola biosinteze se postiže postojanjem inhibicije biosintetskog puta povratnom povratnom spregom spregom (npr. dovoljno velika koncetracija finalnog
proizvoda biosintetičkog puta će inhibirati sopstvenu sintezu i to se najčešće obavlja smanjenjem aktivnosti enzima koji tu sintezu katalizuju); inhibicija se efikasno postiže organizacijom gena, odgovornih za sintezu enzima koji kontrolišu biohemijski put sinteze i strukturu operona (funkcionalna jedinica regulacije genetičke aktivnosti koja se sastoji iz promotora, promotora, operatora i jednog ili više inducibilnih strukturnih gena gena koji se nalaze pod kontrolom regulatornih elemenata); elemenata); npr. u biosintezi histidina kod bakterije Escherichia coli učestvuje devet enzima, kodiranih od strane devet gena operonske strukture ( histidinski operon), operon), koji su pod istim 2
3. Identitet svakog živog sistema je sačuvan posredovanjem specifičnog seta nukleinskih ki selina i proteina – svaki živi sistem ima set nukleinskih kiselina koji se razlikuje od drugih živih sistema;
sličnost u setu kiselina je veća što su sistemi evolutivno bliži – jedan biomolekul može obavljati više 4. Postoji princip molekulske ekonomije u živim sistemima – jedan različitih funkcija u živom sistemu 5. Živi sistemi formiraju i održavaju svoju osnovnu uređenost na račun okoline – konstantnim protokom energije kroz sebe, živi sistemi održavaju svoju uređenost i istovremeno zadovoljavaju zakone termodinamike – tako procesi koji su odgovorni za održavanje uređenosti živog sistema je u toplotu koja se rasprostire po njegovoj okolini, povećavajući entropiju prevode deo energi je okoline; svaka ćelija predstavlja neekvilibrisan, otvoren sistem – ona se nalazi u stabilnoj dinamičkoj ravnoteži sa okolinom, uz neprestanu razmenu materije i energije
6. Živi sistem funkcioniše kao izotermalna hemijska mašina – biomolekuli koji grade ćeliju se
stabilni samo na određenoj temperaturi i pH vrednosti, pa je ćelija izotermalna – u datom vremenu svi delovi ćelije su na istoj temperaturi (zbog toga ona i ne može da koristi temperaturu kao izvor energije); ćelija se takođe nalazi pod konstantnim pritiskom i održava konstantnu zapreminu, tako ni te promene ne može koristiti za proizvodnju rada; zato ona koristi slobodnu energiju, tip energije koji se može prevesti u rad pod k onstantnom temperaturom, zapreminom i pritiskom 7. Specifičnost interakcija molekula u ćeliji je posledica strukturne komplementarnosti molekula koji interaguju – ćelije funkcionišu zahvaljujući enzimima, biološkim katalizatorima koji imaju
100% efikasnost i nijedan otpadni produkat; više enzima katalizuje više biohemijskih reakcija bez pojave nusproizvoda i takva funkcionalnost se bazira na strukturnoj komplementarnosti molekula enzima i susptrata – enzimi su visoko specifična jedinjenja; efikasnost biohemijskih reakcija je zasnovana i na povezanosti enzimskih reakcija (produkt jedne enzimske reakcije je jako čestu supstrat za drugu) 8. Povezanost enzimskih reakcija daje sredstvo za prenos energije od procesa koji je oslobađaju do procesa koji je koriste – ukupan promet materije i energije u živom sistemu se naziva
metabolizam, metabolizam, i on obuhvata procese razgradnje organskih molekula – katabolizam; katabolizam; i procese biosinteze organskih molekula – anabolizam; u kataboličkim procesima dolazi do oslobađanja
energije, koja će se vezati i koristiti u anaboličkim procesima i na taj način su ove dve vrste procesa povezane 9. Živi sistemi su spobosni da regulišu svoje metaboličke reakcije kao i biosintezu enzima da bi
postigli maksimum efikasnosti i ekonomičnosti – ekonomičnosti – kontrola biosinteze se postiže postojanjem inhibicije biosintetskog puta povratnom povratnom spregom spregom (npr. dovoljno velika koncetracija finalnog
proizvoda biosintetičkog puta će inhibirati sopstvenu sintezu i to se najčešće obavlja smanjenjem aktivnosti enzima koji tu sintezu katalizuju); inhibicija se efikasno postiže organizacijom gena, odgovornih za sintezu enzima koji kontrolišu biohemijski put sinteze i strukturu operona (funkcionalna jedinica regulacije genetičke aktivnosti koja se sastoji iz promotora, promotora, operatora i jednog ili više inducibilnih strukturnih gena gena koji se nalaze pod kontrolom regulatornih elemenata); elemenata); npr. u biosintezi histidina kod bakterije Escherichia coli učestvuje devet enzima, kodiranih od strane devet gena operonske strukture ( histidinski operon), operon), koji su pod istim 2
regulatornim elementom odgovornim za regulaciju eksprecije celog histidinskog operona (operator ); tada će povećanje koncentracije prisutnog histidina biti signal za inhibiciju njegove sinteze – prekid sinteze se ostvaruje vezivanjem specifičnog represor-proteina za operatorski deo operona 10. Genetička informacija je smeštena u molekulu DNK i prenosi se na makromolekule živih sistema – kod većine organizama, osim retrovirusa i nekih bakterija, osnova genetičke
infomracije je DNK ; vernost replikacije DNK, odnosno polimerizacija dezoksiribonukleotida u polinukleotidne lance, je veoma visoka i obezbeđuje verne kopije genetičkog materijala;
genetička informacija je smeštena u hromozomu, hromozomu, koji predstavlja cirkularan ili linearan molekul DNK povezan sa histonima, i čini je kombinacija četiri nukleotida, predstavljena njihovim redosledom u DNK; stabilnost DNK je obezbeđena komplementarnošću azotnih baza nukleotida u naspramnim lancima dvostrukog heliksa DNK Jednodimenzionalna informacija u molekulu DNK se prevodi u 3-D organizovane molekule i 11. Jednodimenzionalna
supramolekulske strukture živog sistema, tr anslacijom informacije iz DNK u 3-D strukturu proteina – redosled aminokiselina u novosintetisnaom proteinu je određen redosledom nukleotida u DNK; protein se sintetiše u svojoj linearnoj formi, i vrlo brzo prelazi u svoju trodimenzionalnu strukturu; svaki protein ima svoju specifično prostorno-organizovanu strukturu – nativnu konformaciju , što mu obezbeđuje izvršavanje specifične biološke funkcije u živom sistemu
Opšta definicija živog sistema na osnovu ovih aksioma, bila bi da on predstavlja samoorganizovan, samoregulirajući, samoreplicirajući izotermalni otvoren sistem roganskih molekula, koji funkcioniše po principu maksimalne ekonomičnosti delova i procesa. Taj sistem je u stanju da otpočne seriju povezanih komponenti, koristeći pri tome biokatalizatore biokatalizatore reakcija za transformaciju energi je i za sintezu sopstvenih komponenti,
koje sam proizvodi.
3. Uloga vode u funkcionisanju živih sistema: Voda je hemijsko jedinjenje kiseonika i vodonika, vodonika, hemijske formule H 2O. Ona je tečnost bez mirisa i
ukusa koja je prisutna skoro svuda: u okeanima, morima, rekama, jezerima, gasovita u oblacima,
zamrznuta u glečerima ili u velikim podzemnim bazenima ispod krečnjačkih stena. To je jedina hemijska supstanca koja može postojati u sva tri agregatna stanja. Sam život na plan eti je nastao i evoluirao u vodi – u primrodijalnom moru. Vodu neprestano koristi živi svet koji bez nje ne može da živi. Ljudsko telo čini 72 odsto vode, pri čemu ono stalno unosi i izbacuje nove količine. Voda je presudna za metabolizam u organizmu, pošto omogućuje varenje i kasnije rastvaranje hrane u ćelijama, ali i čišćenje ćelija od otpada.
Voda, je hemijski reaktivna tečnost sa dosta neverovatnim fizičko -hemijskim karakteristikama smeštenim u tako mali molekul. Kada bi se napravio neki molekul sa istim osobinama kao i voda, on bi morao biti mnogo veći i kompleksniji i ni tad nije sigurno da li bi imao funkcionalnost značajnu za biološke sisteme, kakav ima voda. Te osobine vode su od izuzetnog značaja za održavanje i funkcionisanje bioloških sistema. Strukture molekula na kojima je baziran život rezultiraju baš iz njehove 3
interakcije sa vodom. Kombinacije rastvornih osobina tih molekula, odgovornih za njihove intermolekulske i intramolekulske asocijacije, su posledica svojstava vode. Ona deluje kao akter u
kontaktu između bioloških molekula, ali ne samo u njihovom razdvajanju u vodenoj sredini ćelije, već i u prenošenju informacije među njima. U vodenoj sredini svaki molekul je u stanju da detektuje strukturu ostalih prisutnih molekula, stoga ti molekuli u ćeliji deluju kao zajednica, a ne kao pojedinačne strukture. Odatle i potiče kompleksnost i funkcionalnost ćelije – svi biološki procesi mogu se objasniti samo korišćenjem fizičkih i hemijskih svojstava. Osobine vode koje je ćine tako značajnom za ćeliju su:
Polarizovanost – on je dipol (visoko negativni atom kiseonika teži da privuče elektrone od
vodonika, što čini okolinu vodonika parcijalno pozitivnom, a okolinu kiseonika parcijalno negativnom); polarizovani molekuli vode formiraju slabo elektromagnetno polje, što im omogućava da stupe u međusobnu interakciju, ali i da interaguju sa drugim biološki važnim molekulima; međusobnom interakcijom molekula vode se formiraju vodonične veze – elektrostatičke interakcije koje se uspostavljaju između vodonika, kovalentno vezanih za elektronegativni atom; ove veze omogućavaju održavanje strukture DNK u 3 -D organizaciji; zbog mogućnosti međusobnog privlačenja i formiranja vodoničnih veza, voda poseduje izuzetnu strukturnu uređenost Specifični toplotni kapacitet – količina energije potrebna da se temperature 1g neke supstance poveća za 1°C (od 15 do 16°C); za vodu je potrebna jedna kalorija ( 1 cal ), što je mnogo više nego za bilo koju drugu supstancu; što veći specifični toplotni kapacitet to je više toplotne energije potrebno za promenu temperature nekog sistema; stoga je voda jako podesna za održavanje telesne temperature živih sistema konstantnom Toplota isparavanja – direktna mera količine energije potrebne da se dovede nekom siste mu da bi se prevazišle privlačne sile između molekula tečnosti, tako da se oni razdvajaju i prelaze u gasovito stanje; voda ima izuzetno veliku toplotnu isparavanja, što je takođe čini podesnom za održavanje telesne temperature živih sistema konstantnom Toplota fuzije – količina energije koju sistem mora da oslobodi da bi prešao u čvrsto stanje; voda se naravno odlikuje velikom toplotom fuzije
Maksimalna gustina na +4°C – voda se širi pri hlađenju, pa je njeno čvrsto agregatno stanje –
led, lakše nego tečno; to je posledica kumulativnog formiranja vodoničnih veza između molekula vode pri njenom hlađenju; svaki molekul vode uspostavlja vodoničnu vezu sa okolnim molekulima vode formirajući tetraedalnu strukturu ; biološki značaj ovoga jeste da voda uvek mrzne od površine ka dnu Rastvorljivost u vodi – voda je univerzalan rastvarač i ima veoma visoku dielektričnu konstantu, tako da teži da neutrališe elektrostatičku privlačnost između pozitivnih i negativnih jona (Coulombov zakon); rastvroljivost soli u vodi je posledica dipolnog fenomena vode – on rastvara soli interakcijom sa svakim jonom ponaosob, formirajući pri tome hidrate tih jona; rastvorljivost polarnih supstanci u vodi se objašnjava sposobnošću polarnih grupa tih jedinjenja da formiraju vodonične veze sa molekulima vode
4
Hidrofobna interakcija – većina biomolekula u svojoj strukturi ima hidrofilni domen (polarne ili
jonizovane grupe) i hidrofobni domen (nepolarna grupa) – amfipatični molekuli ; takvi molekuli se
u vodenoj sredini ponašaju jako specifično – hidrofilni delovi interaguju sa vodom, a hidrofobni se međusobno ogranizuju tako da istiskuju vodu iz svoje sredine (hidrofobna interakcija); stoga se ne radi o pravoj rastvorljivosti ovih molekula nego o njihovoj disperziji u formi micela; one se mogu f ormirati samo pri određenim koncentraicjama, onda kada je koncentraicja veća od
kritične micelarne koncentracije; fosfolipidi u vodenoj sredini formiraju dvosloje – lipozome Jonizacija vode – postoji tenedecija da zbog tesne veze elektrona vodonika sa atomom kiseonika. Vodonik kovalentno vezan za kiseonik preskoči na susedni molekul kiseonika, čime se formiraju hidronijum jon (H3O+) i hidroksilni jon (OH -); voda može provoditi protone preko vodoničnih veza – fenomen tunelovanja protona;
Mnoge funkcionalne grupe biološki vaćnih molekula su podložne kiselinsko-baznim reakcijama, pa zato njihove osobine variraju od pH vrednosti sredine u kojoj se nalaze. Kiseline su donori protona, a baze akcpetori. U reakciji kiseline sa bazom, se od kiseline dobija konjugovana baza, a od baze konjugovana
kiselina. Jačina kiseline je određena njenom konstantnom disocijacije (K). Ona je okarakterisana konstantnom ravnoteže, i predstavlja meru relativnog afinitet a između kiseline i njene konjugovane baze (HA/ A-), i baze i njene konjugovane kiseline (H3O+/H2O). HA + H2O ↔ A- + H3O+
=
[3 + ][− ] [][2 ]
[H2O]=const → [3 + ][− ] = [2 ] = [] Kiseline mogu biti klasifikovane prema relativnoj snazi, odnosno sposobnosti da prenesu proton na vodu, na slabe (K<1; konstanta disocijacije je manja od konstante disocijacije H 3O+) i jake (K>1; konstanta disocijacije je veća od konstante disocijacije H3O+). Konstanta disocijacije vode je jednaka:
=
[ + ][− ] [2 ]
I pošto je, kao što je već rečeno, koncentracija vode u razblaženom vodenom rastvoru konstantna – 55.5 M, tako da se uvođenjem te vrednosti u jednačinu dobija konstanta jonizacije vode. = [+ ][ − ] = 1.0 ∙ 10−4 /
Čista voda mora da sadrži istu količinu protona i hidroksilnih jona, pa formula dobija novi oblik kojima se izražava jonski proizvod vode: 2
= [+ ] = [− ] = 1.0 ∙ 10−7 /
5
Iz jonskog proizvoda vode se može odrediti kiselos t ili baznost sredine. Kada je koncentracija protona i hidroksilnih jona u rastvoru jednaka, rastvor je neutralan; u koliko ima više protona on je kiseo, a u suprotnom bazan. pH vrednost je mnogo prkatičnija mera aktivnosti vodonikovih jona (H+). pH vrednost je bezdimenziona veličina, i za poređenje se koristi pH skala koja obuhvata vrednosti od 0 do 14. Za kisele rastvore pH vrednost je manja od 7 (pH < 7,0), a za bazne je veća od 7 (pH > 7,0). Za neutralan rastvor pH je 7. Mera analogna ovoj za koncentraciju hidroksilnih jona u rastvoru je pOH. Iako je pH
vrednost bezdimenziona veličina, njena skala nije proizvoljna. pH vrednost se meri na osnovu aktivnosti vodonikovih jona u rastvoru.
= [ + ]
4. Biomolekuli i organizacija ćelije: Svi živi sistemi su izgrađeni od ćelija, kao osnovnih gradinih blokova, koje predstavljaju kompartmente ograničene membranom, ispunjene koncentrisanim vodenim rastvorom hemikalija. Najprostiji živi sistemi se sastoje iz jedne ćelije – prokarioti ; dok su viši organizmi, izgrađeni od skupova ćelija, od kojih je svaki specijalizovan za vršenje neke određene funkcije - eukarioti . Prokariotima pripadaju bakterije i cijanobakterije, anaerobnom ili aerobnog metabolizma, sa malo ili bez organela, cirkularnom DNK, slabo razvijenim citoskeletom. Sinteza RNK i proteina je povezana i vrši se na istom mestu, dok se deoba vrši
binarnom fisijom. Eukariotima pripadaju organizmi jednoćelijske ili višećelijske organizacije i aerobnog metabolizma – protisti, gljive, biljke i životinje. Oni imaju razvijene organele (nukleus sa nukleolusom, mitohondrije, endoplazmin retikulum, plastidi…), citoskelet od proteinskih filamenata i linearnu DNK u hromozomima nukleusa. RNK se sintetiše u nukleusu, a proteini odvojeno u nukleusu ili citoplazmi. Eukariotske ćelije se deobu vrše mitozom ili mejozom. Molekuli koji se nalaze u živim sistemima i omogućavaju njihovu unutrašnju orgnaizovanost i funkcionalnost se nazivaju biomolekuli . Živi sistemi su uglavnom izgrađeni od ugljenika, kiseonika, vodonika i azota. Samo trećina od svih prirodnih elemenata učestvuje u izgradnji živih organizama. Ova četiri elementa lako formiraju kovalentne veze, pa p redstavljaju osnov za za izgradnju različitih biomolekula. Ugljenikovi atomi mogu graditi duge lance – alifat ična jedinjenja, i prstenove – ciklična jedinjenja, koja mogu biti homo- i heterociklična. Homociklični prstenovi su izgrađeni samo od atoma ugljanika, a heterociklični u svojoj strukturi pored C-atoma,imaju i neki drugi atom (kiseonik, azot ili sumpor).
Molekulska struktura ćelije podesuje visok stepen hijerarhijske organizacije komponenti . Osnovni prekursori za sve biomolekule, koji se uzimaju iz sredine su ugljendioksid, voda i amonijak . Od njih se
dobijaju metabolički intermedijeri piruvat , oksalacetat, citrat, malat i izocitrat , od kojih će se sintetisati gradivni blokovi biomolekula – nukleotidi, aminokiseline, monosaharidi, masne kiseline i glicerol . Na
sledećem hijerarhijskom nivou se nalaze makromolekuli ili biomolekuli – nukleinske kiseline, proteini, polisaharidi i lipidi , koji će graditi supramolekulske strukture – hromozome, ribozome, enzimske komplekse, kontraktilne sisteme i mikrotubule. Na samom vrhu organizacije se nalazi ćelija, izgrađena iz nukleusa, mitohondrija, hloroplasta, G oldžijevog aparata, membrane, citoskeleta… Biomolekuli su u stalnom prometu i reakcije se odigravaju veoma brzo. Sve biološke hemijske reakcije su katalizovane 6
enzimima, koji konvertuju supstrate u produkte. Osnovna karakteristika hijerarhijske organizacij e ćelije
jeste da se pojedini koraci usložnjavanja strukture razlikuju po vezama koji međusobno uspostavljaju. Npr. povezivanje gradivnih blokova u odgovarajuće makromolekule se zasniva na uspostavljanju kovalentnih
veza; dok
se
organizacija
supramolekulskih
struktura
zasniva
na
strukturnoj
komplementarnosti komponenata koji međusobno interaguju preko nekovalentnih veza – vodonične veze, elektrostatičke interakcije ili van der Waalsove sile. Vodonična veza predstavlja vezu između atoma vodonika i dva druga atoma – donora H-atoma i akceptora (parcijalno negativno naelektrisan atom). Znači to je veza koju uspostavlja vodonik (kovalentno vezan za elektronegativan atom) sa susednim elektronegativnim atomom. U biološkim sistemima donori su obično elektronegativni kiseonik ili azot za koje je H-atom vezan, a akceptori su takođe kiseonik ili azot. Elektrostatičke interakcije nastaju stupanjem u kontakt grupa molekula sa suprotnim naelektrisanjem, poštujući Coulombov zakon elektrostatičkog privlačenja ( =
∙ ∙
). Elektrostatičke interakcije su poznate i kao jonske veze ili soni
mostovi. Van der Waalsove sile su nespecifične privlačne sile, koje se uspostavljaju kada bilo koja dva
atoma dođu u međusobnu blizinu od 3 -4Ᾰ. Ovo su dosta slabe veze, ali su isto tol iko bitne za biološke sisteme. Osnova van der Waalsovih veza jeste distribucija promena distribucije naelektrisanja u toku nekog vremena. Ta tranzitorna asimetričnost u naelektrisanju jednog atoma, favorizuje asimetriju elektronskog naelektrisanja u susedn im atomima. Rezultujuća privlačnost između para atoma se uvećava
kako oni dolaze u bliži kontakt, dok ne dostignu van der Waalsovu kontaktnu distancu (ukoliko se razdaljina dalje smanji doći će do odbijajućih sila), koja se izračunava sabiranjem kontaktnih prečnika atoma koji uspostavljaju ovu vezu. To znači da će efektivnost ove veze, zavisiti od steričke, prostorne komplementarnosti; dok će odsustvo specifičnosti omogućavati uspostavljanje većeg broja veza istovremeno. Glavne klase biomolekula - nukleinske kiseline, proteini, polisaharidi i lipidi; uvek imaju istu funkciju u
svim živim sistemima. Nukleinske kiseline uvek služe za čuvanje i prenošenje genetičke informacije; proteini su enzimi i strukturne komponente; ugljeni hidrati rezervne forme energije, kao i strukturni elementi; i lipidi su strukturna osnova membrane i rezervna forma energije. Analizom svih biomolekula,
došlo se do zaključka da svi oni vode poreklo od oko tridesetak molekula, označenih kao primrodijalni molekuli (dvadeset aminokiselina, tri pirimidinske baze, dve purinske baze, dva monosaharida – α-Dglukoza i α-D-riboza, glicerol, holin, masne kiseline…). Ruski naučnik Aleksandar Oparin i engleski naučnik J.B.S. Haldane su došli do zaključka da su uslovi u primitivnoj redukujućoj atmosferi Zemlje, uz učešće UV zračenja i električnog pražnjenja, mogli dovesti do nastanka prostih organskih molekula, i da su se ta jedinjenja akumulirala u visokim koncentracijama primitivnog okeana čineći neku vrstu organske supe. Ova teorija je eksperimentalno potvrđena. Mnoge činjenice potvrđuju da su u ranoj fazi istorije Zemlje, organska jedinjenja prvo nastala interakcijom neorganskih komponenti primitivne atmosfere i geosfere,
koja je bila uzrokovana od strane električnog pražnjenja, UV i radiokativnog zračenja i toplotom. Proces sinteze organskih molekula od neogranskih sirovina se naziva hemijska evolucija , i smatra se da je ona
trajala oko 1.5 milijardi godina (trećina ukupne istorije Zemlje).
5. Struktura i funkcija saharida
7
6. Struktura i funkcija lipida 7. Struktura i funkcija proteina 8. Struktura i funkcija nukleinskih kiselina
9. Opšti pregled puteva transfera materije i energije u živim sistemima: Metabolizam je skup svih biohemijskih procesa u kojima dolazi do modifikacije hemijskih jedinjenja u
živim organizmima i ćelijama, i to uz stalan protok energije i materije kroz organizam u komunikaciji sa spoljašnjom sredinom što im daje osnovu za održavanje svoje unutrašnje strukture i funkcije . U metaboličkim procesima dolazi do iskorišćavanje slobo dne energije (G), potrebne za realizaciju svih funkcija nekog organizma. Metabolizam obuhvata anabolizam, odnosno biosintezu (stvaranje) kompleksnih organskih molekula; katabolizam, koji je obrnuti proces od anabolizma, a to je razlaganje kompleksnih organskih jedinjenja u jednostavnija jedinjenja; i amfibolizam, procesi koji povezuju puteve katabolizma i amfibolizma. Znači metabolzam omogućava povezivanje egzerogenih reakcija (kataboličke reakcije) i enderogenih reakcija (anaboličke reakcije), potrebnih za održavanje funkcionalnosti živog sistema.
Živi sistemi se mogu podeliti na autotrofe i heterotrofe, i to na osnovu načina usvajanja ugljenika. Autotrofi mogu koristiti CO2 kao izvor ugljenika i mogu sintetisati sve svoje ćelijske konstituente koristeći ugljendioksid i male proste molekule (NH3, H2S, H2O…). Heterotrofi, kao izvor ugljenika, koriste redukovana organska jedinjenja – poput glukoze. Obligatni aerobni heterotrofi moraju koristiti kiseonik za procese oksidacije organskih jedinjenja, dok neki anaerobni prokariotski heterotrofi mogu koristiti sulfate ili nitrate.
Ciklus ugljenika u biosferi se zasniva na postojanju fotosintetičkih ćelija koje u procesu fotosinteze prevode ugljendioksid i vodu u glukozu, uz oslobađanje kiseonika i korišćenje Sunčeve energije. Nastalu glukozu koriste heterotrofi koji je degradiraju do ugljendioksida i vode. Znači kruženje ugljenika u biosferi predstavlja sintrofiju između autotrofa i heterotrofa. Na osnovu toga koji vid energije koriste, organizmi su podeljeni na fototrofe i hemotrofe. Fototrofi, biljke i cijanobakterije, slobodnu energiju potrebnu za prenos elektrona od inorganskog donora na CO 2, ustvari za sintezu glukoze u procesu fotosinteze, dobijaju iz energije Sunca. n CO2 + n H2O → (CH2O)n + n O2
Cijanobakterije su organizmi u stanju da vrše ne samo fotosintezu, već i konvertovanje atmosferskog azota u organska azotna jedinjenja – azotofiksacija. Zbog ovoga oni imaju najmanje nutritivne zahteve za svoju reprodukciju. Kod anaerobnih fotosintetičkih bakterija se vrši najjednostavniji vid fotosinteze, gde su donori elektrona vodonik, vodoniksulfid ili neko organsko jedinjenje. n CO2 + 2n H2S → (CH2O)n + n H2O + 2n S
8
Hemotrofi dobijaju slobodnu energiju iz hemijske veze jedinjenja koja oksiduju. Oni su u zavisnosti od toga koja jedinjenja koriste kao donore elektrona u procesu oksidacije, podeljeni na:
Hemolitotrofe – organizmi koji kao donore elektrona koriste proste inorganske molekule - NH 3,
H2S i H2
Hemoorganotrofe – organizmi koji kao donore elektrona koriste kompleksna organska
jedinjenja; njihovom oksidacijom se dolazi do metaboličkih intermedijera, koji se kasnije koriste kao prekurosri za biosintezu nekih drugih biomolekula; mnogi organizmi u anaerobnim uslovima
mogu delimično da metabolišu različita organska jedinjenja korz oksidoredukcione procese u seriji reakcija – fermentacija Ciklus energije u živim sistemima može da se ostvaruje na dva načina. Hemijska energija oslobođena u procesima katabolizma redukovanih jedinjenja se može deponovati u obliku ATP-a, koji je ključni energetski biomolekul svih živih sistema. Sintetisani ATP se koristei za sve vrste rada u živom sistemu, pri čemu se razgrađuje na jednu fosfatnu grupu i ADP. Alternati vni energetski ciklus se zasniva na koenzimu nikotinamid adenindinukleotid fosfatu – NADP +, koji se u procesima oksidacije redukuje na NAPDH i H+. Nastali NADPH i H + se koriste u reduktivnim biosintetičkim reakcijama, pr čemu se dobijaju redukovani produkti i regenerisani oskidovani NADP +. Na taj način se oslobođena hemijska energija u procesu katabolizma, direktno prenosi na procese anabolizma.
Ciklus azota je u živim sistemima dosta komplikovan. Viši organizmi nisu sposobni da vrše redukciju elementarnog azota u amonijum jon, tako da ne mogu da koriste azot iz atmosfere, nego nitrate,
amonijak i aminokiseline iz proteina. Ključnu ulogu u ciklusu azota u biosferi imaju azotofiksirajuće bakterije, koje poseduju nitrogenazni kompleks koji se sastoji iz dve vrste proteinskih komponenti i koji
im omogućava redukovanje N2 u NH4+, uz utrošak energije hidrolizom 12 molekula ATP -a. Promet sumpora se veoma razlikuje u zavisnosti od vrste živog sistema, ali transsulfuracioni putevi se uglavno m zasnivaju na enzimskim manipulacijama sa cisteinom. Metabolizam obezbeđuje četiri specifične funkcije za žive sisteme – obezbeđuje hemijsku energiju iz redukovanih organskih jedinjenja ili iz apsorbovane Sunčeve svetlosti; konverziju egzogenih nutrijenata u gradivne blokove, prekursore ili makromolekulske komponente ćelije; povezivanje gradivnih blokova u biomolekule; formiranje i degradaciju biomolekula potrebnih za specijalizovane funkcije ćelije.
Kompletan metabolizam i njegova sinhronizovana aktivnost se zasniva na postojanju multienzimskih
sistema u živim sistemima, pri čemu se moraju poštovati tri pravila: 1. Metabolički putevi su ireverzibilni – katabolički putevi su visoko egzerogeni (∆G<0), a anabolički enderogeni (∆G>0), i ove osobine metaboličkim putevima daju usmerenost; tako da ako su dva supstrata interkonvertibilna, biohemijski put koji vodi od molekula A do molekula B, se razlikuje
od biohemijskog puta prevođenja molekula B u A; to daje osnovu za sinhronu ili nezavisnu i preciznu regulaciju oba puta; ipak dosta reakcija se odvija veoma blizu ekvilibrijuma same
reakcije, ali uvek psotoji jedna ireverzibilna egzerogena reakcija na početku metaboličkog puta koja gura nastale produkte u dalje konverzije do kraja metaboličkog puta
9
2. Metabolič ki putevi su regulisani – ključne reakcije svakog metaboličkog puta su jako
kontrolisane; to su najčešće reakcije kojima se otpočinje metabolički put, te se glavna regulacija zasniva na nivou kontrole aktivnosti enzima koji katalizuju prvu reakciju u putu 3. U eukariotskim ćelijama, metabolički putevi se dešavaju na specifičnim ćelijskim lokacijama –
sinteza metabolita se dešava u specifičnim subcelularnim kompartmentima , koji su okruženi membranama; zato je i potreban transport metabolita između ovih subcelul arnih odeljaka; biološke membrane su selektivno permeabilne za određene metabolite zahvaljujući prisustvu specifičnih transportnih proteina u njima
10. Enzimi – priroda, nomenklatura, specifičnost 11. Kofaktori – priroda; funkcija u enzimski katalizovanim procesima 12. Slobodna energija aktivacije i efekat katalizatora 13. Aktivni centar – osobine; odnos konf ormacije enzima i katalitičke aktivnosti
14. Građa i funkcija aktivnog centra – primer himotripsina 15. Kinetika enzimski katalizovanih reakcija (Michaelis – Mentenova konstanta)
16. Faktori koji doprinose katalitičkoj aktivnosti enzima 17. Aktivacija i inhibicija enzima
18. Regulatorni enzimi (alosterički i kovalentno modulirani enzimi): Regulatorni enzimi su enzimi koji pored definisanog optimuma pH vrednosti i potrebe za jonima metala
ili koenzimima za pravilno funkcionisanje, imaju i regulatornu ulogu u ćeliji, tako kontrolišući metabolizam. Razlikuju se alosterički (aktivnost im je modulirana kroz nekovalentno vezivanje specifičnih metabolita za enzim van aktivnog mesta) i kovalentno modulirani enzimi (prevode se iz neaktivne u aktivnu formu nekim drugim enzimom). Alosterički proteini su u stanju da unutar molekula formiraju alternativne vodonične veze sa sličnom
energetskom vrednošću, i na taj način reverzibilno zauzimaju dva konformaciona stanja. Promena
vodoničnih veza, ili ti promena alosteričkog stanja zahteva i promenu u prostornoj organizaciji između pojedinih domena proteina. Favorizovana su stanja sa relativno veliko m stabilnošću, ali i među njima ima razlike u stabilnosti. Obično se u neaktivnom stanju zauzima stabilnija konformacija, dok ona manje stabilna ima visok afinitet za vezivanje drugog molekula – liganda. Njegovo vezivanje potpuno stabilizuje tu konformaciju. Vezivanje liganda je nekovalentno i reverzibilno, i njegovo prisustvo diktira
konformaciju koju će protein zauzeti. Alosterički enzimi su glavni elementi regulacije u biosintetskim putevima gde postoji inhibicija povratnom spregom. Oni dakle, pored aktivnog imaju i alosteričko ili regulatorno mesto, za koje se vezuju supstrat i ligand – molekul modulator aktivnosti enzima . Postoje
10
dva modela koja objašnjavaju kako funkcionišu subjedinice alosteričkih enzima. Oba se baziraju na postojanju dve finalne forme enzima – neaktivna forma ili ti T-stanje, i aktivna forma ili R-stanje. U neaktivnoj formi ni jedna subjedinica enzima nema visok afinitet za supstrat, dok u aktivnoj formi obe imaju jako visok afinitet. Prvi model je usklađeni model alosteričke interak cije. Po tom modelu vezivanje
supstrata za jednu subjedinicu enzima indukuje alosteričku promenu u drugoj, koja sada lakše interaguje sa drugim molekulom supstrata. Tako enzim prelazi iz T-stanja u R-stanje. Negativni modulator stabilizuje T-stanje, a pozitivni R-stanje. Drugi model je sekvencijalni model alosteričke interakcije , po
kome vezivanje supstrata za jednu subjedinicu indukuje alosteričku promenu u toj istoj subjedinici – međustanje RT-hibrid . Vezivanje supstrata za drugu subjedinicu je o lakšano jer ta subjedinica u RThibridu ima veći afinitet za supstrat, što dovodi do prelaska u finalno R -stanje. Sekvencijalni model predviđa tranziciju stanja iz T u R, u subjedinicama pojedinačno, kao i TR hibridno stanje; dok usklađeni to ne radi.
Alosterički enzimi su zastupljeni u svim živim sistemima i katalizuju reakcije u metaboličkim putevima preko koih se vrši regulacija tog puta. Ovim enzimima pripadaju transkarbamiloza (ATCaza), fosfofruktokinaza, fruktozo-1,6-bisfosfataza... Aktivacija ili inaktivacija kovalentno moduliranih enzima se bazira na modifikaciji trodimenzionalne
strukture enzima pomoću nekog drugog enzima. Najčešće se kovalentna modulacija odvija kroz fosforilaciju, adenilizaciju, uridilizaciju...- enzima.
19. Alosterička modifikacija regulatornih enzima (primer aspartat transkarbamoilaze): Poznat alosterički enzim je aspartat transkarbamiloza ( ATCaza). Ona otpočinje biosintezu pirimidina, katalizujući biosintezu N-karbamoil-aspartata počevši od karbamoil-fosfata i asparaginske kiseline. Ona je inhibirana CTP -om (citidin-3-fosfat), kao krajnjim produktom puta biosinteze pirmidina. Vezivanje karbamoil-fosfata i asparaginske kiseline je kooperativan proces, pa to omogućava sintezu
dovoljne količine N-karbamoil-aspartata, i u prisustvu niskih koncentracija supstrata. CTP , kao negativni modulator , inhibira ATCazu smanjujući njen afinitet za supstrate; ATP , kao pozitivni modulator , aktivira enzim i povećava njegov afinitet prema supstratu bez uticaja na Vmax. Ova dva modulatora su u kompetitivnom odnosu, tako da aktivnost ATCaze zavisi od trenutne koncentracije ta dva modulatora. Visoka koncentracija ATP- a govori da je energetsko stanje ćelije pogodno za replikaciju DNK -a, pa on
stimuliše sintezu CTP-a aktivirajući ATCazu, pošto je i CTP po treban za replikaciju DNK. Suprotno tome, u prisustvu velikih koncentracija CTP- a, dolazi do inhibacije ATCaze, što sprečava sintezu N-karbamoilaspartata, i samim tim sprečava sintezu i ostalih intermedijera u biosintezi pirimidina. Enzim ATCaza se sastoji iz dva katalitička trimera i dva regulatorna dimera. Ovo je dokazano razlaganjem
enzima određenim tretmanima. Aktivnost slobodnih katalitičkih trimera nije pod uticajem modulatora. Izolovani regulatorni dimeri vezuju za sebe alosteričke modulatore isto kao i intaktan enzim, ali ne poseduju nikakvu katalitičku aktivnost. Ovo je dokazalo da regulatorni dimeri alosterički redukuju aktivnost katalitičkih trimera enzima. Prevođenje enzima u neaktivnu formu se ostvaruje vezivanjem liganda CTP-a za regulatorne jedinice, a aktivacija vezivanjem ATP-a takođe za regulatorne jedinice što 11
dovodi do alosteričke modifikacije enzima. Ako se ATCaza tretira agensima koji će reagovati sa sulfhidridnim grupama, ATP i CTP gube svoje efekte na katalitičke moći enzima, dok enzim zadržava svoju katalitičku aktivnost – desenzitizacija enzima. Alosteričke interakcije u ovom enzimu se ostvaruju kroz velike promene u kvaterernoj strukturi enzima. Dolazi do širenja molekula nakon vezivanja supstrata tako da se katalitički trimeri udaljavaju jedan od drugog. I ATP i CTP se vezuju za isto mesto na spoljašnjoj strani regulatorne subjedinice ATCaze. ATP se vezuje za R-stanje enzima, dok se alosterički inhibitor vezuje za neaktivno T -stanje enzima. Vezivanje supstrata za prvu kata litičku subjedinicu trimera povećava afinitet vezivanja od strane drugih katalitičkih subjedinica – postoji kooperativni efekat vezivanja supstrata za ATCazu i to odgovara usklađenom modelu alosteričke transformacije. Sve alosteričke promene ATCaze se dešavaju zahvaljujći specifičnoj građi enzima – postojanju fleksibilne petlje (240-petlja) koja menja lokalnu organizaciju tog regiona pri prelasku enzima iz T u R-stanje. U T-stanju ona formira vodonične veze sa katalitičkim trimerom, koje se raskidaju nakon vezivanja supstrata usled migracije subjedinica. U R- stanju ona formira nove vodonične veze.
20. Kovalentna modifikacija regulatornih enzima (primer glikogen fosforilaze): Enzim glikogen fosforilaza je enzim koji je kovalentno moduliran putem fosforilacije. U mišićima i jetri, ona postoji u dve interkonvertibilne forme – fosforilaza a (aktivna, fosforilisana forma) i fosforilaza b (nefosforilizovana neaktivna forma). Ovaj enzim katalizuje proces fosforilize glikogena – uvodi molekul fosforne kiseline na mesto glikozidne veze počev od C 4-neredukujućeg kraja lanca dajući kao produkte glukozo-1-fosfate. Aktivnost ovog enzima je regulisana alosterički, preko ATP-a, glukozo-6-fosfata i
glukoze kao inhibitora; i AMP-a kao aktivatora. Aktivacija fosforilaze (prelazak iz fosforilaze b u fosforilazu a) se ostvaruje fosforilacijom bočne grupe aminokiseline – serina, u polipeptidnim lancima obe subjedinice. Donor fosforne grupe je u tom slučaju ATP . Ovu reakciju katalizuje kinaza fosforilaze, i na kraju reakcije se pomera ekvilibrijum u aktivno R-
stanje. Fosforilacija dovodi do velike konformacione promene, tako da dolazi do pomeranja jednog dela polipeptida na N-terminusu sa površine prema unutrašnjosti. U neaktivnoj formi ovaj deo od 19 aminokiseline je slobodan i lako pokretljiv, dok u aktivnom stanju on interaguje sa bočnim grupama aminokiseline iz obe subjedinice što rezultira konformacionom promenom i nastankom veoma riginde strukture. AMP deluje po sličnom principu. On se čvrsto vez uje za mesta locirana na površinama
interakcije dve subjedinice, i inaktivacija fosforilaze a se vrši hidrolizom fosfornih grupa sa serina na obe subjedinice. Ova reakcija je katalizovana enzimom fosfoprotein fosfatazom. Suprotno glikogen fosforilazi, enzim glikogen sintaza je aktiviran glukozo-6-fosfatom. Znači ako je visok
zahtev ćelije za ATP-om, onda je stimulisana glikogen fosforilaza i koordinisano inhibirana glikogen sintaza. Posledica toga je favorizovanje glikogenolize ili ti razlaganja glikogena. Obrnut proces se d ešava ako ćelija ima nizak zahtev za ATP-om. Metabolizam glikogena je pod cikličnom kaskadnom kontrolom, koja predstavlja seriju kovalentnih
modifikacija i demodifikacija enzima u metaboličkom putu. Biosinteza glikogena je, kao što je već 12
rečeno, usko povezana sa njegovom degradacijom, i to preko glikogen fosforilaze i glikogen sintaze. Njihova aktivnost je kontrolisana cikličnom kaskadom zasnovanom na fosforilaciji i defosforilaciji serije enzima, koja je indukovana hormonima – glukagon (u jetri), i insulin, epinefrin i norepinefrin (u mišićima i drugim tkivima). Ćelije na svojim membranama imaju receptore za koje se vezuju hormoni i to stimuliše metabolizam glikogena. Proces ciklične kaskadne kontrole metabolizma glikogena u mišićima i drugim tkivima, ima sledeći tok: 1. Hormoni se vezuju za receptore na ćelijskim membrana, što dovodi do aktivacije adenil ciklaze 2. Adenilat ciklaza katalizuje sintezu ciklično g AMP-a (cAMP ) od ATP-a; cAMP služi kao prenosilac hormonskih signala – sekundarni glasnik ; koncentracija cAMP-a u ćeliji je u funkciji odnosa
njegove sinteze katalizovane adenilat ciklazom, i njegove hidrolize od strane specifične cAMP fosfodiesteraze 3. Povećan nivo cAMP-a u ćeliji dovodi do aktiviranja enzima cAMP zavisne protein kinaze (potpuno neaktivna bez cAMP-a; vezivanjem za njega dolazi do alosteričke modifikacije enzima i disocijacije
katalitički aktivnih subjedinica) 4. cAMP zavisna protein kinaza fosforiliše enzime kinazu fosforilaze i glikogen sintazu; to je osnova za regulaciju sinteze i razgradnje glikogena; protein kinaza posredno aktivira glikogen fosforilazu i simultano inaktivira glikogen sintazu; glikogen sintaza se fosforiliše i od strane kinaze fosforilaze i
to osigurava da neće doći do sinteze glikogena; kinaza fosforilaze konvertuje glikogen fosforilazu b u njenu aktivnu formu, i ona se aktivira pri niskim koncentracijama Ca 2+ kao i naravno
kovalentnom modifikacijom uz pomoć protein kinaze; kinaza fosforilaze se sastoji iz četiri subjedinice (γ-subjedinica katalitički aktivna; δ-subjedinica ili kalmodulin, ima četiri mesta za vezivanje jona Ca2+ i vezivanje za bilo koje mesto dovodi do konformacione promene dovoljne za aktivnost enzima; u procesu aktivacije enzima moraju se fosforilisati i α - i β-subjedinice jer se maksimalna aktivnost enzima postiže jedino tada); uticaj kalcijuma je bitan jer povezuje
razgradnju glikogena sa kontrakcijom mišića; 5. Enzimi se vraćaju u početno stanje hidrolitičkim uklanjanjem fosfatnih grupa – defosforilacija; to je katalizovano fosfoprotein fosfatazom-1; ona katalizuje defosforilaciju i kinaze fosforilaze i glikogen fosforilaze a, prevodeći ih u neaktivno stanje i istovremen o aktivira glikogen sintazu; ovaj enzim je u mišićima aktivan samo ako je vezan za glikogen preko G-subjedinice; aktivnost i afinitet prema G-subjedinici fosfoprotein fosfataze-1 je regulisana fosforilacijom dva različita mesta na G-subjedinici – fosforilacija mesta 1 aktivira fosfoprotein fosfatazu-1 i dovodi do smanjenja stepena fosforilacije glikogen fosforilaze, i na taj način smanjuje i razgradnju glikogena
i istovremeno stimuliše njegovu sintezu; suprotno tome fosforilacija mesta 2 od strane cAMP zavisne protein kinaze izaziva disocijaciju, odvajanje fosfoprotein fosfataze-1 iz kompleksa sa G-
subjedinicom i njeno oslobađanje u citoplazmu (slobodan enzim ne može da katalizuje defosforilaciju enzima metabolizma glikogena); njenu aktivnost u citoplazmi inhibira inhibitor 1 fosfoprotein fosfataze (efikasan je samo ako je fosforilisan i to od strane cAMP zavisne protein
kinaze – ona konroliše koji će deo enzimskih molekula biti fosforilovan ne samo povećanjem
brzine njihove fosforilacije, već i smanjenjem brzine njihove defosforilacije)
13
U jetri je ukupna aktivnost fosfoprotein fosfataze-1 kontrolisana vezivanjem ovog enzima za aktivnu formu glikogen fosforilaze a. Glavna konformaciona promena glikogen fosforilaze je kretanje polipeptida
sa fosforilovanim serinom sa površine T -stanja prema mestu u unutrašnjosti, lociranom na površina ma interakcije dve subjedinice u R-stanju. Fosfoprotein fosfataza-1 je u oba stanja čvrsto vezana sa enzim, ali samo je u T-stanju fosforna grupa serina dostupna hidrolizi. Posledica hidrolize fosforne grupe je prelazak iz fosforilaze a u fosforilazu b. Prema tome fosforilaza a u svom R-stanju veoma efikasno uklanja fosfoprotein fosfatazu-1 iz opticaja, dok fosforilaza b ima veoma nizak afinitet za vezivanje fosfoprotein fosfataze-1 za sebe. Samim tim, konverzija fosforilaze je povezana sa oslobađanjem fosfoprotein fosfataze-1 iz kompleksa, što omgućava da ovaj enzim katalizuje defosforilaciju ostalih fosfoproteina,
uključujući i glikogen sintazu. Kao i glikogen fosforilaza, i glikogen sintaza postoji u dve interkonvertibilne forme koje se takođe modifikuju kaskadom preko fosforilacije. Samo što je kod glikogen sintaze defosforilisana forma aktivna, a fosforilisana ne. Metabolizam glikogena u jetri je regulisan nivoom glukoze u krvi, i ta kontrola sinteze i degradacije je centralni proces regulacije nivoa gl ukoze u krvi. Ćelije jetre senzorišu koncentraciju glukoze u krvi, i
prema potrebama organizma je apsorbuju iz ili oslobađaju u krvotok. To je kao što je već rečeno indukovano glukagonom . Receptori na ćelijama jetre odgovaraju na vezivanje glukagona, aktivacijom adenilat ciklaze koja sintetiše cAMP i tako povećavaju rezgradnju glikogena, pri čemu se akumulira glukozo-6-fosfat, koji ne može da prolazi kroz membranu, pa biva hidrolizovan na glukozu i P I. Glukoza se prebacuje u krvotok i tako se povećava koncentracija glukoze u krvi. U slučaju visoke koncentracije glukoze u krvi, nivo glukagona opada, a raste količina insulina. To izaziva opadanje cAMP -a, što izaziva preusmerenje metabolizma glikogena iz kataboličkih procesa – glikolize, i anaboličke – sinteza. Smatra se da je glavni senzor za glukozu u ćelijama jetre enzim glikogen fosforilaza a. Vezivanje glukoze za aktivno mesto ovog enzima, pomera alosterički ekvilibrijum od R ka T -stanju, tako da se fosforilisane bočne grupe serina izlažu hidrolizi, što dovodi do njene inaktivacije.
21. Kovalentna modifikacija regulatornih enzima (primer glutamin sintetaze): Glutamin sintetaza bakterije E. coli se sastoji iz 12 identičnih subjedinica koje formiraju dva
heksagonalna prstena koji se nalaze jedan iznad drugog. Aktivnost enzima je kontrolisana reverzibilnom kovalentnom modifikacijom , pri čemu se vrši adenilacija – transfer AMP-a iz ATP-a na bočne grupe tirozinskih ostataka u svakoj subjedinice enzima. I proces adenilizacije i proces deadenilizacije su katalizovani adenil transferazom sa regulatornim proteinom P . Ovaj enzim u kompleksu sa proteinom P,
označenom kao kompleks P A, katalizuje vezivanje AMP-a za glutamin sintetazu smanjujući joj aktivnost. Znači aktivnost opada sa povećavanjem broja adenilovanih subjedinica enzima. Suprotno tome kompleks adenil transferaze i proteina P , označen kao kompleks PD, katalizuje deadenilaciju glutamin sintetaze, koristeći inorganski fosfat, pri čemu se oslobađa ADP. Aktivnost raste sa brojem deadenilovanih subjedinica enzima.
14
Ova dva procesa nisu katalizovana istim aktivnim mestom, već postoje dva koja se aktiviraju u zavisnosti od forme proteina P koji je vezan za njih. Protein P takođe podleže kovalentnoj modifikaciji pomoću enzima uridil transferaze, koji katalizuje uridilaciju (prenos dva UMP-a iz UTP-a na protein P), kojom se on prevodi iz P A u PD formu. Proces je stimulisan ATP-om i α-keto-glutarnom kiselinom, a inhibiran glutaminom. Isti enzim katalizuje i hidrolitičko uklanjanje UMP ostataka sa proteina P, na taj način ga
prevodeći iz PD u P A formu. Taj preces je aktiviran glutaminom, a inhibiran α-keto-glutarnom kiselinom. I uridil transferaza poseduje dva aktivna mesta na istom polipeptidnom lancu, i ona su kontrolisana
navedenim jedinjenjima tako da enzim nije u stanju da simultano katalizuje oba procesa već samo jedan. Proteolitički enzimi katalizuju hidrolitičku razgradnju proteina uvođenjem molekula vode u peptidnu vezu. Oni su glavna grupa enzima uključena u katabolizam proteina, jer omogućavaju da organizmi koji ne mogu da sintetišu amino kiseline do njih dođu. Razlikuju se egzopeptidaze i endopeptidaze. Egzopeptidaze katalizuju hidrolitičku razgradnju spoljašnjih delova proteina i daju slobodne aminokiseline, dok endopepridaze katalizuju hidrolizu unutrašnjih delova lanaca dajući oligopeptide i polipeptide manje molekulske mase. U egzopeptidaze spadaju aminopeptidaze, koje katalizuju hidrolizu polipeptidnog lanca sa NH 2terminusa; i karboksipeptidaze koje katalizuju hidrolizu sa C-terminusa. Od aminopeptidaze je poznata leucin aminopeptidaza, metaloenzim koga sintetišu ćelije intestinaln e mukoze. Od karboksipeptidaza su poznate karboksipeptidaze A i B. U endopeptidaze spadaju pepsin, tripsin i himotripsin. Sva tri enzima se sintetišu u svojim neaktivnim
formama, i aktiviraju se nakon napuštanja ćelija koje ih sintetišu. Pepsin se sintetiš e u obliku zimogena – pepsinogena u ćelijama mukoze želudca, dok su tripsin i himotripsin proteolitički enzimi pankreasa.
22. Proteolitički enzimi pankreasa : Karboksipeptidaza A je metaloenzim koji se sintetiše u svom neaktivnom obliku – zimogenu u
pankreasu. Polipeptidni lanac ovog enzima je kompaktan i elipsoidan, izgrađen većinom od α-heliksa, ali sadrži i regione sa β-naboranom pločom. Ima čvrsto vezan jon Zn2+ i on je deo katalitičkog centra enzima, i esencijalan je za pravilno funkcionisanje ovog enzima. Vezan je za enzim u obliku koordinativnog
kompleksa i to preko bočnih grupa dva histidina i bočne grupe jedne glutaminske kiseline. Za kompleks je vezan i molekul vode. Hidroliza je najefikasnija ako je C-terminalni ostatak aromatična kiselina ili neka druga aminokiselina sa velikim alifatičnim bočnim lancem, i to je zato zbog organizacije velikog džepa izgrađenog od bočnih grupa hidrofobnih aminokiselina, u blizini jona Zn2+, u koga se smešta bočni lanac terminalne aminokiseline peptidnog lanca. Himotripsin je digestivni enzim koji hidrolizuje proteine hrane u tankom crevu. Njegov neaktivni
prekursor – himotripsinogen se sintetiše u acinarnim ćelijama u pankreasu. Himotripsinogen se transportuje Goldžijevim aparatom u obliku granula i sekretira u kanal pankreasa koji vodi u duodenum.
Poseduje 245 aminokiselina i dva disulfidna mosta između bočnih grupa cisteina. Himotripsinogen nema nikakvu biološku funkciju. Tek nakon što se konvertuje u svoju aktivnu formu dobija svoju biološku funkciju. 15
Tripsin je digestivni enzim veoma sličan himotripsinu – sinteišu ih iste ćelije pankreasa u njihovoj
neaktivnoj formi. Tripsinogen se aktivira mnogo prostije nego himotripsinogen – uklanja se peptid sa Nterminusa i taj proces katalizuje enteropeptidaza, kou sintetišu ćelije epitela duodenuma. Enterokinaza
je ključni enzim u aktivaciji proteolitičkih enzima, pošto aktivirani tripsin može vršiti autokatalitičku aaktivaciju tripsinogena, kao i himotripsinogena. Tripsin katalizuje hidrolizu peptidne veze koju formira karboksilna grupa baznih aminokiselina – lizina, arginina, i histidina, i amino grupe susedne aminokiseline.
Proteolitički enzimi pankreasa – himotripsin, tripsin i elastaza spadaju u serin-proteaze, specifičnu grupu enzima koji katalizuju reakcije kovalentnom katalizom i to preko bočne grupe serina.
23. Mehanizam delovanja himotripsina: Himotripsin poseduje nekoliko antiparalelnih β-naboranih ploča i vrlo malo α-heliksa. Sve naelektrisane
bočne grupe su okrenute ka spoljašnjosti, osim bočnih grupa histidina, serina i asparaginske kiseline koje formiraju katalitički centar enzima. One formiraju katalitičku trijadu , u kojoj asparaginska kiselina uspostavlja specifične vrste vodoničnih veza sa histidinom, koje aktiviraju nukleofilno stanje serina. Prenos protona između grupa povezanih vodoničnom vezom se dešava dovoljnom brzinom, kada razlika pK vrednosti donora i protonizovane forme potencijalnog akceptora protona nije veća od 3 pH jedinice. Kada nema velike razlike između pK vrednosti i donora i akceptora, onda oboje imaju isti afinitet prema protonu, i kao posledica toga on se deli između njih manje ili više podjednako – vodonična veza sa niskom barijerom. Ona je jako jaka, sa dosta većom slobodnom energijom. Znači u enzimu se slaba vodonična veza koja postoji u ES kompleksu, prevodi u jaku vodoničnu vezu u tranzicionom stanju supstrata. Ta vodonična veza sa niskom barijerom se formira upravo između histidina i asparaginske kiseline u katalitičkoj trijadi, prilikom prevođenja supstrata u tranziciono stanje. Formiranje ove vodonične veze indukuje prenos protona sa serina na histidin, prevodeći – CH 2OH bočnu grupu serina u visoko nukleofilni alkoksidni jon –CH 2O-. Zato se i himotripsin preferencijalno čvrsto vezuje za tranziciono stanje supstrata. Sa obzirom da je bočna grupa serina odgovorna za kovalentno vezivanje supstrata, himotripsin se svrstava u kategoriju serin-proteaza .
Kiseonik nastalog alkoksidnog jona vrši nukleofilni napad na karbonilni ugljenikov atom peptidne veze u polipeptidu vezanom za enzim. Posledica nukleofilnog napada je uspostavljanje kovalentne veze sa
ugljenikom iz peptidne veze, zbog čega veza karbonilne grrupe peptidne veze postaje jednostruke i karbonilni kiseonik prima negativno naelektrisanje – formira se tetraedalni tranzicioni kompleks. To omogućava prebacivanje protona sa N3-atoma protonizovanog imidazolnog prstena histidina, na azotov atom peptidne veze zbog čega se ona raskida. Deo polipeptida, koji nakon raskidanja peptidne veze, poseduje slobodnu amino grupu, ostaje vezan vodoničnom vezom za imidazolni prsten; dok drugi deo polipeptidnog lanca biva kovalentno vezan za serin. Tako je izvršena acilizacija enzima – formirao se acilenzim kovalentni intermedijer .
U sledećoj fazi, fazi deacilizacije enzima, molekul vode zauzima mesto polipeptidnog lanca vezanog vodoničnom vezom za imidazolni prsten histidina, istiskujući ga iz enzima. To omogućava deacilizaciju enzima, gde je donor protona na imidazolni prsten voda i gde rezultirajući OH- jon vrši nukleofilni napad 16
na karbonilni ugljenikov atom preko koga je polipeptid vezan za serin. Opet se formira tranzicioni intermedijer i histidin donosi proton kiseonikovom atomu serina, pri čemu se oslobađa drugi deo
polipeptida, a enzim vraća u prvobitno neizmenjeno stanje.
24. Mehanizam delovanja karboksipeptidaze A: Karboksipeptidaza A je enzim koji funkcioniše po modelu indukovanog uklapanja sa supstratom .
Vezivanje enzima za supstrat je praćeno mnogim promenama u strukturi karboksipeptidaze. Najveća konformaciona promena je pomeranje bočne grupe tirozina sa površine u unutrašnjost molekula, ta ko da dolazi u blizinu karboksilne grupe terminalne aminokiseline. Ova promena dovodi do zatvaranja
džepa u kome je aktivno mesto, kao i to istiskivanja molekula vo de čime se formira veoma tesna veza sa supstratom. Promena konformacije omogućava da Zn2+ i druge grupe aktivnog mesta, koje nose višak elektrona, katalizuju reakicju redistribucijom elektrona u supstratu, čineći ga dostupnijim delovanju molekula vode.
Mehanizam vezivanja supstrata i proces katalize, karakterišu sledeći događaji: 1. Hidrofobna bočna grupa C-terminalne aminokiseline se smešta u hidrofobni džep enzima 2. Stabilizuje se vezivanje supstrata i to pozitivno naelektrisanom gvanido grupom bočne grupe arginina (elektrostatički interaguje sa akrboksilnom grupom C -terminalne aminokiseline)
3. Tirozin uspostavlja vodonične veze sa karboksilnom grupom C-terminalne i N-atomom subterminalne aminokiseline; on, kao i arginin, odre đuje specifičnost enzima za C-terminalnu aminokiselinu 4. Karbonilni kiseonik peptidne veze formira koordinativni kompleks sa Zn2+ koji je smešten u
nepolarnom delu enzima, i to povećava efektivno naelektrisanje kiseonika 5. Bočna grupa glutaminske kiseline katalizuje reakciju između jona cinka i bočne grupe arginina; hidroliza terminalne amino kiseline se odvija preko kovalentnog anhidridnog intermedijera koga
formira bočna grupa glutaminske kiseline, i koji je stabilizovan pomoću Zn2+; ovakav intermedijer je podložan delovanju visoko polarizovanog molekula vode, vezanog za jon Zn2+, koji prenosi proton na NH- grupu peptidne veze što dovodi do oslobašanja terminalne aminokiseline
25. Mehanizam aktivacije himotripsina: Aktivacija himotripsina, ustvari konvertovanje himotripsinogena u himotripsin, se vrši hidrolizom
peptidne veze između arginina i izoleucina koju katalizuje tripsin. Tako se formira nestabilni molekul πhimotripsina. Iz tog oblika se seku dva dipeptida serin-arginin i trionin-asparagin, čime nastaje aktivna forma α-himotripsin, stabilan molekul izgrađen iz tri polipeptida povezana disulfidnim mostovima. Znači hidroliza samo jedne specifične veze, dovodi do potpunog konvertovanja iz neaktivne u aktivnu formu. To je zato što se hidrolizom veze između arginina i izoleucina formiraju nove NH 2- i COOH-terminalne grupe grupe u polipeptidu. Novoformirana terminalna NH 2-grupa izoleucina se okreće ka unutrašnjosti himotripsina i interaguje sa asparaginskom kiselinom, uspostavljajući vodonične veze – ona se protonizuje što čini himotripsin stabilnijim. Elektrostatička interakcija NH3+-grupe izoleucina, i COO-grupe asparaginske kiseline u nepolarnom delu enzima indukuje brojne konformacione promene, koje 17
dovode do specifičnog mesta vezivanja supstrata koje određuje specifičnost enzima za supstrat – favorizuje vezivanje nepolarnih, aromatičnih grupa. Zato se specifičnost delovanja himotripsina ogleda u hidrolizi peptidne veze koju formira karboksilna grupa aromatične kiseline i amino grupa susedne aminokiseline, ili čak veze koje formira karboksilna grupa aminokiselina sa velikom hidrofobnom bočnom grupom, poput metionina.
26. Nespecifične nukleaze: Najpoznatiji predstavnik nukleaza a-tipa je egzonukleaza fosfodiesteraza zmijskog otrova, koja hidrolizuje i RNK i DNK molekule dajući kao proizvode slobodne nukleotide u obliku nukleozid-5'-fosfata.
Enzim započinje delovanje sa 3' kraja polinukleotida, uklanjajući sukcesivno jedan po jedan nukleotid. Za svoje delovanje ovaj enzim zahetva postojanje 3'-OH grupe na terminalnom nukleotidu. Predstavnik egzonukleaza b-tipa je fosfodiestaraza slezine. To je nespecifična egzonukleaza – hidrolizuje i RNK i DNK, dajući kao produkte nukleozid-3'-fosfate. Hidrolizu otpočinje sa 5' kraja polinukleotida, ali zahteva da ta grupa ne bude fosforilizovana – znači delovaće samo nakon delovanja neke fosfataze koja
će katalizovati defosforilaciju supstrata.
27. Nukleaze: Nukleaze su enzimi koji katalizuju hidrolizu nukleinskih kiselina. Prema mestu svog hidrolitičkog
delovanja se dele na nukleze 3' ili nukleaze a-tipa; i nukleaze 5' ili nukleaze b-tipa. Nukleaze a tipa
hidrolizuju estarsku vezu između 3' ugljenikovog atoma i fosforne grupe, a nukleaze b tipa hidroliz uju estarsku vezu između fosforne grupe i 5' ugljenikovog atoma. Ova hidroliza se dešava uvođenjem molekula vode u fosfodiestarsku vezu između atoma kiseonika i fosforne grupe. Prema topologiji svog delovanja nukleaze se mogu podeliti i na egzonukleaze, koje hidrolizuju
fosfodieastarske veze terminalnih nukleotida, kao produkte dajući slobodne nukleotide; i enodnukleaze, koje hidrolizuju fosfodiestarske veze unutar lanca nukleinskih kiselina, dajući kao produkte oligonukleotide ili kraće polinukleotide. Najpoznatiji predstavnik nukleaza a-tipa je egzonukleaza fosfodiesteraza zmijskog otrova, koja hidrolizuje i RNK i DNK molekule dajući kao proizvode slobodne nukleotide u obliku nukleozid-5'-fosfata. Enzim započinje delovanje sa 3' kraja polinukleotida, uklanjajući sukcesivno jedan po jedan nukleotid. Od endonukleaza a-tipa, poznat je enzim dezoksiribonukleaza I (DNAza I ) koja se sintetiše u pankreasu. Ona
hidrolizuje veze samo unutar molekula DNK bez efekta na RNK, dajući kao proizvode oligonukleotide ko ji se završavaju sa 5'-P i 3'-OH krajevima na mestu hidrolize. Ona se vezuje za mali žljeb molekula DNK, tako što se pentapeptidna petlja izgrađena od arginina i lizina smešta u uvojnicu, fomirajući jonske veze sa fosfornim grupama DNK i to sa obe strane m alog žljeba. To za posledicu ima stabilizaciju vezivanja enzima za DNK. Pretpostavlja se da je za delovanje ovog enzima potreban dvovalentni katjon – jon Ca2+ je lociran veoma blizu fosfodiestarske veze koja će biti hidrolizovana. Smatra se da je u živoj ćeliji jon Mg2+ taj koji pomaže katalizu. Za katalizu su pored jona metala, potrebni i molekul vode vezan za enzim, i bočne grupe histidina i glutaminske kiseline. Oni obrazuju katalitičku trijadu DNAze I. Molekul vode se
18
aktivira kada se proton sa njega prebaci na imidazolni prsten histidina koji postaje pozitivno
naelektrisan. To naelektrisanje se elektrostatički neutrališe negativno naelektrisanom grupom glutaminske kiseline. Nastali OH- jon vrši napad na atom koji formira fosfodiestarsku vezu dajući pentokovalentni intermedijer fosfora. Dvovalentni katjon je tu, upravo da bi stabilizovao ovo stanje,
interagujući elektrostatički sa negativno naelektrisanim kiseonikom vezanim za fosfor diestarske veze. Na kraju C3'-O-P veza se raskida i fosfor ostaje vezan za C5' atom. Predstavnik egzonukleaza b-tipa je fosfodiestaraza slezine. To je nespecifična egzonukleaza – hidrolizuje i RNK i DNK, dajući kao produkte nukleozid-3'-fosfate. Hidrolizu otpočinje sa 5' kraja polinukleotida, ali zahteva da ta grupa ne bude fosforilizovana – znači delovaće samo nakon delovanja neke fosfataze koja
će katalizovati defosforilaciju supstrata. Primeri endonukleaza b-tipa su dezoksiribonukleaza II (DNAza II) koja se sintetiše u slezini i timusu; ribonukleaza T (RNAza T) koju sintetišu plesni i gljive i koja je specifična samo za RNK, u kojoj je purin donor u estarskoj vezi sa svojim C3' atomom i ribonukleaza A. Ribonukleaza A (RNAza A) je izolovana iz pankreasa, i to je enzim koji nakon hidrolize enzimom subtilizinom daje katalitički aktivan enzim ribunukleazu S (RNAzaS). To je kompleks koji se sastoji od S-
peptida i S-proteina, međusobno povezanih multipnim, nekovalentnim interakcijama. Obe forme enzima
su iste katalitičke aktivnosti. RNAza A je izgrađena od polipeptidnih lanaca koji su većinom u formi β naborane ploče, što je specifično. Ona hidrolizuje fosfodiestarske veze u molekulu RNK, gde je kao učesnik u vezi sa 3'-strane pirimidinska baza. Potreba za prisustvom pirimidina kao donora 3'-veze u fosfodiestru je posledica svojstva enzima da za sebe može vezati specifično ovaj nukleotid. Purinske baze se ne mogu vezati za ovaj enzim, jer bi zbog njihove veličine izazvale distorziju i inaktivaciju aktivnog mesta.
28. Mehanizam delovanja ribonukleaze A: U vezivanju enzima za pirimidinski prsten, učestvuju bočne grupe serina i treonina, kao i N-atom peptidne veze koji treonin formira sa susednom aminokiselinom preko vodoničnih veza. Vezivanje ostalog dela polinukleotida za RNAzu A se odvija preko elektrostatičkih interakcija. Serija pozitivnih bočnih grupa lizina i arginina, formiraju sone veze sa negativno naelektrisanim fosfatima u kičmi molekula RNK. Jednolančana DNK se može vezati za RNAzu, ali neće doći do hidrolize jer ona ima dezoksiribozu kao pentozni šećer. Produkti reakcije hidrolize RNK katalizovane od strane RNAze A su oligonukleotidi koji poseduju 5'-OH i 3'-P terminuse, a nastaju preko cikličnog intermedijera. Prvo dolazi do raskidanja fosfodiestarske veze i
formiranja cikličnog intermedijera, pri čemu nastaje slobodan 5'-OH terminus jednog oligonukleotida. U drugom koraku, dolazi do hidrolize cikličnog intermedijera, koji daje 3' -P terminus drugog kraja oligonukleotida. Ovaj enzim vrši bazno-kiselinsku katalizu. Njegovo aktivno mesto čine bočne grupe dva histidina i lizina. Imidazolni prsten jednog histidina (119) mora biti protonizovan – tako i enzimska reakcija počinje, preuzimanjem protona sa 2'-OH grupe od strane nejonizovanog imidazolnog prstena. Tako nastaje nukleofilna O- grupa, koji vrši napad na fosfodiestarsku vezu. U isto vreme protonizov ani imidazolni prsten (119) predaje svoj proton na 5'-O-P deo fosfodiestarske veze, oslobađajući oligonukleotid sa 5'-OH krajem. Kao posledica toga se javlja 2'3' ciklični intermedijer , koji je stabilizovan 19
od strane pozitivno naelektrisane bočne grupe lizina. Hidroliza nastalog cikličnog intermedijera je reverzibilni proces. Molekul vode je taj koji zamenjuje 5'-O komponentu fosfodiestarske veze. Sada su
bočne grupe i drugog molekula histidina (12) protonizovane i ponašaju se kao donori protona, dok je prvi histidin (119) akceptor.
29. Restrikcioni enzimi: Restrikcioni enzimi čine posebnu klasu nukleaza. Oni čine resktrikciono-modifikacioni sistem, koji služi
za modifikaciju molekula DNK bakteriofaga. Restrikcione endonukleaze prepoznaju specifičnu sekvencu baza u dvolančanoj DNK, katalizujući hidrolizu molekula DNK na specifičnim mestima; uz odgovarajuće metilaze, koje su odgovorne za modifikaciju molekula DNK i to tako što katalizuju m etilizaciju baza na
specifičnim mestima u DNK. Tako se metiluje amino grupa adenina ili citozina i to u sekvenci baza koje prepoznaje restrikciona endonukleaza . Tako modifikovan molekul DNK ne može da bude supstrat za odgovarajući restrikcioni enzim. Tako je vlastita DNK ćelije zaštićena od delovanja sopstvenog restrikcionog enzima, jer je sekvenca koju on prepoznaje metilovana. Znači, uloga restrikciono modifikacionog sistema je da zaštiti bakteriju od invazije strane DNK – najčešće bakteriofagne DNK. Restrikcione endonukleaze su odgovorne za hidrolizu strane DNK koja ulazi u bakterijsku ćeliju. U eksperimentu, bakteriofag se razmnožavao u bakteriji-domaćinu 1 i dao je potomstvo čiji su DNK molekuli modifikovani na isti način kao i sama hromozomalna DNK, te restrikcioni enzim te bakterije ne može prepoznati DNK bakteriofaga kao strani molekul. Kada se tako modifikovana DNK bakteriofaga prebaci u bakteriju-domaćina 2, koja poseduje svoj specifični restrikciono-modifikacioni sistem, ta DNK je strani molekul. Ipak, neki procenat bakteriofagne DNK će stići da se modifikuje pre nego što dođu u kontakt sa restrikcionim enzimima domaćina 2. Tako modifikovani bakteriofagi će dati potomstvo u domaćinu 2, ali kada bi ih vratili u domaćina 1 oni bi bili strani molekuli. Poznata su tri tipa restrikcionih endonukleaza. Oni tipa I i III poseduju i endunukleaznu i metilaznu aktivnost na istom proteinskom molekulu. Restrikcione endonukleaze tipa I hidrolizuju molekul DNK na velikoj udaljenost od mesta prepoznavanja, a one tipa III na dosta manjoj udaljenosti. Enzimima tipa II su
endonukleazna i metilazna aktivnost su odvojene i predstavljaju zasebne entitete. Oni su značajni jer hidrolizuju molekul DNK na mestu prepoznavanja što je značajno za genetičko inžinjerstvo. Većina restrikcionih enzima prepoznaje specifičnu sekvencu od četiri do osam baznih parova i hidrolizuje fosfodiestarsku vezu u oba lanca, u okviru tog regiona. Ove sekvence poseduju dvostruku rotacionu simetriju – odnosno palindromsku strukturu (redosled čitanja baza u oba lanca je identičan); što znači da
su mesta hidrolize simetrično postavljena u odnosu na osu simetrije. Hidroliza može da generiše 5 asmietrične krajeve (oba lanca imaju duže jednolančane fragmente koji se završavaju sa 5'-P), 3' asimetrične-krajeve (oba lanca imaju duže jednolančane fragmente koji se završavaju sa 3'-OH) i ravne krajeve. Enzim EcoRI je endonukleaza, dimer od dve identične subjedinice, koji se veže za molekul DNK tako što simetrija enzima odgovara palindromskoj simetriji molekulu DNK u okvi ru specifičnog heksamera baza
(GAATTC). Vezivanje enzima za DNK je praćeno lokalnim savijanjem molekula u centru ose heksanukleotida, što je posledica razdvajanja baza u centru simetrije. Zbog toga se heliks DNK u jednom 20
delu odvija. Ovakva promena strukture omogućava da specifični α -heliksi obe subjedinice enzima uđu u prošireni veliki žljeb i dođu u kontakt sa specifičnim bazama, pri čemu se kooperativno formira mreža vodoničnih veza obe subjedinice sa mestom vezivanja enzima za DNK. Jedan od α-heliksa ima na specifičnom mestu u polipeptidu, arginin čija bočna grupa formira dve vodonične veze sa guaninom u heksanukleotidu. Drugi α-heliks iste subjedinice poseduje arginine i glutaminske kiseline na specifičnim mestima, koje preko svojih bočnih grupa formiraju četiri vodonične veze sa susednim adeninima u heksanukleotidu. Druga subjedinica formira identičan kompleks sa simetričnom sekvencom u drugom lancu DNK. Znači visoka specifičnost enzim-DNK interakcije je bazirana na simetriji heksanukleotida i formiranju dvanaest preciznih vodoničnih veza.
30. Hidrolitički enzimi polisaharida : Enzimi odgovorni za katabolizam polisaharida, katalizuju razgradnju polisaharida na osnovne gradivne jedinice putem hidrolize ili fosforilize. Najpoznatiji hidrolitički enzimi rezervnih polisaharida su amilaze, koje katalizuju hidrolizu skroba (i amiloze i amilopektina). Enzim α-amilaza, koju sekretiraju pljuvačne
žlezde i pankreas, hidrolizuje internalne α(1-4) glikozidne veze, dajući kao produkte maltozu, maltotriozu i dekstrin. Maltoza i maltotrioza se dalje razlažu do glukoze pomoću enzima maltaze; a dekstrin koji sadrži ostatke glukoze povezane α(1-4) i β(1-6) glikozidnim vezama se do glukoze hidrolizuje uz pomoć enzima α-dekstrinaze. α-amilaza ne može delovati ni na jedan od svojih produkata. Drugi predstavnik hidrolitičkih enzima je β-amilaza, koju sintetišu neke biljke i bakterije, i koja katalizuje hidrolizu α(1-4) glikozidne veze u skrobu, ali počevši od neredukujućeg kraja skroba. Kao produkti se dobijaju maltoze, koje se sekvencijalno uklanjaju sa neredukujućeg kraja molekula skroba. Najpoznatiji hidrolitički enzim koji hidrolizuje strukturne polisaharide je lizozim. On se nalazi u nazalnom mukusu, suzama i belancetu jajeta. On lizira bakterije, hidrolizujući polisaharidne komponente njihovog
zida i time dovodi do prskanja bakterije. On može razlagati i polisaharidni hitin. Oba polisaharida u svojoj strukturi imaju N-acetilglukozamin (NAG). Bakterije takođe imaju i N -acetil-muraminsku kiselinu (NAM) koja je sa NAG-om povezana preko β(1-4) glikozidnih veza. Kod hitina nema NAM-a, samo N-acetil-
glukozamina povezanih istim vezama. Lizozim funkcioniše tako što hidrolizuje glikozidnu vezu između C 1atoma NAM-a i C4-atoma NAG-a, dok je sledeća glikozidna veza (između C1-atoma NAG-a i C4-atoma NAM-a) rezistentna na delovanje lizozima. Lizozim belanceta je relativno mali enzim, i katalizuje reakcije
velikom brzinom. To je jako stabilan protein, sa četiri disulfidna mosta i elipsoidnog oblika, sa velikim delom lanca u formi β-naborane ploče. N jegova unutrašnjost je hidrofobna, tako da hidrofobne interakcije imaju ključnu ulogu u dostizanju nativne konformacije. Ovaj lizozim ne zahteva koenzim za svoju aktivnost.
31. Fosforilaza glikogena: U katabolizmu glikogena učestvuje enzim glikogen fosforilaza. Ona spada u fosforilitičke enzime – katalizuje proces fosforilize, da jići kao produkt glukozo-1-fosfat koji zadržava α-konfiguraciju C1-atoma. Glikogen fosforilaza uklanja glukozne jedinice dok ne dođe na udaljenost od četiri glukozne jedinice od mesta račvanja molekula, kada joj prestaje aktivnost. Slobodna energija ove reakcije je mala, jer se 21
glikozidna veza zamenjuje fosfodiestarskom, koja im a sličan energetski potencijal. Glikogen fosforilaza
sleketnih mišića je dimer koji se sastoji od dv e subjedinice. Svaka subjedinica psoeduje dva domena – aminoterminalni domen i karboksiterminalni domen. U okviru aminoterminalnog regiona se nalazi
subdomen koji obrazuje kontaktne površine obe subjedinice u dimeru i u njemu se nalazi i specifični serinski ostatak koji je mesto kovalentne modifikacije enzima. U tom subdomenu je locirano i mesto vezivanja alosteričkih efektora. U drugom subdomenu aminoterminalnog regiona se nalazi deo za koji se
vezuje glikogenska partikula za enzim. Katalitičko mesto ovog enzima je locirano u dubokom udubljenju koje grade amiterminalni i karboksiterminalni domen, i ono je dosta udaljeno od mesta vezivanja
glikogena. To omogućava enzimu da izvrši veći broj sukcesivnih fosforilaza terminalnih C 4-glukoza, bez ponovne reasocijacije sa supstratom. U udubljenju između mesta vezivanja i katalitičkog centra se može smestiti četiri do pet glukoznih ostataka, ali nema nesta za granati deo glikogena – to je i razlog zašto fosforilaza može da ukloni najdalje četiri glukozne jedinice od mesta grananja. Katalitički centar je zaštićen od kontakta sa vodom, što favorizuje fosf orilizu u odnosu na hidrolizu. Za aktivnost glikogen fosforilaze je potreban koenzim piridoksal fosfat (PLP ), čija aldehidna grupa formira Schiffovu bazu sa bočnom grupom specifičnog lizina u polipeptidnom lancu enzima. On je lociran u aktivnom centru enzima tako da je njegova fosforna grupa veoma blizu ortofosfata, koji učestvuje u reakciji u okviru aktivnog mesta enzima. Ortofosfat koji učestvuje u fosforilizi se nalazi smešten između 5'-fosfatne grupe PLP-a i vezanog supstrata – glikogena. Fosfatna grupa PLP-a deluje u tandemu sa ortofosfatom, kao donor i akceptor protona (kiselinsko bazna kataliza). Ortofosfat je donor protona glikozidnoj vezi tako da kiseonikov atom ostaje vezan za C1-atom dela glikogena koji napušta kompleks sa enzimom . Ostatak ortofosfata u enzimu istovremeno prihvata proton sa fosfatne grupe PLP-a. U tom koraku se formira intermedijer glukoze sa karbokatjonom, oksonijum jonom na C 1-atomu. Nastali oksonijum jon interaguje
sa ortofosfatom dajući glukozo -1-fosfat. Proces fosforilaze počinje sa neredukujućeg kraja glikogena i odvija se sekvencijalnim uklanjanjem jedne po jedne glukozne jedinice. Međutim, kao što je rečeno, fosforiliza se odvija sve do mesta račvanja glikogena – do α(1-6) glikozidne veze. Fosforilaza deluje na oba lanca molekula glikogena – i glavnu i bočnu granu; i uklanja sukcesivno na gornjem lancu šest, a na donjem lancu tri glukozne jedinice u obliku glukozo-1-fosfata. Tu aktivnost enzima prestaje, pošto su ostaci oba lanca udaljeni četiri glukozne jedinice od mesta račvanja. Tada deluje enzim α(1-4) transglikozidaza (transferaza), i ona prenosi glukozne ostatke na redukujući kraj donjeg lanca. Samo jedan glukozni ostatak ostaje kao jedina glukozna jedinica bočnog lanca vezana α(1-6) vezom za glavni lanac. Ona je supstrat za enzim α-1,6glukozidazu, koja hidrolizuje tu vezu dajući slobodnu glukozu. Ostatak glikogena predstavlja linearni polimer, na koga opet deluje fosforilaza. α(1-4) transglikozidaza i α-1,6-glukozidaza nisu dva zasebna enzima – oni su deo jednog polipeptidnog lanca. Takvi bifunkcionalni enzimi se nazivaju tandem enzimi .
Energetski gledano, fosforiliza glikogena je prednost za ćeliju, jer se fosforilisana glukoza može uključiti u glikolizu tako da ne troši ATP. Glukozo-1-fosfat je supstrat za fosfoglukomutazu, koja ga prevodi u glukozo-6-fosfat, početni molekul glikolize. Aktivno mesto ovog enzima formira formira specifični serin, čija je bočna grupa fosforilisana. Mehanizam reakcije se najverovatnije dešava tako što se fosforna grupa sa enzima prebacuje na glukozo-1-fosfat, pre čemu nastaje intermedijer glukozo-1,6-bifosfat, koji je i
22
dalje vezan za enzim. U sledećem koraku fosfatna grupa vezana za C 1-atom se prebacuje na bočnu grupu serina u aktivnom mestu, čime se oslobađa glukozo -6-fosfat i enzim vraća na početno fosforilisano stanje. Povremeno se dešava da glukozo-1,6-bifosfat disosuje sa fosfoglukomutaze što rezlutira u inaktivaciji enzima, stoga u ćeliji uvek postoji minimalna koncentracija glukozo -1,6-bifosfata kako bi se obezbedila stalna aktivnost enzi ma. To se postiže aktivnošću fosfoglukokinaze, koja katalizuje fosforilaciju primarne alkoholne grupe glukozo-1-fosfata uz utrošak ATP-a dajući glukozo-1,6-bifosfat.
32. Mehanizam delovanja lizozima: Vezivanje supstrata za lizozim je omogućeno postojanjem specifičnog udubljenja u enzimu u koga može da se smesti šest saharidnih jedinica polimera. Vezivanje heksamera NAG-a na mesta vezivanja ( A-B-C-DE-F ) na lizozimu, je pokazalo još jednu specifičnost. Vezivanje svakog monomera A, B, C, E, i F za
odgovarajuća mesta je sasvim precizno i omogućeno uspostavljem vodoničnih veza i Van der Valsovih interakcija monomera sa lizozimom; dok je vezivanje momomera D zavisno od distorzije prstena. D-
ostatak se ne može direktno, stabilno vezati za svoje m esto na enzimu zato što su njegovi C6- i O6-atomi iz CH2OH-grupe u neposrednoj blizini glutaminske kiseline i triptofana, kao i acetamidne grupe NAG-a lociranog na C-mestu. Ova prepreka može biti prevaziđena samo distorzijom njegovog prstena iz normalne konfiguracije stolice u konformaciju polustolice. Ona dovodi atome C1--, C2-, C5- i piranozni kiseonik O5 u istu ravan što izaziva pomeranje CH2OH grupe tako da može formirati vezu sa glutaminom. Trimer A-B-C se stabilno vezuje i ne može biti hidrolizovan, pa oni nisu mesto hidrolize. Takođe mesto
vezivanja monomera C, ne može prihvatiti NAM. NAG se precizno uklapa na C -mesto, ali NAM nije u stanju zbog velike bočne grupe. Isti je slučaj sa mestom E. Stoga ni C-D glikozidna veza ne može biti mesto hidrolize kada se peptidoglikan bakterijskog zida ne vezuje za enzim. To isključuje i mogućnost hidrolize E-F glikozidne veze. Zatim, pošto je peptidoglikan alternativni polimer NAG-a i NAM-a, ako mesto C ne može vezati NAM, nego samo NAG, onda će i mesto E biti okupirano NAG -om. Prema tome, NAM se može vezati samo za B, D i F. Kako je specifičnost enzima hidroliza β(1-4) glikozidnih veza, jedina mohućnost koja preostaje je D-E glikozidna veza. To znači da je produkt hidrolize jedan tetramer i jedan dimer saharidnih jedinica.
Aktivno mesto lizozima obrazuju bočne grupe asparaginske i glutaminske kiseline . Bočna karboksilna grupa asparaginske, i ista grupa glutaminske kiseline se nalaze sa jedne i druge strane vezanog supstrata,
i te bočne grupe se nalaze u različitim sredinama. Bočna grupa asparaginske kiseline se nalazi u izrazitoj polarnoj sredini, gde se ponaša kao akceptor vodoničnih veza. Ova sredina omogućava da asparaginska kiselina ima normalnu pK vrednost, i da je neprotonizovana, odnosno da nosi negativno naelektrisanje (COO-) u opsegu pH od 3 do 8. Suprotno tome, bočna grupa glutaminske kiseline se nalazi u nepolarnom regionu lizozima. Ona je protonizovana (-COOH). Iz toga je zaključeno da je gluta minska kiselina donor protona za hidrolizu glikozidne veze. Mehanizam hidrolize glikozidne veze u peptidoglikanu se ostvaruje u nekoliko koraka: 1. Lizozim interaguje sa peptidoglikanom bakterijskog zida, vezujući se za heksasahardinu jedinicu
23
2. Bočna –COOH grupa glutaminske kiseline prenosi proton na kiseonik glikozidne veze između monomera D i E (generalna kiselinska kataliza ); prenos protona izaziva raskidanje veze između C1-atoma prstena D i kiseonika glikozidne veze 3. Prenos protona na kiseonik generiše pozitivno naelektrisanje na C1-atomu D monomera; formira se tranzitorna struktura – karbokatjon 4. Nastali saharidni dimer koji se sastoji iz monomera E i F difunduje u medijum iz kompleksa sa enzimom 5. Karbokatjon tada reaguje sa vodom u OH - jon se vezuje za C1-atom; u isto vreme dolazi do protonizacije karboksilne grupe glutaminske kiseline prtonom iz vode 6. Novonastali A-B-C-D tetramer difunduje sa lizozima, a enzim se vraća u prvobitno stanje neizmenjen Negativno naelektrisana karboksilna grupa asparaginske ki seline je imala ulogu u elektrostatičkoj stabilizaciji nastalog pozitivno naelektrisanog karbokatjona C 1-atoma monomera D. Obe bočne grupe su dosta udaljene od karbokatjona, a to se osiguralo konformacijom D- monomera, čime je efikasnost lizozima znatno uvećana. Konformaciom D-monomera u polustolicu, se C1-atom približava kiseoniku
prstena, tako da se može formirati rezonantno stabilan karbokatjon koji se naziva oksonijum jon.
33. Bioenergetski principi: Svaki sistem se, sa termodinamičkog stanovišta, definiše kao materija ograničene, konstantne zapremine (V), pritiska (p) i temperature (T); dok okolina definiše ostatak materije u univerzumu. Znač i univerzum je izgrađen iz sistema i okoline, u kojima se entropija stalno povećava. I zakon termodinamike govori da je totalna energija sistema i njegove okoline konstantna i da se energija
ne može dobiti ni uništiti, već se može samo prevesti iz jednog vida u drugi.
∆E = EB-EA = Q-W (EB – energija sistema na kraju reakcije; E A – energija sistema na početku reakcije; Q – toplota apsorbovana od sistema; W – rad koji sistem izvršava)
Tako se hemijska energija u živim sistemima može transformisati u toplotu, mehanički energiju... Promena energije u sistemu zavisi samo od početnog i krajnjeg stanja sistema, a ne od puta dešavanja transformacije. II zakon termodinamike definiše sponatost proces a; po njemu se u svim procesima u univerzumu
entropija uvek uvećava dok se ne dostigne ekvilibrijum reakcije, kada je ona maksimalna. To znači da će se proces dešavati spontano jedino ako se entropija sistema i njegove okoline uvećava. Entropija biološkog sistema se može smanjiti, ako se poveća entropija njegove okoline . Ipak entropija je nepodesna za određivanje spontanosti i ravnoteže reakcija u biološkim sistemima. (∆Ssistem + ∆Sokolina) > 0
24
Zato je uvedena Gibsova slobodna energija, kao nova termodinamička funkcija nastala kombinacijom I i II takona termodinamike.
∆G = ∆H - T ∆S (∆G – slobodna energija; ∆H – promena entalpije; T – temperatura; ∆S – promena entropije)
Slobodna energija predstavlja deo ukupne količine energije, koja se može koristiti za rad u sistemu koji teži ravnoteži, pri konstantnom pritisku, temperaturi i zapremini. Karakteristike okoline ne ulaze u jednačinu. Entalpija definiše ukupan toplotni sadržaj sistema, dok je njena promena definisana jednačinom:
∆H=∆E + P ∆V ∆H=∆E + P ∆V ∆H=∆E (zapremina je u živim sistemima skoro konstantna)
∆G ≈ ∆E - T ∆S (∆H – promena entalpije; ∆E – promena ukupne energije sistema; P – pritisak; ∆V – promena zapremine) Znači slobodna energija je približno jednaka promeni ukupne energije i entropije, i po prvom zakonu termodinamike ona ne zavisi od toka reakcije, već samo od njenih produkta. Prema promeni slobodne energije se razlikuju:
Egzergone reakcije - ∆G<0; spontane reakcije koje ne zahtevaju dodavanje energije za realizaciju
Enderogone reakcije - ∆G>0; reakcije koje zahtevaju dodatnu energiju za njihovo izvršenje
Reakcije u ekvilibrijumu - ∆G=0; ne dolazi do promene ukupne energije
Slobodna energija govori o spontanosti reakcije, ali ne i o njenoj brzini. Brina zavisi od slobodne energije
aktivacije (∆G # ). A + B ↔ C +D; p, T, V=const.
∆ = ∆
[][] [][]
∆G= Σ∆G0produkata - Σ∆G0reaktanata (∆G0 – promena standardne slobodne energije; R – univerzalna gasna konstanta; T – apsolutna temperatura; [A],[B],[C],[D] – molarne koncentracije produlata i reaktanata)
25
∆G0 je fiksna konstanta čija je vrednost karakteristična za svaku hemijsku reakciju i predstavlja maksimalnu teoretsku količinu energije, koja se izražava poslednjom jednačinom. To je mera smanjenja slobodne eenergije date reakcije ako se dešava u standardnim fizičko-hemisjkim uslovima. Međutim biološke reakcije se odigravaju u vodenim rastvorima blizu neutralnog pH, pa konvencija definiše nešto drugači je standardne uslove - vodeni rastvor se uzima kao da je jedinične molarnosti; vodonikov jon je definisan kao jedinične vrednost na fiziološkom pH=7. =
[][] [][]
′
∆ = ∆
Ako se navedena reakcija dovede do ekvilibrijuma, ∆G se smanjuje u procesu dostizanja ekvilibrijuma i to je razlog zašto živi sistem može vršiti rad na konstantnoj temperaturi, pritisku i zapremini. Kada sistem dostigne ekvilibrijum, promene slobodne energije više nema, i sistem ne može dalje vršiti rad. Stoga je ′
∆ konstanta za svaku datu reakciju u živom sistemu na datoj temperaturi, dok ∆G varira sa koncentracijom reaktanata i produkata – predstavlja aktuelnu ili uočenu promenu slobodne energije reakcije.
34. Način korišćenja energije od strane živih sistema (energijom bogata jedinjenja): Najvažniji izvori energije za hemotrofne žive sisteme su oskido-redukcione reakcije, fosforilisana jedinjenja i tioestri .
Oksidoredukcija je prenos elektrona od donora – redukujućeg agensa, do akceptora – oksidujućeg agensa . Najčešći oksidoredukcioni procesi u biološkim sistemima su dehidrogenizacije i hidrogenizacije
supstrata. Postoje četiri tipa oksido -redukcionih enzima ili proteina, koji indirektno ili direktno učestvuju u prenosu elektrona sa supstrata na molekularni kiseonik, i to su:
Enzimi dehidrogenaze
One koje kao koenzime imaju NAD + ili NADP+
One koje kao koenzime imaju FMN ili FAD
Gvožđe-sumporni proteini (Fe-S kompleksi ) Citohromi (proteini sa porfirinskim prstenom za koga je koordinativno vezano gvožđe)
Gvožđe-sumporni proteini prenose elektrone putem tranzicije fero (Fe2+) u feri (Fe3+) stanje i obrnuto. Imaju samo jedan, dva ili četiri atoma gvožđa, koordinativno vezan preko jednog, dva, ili četiri sumpora bočnih grupa cisteina. Poznat je feredoksin. Citohromi su proteini koji sadrže različito supstituisan planaran protoporfirinski prsten sa koordinativno
vezanim atomom gvožđa, i nalaze se samo kod aerobnih organizama. Oni prenose elektrone sa različitih dehidrogenaza do molekularnog kiseonika (kada su smešteni u mitohondrijama), pri čemu gvožđe alterira između dva redoks stanja fero (Fe2+) i feri (Fe3+). U citohrome spadaju: citohrom b (Cyt b), citohrom c (Cyt c), citohrom a (Cyt a) i citohrom a3 (Cyt a3). Pored njih postoje i citohromi 26
endoplazmatičnog retikuluma, koji su uključeni u procese oksidacije. Citohromi b (bH i bI) u svojoj strukturi sadrže kao prostetičku grupu hem-protoporfirin IX , koji ima istu strukturu kao i hemoglobin. Prsten nije kovalentno vezan za proteinski deo; za razliku od citohroma c, kod kojih jeste (kovalentna,
tioestarska veza između bočnih grupa cisteina citohroma, i vinilnih grupa hema). Citohromi a poseduju hemA, koji se strukturno razlikuje od ostalih. Gvožđe svih citohroma formira koordinativne veze sa različitim bočnim grupama aminokiseline citohroma, sa obe strane planarnog prstena – histidini (citohrom a i b), ili histidin i metionin (citohrom c). Citohromi služe kao kontrolori visoko reaktivnih hemova, tako da oni ne prenesu svoje elektrone na nespecifične ćelijske komponente. Citohromi b i c 1 su komponente citohrom c reduktaze; a citohromi a i a3 su delovi citohrom c oksidaze. Ubikvinon (koenzim Q - CoQ) je izoprenoidni derivat rastvoren u lipidima, koji je uključen u
funkcionisanje u funkcionisanje samog respiratornog lanca u mitohondrijama. On je kvinonski derivat sa
dugačkim bočnim izoprenoidnim lancem (kod sisara je izgrađen od deset jedinica). Ubikvinon omogućava reverzibilno preuzimanje i odavanje dva H-atoma u respiratornom lancu. On se tako transfomriše u ubikvinol Q (QH 2), i to preko semikvinonskog intermedijera (Q●-). Endergoni procesi koji održavaju živi sistem su omogućeni i favorizovani egzergonim rekacijama
oksidacije nutrijenata iz spoljne sredine. Povezivanje ovih reakcija u živom sistemu se ostvaruje putem sinteze nekoliko tipova visokoenergetskih molekula, koji imaju u sebi veze čijom se hidrolizom oslobađa velika količina energije i koji predstavljaju intermedijere koji obezbeđuju tok slobodne energije u živom sistemu od kataboličkih, egzergonih reakcija u kojima se ona oslobađa, do anaboličkih, endergonih reakcija koji je koriste. Ta fosforilisana jedinjenja su ATP , acil-fosfati i enol-fosfati .
Reakcije transfera visokoenergetske fosforne grupe su od ogromne metaboličke važnosti, i od njih najviše su bitne reakcije hidrolize i sinteze ATP-a. R1-O―P + R2―OH →R1-OH + R2-O―P ATP + H2O ↔ ADP + P I (ortofosfat) ATP + H2O ↔ AMP + PP I (pirofosfat) Ove visoko egzergone reakcije su povezane sa velikim brojem endergonih biohemijskih procesa, kojima se dolazi do završnih realizacija. ATP se i regeneriše povezivanjem svoje sinteze sa visoko egzergonim
metaboličkim procesima, npr. biosinteza glukozo-6-fosfata (glukoza i ATP) ili biosinteza ATP i egerogena hidroliza fosfoenolpiruvata (PEP). Inicijalni korak u metabolizmu glukoze je njena koncverzija u glukozo6-fosfat. Direktna reakcija glukoze i ortofosfata je termodinamički nemoguća; pa je u biološkim sistemima fosforilacija glukoze vezana sa egzergonom hidrolizom ATP-a, tako da je celokupna reakcija
termodinamički favorizovana. I stupanj: Endergona reakcija Pi + Glukoza ↔ Glukozo-6-fosfat + H2O ― ∆Go'= +13,8 kJ/mol II stupanj: Egzergona reakcija 27
ATP + H2O ↔ ADP + P I ― ∆Go'= -30,5 kJ/mol
→ ATP + Glukoza ↔ ADP + Glukozo-6-fosfat ― ∆Go'= -16,7 kJ/mol Isto tako se ATP može regenerisati povezivanjem njegove sinteze sa veoma egzergonom reakcijom hidrolize PEP-a. I stupanj: Egzergona reakcija PEP + H2O ↔ Piruvat + P i ― ∆Go'= -61,9 kJ/mol II stupanj: Endergona reakcija ADP + PI ↔ ATP + H2O ― ∆Go'= +30,5 kJ/mol
→ ADP + PEP ↔ ATP + Piruvat ― ∆Go'= -31,4 kJ/mol ATP je univerzalan molekul energetskog metabolizma svakog živog sistema, i to zato što je promena standardne slobodne energije njegovom hidrolizom ∆G o'= -30,5 kJ/mol, što je neki prosek
visokoenergetskih veza fosforilisanih jedinjenja; on služi kao intermedijer između fosforilisanih molekula donora energije i niskoenergetskih akceptora te energije u obliku fosfata. Enzimi kinaze katalizuju transfer γ-fosforne grupe na alkoholne, karboksilne i gvanido grupe – kinazni efekat . On učestvuje i u prenosu difosfata (γ- i β-fosforne grupe istovremeno); prenosu nukleotidilnog dela (adenilacija); prenosu adenozina... Sa druge strane on se može sintetisati u živim sistemima na tri načina:
Oksidativni metabolizam formira gradijent protona na unutrašnjoj membrani mitohondrija i njeno vraćanje u normalu je povezano sa sintezom ATP -a od ADP-a i inorganskog fosfata; ovaj proces je u procesu fotosinteze označen kao fosforilacija Fosforilacija na nivou supstrata – ADP prihvata fosfornu grupu sa energijom bogatih fosforilisanih jedinjenja
Sinteza od AMP-a u dvostepenoj reakciji; prvi korak katalizuje adenilat kinaza (AMP + ATP ↔ 2 ADP); u drugom koraku se nastali AD P fosforiliše na neki od gore navedenih načina
ATP se više ponaša kao slobodni prenosilac energije u živim sistemima, nego kao rezervoar energije – njegov poluvek je jako kratak. ATP se sastoji iz nukleozida adenozina za koga je vezana α-fosforna grupa fosfoestarskom vezom; dok su β- i γ -fosforne grupe sukcesivno vezane fosfoanhidridnim vezama. U tim uslovima postoji parcijalno pozitivno naelektrisanje na fosfornim atomima, koji su okruženi negativno naelektrisanim kiseonicima. Hidroliza ATP-a na ADP i jednu fosfatnu grupu daje energiju za mnoge
esencijalne biohemijske procese; i to je omogućeno konformacionim promenama koje se dešavaju na enzimima kada se za njih veže ATP. Egzergona hidroliza vezanog ATP-a, na ADP i jednu fosfatnu grupu koji napuštaju enzim omogućava da se reakcije dešavaju usmereno i ireverzibilno. U nekim reakcijama dolazi i do razlaganja ATP-a na AMP i pirofosfat, i tad se pirofosfat brzo hidrolizuje na dva ortofosfata što katalizuje anorganska pirofosfataza, i to je jako egzergona reakcija. Slobodna energija te hidrolize se
koristi u živim sistemima za odigravanje reakcija koje su po prirodi egzergone. Pirofosfatno razlaganje ATP-a je vezano za aktivaciju masnih kiselina i biosintezu nukleotida, kao i za urea ciklus... 28
Acil-fosfati su jedinjenja čija hidroliza ili transfer fosforne grupe takođe rezultira u oslobađanju energije.
Ti molekuli su bogati energijom, zbog prirode rezonancije estarske veze koju formira kiseonik. Npr. u 1,3-
bifosfogliceratu, mogućnost rezonancije je mnogo manja nego u njegovim hidrolitičkim produktima – parcijalno pozitivno naelektrisanje je prisutno sa obe strane kiseonika. Enol-fosfati su visokoenergetska jedinjenja – hidrolizom fosfoenolpiruvata se oslobađa slobodna
energija - ∆Go'= -61,9 kJ/mol, što je najvećim delom posledica procesa izomerizacije enolnog produkta u keto-tautomer. U prvom koraku dolazi do hidrolize ili transfera fosforne grupe sa PEP- a, pri čemu se ostvaruje ∆Go'= -15,9 kJ/mol, dok je tautomerizacija enolnog u keto oblik visoko egzergon proces praćen promenom ∆Go'= -46 kJ/mol – zato je tautomerizacija ta koja omogućava biosintezu ATP -a, a ne hidroliza. Fosfoguanidini , kao što su fosfokreatin ili fosfoarginin, imaju visoki potencijal transfera fosfatne grupe
koji potiče iz kompetitivne rezonance u njihovim guanido-grupama. Ona je izraženija nego rezonanca fosfatne grupe u fosfohidridnoj vezi. Kod kičmenjaka služe kao rezervoari energije koji služe za brzu regeneraciju ATP-a u mišićnim i nervnim ćelijama. ATP + Kreatin ↔ Fosfokreatin + ADP Ovaj proces katalizuje enzim kreatin kinaza. U standardnim uslovima ova reakcija je enderogona, ali intercelularna koncentracija reaktanata i proizvoda je takva da se ona odvija veoma blizu ekvilibrijuma.
Znači kad je ćelija u procesu mirovanja, tada je koncentracija ATP-a relativno visoka, pa je reakcija usmerena ka sintezi fosfokreatina. Ali kada je aktivnost ćelije visoka, koncentracija ATP -a je niska i ova reakcija je pomerena ka sintezi ATP-a. Tioestri spadaju u visoko energetska jedinjenja, koja se mogu ponašati i kao nukleofili (donori elektrona)
ili elektrofili (akceptori elektrona). To je zato što sumpor ne daje tako lako svoje elektrone za formiranje dvogube veze, takod a oni imaju isti tip rezonancije kao i kiseonični estri i pokazuju značajan karbonilni karakter. Ovakva osobina tioestrima omogućava da nukleofilni oblik može vršiti napad na elektrofilni oblik istog tioestra što daje osnovu za biosintezu npr. masnih kiselina.
35. Mehanizam delovanja dehidrogenaza: Dehidrogenaze koje kao koenzim imaju NAD+ ili NADP + učestvuju u jako velikom broju reakcija u živim
sistemima u različitim aspektima metabolizma. SH2 + NAD+ (NADP+) ↔ S + NADH + H + (NADPH + H+) (SH2 – redukovana forma supstrata; S – oksidovana forma produkta reakcije; NAD+ i NADP+ - oksidovane forme koenzima; NADH + H+ i NADPH + H+ - redukovane forme koenzima) Piridinski nukleotidi NAD+ i NADP+ su kao koenzimi, slabo vezani za apoenzim dehidrogenaze i lako mogu disosovati sa apoenzima, te se mogu smatrati kosupstratima, više nego prostetičkim grupama. Vezivanje NAD+ ili NADP+ za apoenzim dehidrogenaze je determinisano afinitetom apoenzima za jedan od koenzima. NAD+-zavisne dehidrogenaze služe u katabolizmu za prenošenje redukcionog potencijala sa 29
supstrata na kiseonik; dok NADP +-zavisne hidrogenaze primarno služe za prenos elektrona sa intermedijera katabolizma na intermedijere anabolizma.
Mehanizam delovanja ovih dehidrogenaza u procesu redukcije se sastoji u prebacivanju dva redukujuća ekvivalenta (2H) sa supstrata u formi hidridnog jona (H-) na C4-atom pirdidinskog prstena NAD + ili NADP+; i slobodnog vodonikovog jona (H +), pri čemu se supstrat oskiduje, a NAD + ili NADP+ redukuju. Redukovani
NADH ili NADPH mogu prebaciti dva redukujuća ekvivalenta na oskidovani supstrat i sami se reoksidovati, tako da je reakcija oskido-redukcije katalizovana ovim NAD+ ili NADP+-zavisnim dehidrogenazama reverzibilan proces. Preuzimanje hidridnog jona sa supstrata od strane piridinskog
prstena je omogućeno postojanjem rezonantne forme piridinskog prstena usled pregrupisavanja elektrona. N1-atom privlači elektrone od susednog C2-atoma, koji privlači elektrone njegovog suseda C3atoma, koji takođe privlači elektrone sledećeg u nizu – C 4-atoma; zato on ostaje sa manjkom elektrona, pa se za njega vezuje hidridni jon i tako stabilizuje naelektrisanje piridinskog prstena. NAD + i NADP+-
zavisne hidrogenaze poseduju stereospecifičnost po dva osnova – specifičnost sa stereoizomer , i specifičnost za A ili B stranu piridinskog prstena pri redukciji (alkoholna dehidrogenaza kvasca – A-strana prstena; glukozo-6-gosfat dehidrogenaza – B-strana prstena). Dehidrogenaze koje kao koenzime imaju FMN (npr. NADH-dehidrogenaza ) ili FAD (npr. sukcinat dehidrogenaza), se nazivaju i flavoproteinima, i one katalizuju opštu reakciju reverzibilnog tipa: SH2 + E-FMN (FAD) ↔ S + E-FMNH2 (FADH2) (SH2 – redukovana forma supstrata; S – oksidovana forma produkta reakcije;E-FMN (FAD) – oksidovane forme koenzima; E-FMNH2 (FADH2) – redukovane forme koenzima)
Ovi koenzimi su mnogo čvršće vezani za apoenzim dehidrogenaze, nego što su to piridinski koenzimi. Najvažnije dehidrogenaze koje poseduju flavinske koenzime, uljučene su u procese respiracije i transport elektrona u respiratornom lancu mitohondrija. Mehanizam delovanja
FMN ili FAD-zavisnih
dehidrogenaza u procesu oksidoredukcije se zasniva na reverzibilnom prenosu dva kompletna atoma vodonika sa supstrata na izoaloksazonski prsten koenzima (oksidacija supstrata i redukcija koenzima) i obrnuto. Prvo dolazi do prebacivanja jednog H-atoma sa supstrata na N 5-atom izoaloksazonskog prstena,
pri čemu nastaje radikal – semikvinonska forma koenzima , što izaziva pregrupisanje elektrona u samom prstenu. C4α-atom sada ima višak elektrona koga sparuje sa elektron C 10α-atoma pri čemu se uspostavlja dvostruka veza između dva atoma. To za posledicu ima višak elektrona na N 1-atomu izoaloskazonskog prstena, te on prihvata drugi H-atom supstrata, pr i čemu se dobijaju hidrokvinonske redukovane forme koenzima - FMNH2 (FADH2). Reoksidacija redukovanih koenzima ovih dehidrogenaza, se ostvaruje na respiratornom lancu predavanjem redukcionog potencijala, direktno ili indirektno, na CoQ u respiratornom lancu. Pored dehidrogenaza FMN i FAD mogu biti prostetičke grupe i oksidazama ( ksantin oksidaza; oksidaza aminokiselina ), i u tom slučaju se njihova reoksidacija vrši direktno molekularnim
kiseonikom, pri čemu nastaje vodonik-peroksid.
36. Oksidacija i redukcija piridinskih nukleotida:
30
Dehidrogenaze koje kao koenzim imaju NAD + ili NADP+ učestvuju u jako velikom broju reakcija u živim
sistemima u različitim aspektima metabolizma. SH2 + NAD+ (NADP+) ↔ S + NADH + H + (NADPH + H+) (SH2 – redukovana forma supstrata; S – oksidovana forma produkta reakcije; NAD+ i NADP+ - oksidovane forme koenzima; NADH + H+ i NADPH + H+ - redukovane forme koenzima) Kod NAD+ takve reakcije obuhvataju uklanjanje dva atoma vodonika sa supstrata (S), u obliku hidridnog jona (H−), i protona (H+). Proton se oslobađa u rastvor, dok se reduktant SH2 oksiduje i NAD+ se redukuje u NADH transferom hidrida do nikotinamidnog prstena. Sa hidridnog elektronskog para, jedan elektron se prenosi do pozitivno naelektrisanog azota u nikotinamidnom prstenu, a drugi atom vodonika se prenosi do C4 ugljenika nasuprot tog azota. Potencijal NAD +/NADH redoks para je −0.32 volti, što čini
NADH jakim redukujućim agensom. Reakcija je lako reverzibilna, pri čemu NADH redukuje drugi molekul i re-oksiduje se do NAD+. To znači da koenzim može kontinuirano da cirkuliše između NAD+ i NADH oblika bez gubitka. Piridinski nukleotidi NAD+ i NADP+ su kao koenzimi, slabo vezani za apoenzim dehidrogenaze i lako mogu disosovati sa apoenzima, te se mogu smatrati kosupstratima, više nego prostetičkim grupama. Vezivanje NAD+ ili NADP+ za apoenzim dehidrogenaze je determinisano afinitetom apoenzima za jedan od koenzima. NAD+-zavisne dehidrogenaze služe u katabolizmu za prenošenje redukcionog potencijala sa supstrata na kiseonik; dok NADP+-zavisne hidrogenaze primarno služe za prenos elektrona sa intermedijera katabolizma na intermedijere anabolizma.
37. Oksidacija i redukcija flavinskih nukleotida: Dehidrogenaze koje kao koenzime imaju FMN (npr. NADH-dehidrogenaza) ili FAD (npr. sukcinat dehidrogenaza), se nazivaju i flavoproteinima, i one katalizuju opštu reakciju reverzibilnog tipa: SH2 + E-FMN (FAD) ↔ S + E-FMNH2 (FADH2) (SH2 – redukovana forma supstrata; S – oksidovana forma produkta reakcije;E-FMN (FAD) – oksidovane forme koenzima; E-FMNH2 (FADH2) – redukovane forme koenzima)
Ovi koenzimi su mnogo čvršće vezani za apoenzim dehidrogenaze, nego što su to piridinski koenzimi. Najvažnije dehidrogenaze koje poseduju flavinske koenzime, uljučene su u procese respiracije i transport elektrona u respiratornom lancu mitohondrija. Mehanizam delovanja
FMN ili FAD-zavisnih
dehidrogenaza u procesu oksidoredukcije se zasniva na reverzibilnom prenosu dva kompletna atoma vodonika sa supstrata na izoaloksazonski prsten koenzima (oksidacija supstrata i redukcija koenzima) i obrnuto. Reoksidacija redukovanih koenzima ovih dehidrogenaza, se ostvaruje na respiratornom lancu predavanjem redukcionog potencijala, direktno ili indirektno, na CoQ u respiratornom lancu. Pored
dehidrogenaza FMN i FAD mogu biti prostetičke grupe i oksidazama ( ksantin oksidaza; oksidaza aminokiselina), i u tom slučaju se njihova reoksidacija vrši direktno molekularnim kiseonikom, pri čemu nastaje vodonik-peroksid.
31
FMN je jači oksidicioni agens nego NAD i posebno je koristan zato što učestvuje u jedno- i dvo-
elektronskim transferima. FAD može postojati u dva različita redoks-stanja, između kojih se on konvertuje primanjem ili doniranjem elektrona. Ovaj molekul se sastoji riboflavina (vitamina B2) vezanog za fosfatnu grupu ADP molekula. Flavinska grupa je vezana za ribitol, šećerni alkohol, ugljenik-azot
vezom, koja nije glikozidna. Stoga, riboflavin nije tehnički nukleotid. FAD se može redukovati do FADH2, pri čemu prima dva atoma vodonika (neto dobit od dva elektrona).
38. Nikotin adenin dinukleotid fosfat (NADP – građa i funkcija): NADP + razlikuje od NAD+ po prisustvu jedne dodatne fosfatne grupe na 2' poziciji riboznog prstena za
koji je vezan adenin, a oboje pripadaju grupi piridinskih nukleotida. On se koristi u anaboličkim
reakcijama, kao što su sinteze lipida i nukleiniskih kiselina, za koje je NADPH neophodan kao redukujući agens. NADPH se redukuje iz NADP+. I NAD+ i NADP+ su kao koenzimi, slabo vezani za apoenzim dehidrogenaze i lako mogu disosovati sa apoenzima, te se mogu smatrati kosupstratima, više nego prostetičkim grupama. Vezivanje NADP+ za apoenzim dehidrogenaze je determinisano afinitetom apoenzima njega. NADP +-zavisne hidrogenaze
primarno služe za prenos elektrona sa intermedijera katabolizma na intermedijere anabolizma. One poseduju stereospecifičnost po dva osnova – specifičnost sa stereoizomer , i specifičnost za A ili B stranu piridinskog prstena pri redukciji. Na ovom nukleotidu je zasnovan alternativni energetski ciklus – on se u procesima oksidacije redukuje na NADPH i H +. Nastali NADPH i H + se koriste u reduktivnim biosintetičkim reakcijama, pr čemu se dobijaju redukovani produkti i regenerisani oskidovani NADP +. Na taj način se oslobođena hemijska energija u procesu katabolizma, direktno prenosi na procese anabolizma.
39. Nikotin adenin dinukleotid (NAD – građa i funkcija): Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) je koenzim prisutan u svim
živim ćelijama. Jedinjenje je dinukleotid , jer se sastoji od dva nukleotida spojena putem fosfatnih grupa. Jedan nukleotid sadrži adeninsku bazu, a drugi nikotinamid . U metabolizmu, NAD+ učestvuje u redoks-reakcijama, prenoseći elektrone se jedne reakcije do druge. Koenzim je, stoga nađen u dva
oblika u ćelijama. NAD+ kao oksidujući agens – on prima elektrone sa drugih molekula i postaje redukovan. Ta reakcija formira NADH , koji
se zatim može koristiti kao redukujući agens (doniranje elektrona). Reakcije elektronskog transfera su glavna NAD+ funkcija. Međutim, on se takođe koristi u drugim ćelijskim procesima, najznačajniji od kojih su oni u kojima je on supstrat enzima koji dodaju ili uklanjaju hemijske grupe sa proteina, u posttranslacionim modifikacijama.
Zbog značaja tih funkcija, enzimi koji uzimaju udela u NAD+ metabolizmu su meta u otkrivanju lekova.
32
U organizmu, NAD+ može biti sintetisan iz jednostavnih gradivnih blokova iz aminokiseline triptofan ili asparaginske kiseline. Alternativno, kompleksnije komponente koenzima se uzimaju iz hrane kao vitamin pod nazivom niacin. Slična jedinjenja nastaju u reakcijama kojima se razlaže NAD+ struktura. Deo NAD+
sadržaja se takođe konvertuje u nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP +); hemija tog srodnog koenzima je slična sa NAD+-om, ali podleže različitim pravilima u metabolizmu. Nikotinamidna grupa može biti vezana u dve orijentacije za taj anomerni ugljenik. Zbog te dve moguće strukture, jedinjenje postoji kao dva diastereomera. β-nikotinamidni NAD+ diastereomer je nađen u organizmima. Ti nukleotidi su međusobno spojeni mostom između dve fosfatne grupe preko 5' ugljenika.
40. Piridoksal fosfat – građa i funkcija: enzima – koenzim. On je aktivna Piridoksal-fosfat (PLP , piridoksal-5'-fosfat, P5P) je prostetska grupa više enzima – forma vitamina B6, koji se sastoji od tri prirodna organska jedinjenja – piridoksal, piridoksamin i piridoksin.Odgovoran je za transfer amino-grupa, racemizaciju i dekarboksilaciju dekarboksilaciju aminokiselina.
PLP deluje kao koenzim u reakcijama transaminacije, kao i u nekim od reakcija dekarboksilacije i deaminacije aminokiselina. Aldehidna grupa PLP-a formira Šifove bazne veze (interne aldimine) sa ε-
amino grupom specifičnih lizinskih grupa aminotransferaznih enzima. α-amino grupa aminokiselinskog supstrata zamenjuje ε-amino grupu aktivnog-mesta lizinskog ostatka. Rezultujući spoljni aldimin postaje deprotonisan i služi kao hinoidni intermedijar, koji zatim prima proton u različitoj poziciji da postane ketimin. Rezultirajući ketimin je hidrolizovan tako da amino grupa ostaje u kompleksu. Osim toga, PLP koriste aminotransferaze (ili transaminaze) koje deluju na šećerim a poput perosamina i dezosamina. U tim reakcijama, PLP reaguje sa glutamatom, koji prenosi alfa-amino grup na PLP da
formira piridoksamin fosfat (PMP). PMP zatim prenosi svoj azot n a šećer, formirajući amino šećer.
41. Glikoliza – faze glikolize: p iruvat, uz istovremenu biosintezu Glikoliza je sekvenca reakcija koje omogućavaju konverziju glukoze u piruvat, ATP-a. Ona se odigrava u citoplazmi i kod aerobnih organizama je prethodnica Ciklusa limunske kiseline, kiseline ,
koji zajedno sa respiratornim lancem, omogućava ekstrakciju najvećeg dela energije sadržane u glukozi, pri čemu se glukoza degraduje do ugljen-dioksida i vode. Proces glikolize se može podeliti u dve faze:
Faza I – prevođenje prevođenje monosaharida monosaharida u gliceraldehid-3-fosfat ( GLA-3-P GLA-3-P ) uz korišćenje ATP-a za otpočinjanje reakcije
– konverzija GLA-3-P u piruvat , pri čemu dolazi Faza II – dolazi do konzervacije konzervacije energije u vidu vidu ATP-a
Ukupan energetski bilans glikolize je dobijanje dva molekula ATP-a. Svi intermedijeri glikolize su fosforilisani i funkcije fosfornih grupa su – obezbeđi vanje vanje negativno naelektrisane polarne grupe
(onemogućavaju slobodan prolazak intermedijera kroz membranu); grupe za vezivanje ili il i prepoznavanje enzima i supstrata – omogućavanje formiranje kompleksa enzim -supstrat; konzervacija energije intermedijera i nje no prenošenje na ATP... Glikolizu karakterišu tri tipa hemijskih transformacija – put Catoma (sekvenca reakcija koja omogućava da se skelet ugljenika glukoze prevede u piruvat); put fosfata 33
(sekvenca reakcija u kojima se inorganski fosfor vezuje za intermedijere i prenosi na ATP) i put elektrona (sekvenca oskidoredukcionih reakcija). Prvi koraci glikolize su konverzije glukoze u fruktozo 1,6-bifosfat (Glu-1,6-BisP). U glikolizu glukozu uvodi
specifični membranski protein; ona se fosforiliše na račun molekula ATP -a pri čemu nastaje startni molekul glikolize – glukozo-6-fosfat (Glu-6-P). Tu reakciju katalizuje heksokinaza, koja za svoju aktivnost zahteva jone Mg2+, koji služe za uspostavljanje kompleksa sa ATP -om. Mg2+ služi da stabilizuje negativno naelektrisanje na poslednjoj fosfornoj grupi ATP-a, tako da ona postaje podložna nukleofilnom napadu kiseonika iz C 6-OH grupe glukoze. To izaziva potpuno opkoljavanje glukoze proteinima aktivnog mesta heksokinaze, heksokinaze , i ostavljanje samo C6-atoma slobodnim – indukovano uklapanje enzima sa supstratom . Ovom konformacionom promenom se molekul ATP-a dovodi u neposrednu blizinu sa primarnom
alkoholnom grupom glukoze; dok okolina glukoze postaje jako polarna što uslovljava prenos fosfor ne grupe sa ATP-a na glukozu. Znači konformaciona promena heksokinaze, indukovana heksozama sa CH2OH-grupom na C6-atomu, je odgovorna za supstratnu specifičnost enzima. Istim principom funkcionišu i druge kinaze glikolize – piruvat kinaza; fosfoglicerat kinaza; fosfofruktokinaza fosfofruktokinaza... ... Sledeći korak glikolize je izomerizacija nastalog glukozo-6-fosfata u fruktozo-6-fosfat (Fru-6-P ). ). To katalizuje enzim fosfoglukozo izomeraza – ona konvertuje heksozni piranozni prsten glukozo-6-fosfata u pentozni furanozni prsten fruktozo-6-fosfata (konverzijom aldoze u ketozu). Fosfoglukozo izomeraza deluje po sistemu kiselinsko-bazne katalize (bočne grupe lizina deluju kao generalna kiselina, a bočne grupe glutamata kao generalna baza). Nakon toga, dolazi do fosforilacije fruktozo-6-fosfata (donor fosforne
), čime nastaje fruktozo-1,6-bifosfat . Ovu reakciju katalizuje fosfofruktokinaza, koja grupe je opet ATP ), obezbeđuje nukleofilni napad C1-OH grupe Fru-6-P, na elektrofilnu γ-fosfornu grupu ATP-Mg2+kompleksa. Fosfofruktokinaza je alosterički enzim preko kog a se i vrši kontrola glikolize. Nastali fruktozo1,6-bifosfat se razlaže na dva triozofosfata – D-gliceraldehid-3-fosfat ( (GLA-3-P ) i dihidroksiaceton fosfat (DHA-P ). ). Taj proces – aldolno razlaganje; razlaganje; katalizuje aldolaza. Ono zahteva postojanje karbonilne grupe na C2-atomu i hidroksilne grupe na C 4-atomu – zato se i glukozo-6-fosfat izomerizovao u fruktozo-6fosfat. Dihidroksiaceton fosfat nastaje nastaje od C1-, C 2-, i C3-atoma; dok gliceraldehid-3-fosfat nastaje od C4-, C5-, i C6-atoma. Aldolno razlaganje je katalizovano stabilizacijom enolatnog intermedijera preko dislokacije protona. Na osnovu toga se razlikuju dva tipa aldolaza – tip I (aldolaze (aldolaze prisutne u biljkama i
životinjama; stabilizacija enolatnog intermedijera stvaranjem Schiffove baze) i tip II (kod gljiva, algi i nekih bakterija; stabilizacija enolatnog intermedijera preko jona Zn 2+ ili Fe2+ koji se koriste za polarizaciju karbolnilnog atoma). Dihidroskiaceton fosfat se mo ra pretvoriti u gliceraldehid fosfat, i to se postiže izomerizacijom koju katalizuje triozofosfat izomeraza. Konverzija je reverzibilan proces i dešava se
dobijanjem enediolnog intermedijera koji se formira preko specifičnih tranzicionih stanja. Nastale dve fosfotrioze se konvertuju u piruvat u piruvat u Fazi II glikolize. II glikolize. Ona je povezana i sa deponovanjem energije poreklom iz glukoze u molekule ATP-a. Početna reakcija Faze II je prevođenje GLA-3-P u 1,3bisfosfoglicerat , što katalizuje gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, i ona kao koenzim koristi NAD+. U
ovoj oksido-redukcionoj reakciji se formira visoko energetsko jedinjenje – oksidacija aldehidne grupe
omogućava da se na C1-atomu aldehidne grupe GLA-3-P formira energijom bogat acil-fosfatni intermedijer – 1,3-bisfosfoglicerat. Nakon toga se vrši transfer fosforne grupe sa visokim potencijalom sa
34
1,3-bisfosfoglicerata na ADP da bi se dobio ATP . Ovu reakciju, prvu reakciju glikolize u kojoj se generiše ATP, katalizuje fosfoglicerat kinaza. Sinteza ATP-a se odvija nukleofilnim napadom kiseonika β-fosfornog atoma ADP-a na fosforni atom vezan za C1-atom 1,3-bisfosfoglicerata. Pored ATP-a se dobija i 3 fosfoglicerat . Sve u svemu gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza i fosfoglicerat kinaza kinaza katalizuju
oksidaciju gliceraldehid-3-fosfata u 3-fosfoglicerat uz uvođenje inorganskog fosfora u reakciju, redukciju NAD+ u NADH i biosintezu ATP-a od ADP-a i aktiviranog inorganskog fosfata. Njihov energetski bilans je u totalu egzergon ∆Go'=-12,1 kJ/mol. Ovakav proces biosinteze ATP-a se naziva fosforilacija na nivou supstrata. 3-fosfoglicerat je supstrat za enzim fosfoglicerat-mutazu fosfoglicerat-mutazu, koja ga prevodi u 2-fosfoglicerat
(katalizuje intramolekulski rearanžman – fosforna grupa prelazi sa C3- na C2-atom). Ona ima fosfornu grupu u svom aktivnom centru, i ona je vezana za imidazolni prsten histidina. Nakon vezivanja supstrata
za enzim, dolazi do transfera fosforne grupe sa histidina na njega, pri čemu nastaje 2,3-bisfosfoglicerat . 2-fosfoglicerat se oslobađa sa enzima, tek nakon što se izvrši transfer fosforne grupa sa C 3-atoma na imidazolni prsten histidina. Tako nastaje neaktivna forma enzima, i on će se aktivirati tek nakon ponovnog vezivanja 2,3-bisfosfoglicerata. To se dešava zato što u ćeliji uve k mora postojati minimalna koncentracija slobodnog 2,3-bisfosfoglicerata. Nakon toga se dešava dehidratacija 2-fosfoglicerata, koju ). Ova reakcija dosta povećava energetski katalizuje enolaza. Time se dobija fosfoenolpiruvat (PEP ). potencijal fosforne grupe jer prevodi molekul i enolfosfatni intermedijer (2-fosfoglicerat). Enolaza formira kompleks sa dvovalentnim katjonima (Mg 2+ u fiziološkim uslovima) pre interakcije sa supstratom. Ona brzo formira karboanjonski intermedijer uklanjanjem protona sa C 2-atoma 2-
fosfoglicerata. Nakon toga se eliminiše C 3-OH grupa koja je stabilizovana Mg2+ jonom. U poslednjoj reakciji glikolize dolazi do formiranja piruvata i sinteze još jednog molekula ATP -a, tako što se fosforna grupa sa PEP-a prenosi na ADP; a enolpiruvatni in termedijer se tautomerizacijom transformiše u keto oblik. Ovaj proces katalizuje piruvat kinaza. Ona zavisi od prisustva K+ i Mg2+. Reakcija počinje nukleofilnim napadom kiseonika β-fosfornog atoma ADP-a na atom fosfora u PEP-u. ATP se oslobađa, dok se dob ijeni enolpiruvat konvertuje u keto oblik uz učešće jednog protona.
42. Energetski bilans glikolize: Ukupan energetski bilans transformacije glukoze u piruvat, u procesu glikolize se može sumarno
prikazati opštom formulom: GLUKOZA + 2PI + 2 ADP + 2NAD + ―→ 2PGK + 2ATP+ 2NADH + 2H + + 2H2O
Sa energetskog stanovišta u Fazi I glikolize se koristila energija ATP -a dok se u Fazi II oslobođena energija tranzitorno deponovala u vidu ATP-a, tako da je neto bilans glikolize jednak dva molekula ATP-a. ATP se
troši prilikom prelaska glukoze u glukozo-6-fosfat; kao i pri prelasku fruktozo-6-fosfat u fruktozo-1,6bisfosfat. Suprotno tome ATP se sintetiše pri prelasku 1,2 -bisfosfoglicerata u 3-fosfoglicerat; kao i pri prelasku fosfoenolpiruvata u piruvat. Sa obzirom da postoje dva molekula i 1,2-bisfosfoglicerata i fosfoenolpiruvata, ukupno se sintetiše četiri molekula ATP-a.
43. Mehanizam delovanja GLA-3-P dehidrogenaze:
35
Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza je enzim koji prevodi gliceraldehid-3-fosfat u u 1,3-bisfosfoglicerat .
Ona je tetramer i svaka njena subjedinica poseduje aktivno katalitičko mesto za koga se slabim vezama veže koenzim NAD+. Proces konverzije predstavlja kombinaciju oksidacije i fosforilacije, i on je moguć zato što enzim poseduje sulfidrilnu grupu u svom aktivnom mestu (bočna grupa specifičnog cisteina). Ona vrši nukleofilni napad na karbonilni atom aldehidne grupe GLA-3-P, koji se ostvaruje nakon vezivanja supstrata za enzim. Posledica toga je vezivanje GLA-3-P za sumpor tiohemiacetalnom vezom. Sledeći korak je prenos hidridnog jona na NAD+, pri čemu se dobija redukovani koenzim i tioestarski vezan GLA 3-P. NADH disosuje sa enzima i biva zamenjen oskidovanom formom NAD+. Istovremeno se u reakciju
uključuje i inorganski fosfat, koji vrši napad na tioestarsku vezu. Tada se sa enzima oslobađa 1,3bifosfoglicerat, a enzim se vraća u početno stanje.
44. Regulacija glikolize i glukoneogeneze: Glukoneogeneza i glikoliza su recipročno regulisani, kako ne bi došlo do beskorisne hidrolize ATP -a i GTPa, ali i da bi došlo do zadovoljavanja potreba organizma. Pri visokoj koncentraciji glukoze u krvi, u jetri se procesi usmeravaju ka konzervaciji energije – stimuliše se biosinteza glikogena; a aktiviraju se i glikoliza i oksidativna dekarboksilacija piruvata, kako bi se glukoza prevela u acetil-S- CoA (koji će se dalje koristiti za sintezu lipida). Suprotno tome u fazi gladovanja, kada je nivo glukoze u krvi nizak, aktivnost ćelija jatre je usmerena ka razgradnji glikogena i na glukoneogenezu, kako bi se održao potreban nivo glukoze u krvi. Sa obzirom na takve zahteve, regulacija glukoneogeneze i glikolize se ostvaruje i biohemijskim koracima koji se u ova dva procesa razlikuju. Enzimi koji katalizuju ireverzibilne reakcije u metaboličkim putevima, su i mesta regulacije tog puta i u slučaju glikolize to su – heksokinaza, fosfofrukzokinaza i piruvat kinaza. U slučaju glukoneogeneze regulacija se vrši preko glukozo-6-fosfata, fruktozo bisfosfata, piruvat karboksilaze i fosfoenolpiruvat karboksikinaze karboksikinaze. Fosfofruktokinaza je prisutna u jetri i egzistira u dva konformaciona stanja – R- i T-stanje, T-stanje, koja su
ekvilibrijumu. Ona je inhibirana visokim nivoom ATP -a, -a, koji ukazuje na povoljno energetsko stanje i
en zima. smanjuje afinitet enzima za fruktozo-6-fosfat . ATP je i supstrat, ali i alosterički modifikator tog enzima. Svaka subjedinica ima dva mesta za vezivanje ATP-a – jedno ga vezuje kao supstrat, a drugo kao
inhibitor. Supstrat se lako vezuje bez obzira na formu enzima, dok će se ATP za mesto inhibitora vezati jedino u T-stanju. Drugi supstrat enzima je Fru-6-P, Fru-6-P, koji se preferencijalno vezuje za R stanje enzima znači pri visokim koncentracijama ATP-a. On deluje kao alosterički inhibitor vezujući se za enzim u T-
stanje i tako pomerajući T-R ekvilibrijum ka T-stanju, i smanjujući afinitet enzima za fruktozo -6-fosfat. Aktivnost fosfofruktokinaze fosfofruktokinaze se inhibira i velikom koncentracijom NADH što takođe govori o energetskom statusu ćelije. Fosfofruktokinaza Fosfofruktokinaza je inhibirana i citratom, prvim intermedijerom ciklusa limunske kiseline. Visok nivo citrata pokazuje da ima dovoljno prekursora biosinteze, tako da nije potrebno da se glukoza dalje koristi za tu svrhu. Inhibitorni efekat ATP-a se anulira AMP -om, -om, koji se preferencijalno vezuje za R-
stanje enzima povećavajući njegov afinitet prema fuktozo -6-fosfatu, samim tim stimulišući fosfofruktokinazu i forsirajući glikolizu. AMP pored toga inhibira i fruktozo bisfosfatazu. Aktivator fosfofruktokinaze i inhibitor fruktozo bisfosfataze, je i fruktozo-2,6-bisfosfat . On povećava njen afinitet za fruktozo-6-fosfat, smanjujući inhibitorni efekat ATP-a. On izaziva konformacionu promenu tetramernog enzima – menja njegovu alosteriju iz T- u R-stanje. Fru-2,6-bisfosfat se formira 36
fosforilacijom fruktozo-6-fosfata, koju katalizuje specifična fosfofruktokinaza-2 fosfofruktokinaza-2;; dok se sa druge strane on se hidrolizuje do f ruktozo-6-fosfata uz katalizu fruktozo-bisfos katalizu fruktozo-bisfosfataze-2 fataze-2.. Fosfofruktokinaza-2 i fruktozobisfosfataza-2 su tandem enzimi – nalaze se na istom polipeptidnom lancu. Povećavanje koncentracije fruktozo-6-fosfata ubrzava biosintezu fruktozo-2,6-bisfosfata, i istovremeno inhibira njegovu hidrolizu. Aktivnost ovog tandem-enzima je kontrolisana fosforilacijom jednog jedinog serinskog ostatka u
polipeptidu. Povećan nivo glukoze u krvi, dovodi po povećanja lučenja glukagona, koji otpočinje niz kaskadnih reakcija fosforilacije u ćeliji – jedna od njih je i dobijanje Fru-2,6-BisP. Ova kovalentna modifikacija
putem
fosforilacije
aktivira
domen
fruktozo-bifosfataze-2,a
inhibira
domen
fosfofruktokinaze-2, što dovodi do smanjenja količine Fru-2,6-BisP i samim tim usporava proces glikolize.
Suprotno, ako je mala koncentracija glukoze u krvi, dešava se suprotna situacija i glikoliza se ubrzava. Regulacija na nivou heksokinaze se ostvaruje time što se aktivnost ovog enzima inhibira rastućom koncentracijom glukozo-6-fosfata. Kada dođe do inhibicije fosfofruktokinaze, povećava se i koncentracija supstrata ovog enzima – fruktozo-6-fosfata fruktozo-6-fosfata, i to dovodi do povećavanja koncentracije glukozo-6-fosfata. Pošto su oni u ekvilibrijumu, inhibicija fosfofruktokinaze ima za posledicu i inhibiciju
heksokinaze. U jetri se glukoza fosforiliše u glukozo -6-fosfat, čak i u prisustvu velike koncentracije Glu -6P i to zbog prisustva glukokinaze. Ona ima nizak afinitet za glukozu, stoga je efikasna samo u prisustvu
velike koncentraicje glukoze. Ona obezbeđuje velike količine glukozo-6-fosfata za sintezu glikogena i za put pentozofosfata. Piruvat kinaza i piruvat karboksilaza su takođe recipročno regulisani. Piruvat kinaza je kinaza je tetramer koji se
razlikuje u zavisnosti od pozicije u telu – tip L (jetra), tip M (mišići i mozak), i tip A (u ostalim tkivima).
Oni imaju identične katalitičke mehanizme i osnovnu građu, ali se razlikuju po tipu regulacije – izoenzimi ili izozimi . Piruvat kinaza L L vezuje fosfoenolpiruvat kooperativno, ATP alosterički inhibira ovaj izozim usporavajući glikolizu kada je energetski status ćelije dobar. Alosterički inhibitor je i alanin, čiji visok nivo signalizira da su gradivni blokovi potrebni za anabolizam u višku, kao i NADH . Fruktozo-1,6-bisfosfat i glukozo-6-fosfat aktiviraju piruvat kinazu, da bi se nadolazeći intermedijeri glikolize pretvorili što efikasnije u piruvat. Piruvat kinaza L je L je kontrolisana reverzibilnom fosforilacijom – nakon fosforilacije njemu se smanjuje aktivnost, sve dok se ne defosforiliše. To se dešava da bi se u jetri sprečilo korišćenje glukoze, ukoliko ćelije mišića i mozga ostanu bez nje. Piruvat kinaza M ne podleže regulaciji fosforilacijom, jer ćelije mozga i mišića koriste glukozu kao jedini izvor energije. Piruvat kinaza A se delimično kontroliše fosforilacijom. Piruvat karboksilazu karboksilazu stimuliše acetil-S-CoA, dok je ADP inhibira. inhibira. ADP inhibira i fosfoenol karboksikinazu, tako da je tok reakcija od PGK ka fosfoenolpiruvatu favorizovan povoljnim energetskim stanjem – visokim nivom ATP-a.
45. Ulazak saharida u proces glikolize (saharoza, laktoza, skrob, glikogen): Hidrolizu skroba katalizuju hidrolitički enzimi amilaze. Enzim α-amilaza, koju sekretiraju pljuvačne
žlezde i pankreas, hidrolizuje internalne α(1-4) glikozidne veze, dajući kao produkte maltozu, maltotriozu i dekstrin. Maltoza i maltotrioza se dalje razlažu do glukoze pomoću enzima maltaze; a dekstrin koji sadrži ostatke glukoze povezane α(1-4) i β(1-6) glikozidnim vezama se do glukoze hidrolizuje uz pomoć
37
enzima α-dekstrinaze. Krajnji produkti delovanja α-amilaze, maltaze i α-dekstrinaze jesu molekuli
glukoze koji se direktno uključuju u proces glikolize. U katabolizmu glikogena učestvuje enzim glikogen fosforilaza. Ona spada u fosforilitičke enzime –
katalizuje proces fosforilize, dajići kao produkt glukozo-1-fosfat koji zadržava α-konfiguraciju C1-atoma. Glukozo-1-fosfat je supstrat za fosfoglukomutazu, koja ga prevodi u glukozo-6-fosfat, početni molekul glikolize. Saharoza se u organizam unosi preko voća ili meda, i poznato je da je ona disaharid sastavljen iz
molekula glukoze i fruktoze. Ona se hidrolizuje pod delovanjem enzima β-fruktofuranozidaze ili ti saharaze. Glukoza se direktno uključuje u glikolizu, ali fruktoza to može učiniti na dva načina –
prevođenjem u fruktozo-6-fosfat pod delovanjem heksokinaze u ćelijama mišića; dok je u jetri njeno uključivanje mnogo komplikovanije. To je zato što jet ra ima nizak nivo heksokinaze, koja i pored toga pokazuje mnogo veći afinitet prema glukozi, a ne fruktozi. Stoga se konverzija fruktoze u neki intermedijer glikolize odvija fosforilisanjem uz enzim fruktokinazu, čime se dobija fruktozo-1-fosfat . On je supstrat za delovanje enzima fruktozo-1-fosfat aldolaze, koja ga razlaže na gliceraldehid i dihidroksiaceton fosfat . DHA-P je direktni intermedijer glikolize, ali se gliceraldehid mora fosforilisati
(enzimom triokinazom), čime se dobija gliceraldehid-3-fosfat koji je direktan intermedijer glikolize. U jetri postoji i opcija da se nastali gliceraldehid konvertuje u DHA-P – redukuje se uz alkoholnu dehidrogenazu; nastali glicerol je supstrat za delovanje glicerol kinaze (koristi ATP za sintezu glicerolfosfata); nastali glicerolfosfat se oksiduje delovanjem enzima glicerolfosfat dehidrogenaze
(koristi NAD+ kao koenzim) i dobija se dihidroksiaceton fosfat . U masnom tkivu je mnogo veća koncentracija fruktoze u odnosu na glukozu, i ona se u glikolizu uvodi na isti način kao i u mišićnim
ćelijama. Galaktoza je epimer glukoze na C4-atomu i u organizam se unosi mlekom u obliku laktoze. Laktoza se
hidrolizuje delovanjem β-galaktozidaze ili laktaze na glukozu i galaktozu . Glukoza se direktno uključuje u glikolizu, dok se galaktoza prevodi u glukozo-6-fosfat . Galaktoza se fosforiliše uz korišćenje jednog molekula ATP -a (donor fosforne grupe) uz katalizu galaktokinazom. Galaktozo-1-fosfat uridil transferaza vrši transfer galaktozo-6-fosfata na uridilnu grupu koja je poreklom iz UDP-glukoze, tako da nastaju UDP-galaktoza i glukozo-1-fosfat . Nakon toga se galaktoza epimerizuje u glukozu dok je u formi
UDP-galaktoze, uz katalizu UDP-galaktozo-4-epimerazom, čime se dobija UDP-glukoza. UDP-galaktozo4-epimeraza poseduje čvrsto vezan NAD+, i prilikom delovanja enzima dolazi do transfera H-atoma sa C4atoma UDP-galaktoza na koenzim čime se on redukuje. Ova reakcija je reverzibilna, i ovako nastali molekul glukoze se ne korsiti za glikolizu. Nastali glukozo-1-fosfat se izomerizuje u glukozo-6-fosfat, preko enzima fosfoglukomutaze i kao takav se uključuje u glikolizu. Na isti način se uključuje i Glu-1Fosfat dobijen u procesu fosforilize glikogena ili skroba pod delovanjem enzima fosforilaza.
46. Tipovi fermentacije: Nizovi reakcija glikolize su kod skoro svih ćelija, svih živih organizama identični. Međutim dalja sudbina piruvata se drastično razlikuje od fizioloških uslova organizama. Da bi se proces glikolize nastavio, mora
doći do regeneracije NAD+ iz redukovanog NADH. NADH se u prisustvu kiseonika reoksiduje u 38
mitohondrijama i to prebacivanjem svog redoks- potencijala na neki intermedijer koji može da prolazi kroz membranu mitohondrija. U anaerobnim uslovima NAD + se obnavlja redukcijom piruvata u dva procesa: homolaktičkoj ili mlečnokiselinsk oj i alkoholnoj fermentaciji .
Mlečnokiselinska fermentacija je proces redukcije piruvata od strane enzima laktat dehidrogenaze i dobijanja laktata. Zastupljena je kod mnogih mikroorganiza, naročito anerobima. Alkoholna fermentacija je proces koga čine dve sukcesivne reakcije, nakon kojih kao krajni produkt
nastaje etanol . Da bi neki organizam mogao da vrši ovu vrstu fermentacije potrebno je da ima enzim alkoholnu dehidrogenazu i nju poseduju kvasci i nekoliko vrsta drugih mikroorganizama.
U oba slučaja fermentacije dolazi do sinteze dva molekula ATP-a koja zahteva ukupnu energiju od ∆Go'=+61 kJ/mol, a to znači da razlika u energetskim vrednostima između procesa fermentaicje i biosinteze ATP-a oslobađa se u vidu toplote, što sam proces čini irreverzibilnim.
47. Alkoholna fermentacija: Alkoholna fermentacija je proces koga čine dve sukcesivne reakcije, nakon kojih kao krajni produkt
nastaje etanol . Da bi neki organizam mogao da v rši ovu vrstu fermentacije potrebno je da ima enzim alkoholnu dehidrogenazu i nju poseduju kvasci i nekoliko vrsta drugih mikroorganizama.
Prvi korak u predvođenju piruvata u etanol je dekarboksilacija piruvata, i taj proces katalizuje piruvat dekarboksilaza, koju životinje nemaju. Ovaj enzim poseduje TPP – tiamin pirofosfat kao koenzim, i on je čvrsto vezan za njega. C2-H deo tiazolnog prstena ima relativno kiseo karakter zbog blizine pozitivno naelektrisanog N1-atoma. On lako otpušta protone, i nastali ka rbanjon na C2-atomu je elektrostatički stabilizovan N1-atomom. Karbanjon tiazolnog prstena je aktivna forma koenzima TPP-a. Piruvat se vezuje za C 2-atom TPP-a i to nukleofilnim napadom karboanjona na karbonilni atom piruvata. Nakon vezivanja
iz karboksilne grupe piruvata se eliminiše CO2, ostavljajući hidroksietilni derivat piruvata vezan za tiazolni prsten TPP-a. Kompleks je rezonantno stabilizovan karboanjonski derivat u kome tiazolni prsten postaje
prijemčljiv za elektrone. U sledećem koraku reakcije se uključuje proton koji protonizuje karboanjon, i da bi se tiazolni prsten vratio u prvobitno stanje, hidroksietilni derivat napušta enzim u obliku acetilaldehida, kao posledica rearanžmana elektrona u ovom prstenu. Aminopiridinski prsten se konvertuje u svoju imino tautomernu formu, u reakciji koju katalizuje bočna grupa glutaminske kiseline, i kao takav on favorizuje formiranje C2-karbanjona. Nastali acetaldehid, alkoholna dehidrogenaza prepoznaje kao svoj supstrat i redukuje ga do etanola. Ona je tetramer i svaka subjedinica za sebe ima vezan NADH i Zn2+ jon koji je u koordinativnom
kompleksu sa bočnim grupama dva specifična cisteinska ostatka i bočnom grupom jednog histidinskog ostatka enzima. Zn 2+ polarizuje karbonilnu grupu acetaldehida i stabilizuje negativno naelektrisano
intermediejrno stanje. To omogućava prenos hidridnog jona sa A-strane prstena NADH na acetaldehid, pri čemu nastaje etanol. Sisari imaju alkoholnu dehidrogenazu u jetri, ali on a ima ulogu u metabolisanju etanola koji je anaerobno proizveden od intestinalne mikroflore. On je dimer sa vezanim NADH i dva jona Zn2+, mada samo jedan učestvuje u katalizi.
39
Ukupan bilans transformacije glukoze u etanol se može prikazati jednačinom: GLUKOZA + 2PI + 2 ADP + 2 H + ―→ 2 ETANOLA + 2 CO 2 + 2 ATP + 2 H 2O; ∆Go'=-235 kJ/mol NAD+ i NADH se ne pojavljuju u jednačini pošto se dobijeni NADH u procesu prevođenja Gla -3-P u 1,3bisfosfoglicerat koristi za redukciju acetaldehida u etanol, te nema ni doprinosa oksidoredukcione reakcije energetskom bilansu.
48. Mlečno-kiselinska fermentacija: Finalni produkt glikolize u mnogim mikroorganizmima, naročito anerobima, je laktat , koji nastaje redukcijom piruvata od strane enzima laktat dehidrogenaze u procesu mlečno kiselinske fermentacije . Laktat dehidrogenaza koristi redukovanu formu NADH dobijenu u procesu prevođenja gliceraldehid-3fasfata u 1,3-bisfosfoglicerat. Na taj način se reoksiduje i dobija se NAD +, koji se sada može ponovo koristiti u procesu glikolize. Ona je apsolutno stereospecifičan enzim jer na piruvat može preneti samo vodonikov atom vezan za C4-atom NADH koji je na A-strani nikotinamidskog prstena.
Proces mlečno kiselinske fermentacije se dešava i u ćelijama viših organizama, kada postoji pot reba za velikom količinom ATP-a, a koncentraicja kiseonika je opala – u mišićima nakon intenzivne fizičke aktivnosti... Laktat dehidrogenaza sisara se sastoji iz M- i H-subjedinice, i ona je aktivna jedino kao
tetramer koji može biti izgrađen od različite kombinacije ovih subjedinica – M4 , M3H, M2H 2 , MH 3 , H 4. Iako se sve ove forme mogu naći u tkivima sisara, H -subjedinice su predominantne u enzimima visoko aerobnih tkiva. M-subjedinice izgrađuju enzime funkcionalne u anaerobnim uslovima, to se može desiti u jetri ili skeletnim mišićima. Izozim H4 ima nizak Km za piruvat i alosterički je inhibiran visokim koncentracijama ovog metabolita. Suprotno njemu izozim M 4 ima visok Km za piruvat i ne podleže procesu regulacije piruvatom. Ostali izozimi imaju osobine koje variraju između ove dve uniformne varijante izozima LDH, što je posledica vrste i broja M- ili H-subjedinica. Iz toga je i zaključeno da je M4 subjedinica adaptirana da funkcioniše u anaerobiozi, a H4 je prilagođen na uslove aerobnih sredina. Hidridni jon A-strane NADH se prebacuje na C2-atom piruvata uz istovremeno prebacivanje protona sa
imidazolnog prstena specifičnog histidina. Reakcija je olakšana pravilnim pozicioniranjem piruvata usled formiranja jonske veze između njegove karboksilne i gvanido grupe specifičnog arginina. Laktat dehidrogenaza skeletnih mišića je jako slična alkoholnoj dehidrogenazi kvasca u domenu vezivanja NADA, ali se drastično razlikuju po nativnoj konformaciji. U svakom slučaju, oba enzima poseduju regione čiju strukturu čine četiri α-heliksa i šest paralelnih β-naboranih ploča za koje se vezuju nikotinamidni i adeninski deo NAD-a.
Ukupan bilans glukoze u laktat se može prikazati opštom formulom: GLUKOZA + 2PI + 2 ADP ―→ 2 LAKTATA + 2H+ + 2 ATP + 2 H 2O; ∆Go'=-196 kJ/mol
Bitno je napomenuti da se NAD+ i NADH ne pojavljuju u ovoj jednačini, pošto se kao što je već rečeno dobijeni NADH koristi za redukciju piruvata u laktat, te nema doprinosa oksido-redukcione reakcije u energetskom bilansu.
40
49. Aerobni katabolizam monosaharida: Katabolizam monosaharida u aerobnim uslovima započinje glikolizom. Glikoliza je sekvenca reakcija koje omogućavaju konverziju glukoze u piruvat , uz istovremenu biosintezu ATP -a. Ona se odigrava u citoplazmi i kod aerobnih organizama je prethodnica Ciklusa limunske kiseline , koji zajedno sa Respiratornim lancem, omogućava ekstrakciju najvećeg dela energije sadržane u glukozi, pri čemu se
glukoza degraduje do ugljen-dioksida i vode. Proces glikolize se može podeliti u dve faze:
Faza I – prevođenje monosaharida u glicer -aldehid-3-fosfat (GLA-3-P) uz korišćenje ATP -a za otpočinjanje reakcije
Faza II – konverzija GLA-3-P u piruvat, pri čemu dolazi do konzervacije energije u vidu ATP-a
Oksidativna dekarboksilacija piruvata je biohemijski proces koji povezuje katabolizam saharida sa
Ciklusom limunske kiseline. Veza se ostvaruje konverzijom glikolitičkog proizvoda - piruvata u acetil-SCoA (jedan od startnih molekula Ciklusa limunske kiseline). U aerobnim uslovima, NADH se reoksiduje na
respiratornom lancu u mitohondrijama, dok se piruvat oksidativno dekarboksiliše dajući acetil-S-CoA. Proces je katalizovan od strane multienzimskog kompleksa piruvat dehidrogenaze u ukupnoj reakciji: PIRUVAT + HS-CoA + NAD+ → ACETIL-S-CoA + NADH + H + + CO2 Ciklus limunske kiseline, ili ti Krebsov ciklus, se odigrava u mitohondrijama i omogućava oksidativnu degradaciju saharida, lipida i aminokiselina i u eukariotskim, i prokariotskim organizmima. Dobijaju se brojni produkti koji su prekursori za biosintezu osnovnih gradivnih blokova. Stoga je i Ciklus limunske
kiseline amfibolički put – u njemu se odvijaju i katabolički i anabolički procesi. Krebsov ciklus je serija biohemijskih reakci ja koje omogućavaju oksidaciju acetilne grupe acetil-S-CoA u dva molekula CO2, pri čemu se oslobađa energija koja se privremeno konzervira putem biosinteze ATP-a. U ciklusu učestvuje osam enzima, i oni katalizuju proces transfera acetil-S-CoA u ugljen-dioksid, uz nastanak tri molekula NADH, jedan FADH2, i jedan GTP. Redukovane forme NADH i FADH2 daju energiju za biosintezu ATP-a u respiratornom lancu u procesu njihove reoksidacije.
50. Katabolizam glikogena: U katabolizmu glikogena učestvuje enzim glikogen fosforilaza. Ona spada u fosforilitičke enzime – katalizuje proces fosforilize, dajići kao produkt glukozo-1-fosfat koji zadržava α-konfiguraciju C1-atoma. Glikogen fosforilaza uklanja glukozne jedinice dok ne dođe na udaljenost od četiri glukozne jedinice od mesta račvanja molekula, kada joj prestaje aktivnost. Slobodna energija ove reakcije je mala, jer se glikozidna veza zamenjuje fosfodiestarskom, koja ima sličan energetski potencijal. Glikogen fosforilaza sleketnih mišića je dimer koji se sastoji od dve subjedinice. Svaka subjedinica psoeduje dva domena – aminoterminalni domen i karboksiterminalni domen. U okviru aminoterminalnog regiona se nalazi
subdomen koji obrazuje kontaktne površine obe subjedinice u dimeru i u njemu se nalazi i specifični serinski ostatak koji je mesto kovalentne modifikacije enzima. U tom subdomenu je locirano i mesto vezivanja alosteričkih efektora. U drugom subdomenu aminoterminalnog regiona se nalazi deo za koji se
vezuje glikogenska partikula za enzim. Katalitičko mesto ovog enzima je locirano u dubokom udubljenju 41
koje grade amiterminalni i karboksiterminalni domen, i ono je dosta udaljeno od mesta vezivanja glikogena. To omogućava enzimu da izvrši veći broj sukcesivnih fosforilaza terminalnih C 4-glukoza, bez
ponovne reasocijacije sa supstratom. U udubljenju između mesta vezivanja i katalitičkog centra se može smestiti četiri do pet glukoznih ostataka, ali nema nesta za granati deo glikogena – to je i razlog zašto fosforilaza može da ukloni najdalje četiri glukozne jedinice od mesta grananja. Katalitički centar je zaštićen od kontakta sa vodom, što favorizuje fosforilizu u odnosu na hidrolizu. Za aktivnost glikogen fosforilaze je potreban koenzim piridoksal fosfat (PLP ), čija aldehidna grupa formira Schiffovu bazu sa bočnom grupom specifičnog lizina u polipeptidnom lancu enzima. On je lociran u aktivnom centru enzima tako da je njegova fosforna grupa veoma blizu ortofosfata, koji učestvuje u reakciji u okviru aktivnog mesta enzima. Ortofosfat koji učestvuje u fosforilizi se nalazi smešten između 5' -fosfatne grupe PLP-a i vezanog supstrata – glikogena. Fosfatna grupa PLP-a deluje u tandemu sa ortofosfatom, kao donor i akceptor protona (kiselinsko bazna kataliza). Ortofosfat je donor protona glikozidnoj vezi tako da kiseonikov atom ostaje vezan za C 1-atom dela glikogena koji napušta kompleks sa enzimom. Ostatak ortofosfata u enzimu istovremeno prihvata proton sa fosfatne grupe PLP-a. U tom koraku se formira intermedijer glukoze sa karbokatjonom, oksonijum jonom na C 1-atomu. Nastali oksonijum jon interaguje
sa ortofosfatom dajući glukozo -1-fosfat. Proces fosforilaze počinje sa neredukujućeg kraja glikogena i odvija se sekvencij alnim uklanjanjem jedne po jedne glukozne jedinice. Međutim, kao što je rečeno, fosforiliza se odvija sve do mesta račvanja glikogena – do α(1-6) glikozidne veze. Fosforilaza deluje na oba lanca molekula glikogena – i glavnu i bočnu granu; i uklanja sukcesivno na gornjem lancu šest, a na donjem lancu tri glukozne jedinice u obliku glukozo-1-fosfata. Tu aktivnost enzima prestaje, pošto su ostaci oba lanca udaljeni četiri glukozne jedinice od mesta račvanja. Tada deluje enzim α(1-4) transglikozidaza (transferaza), i ona prenosi glukozne ostatke na redukujući kraj donjeg lanca. Samo jedan glukozni ostatak ostaje kao jedina glukozna jedinica bočnog lanca vezana α(1-6) vezom za glavni lanac. Ona je supstrat za enzim α-1,6glukozidazu, koja hidrolizuje tu vezu daj ući slobodnu glukozu. Ostatak glikogena predstavlja linearni polimer, na koga opet deluje fosforilaza. α(1-4) transglikozidaza i α-1,6-glukozidaza nisu dva zasebna enzima – oni su deo jednog polipeptidnog lanca. Takvi bifunkcionalni enzimi se nazivaju tandem enzimi .
Energetski gledano, fosforiliza glikogena je prednost za ćeliju, jer se fosforilisana glukoza može uključiti u glikolizu tako da ne troši ATP. Glukozo-1-fosfat je supstrat za fosfoglukomutazu, koja ga prevodi u glukozo-6-fosfat, početni molekul glikolize. Aktivno mesto ovog enzima formira formira specifični serin, čija je bočna grupa fosforilisana. Mehanizam reakcije se najverovatnije dešava tako što se fosforna grupa sa enzima prebacuje na glukozo-1-fosfat, pre čemu nastaje intermedijer glukozo-1,6-bifosfat, koji je i dalje vezan za enzim. U sledećem koraku fosfatna grupa vezana za C 1-atom se prebacuje na bočnu grupu serina u aktivnom mestu, čime se oslobađa glukozo -6-fosfat i enzim vraća na početno fosforilisano stanje. Povremeno se dešava d a glukozo-1,6-bifosfat disosuje sa fosfoglukomutaze što rezlutira u inaktivaciji enzima, stoga u ćeliji uvek postoji minimalna koncentracija glukozo -1,6-bifosfata kako bi se obezbedila stalna aktivnost enzima. To se postiže aktivnošću fosfoglukokinaze, koja katalizuje fosforilaciju primarne alkoholne grupe glukozo-1-fosfata uz utrošak ATP-a dajući glukozo-1,6-bifosfat.
51. Put pentozo fosfata: 42
ATP je glavni izvor energije svih živih sistema, tako da se energija glukoze putevim glikolize, Ciklusa
limunske kiseline i oksidativne fosforilacije deponuje u vidu ATP-a. Ipak živi sistemi mogu koristiti i redukcioni potencijal glukoze u obliku redukovanog molekula NADPH koji se može direktno koristiti u procesima biostinteze. Iako je NADP+, hemijski veoma sličan NAD+, oni se ne mogu zamenjivati jedan
drugim u metaboličkim procesima. NAD+ učestvuje u iskorišćavanju slobodne energije egzergonih procesa pri oksidaciji metabolita za biosintezu ATP-a; NADP+ je akceptor slobodne energije oksidacije metabolita i njen prenosilac na endergone reduktivne reakcije biosinteze. Put pentozo-fosfata nije put za dobijanje energije iz glukoze i odgirava se u citoplazmi ćelija. On predstavlja kombinaciju oksidativnih reakcija (Faza I ) i inkonverzije saharida sa tri, četiri, pet, šest i sedam C-atoma u seriji neoksidativnih rekacija (Faza II ) . Oskidativni deo puta čine irreverzibilne reakcije i taj deo je odgovoran za biosintezu NADPH, dok su reakcije interkonverzije saharida reverzibilne. Glavne uloge puta pentozofosfata su:
Generisanje NADPH oksidacijom glukozo-6-fosfata i dobijanje ribulozo-5-fosfata; značajno za
ćelije jetre, mlečnih žlezda, adipoznog tkiva... – ćelije koje aktivno sintetišu masne kiseline ili steroide
Omogućavanje konverzije heksoza u pentoze , čiji su derivati konstituenti biološki važnih molekula (ATP, HS-CoA, NAD+, FAD, RNK i DNK)
Omogućavanje konverzije pentoza u heksoze (bitno za npr. uključivanje pentoza u glikolizu)
Glukozo-6-fosfat-dehidrogenaza katalizuje oksidaciju glukozo-6-fosfata na C1-atomu, dajući 6 fosfoglukonolakton. Tom reakcijom počinje Put pentozo fosfata. Ovaj enzim ima visoku specifičnost za
NADP +, a inhibiran je NADPH-om. Nakon toga dolazi do hidrolize 6-fosfoglukonolaktona u 6 fosfoglukonat , i to katalizuje enzim 6-fosfoglukonolaktonoza. Ovaj enzim samo ubrzava hidrolizu, pošto
se i neenzimska reakcija otvaranja laktona dešava prilično brzo. Fosfoglukonat dehidrogenaza je odgovorna za oksidaciju 6-fosfoglukonata do ribulozo-5-fosfata. Reakcija se odvija preko β-ketoacilnog
intermedijera, koji spontano dekarboksiliše u Ru-5-P. Akceptor elektrona je NADP +, koji se redukuje do NADPH + H+. Formiranjem ribulozo-5-fosfata se završava prva faza puta pentozo fosfata, u kojem se sintetišu dva molekula NADPH po jednom molekulu glukozo-6-fosfata. Nastali Ru-5-P se mora prevesti u ribozo-5-fosfat ili ksilulozo-5-fosfat radi daljeg odvijanja reakcije. Prelazak ribulozo-5-fosfata u ribozo-5-fosfat katalizuje ribulozo-5-fosfat izomeraza; dok prelazak u ribulozo-5-fosfata u ksilulozo-5-fosfat katalizuje ribulozo-5-fosfat epimeraza. Obe konverzije se odigravaju preko enoldiolskih intermedijera i predstavljaju dalju osnovu za dalju konverziju saharida. Enzimi transketolaza i transaldolaza katalizuju procese postepene interkonverzije saharida od C3- do C7-
atoma, prevodeći tri polazne pentoze u dve heksoze i jednu triozu. Transketolaza učestvuje u dve reakcije, a transaldolaza u jednoj. Transketolaza katalizuje prenos glikoaldehidne grupe (C-jedinica), gde je donor te grupe ketoza (ksilulozo-5-fosfat ), a akceptor aldoza (ribozo-5-fosfat ). Ona poseduje tiaminpirofosfat (TPP ) kao koenzim, koji je prenosilac glikoaldehidne grupe. Delovanjem transketolaze
se dobija sedoheptulozo-7-fosfat (SP7 ) i enzim se oslobađa u neizmenjenom stanju. Isti redosled reakcije
43
je i pri delovanju transketolaze u konverziji ksilulozo-5-fosfata i eritrozo-4-fosfata (E4P ) u fruktozo-6 fosfat i gliceraldehid-3-fosfat ; sa tim da je donor glikoaldehidne grupe Xu-5-P, a akceptor E4P.
Transaldolaza katalizuje prenos dihidroksiacetonske grupe (C3-jedinica), gde je donor te grupe ketoza (S7P ), a akceptor aldoza ( GLA-3-P ). Ona ne poseduje koenzim kao i transketolaza , već u svom aktivnom
centru ima lizin, čija NH-grupa učestvuje u katalizovanju reakcije formiranjem Schiffove baze sa ketozom. Na kraju reakcije se oslobađa fruktozo-6-fosfat i gliceraldehid-3-fosfat , a enzim izlazi iz reakcije nepromenjen.
Ukupan rezultat ovih transformacija je način povezivanja puta pentozo fosfata i glikolize, odnosno način na koji se pentoze uključuju u glikolizu . 2 Xu-5-P + R-5-P ↔ 2 Fru-6-P + GLA-3-P U zavisnosti od podtrebe organizma za produktima Puta pentozo fosfata (NADPH i R5P), regulacije
tokova reakcija se mogu odvijati na više načina: 1. Put 1: Živom sistemu je potrebno više ribozo -5-fosfata nego NADPH – većina glukozo-6-fosfata se prevodi u fruktozo-6-fosfat i gliceraldehid-3-fosfat u procesu g likolize, nakon čega transketolaza i transaldolaza konvertuju dva molekula fruktozo-6-fosfata i jedan molekul gliceraldehid-3-fosfata u tri molekula ribozo-5-fosfata reverznim redosledom reakcija Puta pentozo fosfata 5 GLU-6-P + ATP → 6 R5P + ADP + H+ 2. Put 2: Živom sistemu je potreban izbalansiran nivo NADPH i R5P (2:1) – predominantna reakcija je formiranje dva NADPH i jedan molekul R5P i to oksidacijom glukozo-6-fosfata u početnim reakcijama Puta pentozo fosfata GLU-6-P + 2 NADP+ + H2O → R5P + 2 NADPH + 2H+ + CO2 3. Put 3: Živom sistemu je potrebno mnogo više NADPH nego R5P – aktiviraju se tri grupe reakcija;
prva otpočinje oksidativnim delom puta pentozo fosfata; druga reakcija je prevođenje nastalog R5P u fruktozo-6-fosfat i gliceraldehid-3-fosfat u transketolaznim i transaldolaznim reakcijama; na kraju se glukozo-6-fosfat resintetiše od nastalih fruktozo -6-fosfata i gliceraldehid-3-fosfata u procesu glukonoegenze 6 GLU-6-P + 12 NADP+ + 6 H2O → 6 R5P + 12 NADPH + 12 H+ + 6 CO2
R5P → 4 FRU-6-P + 2 GLA-3-P 4 FRU-6-P + 2 GLA-3P → 5 GLU-6-P + PI GLU-6-P + 12 NADP+ + 7 H2O → 5 GLU-6-P + 12 NADPH + 12 H+ + 6 CO2 + PI GLU-6-P + 12 NADP+ + 7 H2O → 12 NADPH + 12 H+ + 6 CO2 + PI 4
52. Mehanizam delovanja laktat dehidrogenaze: Laktat dehidrogenaza sisara se sastoji iz M- i H-subjedinice, i ona je aktivna jedino kao tetramer koji
može biti izgrađen od različite kombinacije ovih subjedinica – M4 , M 3H, M 2H 2 , MH 3 , H 4. Iako se sve ove forme mogu naći u tkivima sisara, H-subjedinice su predominantne u enzimima visoko aerobnih tkiva. M-
44
subjedinice izgrađuju enzime funkcionalne u anaerobnim uslovima, to se može desiti u jetri ili skeletnim mišićima. Izozim H4 ima nizak Km za piruvat i alosterički je inhibiran visokim koncentracijama ovog metabolita. Suprotno njemu izozim M 4 ima visok Km za piruvat i ne podleže procesu regulacije piruvatom. Ostali izozimi imaju osobine koje variraju između ove dve uniformne varijante izozima LDH, što je posledica vrste i broja M- ili H-subjedinica. Iz toga je i zaključeno da je M4 subjedinica adaptirana da funkcioniše u anaerobiozi, a H4 je prilagođen na uslove aerobnih sredina. Hidridni jon A-strane NADH se prebacuje na C2-atom piruvata uz istovremeno prebacivanje protona sa
imidazolnog prstena specifičnog histidina. Reakcija je olakšana pravilnim pozicioniranjem piruvata usled formiranja jonske veze između njegove karboksilne i gvanido grupe specifičnog arginina. Laktat dehidrogenaza skeletnih mišića je jako slična alkoholnoj dehidrogenazi kvasca u domenu vezivanja NADA, ali se drastično razlikuju po nativnoj konformaciji. U svakom slučaju, oba enzima poseduju regione čiju strukturu čine četiri α-heliksa i šest paralelnih β-naboranih ploča za koje se vezuju nikotinamidni i adeninski deo NAD-a.
53. Oksidativna dekarboksilacija piruvata: Oksidativna dekarboksilacija piruvata je biohemijski proces koji povezuje katabolizam saharida sa
Ciklusom limunske kiseline. Veza se ostvaruje konverzijom glikolitičkog proizvoda piruvata u acetil-SCoA koji je jedan od startnih molekula Ciklusa limunske kiseline. U anaerobnim uslovima reoksidacija
NADH se vrši prevođenjem piruvata u laktate ili etanol. Međutim u aerobnim uslovima, NADH se reoksiduje na respiratornom lancu i mitohondrijama, dok se piruvat oksidativno dekarboksiliše dajući acetil-S-CoA. Proces je katalizovan od strane multienzimskog kompleksa piruvat dehidrogenaze u ukupnoj reakciji: PIRUVAT + HS-CoA + NAD+ → ACETIL-S-CoA + NADH + H + + CO2 Multienzimski kompleski predstavljaju grupe nekovalentno vezanih enzima koji katalizuju dve ili više uzastopnih reakcija u istom biohemijskom putu. Piruvat dehidrogenaza je kompleks tri enzima – piruvat dehidrogenaza (Subjedinica E 1); dihidrolipoil trasacetilaza (Subjedinica E 2) i dihirolipoil dehidrogenaza
(Subjedinica E 3). Pored ovog kompleksa u reakciji dekarboksilacije piruvata učestvuju i koenzimi – tiaminpirofosfat (TPP ), liponska kiselina (vezana za počnu grupu lizina dihidrolipoil transacetilaze), HSCoA, FAD i NAD+.
Jezgro kompleksa piruvat dehidrogenaze predstavljaju polipeptidi dihidrolipoil transacetilaze, dok se dehidrogenazni i dihidrolipoil dehidrogenazni polipeptidi nalaze na površini kompleksa. Svi ostali
konstituenti su međusobno povezani nekovalentnim vezama. Kod eukariota ovaj kompleks je smešten u mitohondrijama, i sastoji se iz 30 αβ tetramera subjedinice E 1; 6 dimera subjedinice E3 i 60 monomera subjedinice E2 koji grade jezgro. Ovakva organizacija enzimske aktivnosti ima određene prednosti:
Enzimska reakcija je limitirana frekvencom susreta enzima sa svojim supstratom i kada se serija
reakcija ovdija u multienzimskom kompleksu distanca između aktivnog mesta enzima i supstrata, koji je proizvod prethodne reakcije se drastično smanjuje
45
Enzimski kompleks daje mogućnost da se metabolički intermedijeri kanališu po redosledu reakcije
od jednog enzima ka drugom , čime se smanjuje mogućnost bočnih reakcija
Reakcije katalizovane multienzimskim kompleksom mogu biti koordinativno kontrolisane
Kompleks piruvat dehidrogenaze prevodi piruvat u acetil-S-CoA katalizom pet sukcesivnih reakcija. Prvu reakciju katalizuje subjedinica E 1, koja kao koenzim zahteva TPP , pri čemu dolazi do dekarboksilacije piruvata i formiranja hidroksietil-TPP karboanjonskog intermedijera, koji se kanališe do
sledećeg enzima – dihidrolipoil transacetilaze u subjedinici E 2. Subjedinica E1 takođe katalizuje i prenos hidroksietil ostataka u vidu acetilnog ostatka na lipoamidni ostatak dihidrolipoil transacetilaze na subjedinici E 2. Prenos se odigrava napadom karboanjona hidroksietilne grupe vezane za TPP na di sulfidni
most lipoamidne grupe, čime se dobija dihidrolipoamid-E 2, intermedijer bogat energijom. Formiranjem tog intermedijera TPP-E 1 kompleks se vraća u početno stanje. Znači došlo je do oksidacije hi droksietil karbanjona do acetilne grupe uz istovremenu reoksidaciju disulfidnog mosta lipoamida. Dihidrolipoil transacetilaza katalizuje prenos acetilne grupe sa acetildihidrolipoamid-E2 na HS-CoA, tako da se energijom bogata tioestarska veza sada formira u acetil-S-Coa, dok se dihidrolipoamid-E2 oslobađa. Ovaj proces gde sulfhidrilna grupa HS-CoA vrši napad na acetilnu grupu acetildihidrolipoamid-E2, rezultirajući prenosom acetilne grupe se naziva transesterifikacija. Dihidrolipoil dehidrogenaza sa subjedinice E 3
reoksidiše dihidrolipoamid-E2 u lipoamid-E2, vraćajući ga u početno stanje. Dihidrolipoil dehidrogenaza ima čvrsto vezanu oksidovanu reaktivnu disulfidnu grupu, kao i FAD. Oksidacija dihidrolipoamida-E2 u lipoamid-E2 je reakcija disulfidne izmene, pri čemu se reaktivna disulfidna grupa u E 3 redukuje – prevodi u dve sulfhidrilne grupe. One se reoksidišu pomoću FAD-a vezanog za enzim, koji se pri tome redukuje do FADH2, a on će se reoksidovati pomoću poslednjeg koenzima kompleksa – NAD+ (pri čemu se dobija NADH + H+). Dihidrolipoil transacetilaza, kao što je već rečeno, formira jezgro ovog kompleksa i nalazi se između
komponenti druga dva enzima i ta struktura je veoma značajna za efikasnost kompleksa piruvat dekarboksilaze. Zahvaljujući lipolizinskom ostatku dihidrolipoil transacetilaze, je omogućena laka interakcija ove komponente sa TPP-om piruvat dehidrogenaze sa jedne strane, i FAD-om dihidrolipoil transhidrogenaze sa druge strane. To daje osnovu za katalisanje enzimske reakcije i efikasan prenos
vezanog acetilnog ostatka modifikovanog piruvata katalitičkog mesta subjedinice E1 na HS-CoA, kao i redukovanog dihidrolipoamida-E2 na katalitičko mesto subjedinice E3. Takođe postojanje velikog broja polipeptidnih lanaca koji grade ovu subjedinicu, omogućava brzu izmenu acetilne grupe između lipolizinskih ostataka, i time obezbeđuje brz prenos ovih grupa. Formiranje acetil-S-CoA je kod sisara ključni ireverzibilni korak u njihovom metabolizmu, jer oni nisu u stanju da koriste acetil-S-CoA za biosintezu glukoze. Oksidativna dekarboksilacija piruvata u acetil-S-CoA
određuje dve moguće sudbine ugljenikovog atoma poreklom iz glukoze – on se može oksidovati do ugljen-dioksida u Ciklusu limunske kiseline uz stvaranje ATP- a; ili se može inkorporisati u lipid e. Zato je aktivnost kompleksa piruvat dekarboksilaze kontrolisana na tri načina: 1. Inhibicija aktivnosti produktima reakcija - acetil-S-CoA i NADH inhibiraju enzimski kompleks jer kompetitiraju sa HS-CoA i NAD + za mesta vezivanja na enzimima; acetil-S-CoA inhibira 46
dihidrolipoil transacetilaznu komponentu kompleksa (E2); dok NADH inhibira dihidrolipoil dehidrogenaznu komponentu kompleksa (E 3); velike koncentracije acetil-S-CoA i NADH održavaju dihidrolipoil acetilazu u acetiliranom stanju, onemogućavajući prihvatanje nove hidroksietil grupe sa TPP-piruvata, što snižava brzinu dekarboksilacije 2. Regulacija povratnom spregom pomoću nukleotida – kompleks piruvat dehidrogenaze je
inhibiran povoljnim energetskim stanjem živog sistema – velika količina ATP-a, a aktiviran visokom koncentracijom ADP-a ili ti nepovoljnim energetskim stanjem živog sistema 3. Regulacija reverzibilnom fosforilacijom – ovaj tip kontrole postoji samo kod eukariota; kod njih kompleks enzima poseduje i kinazu i fosfatazu piruvat dehidrogenaze, koji su vezani za dihidrolipoil transacetilazno jezgro kompleksa; kinaza inaktivira subjedinicu E1 fosforilišući
specifični serinski ostatak u polišeštidnom lancu enzima i koristeći ATP kao izvor fosforne grupe; fosforilaciju stimulišu visoke koncentracije ATP-a, acetil-S-CoA i NADH; suprotno tome defosforilacija serinskog ostatka fosfatazom, reaktivira kompleks; defosforilacija je povećana visokim nivoom jona Ca2+, i hormonom insulinom
54. Mehanizam delovanja piruvat dekarboksilaze: Alkoholna fermentacija je proces koga čine dve sukcesivne reakcije, nakon kojih kao krajni produkt
nastaje etanol . Da bi neki organizam mogao da vrši ovu vrstu fermentacije potrebno je da ima enzim alkoholnu dehidrogenazu i nju poseduju kvasci i nekoliko vrsta drugih mikroorganizama.
Prvi korak u predvođenju piruvata u etanol je dekarboksilacija piruvata, i taj proces katalizuje piruvat dekarboksilaza, koju životinje nemaju. Ovaj enzim poseduje TPP – tiamin pirofosfat kao koenzim, i on je čvrsto vezan za njega. C2-H deo tiazolnog prstena ima relativno kiseo karakter zbog blizine pozitivno naelektrisanog N1-atoma. On lako otpušta protone, i nastali karbanjon na C2-atomu je elektrostatički stabilizovan N1-atomom. Karbanjon tiazolnog prstena je aktivna forma koenzima TPP-a. Piruvat se vezuje za C 2-atom TPP-a i to nukleofilnim napadom karboanjona na karbonilni atom piruvata. Nakon vezivanja
iz karboksilne grupe piruvata se eliminiše CO2, ostavljajući hidroksietilni derivat piruvata vezan za tiazolni prsten TPP-a. Kompleks je rezonantno stabilizovan karboanjonski derivat u kome tiazolni prsten postaje
prijemčljiv za elektrone. U sledećem koraku reakcije se uključuje proton koji protonizuje karboanjon, i da bi se tiazolni prsten vratio u prvobitno stanje, hidroksietilni derivat napušta enzim u obliku acetilaldehida, kao posledica rearanžmana elektrona u ovom prstenu. Aminopiridinski prsten se konvertuje u svoju imino tautomernu formu, u reakciji koju katalizuje bočna grupa glutaminske kiseline, i kao takav on favorizuje formiranje C2-karbanjona.
55. Katabolizam lipida: Triacilgliceroli su glavni energetski molekuli za metabolizam viših biljaka i životinja, jer su izvor masnih
kiselina, koje oksidacijom oslobađaju enegiju. Kod sisara oni se akumuliraju u citoplazmi adipoznih ćelija koje su specijalizovane za njihovu sintezu i deponovanje, i kao takve grade adipozna tkiva. Oni su
redukovana i anhidridovana jedinjenja, i zbog hidrofobnosti masnih kiselina praktično nemaju vodu vezanu za sebe – zato im je i energetski sadržaj dosta veći.
47
U organizam se triacilgliceroli unose ishranom i u intestinalnoj mukozi se organizuju u hilomikrone koji se
oslobađaju u krvotok i prenose do ostalih tkiva, koji će ih koristiti kao izvor energije. U jetri se oni pakuju u lipoproteine veoma niske gustine koji se direktno oslobađaju u krvotok. Na oba načina s e triacilgliceroli održavaju rastvornim u vodenoj sredini krvi. Triacilglicerolne komponente hilomikrona i VLDL se hidrolizuju do slobodnih masnih kiselina i glicerola u kapilarima adpiozn og tkiva i skeletnim mišićima, pod katalizom lipoprotein lipaze. Mobilizacija triacilglicerola iz adipoznoh ćelija se ostvaruje njihovom hidrolizom na glicerol i masne kiseline uz katalizu enzima triacilglicerol lipaze. Oslobođene masne kiseline se prebacuju u krvotok, vezuju se za serum-albumine i krvotok se prenose do ostalih ćelija organizma. Glicerol se transportuje
nazad u jetru ili bubrege gde se fosforiliše pomoću enzima glicerol kinaze, pri čemu se dobija glicerolfosfat, koji se preko enzima glicerolfosfat dehidrogenaze prevodi u dihidroksiaceton fosfat , koji
se ukl jučuje u glikolizu.
Oksidacija masnih kiselina se odvija u matriksu mitohondrija svih tkiva kičmenjaka, osim u mozgu, i to sekvencijalnim odvajanjem C2- jedinica počevši od COOH-terminusa masne kiseline i to kada je u formi acil-S-CoA. Proces oksdacije se odigrava na C3- ili ti Cβ-atomu masne kiseline – zato je i proces označen kao β-oksidacija masnih kiselina.
56. Metabolička uloga acetil CoA: Acetil koenzim A (acetil-S-CoA) je važan molekul ćelijskog metabolizma. On se koristi u velikom broju
biohemijskih reakcija. Njegova glavna funkcija je prenos atoma ugljenika acetil-grupe do Krebsovog
ciklusa da bi se oksidovali u procesu oslobađanja energije. Po hemijskoj strukturi, acetil -CoA je tioestar između koenzima A (tiola) i sirćetne kiseline (nosioca acilne grupe). Acetil-CoA se formira tokom aerobne ćelijske respiracije, u toku piruvatne dekarboksilacije, koja se odvija u matriksu mitohondrije – i to konverzijom glikolitičkog proizvoda piruvata u acetil-S-CoA, uz ulazak koenzima A u reakciju i redukciju NAD +. U aerobnim uslovima, NADH će se reoksidovati na respiratornom lancu i mitohondrijama. Acetil-CoA zatim ulazi u Cklus limunske kiseline. Znači njegova osnovna uloga jeste povezivanje procesa glikolize i Krebsovog ciklusa. Krebsov ciklus je serija
biohemijskih reakcija koje omogućavaju oksidaciju acetilne grupe acetil-S-CoA u dva molekula CO2, pri čemu se oslobađa energija koja se privremeno konzervira putem biosinteze ATP -a, uz nastanak tri molekula NADH , jedan FADH2, i jedan GTP . Acetil-CoA se sintetiše i β-oksidacijom masnih kiselina, katabolizmom aminokiselina (sve aminokiseline se katabolišu do nekog intermedijera Ciklusa limunske kiseline – ketogene aminokiseline , leucin, lizin, daju acetil-S-CoA). Sinteza masnih kiselina je metabolički put koji generiše lance masnih kiselina počevši od acetil-S-CoA kao
osnovnog supstrata. Taj se proces aktivira u slučaju prevelike proizvodnje acetil-S-CoA kao posledica povećanog unosa ugljenih hidrata. Višak proizvedenog acetil-S-CoA biva preusmeren prema sintezi masnih kiselina, u procesu katalizovanom nizom enzima od kojih su najvažniji acetil CoA karboksilaza i sintetaza masnih kiselina.
48
Acetil-CoA isto tako učestvuje u biogenoj sintezi neurotransmitera acetilholina. Holin, u kombinaciji sa acetil-CoA, posredstvom enzima holin acetiltransferaza, formira acetilholin i koenzim A nusproizvod.
57. Ciklus limunske kiseline (Krebsov ciklus): Ciklus limunske kiseline, ili ti Krebsov ciklus, se odigrava u mitohondrijama i omogućava oksidativnu
degradaciju saharida, lipida i aminokiselina i u eukariotskim, i prokariotskim organizmima. Dobijaju se brojni produkti koji su prekursori za biosintezu osnovnih gradivnih blokova. Stoga je i Ciklus limunske kiseline amfibolički put – u njemu se odvijaju i katabolički i anabolički procesi.
Krebsov ciklus je serija biohemijskih reakcija koje omogućavaju oksidaciju acetilne grupe acetil-S-CoA u dva molekula CO2, pri čemu se oslobađa energija koja se privremeno konzervira putem biosinteze A TP-a. U ciklusu učestvuje osam enzima, i oni katalizuju proces transfera acetil-S-CoA u ugljen-dioksid, uz nastanak tri molekula NADH , jedan FADH2, i jedan GTP . Redukovane forme NADH i FADH2 daju energiju za biosintezu ATP-a u respiratornom lancu u procesu njihove reoksidacije. Reakcije Ciklusa limunske
kiseline se dešavaju sledećim redosledom: 1. Citrat sintaza omogućava otpočinjanje ciklusa i to katalizom aldolne kondenzacije acetil-S-CoA i oksalacetata, pri čemu nastaje citrat 2. Akonitaza katalizuje konverziju citrata u izocitrat – on se prvo dehidratiše, pri čemu nastaje cisakonitat ; nakon čega se sukcesivno hidratiše dajući izocitrat
3. Izocitrat dehidrogenaza ok siduje sekundarnu alkoholnu grupu izocitrata u β-keto intermedijer – oksalsukcinat ; tad dolazi do redukcije NAD+; oskalsukcinat spontano dekarboksiliše dajući αketoglutarat ; znači u ovom koraku se generiše NADH, i oslobađa se prvi molekul CO 2
4. Multienzimski
kompleks
α-ketoglutarat dehidrogenaze
oksidativno
dekarboksiliše
α-
ketoglutarat, dajući sukcinil-S-CoA; dolazi i do redukcije drugog molekula NAD + , i oslobađanje drugog molekula CO 2 5. Sukcinil-S-CoA sintetaza katalizuje prevođenje sukcinil-S-CoA u sukcinat ; slobodna energija dobijena iz tioestarske veze se koristi za biosintezu GTP-a od GDP-a (kod sisara), ili ATP-a od ADPa (kod bakterija) 6. Sukcinat dehidrogenaza prevodi sukcinat u fumarat , pri čemu se redukuje FAD u FADH2 7. Fumaraza katalizuje hidrataciju fumarata, čime se dobija malat 8. Malat dehidrogenaza formira oksalacetat , katalizom oksidacije sekundarne alkoholne grupe malata, uz redukciju trećeg molekula NAD +
Ukupna jednačina hemijske reakcije prelaska acetil-S-CoA u CO2 izgleda ovako: ACETIL-S-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + PI + 2 H2O → 2 CO2 + 3 NADH + 3 H + + FADH2 + GTP + HS-CoA
Enzim citrat sintaza katalizuje mešanu aldolnu kondenzaciju i Claisenovu kondenzaciju estara acetil-SCoA i oksalacetata . Citrat sintaza funkcioniše po principu kiselinsko-bazne katalize, uz formiranje enolne forme acetil-S-CoA. Ovo je početna reakcija Krebsovog ciklusa i jedino mesto ulaza novih C-atoma u vidu 49
acetilnih ostataka. Sa enzima se nakon završene reakcije prvo oslobađa HS-CoA, pa onda i citrat . Nakon
oslobađanja citrata, citrat sintaza se vraća u prvobitnu otvorenu formu. Enzim akonitaza katalizuje reverzibilnu izomerizaciju citrata u izocitrat , uz cis-akonitat kao intermedijer. Akonitaza poseduje kovalentno vezan gvožđe-sumporni protein, neophodan za katalitičku aktivnost enzima. Fe2+ stupa u koordinativnu interakciju sa OH- grupom citrata i tako omogućava njeno uklanjanje, što dovodi do formiranja dvogube veze u cis-akonitatu. Nakon toga, akonitaza katalizuje stereospecifičnu adiciju vode in trans na dvogubu vezu cis-akonitata, čime se dobija izocitrat . Izocitrat dehidrogenaza katalizuje oksidaciju izocitrata do intermedijera oksalsukcinata, koji se sponatano dekarboksiliše u α-ketoglutarat .
Ćelije sisara poseduju dve forme izocitrat dehidrogenaze – aktivnost jedne forme je zavisna od NAD+, dok aktivnost druge zavisi od prisutnosti NADP +. NAD+-zavisna izocitrat dehidrogenaza zahteva i jon Mn2+ ili Mg2+, i ona katalizuje oksidaciju sekundarnog alkohola – izocitrata, u keton – oksalsukcinat, pri
čemu se redukuje NAD+ do NADH + H +. Nakon toga, β-karboksilna grupa oksalsukcinata postaje akceptor elektrona i oslobađa se u vidu ugljendioksida, dok se α-ketoglutarat odvaja od enzima. Multienzimski kompleks α-ketoglutarat dehidrogenaze katalizuje oskidativnu dekarboksilaciju α-ketoglutarata dajući kao proizvod sukcinil-S-CoA. I ovoj reakciji dolazi do redukovanja NAD+ i oslobađanja ugljendioksida. Kompleks se sastoji od α-ketoglutarat dehidrogenaze (subjedinica E1), dihidrolipoil transsukcinilaze (subjedinica E2) i dihidrolipoil dehidrogenaze (subjedinica E3), a reakcija se dešava na isti način kao i dekarboksilacija piruvata. Sukcinil-S-CoA sintetaza katalizuje prevođenje sukcinil-S-CoA u sukcinat , uz biosintezu nukleozid-tri-fosfata. Kod sisara se sintetiše GTP iz GDP-a i fosforne grupe, a kod bakterija i biljaka ATP iz ADP-a i fosforne grupe. Taj proces se naziva fosforilacija na nivou supstrata, i te dve reakcije su katalizovane nukleozid difosfat kinazom, i ekvivalentne su – promena slobodne energije je jednaka nuli. Sukcinat dehidrogenaza katalizuje stereospceifičnu dehidrogenizaciju sukcinata u fumarat .
Ona je alosterički enzim, izgrađen od velike i male subjedinice. Za veliku je kovalentno vezan FAD. Reoksidacija ovog FAD-a se vrši direktno na respiratornom lancu, jer je sukcinat dehidrogenaza locirana na spoljnoj strani unutrašnje membrane mitohondrija. Stereospecifičnost sukcinat dehidrogenaze se ogleda u uklanjanju dva atoma vodonika iz sukcinata u trans- položaju, pri čemu nastaje fumarat. Ovaj enzim je jako inhibiran malonatom, strukturnim analogom sukcinata – kooperativna inhibicija. Fumaraza katalizuje prevođenje fumarata u L-malat . Ona je izgrađena od četiri subjedinice i aktivna je jedino kao tetramer. Ne zahteva koenzim za svoju aktivnost, a ATP smanjuje afinitet fumaraze za
fumarat. Prevođenje u malat se vrši preko karbanjonskog intermedijera – prvo se uvodi OH- jon. Malat dehidrogenaza katalizuje finalnu reakciju Ciklusa limunske kiseline – regeneraciju oksalacetata iz malata. Uz prisustvo NAD+, dolazi do oksidacije alkoholne grupe malata, pri čemu se on redukuje dajući NADH + H+, i oksalacetat . Malat dehidrogenaza je stereospecifičan enzim – prepoznaje samo L-formu malata i A stranu piridinskog prstena NAD+-a.
58. Energetski bilans ciklusa limunske kiseline: U toku jednog punog ciklusa – od oksalacetata do oksalacetata; oslobađaju se dva C-atoma u vidu
ugljendioksida, po svakoj acetilnoj grupi koja uđe u ciklus. Dva atoma koja napušta ju ciklus nisu ona koja su u njega ušli. Takođe se i oslobađaju četiri H -atoma koja redukuju tri NAD + i FAD. Ovi H-atomi se dalje prenose putem respiratornog lanca na molekularni kiseonik, pri čemu se kao finalni proizvod dobija
50
voda. U ovom procesu se oslobađa energija koja se skladišti u obliku ATP -a. U ciklusu se koriste i dva molekula vode – jedan za sintezu citrata i jedan za hidrataciju fumarata. Energetski bilans Ciklusa limunske kiseline je sinteza 11 molekula ATP-a – devet u toku reoksidacije nastala tri NADH, i dva u toku reoksidacije FADH, u respiratornom lancu. Jedan GTP se dobija u procesu fosforilacije na nivou supstrata.
59. Regulacija ciklusa limunske kiseline: Brzina Krebsovog ciklusa je veoma precizno kontr olisana da bi se zadovoljile potrebe živog sistema za ATP-om. Visoke koncentracije NAD + i FAD u živom sistemu signaliziraju da je energetsko stanje veoma
loše – nema redukcionog potencijala koji može obezbediti sintezu ATP -a. Kontrola brzine ovog ciklusa se odvija na tri ključna mesta: 1. Sinteza citrata od oksalacetata i acetil-S-CoA – ATP je inhibitor citrat sintaze – on povećava njen
afinitet prema acetil-S-CoA, tako da kako njegov nivo raste, manje je citrat sintaze saturisano sa acetil-S-CoA i kao posledica toga se citrat manje sintetiše; ovaj enzim je inhibiran i visokim koncentracijama sukcinil-S-CoA ili NADH , kao i citrata 2. Konverzija izocitrata u α -ketoglutarat – izocitrat dehidrogenaza je alosterički stimulisana ADP -
om, koji povećava njen afinitet prema supstratu; njena aktivnost se stimuliše i prisustvom Ca2+ jona; NADH i ATP su inhibitori ovog enzima; kod bakterija se regulacija ovog enzima vrši putem fosforilacije alosteričkih mesta - bočne grupe specifičnog serina (inaktivacija enzima) i defosforilacijom iste bočne grupe (stimulacija enzima) 3. Konverzija α-ketoglutarata u sukcinil-S-CoA – povećavanjem koncentracije NADH, sukcinil-SCoA i ATP -a, enzim α-ketoglutarat dehidrogenaza se inhibira; suprotno tome povećanje koncentracija HS-CoA i NAD+, i prisustvo jona Ca2+ stimulišu ovaj enzim
60. Anaplerotičke reakcije: Osnovna anoplerotička reakcija je karboksilacija piruvata do oksalacetata, i ona se dešava u mitohondrijma iz katalizu enzimom piruvat karboksilazom. Ona je tetramer koji za sebe ima kovalentno vezan biotin. Tetramer se sastoji iz:
Subjedinica za koju je kovalentno vezan biotin i to preko NH 2-grupe specifičnog lizina ,
formirajući fleksibilnu strukturu Subjedinice koja omogućava karboksilaciju biotina Subjedinice koja vrši transfer CO2 sa karboski -biotin enzimskog kompleksa na piruvat Regulatorne subjedinice za koju se vezuje pozitivni alosterički modulator acetil -S-CoA (u njegovom odsustvu ona je neaktivna)
Bilo kakvo smanjenje brzine Ciklusa limunske kiseline izazvano smanjenjem koncentracije oksalacetata ili
nekog drugog intermedijera će dovesti do akumulacije acetil -S-CoA, jer se ne može koristiti u Ciklusu. To će dovesti do stimulacije piruvat karboksilaze, čime će otpočeti anaplerotička reakcija.
51
Druga anaplerotička reakcija je karboksilacija fosfoenol pirvata (PEP) do oksalacetata i prisutna je kod viših biljaka, kvasaca i bakterija, dok je kod životinja nema. Ona je katalizovana PEP-karboksilzom. Treća anaplerotička reakcija je karboksilacija piruvata do malata, koja je katalizovana malatičnim enzimom. Ova reakcija se odvija u prisustvu NADPH, tako da se on reoksiduje do NADP +.
61. Mehanizam delovanja piruvat karboksilaze: Bilo kakvo smanjenje brzine Ciklusa limunske kiseline izazvano smanjenjem koncentracije oksalacetata ili
nekog drugog intermedijera će dovesti do akumulacije acetil -S-CoA, jer se ne može koristiti u Ciklusu. To će dovesti do stimulacije piruvat karboksilaze, čime će otpočeti anaplerotička reakcija. Kataliza ovim enzimom se vrši u dve faze. U Fazi I dolazi do aktiviranja bikarbonatnog jona , pri čemu nastaje međuprodukt karboksifosfat uz utrošak jednog molekula ATP -a. On se na enzimu razlaže do ADP-a i fosforne grupe, uz oslobađanje molekula ugljendioksida. Nastali CO2 karboksiliše biotin, pa nastaje karboksilbiotinil-enzim kompleks, kojim se završava Faza I. U Fazi II se iz tog kompleksa oslobađa CO2, kao i biotinil-enzim (usled preuzimanja protona sa piruvata od strane biotina) , čime se enzim vraća u prvobitno stanje. Posledica preuzimanja protona, je enolni oblik piruvata koji vrši nukleodilni napad na ugljendioksid, pri čemu dolazi do sinteze oksalacetata.
62. Energetski bilans totalne oksidacije glukoze: Potpunu oksidaciju glukoze omogućavaju respiratorni lanac u kome se prenosom elektrona oslobađa energija, i oksidativna fosforilacija, proces u kome dolazi do sinteze ATP-a. Oba procesa se kod
eukariota vrše u mitohondrijama. Dvanaest elektronskih parova iz oksidacije glukoze se prenose na NAD+ i FAD, pri čemu se dobija 10 NADH i 2 FADH2. Dva molekula NADH se dobija u procesu glikolize, dva u procesu oksidativne dekarboksilacije piruvata i šest i cuklusu limunske kiseline, dok je FADH 2 poreklom iz Ciklusa limunske kiseline. Preuzeti elektroni se prenose na respiratorni lanac prilikom njihove reoksidacije, gde je molekularni
kiseonik terminalni akceptor elektrona, čime se dobija voda kao krajnji prizvod. Tokom transporta elektrona u respiratornom lancu dolazi i do istovremenog izbacivanja protona u intermembranski prostor mitohondrija. Kao posledica se formira slobodnom energijom bogat gradijent protona koji forsira sintezu ATP-a od ADP-a i P i. Ta slobodna energija je dvojakog porekla – jedan deo potiče iz hemijske energije koja nastaje kao posledica transfera protona iz matriksa u intermembranski prostor (u matriksu
je višak negativnog, a u intermembranskom prostoru višak pozitivnog naelektrisanja); a drugi deo potiče od električnog potencijala koji je posledica razdvajanja naelektrisanja. Reoksidacija svakog NADH rezultira u sintezi 3 molekula ATP-a, a reoksidacija svakog FADH 2 2 molekula ATP-a. To znači da se potpunom oksidacijom glukoze do ugljendioksida i vode dobija 38 molekula ATPa.
63. Opšti pregled katabolizma aminokiselina:
52
Aminokiseline su bitne i kao gradivni blokovi proteina, ali i kao prekursori za sintezu mnogih biomolekula
– vitamina, hormona, razbih fiziološki važnih supstanci... U višku se č uvaju u obliku uree, ili se prevode u acetil-S-CoA, aceto-acetil-S-CoA ili neki drugi intermedijer Ciklusa limunske kiseline. Tako da je njihov
višak, izvor energije i prekursora za biosintezu glukoze, lipida i ketonskih tela. Glavno mesto degradacije aminokiselina je jetra. Njihov katabolizam se završava u ciklusu limunske kiseline, gde se oksiduju do CO2 i H2O, i tada su izvor energije za žive sisteme. Živi sistemi aktivno oksiduju mali procenat ukupnog prometa aminokiselina – hidroliza proteina unetih hranom je glavni izvor aminokiselina za npr. vertebrate. Proces hidrolitičke razgradnje preteina katalizuju proteolitički
enzimi u želucu i duodenumu. Katabolizam aminokiselina se vrši na tri načina: 1. Deaminacija – uklanjanje amino grupe u obliku amonijaka , ili njeno prebacivanje sa aminokiseline na neku α-keto kiselinu 2. Sinteza uree – ugradnja amonijaka i azota iz asparaginske kisleine u ureu (koja se na kraju izbacuje iz organizma) 3. Koverzije ugljenikovog skeleta aminokiseline do metaboličkih intermedijera
64. Oksidacija aminokiselina (dezaminacija): Najveći broj amino kiselina započinje svoj katabolizam procesom deaminacije, koja može biti oksidativna, neoksidativna i transaminacija.
Oksidativna aminacija glutamata je najčešći proces u živim sistemima. Ona se odigrava u citoplazmi i mitohondrijama hepatocita i katalizovana je enzimom glutamat dehidrogenazom, koja za svoju aktivnost zahteva koenzim NAD+ ili NADP + - ona je jedini enzim koji može koristiti obe vrste koenzima.
Oksidacija se vrši prenosom hidridnog jona sa Cα-atoma glutamata na NAD +, pri čemu se dobija αiminoglutarat , koji se hidrolizuje u α-ketoglutarat . Promena slobodne energije u toku ove reakcije je približno jednaka nuli, ali ravnoteža je pomerena ka sintezi glutamata u odnosu na amonijak. Kako su visoke koncentracije amonijaka toksične za žive sisteme, ovakva pozicija ravnoteže ima važan fiziološki značaj – održava koncentraciju amonijaka niskom. Glutamat dehidrogenaza je alosterički enzim izgrađen iz šest subjedinica. Pozitivni modulatori su joj ADP, GDP i neke amino kiseline; a negativni ATP , GTP i NADH – snižavanje energetskog nivoa u živom sistemu ubrzava oksidaciju aminokiselina. Mnogi organizmi poseduju i nespecifične oskidaze aminokiselina, ali oni ne pripadaju glavnim enzimima
katabolizma aminokiselina, već flavoproteinima – oksidaza L-aminokiselina; oksidaza D-aminokiselina.... Ovi entimi katalizuju reakcije na sledeći način: AMINO KISELINA + FMN (FAD) + H 20 → α-KETO KISELINA + NH3 + FMNH2 (FADH2) FMNH2 (FADH2) + O2 → FMN (FAD) + H 2O2
Neoksidativna deaminacija je karakteristična samo za histidin, asparatat, serin i treonin. Specifične liaze katalizuju deaminaciju histidina i aspartata, daju ći urokanat , odnosno fumarat . Deaminaciju serina
53
katalizuje serin dehidrataza, i na kraju reakcije se dobijaju piruvat i amonijak ; dok treonin daje αketobutirat i amonijak i to uz katalizu treonin dehidrataze. Obe dehidrataze zahtevaju prisustvo piridoksal fosfata (PLP ) za svoju aktivnost. Transaminacija je proces transfera α-amino grupe sa aminokiseline na α-keto kiselinu u dva koraka –
NH2-grupa se prebacuje na enzim uz oslobađanje odgovarajuće α -keto kiseline; dok se u drugom koraku NH2-grupa sa enzima prebacuje na neku drugu α -keto kiselinu, pri čemu dolazi do sinteze odgovarajuće aminokiseline i vraćanja enzima u polazno stanje.
α-AMINOKISELINA1 + ENZIM → α-KETOKISELINA1 + ENZIM-NH2 α-KETOKISELINA2 + ENZIM-NH2 → α-AMINOKISELINA2 + ENZIM Enzimi u pitanju su aminotransferaze ili ti transaminaze, koje se nalaze u citoplazmi i mitohondrijama
eukariotskih ćelija. Glicin, metionin, prolin, serin, treonin i histidin su jedine kiseline koje ne podležu transaminaciji. Amino transferaze se razlikuju po svojoj specifičnosti za aminokiseline koje koriste kao supstrat u prvom koraku; dok većina uzima α-ketoglutarat kao keto supstrat u drugom koraku transaminacije, dajući glutamat i aspartat kao jedine aminokiseline. Stoga većina α-NH2-grupa aminokiselina završava svoj katabolički put kao glutamat ili aspartat, koji mogu interkonvergovati zahvaljujući glutamat-aspartat aminotransferazi: GLUTAMAT + OKSALACETAT ↔ α-KETOGLUTARAT + ASPARTAT
Oksidativna deaminacija nastalog glutamata koja daje amonijak, takođe regeneriše α-ketoglutarat za sledeće transaminacije, dok će oslobođeni amonijak i aspartat biti donori amino grupe za sintezu uree. Jedini izuzetak su aminotransferaze mišića koje ne koriste α-ketoglutarat ili oksalacetat kao akceptore aminogrupe, nego koriste piruvat. Produkt reakcije aminokiselina – alanin, se krvotokom šalje u jetru gde biva preveden u piruvat, koji će se koristiti za sintezu glukoze. Glukoza će se krvotokom vratiti u mišiće i tamo će se glikolitički razložiti do piruvata – glukozo-alaninski ciklus.
65. Mehanizam delovanja transaminaza: Enzimi koji učestvuju u procesu transaminacije su aminotransferaze ili ti transaminaze, koje se nalaze u citoplazmi i mitohondrijama eukariotskih ćelija. Transaminacija je proces transfera α-amino grupe sa aminokiseline na α-keto kiselinu u dva koraka – NH2-grupa se prebacuje na enzim uz oslobađanje odgovarajuće α-keto kiseline; dok se u drugom koraku NH 2-grupa sa enzima prebacuje na neku drugu αketo kiselinu, pri čemu dolazi do sinteze odgovarajuće aminokiseline i vraćanja enzima u polazno stanje. α-AMINOKISELINA1 + ENZIM → α-KETOKISELINA1 + ENZIM-NH2 α-KETOKISELINA2 + ENZIM-NH2 → α-AMINOKISELINA2 + ENZIM Prostetička grupa svih aminotransferaza je piridoksal fosfat (PLP ). On se u procesu transaminacije tranzitorno konvertuje u piridoksamin fosfat (PMP ). On je kovalentno vezan za enzim preko Schiffove baze – imino veza koja se formira kondenzacijom aldehidne grupe PLP-a i amino grupe lizina u
54
apoenzimu transferaze. U aspartat transferazi je primećeno da to nije jedina interakcija između njih. Taj
enzim se sastoji iz dve identične subjedinice od kojih svaka ima veliki i mali domen. PLP je vezan u udubljenju velikog domena - azotov atom piridinskog prstena uspostavlja vodoničnu vezu sa COO--
grupom specifičnog aspartata; dok je 2-metil grupa smeštena u hidrofobni džep apoenzima; 3-OH grupa je disosovana i vezana vodoničnom vezom za OH-grupu specifičnog tirozina; 5-fosforna grupa je u elektrostatičkoj interakciji sa guanido grupom arginina. Vezivanje aspartata za aspartat aminotransferazu izazova steričku promenu enzima – mali domen se savija i zatvara aktivno mesto. Prvi korak katalize transaminacije od strane aminotransferaza otpočinje nukleofilnim napadom NH2grupe α-aminokiseline na C-atom adehidne grupe PLP-a u kompleksu enzim-PLP Schiffova baza. Kao posledica te reakcije dolazi do formiranja aldimina sa aminokiselinom i oslobađanja amino grupe lizina iz Schiffove baze. Aldimin se transformiše u ketimin tranzitornom preraspodelom elektrona preko kvinoidnog intermedijera. Nastali ketimin se hidrolizuje u piridoksamin fosfat (PMP ), pri čemu se sa enzima oslobađa α-ketokiselina. U drugom koraku se prebacuje aminogrupa sa PMP-a na drugu α-ketokiselinu u reakcijama koje su potpuno reverzibilne reakcijama prvog koraka, pri čemu se dobija odgovarajuća aminokiselina, a aminotransferaza se vraća u početno stanje. Transaminacija je samo jedna transformacija aminokiselina, koja je katalizovana PLP-enzim kompleksom. Pored toga oni katalizuju i eliminaciju ili reakcije zamene na Cβ-atomu i Cγ-atomu u aminokiselinama. U tim reakcijama PLP omogućava oslobađanje protona sa Cα atoma i formiranje rezonantno stabil izovanog Cα-karbanjona i to tranzitornim povlačenjem elektrona na piridinski prsten PLP-a.
66. Katabolizam metionina: Metionin, valin i izoleucin imaju kompleksan katabolički put, u kome nastaje propionil-S-CoA, koji se
dalje konvertuje u sukcinil-S-CoA. propionil-S-CoA takođe nastaje u katabolizmu masnih kiselina sa neparnim brojem C-atoma.
Degradacija metionina otpočinje reakcijom u kojoj učestvuju ATP i voda, a dobija se S-adenozilmetionin (SAM), koji je zbog slabo vezane metil grupe za nestabilni sulfonijum jon, biološki važan donor metil grupe u procesima metilacije tokom biosinteze raznih molekula – fosfolipidi, epinefrini... Ovu reakciju katalizuje enzim metionin adenozil transferaza, i dolazi do oslobađanja ortofosfatne i pirofosfatne grupe. Nakon toga dolazi do biosintetičke metilacije SAM-a, katalizovane metiltranferazom, nakon čega se dobija S-adenozilhomocistein (SAH ). On se uvođenjem molekula vode u reakciju i uz katalizu adenozil homocisteinaze, prevodi u homocistein, dok se adenozin oslobađa. Dolazi do uvođenja serina u reakciju, tako da on reaguje sa homocisteinom i daje cistatoin, i to uz oslobađanje vode. Ovu reakciju katalizuje cistatoin β -sintetaza. Od cisteina se, katalizom cistatoin γ -liaze, dobija α-ketobutirat , a oslobađa se cistein. α-ketobutirat će sa koenzimom a (HS-CoA), uz katalizu dehidrogenaze α ketokiselina i redukciju NAD + i oslobađanje CO2, dati propionil-S-CoA. Konverzija propionil-S-CoA u sukcinil-S-CoA uključuje tri enzima. Propionil-S-CoA karboksilaza, koja je
tetramer i sadrži biotin kao prostetičku grupu. Karboksilacija se odgirava u dva koraka, od kojih svaki 55
katalizuju različita katalitička mesta propionil-S-CoA karboksilaze – karboksilacija biotina i istovremena hidroliza ATP-a, uz formiranje karboksibiotin-enzim intermedijera ; i stereospecifično prenoše nje aktivirane karboksilne grupe ovog intermedijera na propionil-S-CoA (u karbanjonskom stanju) i dobijanje D-metilmalonil-S-CoA. Nakon racemizacije D-metilmalonil-S-CoA u L-metilmalonil-S-CoA, enzim metilmalonil-S-CoA mutaza katalizuje reakciju prevođenja nastalog intermedijera u sukcinil-S-CoA. Ovaj
enzim, kao prostetičku grupu, sadrži 5-dezoksiadenozinkobalamin (koenzim B12). Vitamin B12 ne mogu sintetisati ni biljke ni životinje, već samo nekoliko bakterija. Herbivori dobijaju ovaj vitamin od bakterija koje žive u njihovom digestivnom sistemu, dok ih ljudi dobijaju jedenjem njihovog mesa. On se vezuje za glikoprotein koga sintetiše želudac i ovaj kompleks prepoznaje receptore na ćelijama intestinalne mukoze. Kompleks se tad disosuje i dolazi u krvotok, gde se vezuje za plazma globuline – transkobalamini .
67. Katabolizam asparagina i aspartata: Aminokiseline aspartat i asparagin završavaju svoj katabolički put u oksalacetatu. Transaminacija aspartata direktno vodi u dobijanje oksalacetata, dok asparagin prvo deaminira u aspartat uz uvođenje jednog molekula vode i oslobađanje molekula amonijaka, pod katalizom enzima asparaginaze. Enzim aspartat aminotransferaza katalizuje prevođenje aspartata u oksalacetat, uz uvođenje α -
ketoglutarata i oslobađanje glutamata. Prostetička grupa svih aminotransferaza je piridoksal fosfat (PLP ). On se u procesu transaminacije tranzitorno konvertuje u piridoksamin fosfat (PMP ). Kovalentno je vezan za enzim preko Schiffove baze – imino veza koja se formira kondenzacijom aldehidne grupe PLPa i amino grupe lizina u apoenzimu transferaze. U aspartat transferazi je primećeno da to nije jedina
interakcija između njih. Taj enzim se sastoji iz dve identične subjedinice od kojih svaka ima veliki i mali domen. PLP je vezan u udubljenju velikog domena
- azotov atom piridinskog prstena uspostavlja
vodoničnu vezu sa COO--grupom specifičnog aspartata; dok je 2-metil grupa smeštena u hidrofobni džep
apoenzima; 3-OH grupa je disosovana i vezana vodoničnom vezom za OH-grupu specifičnog tirozina; 5-
fosforna grupa je u elektrostatičkoj interakciji sa guanido grupom arginina. Vezivanje aspartata za aspartat aminotransferazu izazova steričku promenu enzima – mali domen se savija i zatvara aktivno mesto.
68. Katabolizam fenilalanina/ 69. Katabolizam tirozina: Katabolizam fenilalanina i tirozina ima zajednički put i završava se u fumaratu, intermedijeru Ciklusa limunske kiseline, i acetoacetatu (ketonsko telo). U prvoj reakciji katabolizma fenilalanina dolazi do oksidacije njegovog prstena, koju katalizuje fenilalanin hidroksilaza, pri čemu nastaje tirozin. Fenilalanin hidroksilaza zatehva prisustvo koenzima biopterina, kao i jon gvožđa Fe3+. Potpuno aktivna forma biopterina je 5,6,7,8-tetrahidrobiopterin, koji nastaje redukcijom 7,8-dihidropterina. Tu redukciju katalizuje dihidrofolat reduktaza (NADPH), ili dihidripteridin reduktaza (koja korsiti NADH). Fenilalanin hidroksilaza koristi i 5,6,7,8-tetrahidrobiopterin i kiseonik za oksidaciju fenilalanina u tirozin, pri čemu se
oslobađa voda i dolazi do pregrupisavanja elektrona u prstenu i pomeranje vodonika fenilalanina u ppoložaju.
56
Aminotransferaza katalizuje prevođenje tirozina u p-hidroksifenilpiruvat , uz uvođenje α-ketoglutarata i
oslobađanje glutamata. Enzim p-hidroksifenilpiruvat dioksigenaza, koji za svoju aktivnost zahteva Cu2+ i askorbat (vitamin C ), katalizuje oksidativnu dekarboksilaciju α-keto kiselinskog bočnog ostatska, hidroksilaciju prstena i migraciju bočnog lanca, prevodeći p-hidroksifenilpiruvat u homogentizat . Rearanžman pozicija grupa na prstenu je posledica mirgracije alkilne grupe, a ne hidridnog jona da bi se formirao rezonantno stabilni oksonijum jon. Koristi se molekularni kiseonik za prvobitno formiranje
epoksidne forme između C 4- i C5-atoma prstena. Otvaranje epoksida indukuje formiranje oksonijum jona na C4-atomu tako da se na kraju reakcije us postavlja veza između C3-atoma alkilne grupe i C 5-atoma prstena u homogentizatu, dok je ta veza bila izme đu C3-atoma alkilne grupe i C4-atoma prstena u polaznom p-hidroksifenilpiruvatu. Enzim homogentizat dioksigenaza zahteva za svoje delovanje prisustvo glutationa (tripeptid – glutamat, cistein i glicin) i askorbata, i katalizuje dobijanje 4-maleiloacetata iz homogentizata koristeći molekul kiseonika. Maleiloacetat izomeraza ga zatim prevodi u 4-fumariloacetat , koji se uz uvođenje molekula vode i katalizu fumarilacetoacetaze razlaže na fumarat i acetoacetat .
70. Ciklus uree: Živi sistemi ekskretiraju višak azota koji nastaje u katabolizmu aminokiselina u nukleotida na jedan od tri načina, na osnovu čega su i podeljeni na:
Amonotelične organizme – organizmi koji ekskretiraju amonijak (mnogi akvatični organizmi) Ureotelične organizme – organizmi koji ekskretiraju ureu (većina terestričnih organizama) Urokitelične organizme – organizmi koji ekskretiraju mokraćnu kiselinu (ptice i terestrični gmizavci)
Urea se, kod terestričnih organizama, sintetiše u jetri od strane enzima urea ciklusa. Jedan atom azota
uree je iz asparaginske kiseline, a drugi je poreklom iz amonijaka; dok je ugljenikov atom poreklom iz bikarbonatnog jona (HCO3-). Nosač ovih atoma u toku ovog procesa je orinitin.
Ciklus počinje biosintezom karbamoil fosfata, u reakciji koja je katalizovana enzimom karbamoil fosfat sintetazom (CPS). Ova sinteza se odigrava u matriksu mitohondrija i predstavlja kondenzaciju i aktivaciju
NH4+ i HCO3- jona uz hidrolizu dva molekula ATP-a. Eukarioti poseduju mitohondrijalnu formu (CPS-I ) i
citoplazmičnu formu (CPS-II ) ovog enzima. Mitohondrijalna forma koristi amonijak kao donor azota i uključena je u biosintezu uree, dok je citoplazmatična uključena u biosintezu pirimidinskih nukleotida, pri tome koristeći glutamin kao donora azotnog atoma. CPS-I katalizuje sintezu karbamoil fosfata u tri koraka: 1. Aktivacija HCO3- od strane ATP-a i dobijanje karbonil fosfata i ADP-a 2. Napad NH4+ na karbonil fosfat, što izaziva izbacivanje fosfata i nastanak karbamata 3. Fosforilacija karbamata drugim molekulom ATP-a i dobijanje karbamoil fosfata i oslobađanje ADP
57
Ove reakcije su ireverzibilne, a CPS-I se alosterički aktivira pomoću N-acetilglutamata. Karbamoilna grupa sintetisanog karbamoil fosfata se prebacuje na ornitin u reakciji koji katalizuje ornitin transkarbamilaza, i dobija se citrulin. Ova reakcija se i dalje odigrava u mitohondrijama, tako da postoje
transportni sistemi za ubacivanje ornitina iz citoplazme u mitohondriju, i citrulina iz mitohondrije. Drugi N-atom uree se uključuje u sledećoj reakciji, koja se odvija u citoplazmi, kada se ureido grupa citrulina kondenzuje sa amino grupom aspartata u reakciji koju katalizuje argininosukcinat sintetaza, uz dobijanje arginino sukcinata. Ta reakcija se odvija u dva koraka – prvo dolazi do aktivacije citrulina i formiranje citruli-AMP intermedijera; i nukleofilni napad aminogrupe aspartata na citruli-AMP-
intermedijer. U sledećoj reakciji argininosukcinaza katalizuje njegovo razlaganje na arginin i fumarat . Finalna reakcija ovog ciklusa je hidroliza arginina na ornitin i ureu, uz katalizu enzima arginaze. Nastali ornitin se transportuje nazad u mitohondriju. Prema tome, Ciklus uree konvertuje dve aminogrupe i jedan C-atom poreklom iz HCO3 - u netoksični
proizvod ureu, uz utrošak četiri molekula ATP-a. Međutim akumulacija amonijaka u mitohondriji se vrši oksidativnom deaminacijom, koju katalizuje glutamat dehidrogenaza pri čemu se dobija NADH, koji u reoksidaciji u respiratornom lancu daje tri molekula ATP-a. Takođe fumarat, nastao razlaganjem argininosukcinata se vraća u Ciklus limunske kiseline, gde se prevodi do oksalacetata, čijom se reoksidaicjom dobijaju još tri molekula ATP -a. Znači Urea ciklus ne opterećuje organizam energetski. Nastali oksalacetat je supstrat za aspartat aminotransferazu koja omogućava regeneraciju aspartata za potrebe Urea ciklusa. Na taj način su povezani oksidativna deaminacija glutamata, Urea ciklus i Ciklus limunske kiseline. CPS-I je glavno regulatorno mesto Ciklusa uree. Ovaj enzim je alosterički aktiviran N-acetilglutamatom,
koji se sintetiše iz glutamata i acetil-S-CoA u reakciji koju katalizuje N-acetilglutamat sintaza; a razgrađuje specifičnom hidrolizom. Povećana brzina Ciklusa uree je potrebna kada dolazi do intenzivnog katabolizma aminokiselina, jer se tada uvećava koncentracija amonijaka koji se mora eksretirati. Signal intenzivnog katabolizma aminokiselina je povećana sinteza glutamata izazvana transaminacijom, koji se acetilira u N-acetilglutamat koji aktivira CPS-I. Ostali enzimi urea ciklusa su regulisani koncentraicjom sopstvenih supstrata.
71. Katabolizam pirimidina: Nukleinske kiseline podležu degradaciji uglavnom u duodenumu gde ih pankreatične nukleaze ili intestinalne fosfodiestaraze razlažu do nukleotida. Oni se ne mogu transportovati kroz ćelijsku membranu tako da se odmah hidrolizuju do nukleozida, dejstvom nukleotidaza i fosfataza. Nukleozide
će absorbovati ćelije intestinalne mukoze, i dalje će se razgraditi do slobodnih baza i riboza ili ribozo-1 fosfata i to delovanjem nukleozidaza u reakcijama: NUKLEOZID + H20 → BAZA + RIBOZA NUKLEOZID + PI → BAZA + RIBOZO-1-FOSFAT
58
Degradacija pirimidinskih nukleotida do odgovarajućih baza se vrši na sličan način kao i kod purinskih nukleotida – defosforilacija, deaminacija i raskidanje N-glikozidne veze. Nukleotidi citidina, dejstvom nukleotidaze oslobađaju fosfatne grupe i prelaze u nukleozid – citidin. On se, uz katalizu citidin deaminaze, uvođenjem molekula vode i oslobađanjem amonijačnog jona , prevodi u uridin (ili dezoksiuridin). U slučaju nukleotida uracila, će delovati samo nukleotidaze i on će preći u uridin. Na uridin deluje enzim uridin fosforilaza, i on prelazi u uracil (timin). Tako nastali uracil i timin se dalje
degraduju u ćelijama jetre i to redukcijom prstena. Dihidrouracil dehidrogenaze ih, uz oksidaciju NADPH i H+, prevode u dihidrouracil ili dihidrotimin, koji hidropirimidin hidrataza, uvođenjem molekula vode, prevodi u β-ureidopropionat ili β-ureidobutirat . Krajnji produkti njihovog katabolizma su β-alanin i βaminoizobuterna kiselina, koji procesom transaminacije i vezivanjem HS-CoA daju malonil-S-CoA,
odnosno metimalonil-S-CoA, koji će se konvertovati do sukcinil-S-CoA, koji je intermedijer Ciklusa limunske kiseline.
72. Katabolizam purina: Nukleinske kiseline podležu degradaciji uglavnom u duodenumu gde ih pankreatične nukleaze ili intestinalne fosfodiestaraze razlažu do nukleotida. Oni se ne mogu transportovati kroz ćelijsku membranu tako da se odmah hidrolizuju do nukleozida, dejstvom nukleotidaza i fosfataza. Nukleozide
će absorbovati ćelije intestinalne mukoze, i dalje će se razgraditi do slobodnih baza i riboza ili ribozo-1 fosfata i to delovanjem nukleozidaza. Purini se kod sisara, na različite načine kataboličkim putevima dovode do zajedničkog intermedijera – mokraćne kiseline . Drugi organizmi mogu i na druge načine doći do mokraćne kiseline, npr. neki oslobađaju slobodan adenin. Slobodne purinske baze mogu biti korišćene u spasonosnom putu purina; dok se onda nastali ribozo-1-fosfat prevodi u ribozo-5-fosfat (delovanjem fosforibomutaza), koji je direktni prekursor za sintezu fosforibozilpirofosfata ( PRPP ). Na adenozin-fosfate deluje enzim nukleotidaza koja ih prevodi u adenozin ili dezoksiadenozin (u zavisnosti od pentoze), dok guanozin-fosfate nukleotidaze prevode u guanozin. Nastali adenozin i dezoksiadenozin ne mogu biti degradovani od strane enzima sisara purin nukleozid fosforilaze (PNF ),
tako da se njihova deaminacija vrši uz katalizu adenozin deaminazom ( ADA). Oni se tako prevode u odgovarajuće inozinske derivate, koji se dalje degraduju. Purinski nukleozidi se vezuju za enzim u obliku retke hidratisane forme - 6-hidroksil-1,6-dihidropurin ribunukleozid . Adenozin deaminaza za svoju aktivnost zahteva prisustvo jona Zn2+. Kao finalni produkt reakcije se dobija inozin u obliku enolne tautomerne forme, a enzim se vraća u prvobitno stanje. Deaminacija AMP-a u IMP u kombinaciji sinteze AMP-a od IMP-a ima efekta na proces deaminacije aspartata u fumarat – u purinskom nukleotidnom ciklusu . Ovaj proces ima važnu metaboličku ulogu u
skeletnim mišićima – povećanje njihove aktivnosti je praćeno povećanjem aktivnosti Ciklusa limunske kiseline, ali mišićne ćelije nemaju enzime koji katalizuju anaplerotičke reakcije, tako da se punjenje Ciklusa limunske kiseline njegovim intermedijerima u ovim tkivima vrši preko fumarata iz purinskog nukleotidnog ciklusa: ASPARTAT + GTP + H2O → FUMARAT + GDP + P I + NH4+
59
Purinski nukleotidni ciklus u skeletnim mišićima, sa aktivnošću tri enzima (AMP -deaminaza, adenilosukcinat sintetaza i adenilosukcinat liaza), ima mnogo veću brzinu nego u drugim tkivima te se u tome i ogleda njegov značaj. Na inozin deluje purin nukleozid fosforilaza (PNF ) i prevodi ga u hipoksantin. Ovaj enzim delovanjem na guanozin, katalizuje njegovo prevođenje u guanin. Ksantin oksidaza je ključni enzim u konverziji hipoksantina u ksantin, i njegovoj konverziji u mokraćnu kiselinu. Ovaj enzim se nalazi u ćelijama jetre i mukoze tankog creva. To je dimerni protein i sastoji se iz dve identične subjedinice, od kojih svaka sadrži potrebne koenzime – FAD, molibdenski kompleks i dva različita gvožđe-sumporna proteina. Ksantin oksidaza hidroksiluje ksantin na C 8-atomu u mokraćnu kiselinu i hipoksantin na C2-atomu u ksantin, uz stabilizovanje nastalih enolnih formi tautomerizacijom u njihove keto-forme. Na guanin deluje guanin deaminaza koja ga prevodi u ksantin, na koji će delovati ksantin oksidaza. Mokraćna kiselina je završni produkt katabolizma purina kod primata, ptica, terestričnih reptila, insekata
i dalmatinaca. Ptice i terestrični gmizavci koriste višak amonijum jona za sintezu purina koji odmah
katabolišu do mokraćne kiseline i ovakav način eliminisanja viška azota u obliku mokraćne kiseline a ne amonijaka ima visok fiziološki smisao – štednja vode. Mokraćna kiselina je supstrat za urat oksidazu, koja katalizuje otvaranje pirimidinskog dela purinskog prstena uz eliminaciju ugljendioksida, pri čemu nastaje alantoin. Alantoin je krajnji produkt katabolizma kod ostalih sisara, kornjača i mekušaca . Enzim alantoinaza otvara imidazolni prsten, pri čemu nastaje alantoinska kiselina – završni produkt
katabolizma purina nekih riba. Alantoinsku kiselinu, enzim alantoikaza, prevodi i glioksalnu kiselinu i dva molekula uree, koji su finalni produkti kod većine riba i vodozemaca. Konačno urea može biti
razgrađena na amonijak i ugljendioksid, pod delovanjem enzima ureaze, što se dešava kod morskih invertebrata.
73. Oksidacija masnih kiselina: Proces aktivacije masne kiseline je katalizovan familijom od najmanje tri varijante enzima acil-S-CoA sintetaze, koji se razlikuju po specifičnosti za dužinu lanca masne kiseline - acil-S-CoA sintetaza aktivira masne kiseline kratkog lanca; MCFA-S-CoA sintetaza aktivira masne kiseline lanca od 4-12 C-atoma; i LCFA-S-CoA sintetaza aktivira masne kiseline dugog lanca. Ovi enzimi su vezani ili za spoljašnju
membranu mitohondrija ili endoplazmatični retikulum. Proces aktivacije masnih kiselina se ostvaruje
vezivanjem masne kiseline za citoplazmatični HS-CoA – prvo se adenilizuje masna kiselina i to uz trošenje jednog molekula ATP- a, čime se dobija adenilat-masna kiselina; a zatim se masna kiselina prebacuje iz adenilatnog kompleksa na citoplazmatični HS-CoA, pri čemu se formira tioestarski proizvod acil-S-CoA, a oslobađa se AMP. Njihova aktivacija podrazumeva razlaganje fosfoanhidridne veze između α- i β-atoma ATP-a i formiranje tioestarske veze, obe sa visokom negativnom promenom slobodne energije, tako da
je sveukupno ona približno jednaka nuli – reakcija je reverzibilna. PPI fosforilizuje enzim inorganska pirofosfataza, zbog čega se sinteza acil-S-CoA favorizuje. U principu u svim metaboličkim procesima je formiranje visokoenergetske veze kroz hidrolizu jedne fosfoanhidridne veze ATP-a favorizovano da se odigra do kraja – hidrolizom druge anhidridne veze. Dobijeni AMP se fosforiliše delovanjem AMP kinaze,
60
koji korsiti ATP, tako da se dobijaju dva molekula ADP- a (ATP+AMP→ 2 ADP). Znači u procesu aktivacije
masnih kiselina se troše dva molekula ATP-a. Unutrašn ja membrana mitohondrija nije permeabilna za masne kiseline, a ni za HS-CoA, tako da i citoplazma i mitohondrije imaju sopstveni HS-CoA. Zato je i razvijen sistem transporta masnih kiselina kroz ovu membranu i to preko karnitina, derivata lizina. Aktivacija masnih kiselina koje se nalaze u matriksu mitohondrija, kao posledica metabolizma lipida u
mitohondrijama, vrši se preko acil-S-CoA sintetaze, koja koristi GTP umesto ATP-a. RCOOH + GTP + HS-CoA → ACIL-S-CoA + GDP + PI Mitohondrijalni acil-S-CoA derivati podležu β-oksidaciji , koja se odigrava u četiri koraka: 1. Oksidacija acil-S-CoA, koju katalizuje acil-S-CoA dehidrogenaza , čiji je koenzim FAD – vrši se dehidrogenizacija Cα- i Cβ-atoma (uklanjanjem protona sa C α-atoma i hidridnog jona Cβ-atoma ),
pri čemu se dobija enoil oblik acil-S-CoA; nastali FADH2 prenosi svoj redoks potencijal na ektrontransportni flavoprotein (ETF), koji elektrone dalje prenosi na ETF-ubikvinon oksidoreduktazu, a
ona na koenzim Q u respiratornom lancu 2. Hidratacija trans- ∆2enoil-S-CoA katalizovana enoil-S-CoA hidratazom (hidratiše trans-∆2dvogube veze), kojom se formira β-L-hidroksiacil-S-CoA izomer 3. Prevođenje OH-grupe na C β-atomu u keto-grupu i istovremeno generisanje NADH, uz katalizu
enzimom β-L-hidroksiacil-S-CoA dehidrogenazom , koja je stereospecifična – ovime nastaje βketoacil-S-CoA
4. Proces tiolize β-ketoacil-S-CoA, koji je katalizovan β-ketoacil-S-CoA tiolazom – ona u svom aktivnom mestu poseduje cistein, čija bočna grupa formira kovalentnu vezu sa β-ketoacil-S-CoA; u aktivnom mestu poseduje i aminokiselinu čija je bočna grupa donor protona
Formiranje tioestarske veze između bočne grupe cisteina i Cβ-atoma β-ketoacil-S-CoA Raskidanje veze između Cα- i Cβ-atoma, uz nastanak acetil-S-CoA karbanjonskog intermedijera, koji se stabilizuje privlačenjem elektrona sa kiseonika na samu akrbonilnu grupu tioestara – Claisenovo razlaganje estara (proces suprotan kondenzaciji)
Protonizovanje acetil-S-CoA karbanjonskog intermedijera od strane bočne grupe donora
protona i njegovo oslobađanje u obliku acetil-S-CoA, dok acilni ostatak ostaje vezan za tiolazu Uključivanje HS-CoA u reakciju – bazna grupa tiolaze preuzima proton sa njega i
omogućava mu da izvrši nukleofilni napad na karbonilnu grupu acilnog ostatka tioestarskog intermedijera enzima, pri čemu se dobija acil-S-CoA kraći za dva C -atoma, a enzim se vraća u početno stanje Dobijeni acil-S-CoA se opet oksiduje, tako da se po dva C-atoma sukcesivno uklanjaju iz masne kiseline u obliku acetil-S-CoA.
61
Oksidacija masnih kiselina je kod sisara uglavnom regulisana koncentracijom slobodnih masnih kiselina u krvotoku, a ona je kontrolisana brzinom hidrolize triacilglicerola u adipoznom tkivu od strane hormonsenzitivnog enzima triacilglicerol lipaze. Taj enzim je podložan regulaciji fosforilacijom ili defosforilacijom kao odgovor na koncentraciju cAMP-a koja je pod hormonskom kontrolom. Epinefrin, norepinefrin i glukagon deluju na povećanje koncentracija cAMP-a u adipoznom tkivu, što za posledicu
ima fosforilaciju enzima lipaze, čime se na aktivira i tako je stimulisana lipoliza u adipoznom tkivu, kao i uvećanje kocentracije masnih kiselina u krvotoku, što rezultira ubrzavanjem β-oksidacije masnih kiselina u drugim tkivima. β-oksidacija viška masnih kiselina u jetri dovodi do biosinteze ketonskih tela, koja se ekskretiraju i putem krvotoka dospevaju do perifernih tkiva gde se koriste kao alternativne forme energije.
74. Oksidacija nezasićenih masnih kiselina: Skoro sve masne kiseline bioloških sistema sadrže dvogube veze u cis -konfiguraciji u svojoj strukturi, najčešće između 9. i 10. ili 12. i 13. C-atoma – linolna ili oleinska kiselina. Linolna kiselina ima dve dvostruke veze – jedna je locirana posle neparnog, a druga parnog C-atoma; tako da njena oksidacija zahteva još tri dodatna enzima. Prvi problem u njenoj oksidaciji nastaje nakon tri ciklusa oskidacije, jer se dobija cis-β,γ (cis- ∆3 ) dvoguba veza u enoil-S-CoA intermedijeru. On ne može biti supstrat za enzim enoil-S-CoA hidratazu, tako da na
njega prvo deluje enoil-S-CoA izomeraza koja katalizuje prevođenje njegove cis- ∆9-dvogube veze u mnogo stabilniju trans- ∆2-vezu. Nastali intermediejr je supstrat za enzim enoil-S-CoA hidratazu i βoksidacija se nastavlja.
Sledeći problem se javlja u petom ciklusu β-oksidacije. Postojanje cis-dvogube veze na parnom C-atomu dovodi do formiranja 2,4-dienoil-S-CoA intermedijera, koji nije supstrat enoil-S-CoA hidratazu. Enzim NADPH zavisna 2,4-dienoil-S-CoA reduktaza, katalizuje redukciju cis- ∆4-dvogube veze, čime se dobija trans- ∆3-enoil-S-CoA. On je supstrat za enzim 3,2-enoil-S-CoA izomerazu koja ga prevodi u normalni
supstrat enoil-S-CoA hidrataze.
U slučaju nezasićenih masnih kiselina koji u β-oksidaciji daju cis- ∆2-enoil-S-CoA, specifičan enzim cis- ∆2enoil-S-CoA hidrataza prepoznaje ovaj intermedijer i prevodi ga u β,D-hidroksiacil-S-CoA. On se mora prevesti u svoj L-izomer da bi postao supstrat za β-hidroksiacil-S-CoA dehidrogenazu (potpuno
stereospecifična) i to se dešava uz katalizu β-hidroksiacil-S-CoA epimeraze.
75. Energetski bilans oksidacije masnih kiselina: Stehiometrija oksidacije npr. palmitoil-S-CoA izgleda ovako: PALMITOIL-S-CoA + 7 HS-CoA + 7 FAD + 7 NAD+ + 7H2O → 8 ACETIL-S-CoA + 7 FADH2 + 7 NADH + 7 H+
Oksidacijom dobijenih osam acetil-S-CoA u Ciklusu limunske kiseline se oslobađa energija za sintezu 96 molekula ATP-a. Reoksidacijom FADH2 se oslobađa energija za sintezu 14 ATP -a, a pri reoksidaciji NADH se
62
dobija još 21 molekul. Kada se oduzmu dva molekula ATP-a koja su se iskoristila za aktivaciju masne kiseline, dobija se
76. Transport masnih kiselina iz citoplazme u mitohondriju: Unutrašnja membrana mitohondrija nije permeabilna za masne kiseline, a ni za HS-CoA, tako da i citoplazma i mitohondrije imaju sopstveni HS-CoA. Zato je i razvijen sistem transporta masnih kiselina kroz ovu membranu i to preko karnitina, derivata lizina. Prebacivanje aktivirane masne kiseline sa acil-SCoA-kompleksa na karnitin, katalizuje karnitin aciltransferaza I , koja se nalazi na spoljašnjoj strani
unutrašnje membrane mitohondrija. Acilni ostatak se vezuje za sekundarnu alkoholnu grupu karnitina, gradeći acil-karnitin kompleks, a oslobođeni HS-CoA se vraća u citoplazmu. Acil-karnitin se prebacuje kroz unutrašnju membranu pomoću translokaze , i to do njene unutrašnje strane. Acilni ostatak prelazi sa acil-karnitin kompleksa na mitohondrijalni HS-CoA, uz katalizu karnitin aciltransferaze II , pri čemu se dobija acil-S-CoA u matriksu mitohondrija. Ovaj prenos masnih kiselina je
termodinamički moguć, zato što je promena slobodne energije veoma mala i to zato što acil -S-CoA, Oestar acil-karnitina i tioestar mitohondrijalnog acil-S- CoA imaju približno isti energetski sadržaj. Translokaza katalizuje izmenu acil-karnitin→karnitin – za svaki prebačeni molekul acil-karnitina, se istovremeno izbacuje jedan molekul karnitina.
77. Ketonska tela: Acetil-S-CoA dobijen u β-oksidaciji masnih kiselina u mitohondrijama jetre, se može dalje oksidovati u
Ciklusu limunske kiseline, ali njegovo uključivanje zavisi od dostupnosti oksalacetata, poreklom iz metablizma ugljenih hidrata. Zato se njegovo uključivanje u Ciklus limunske kiseline dešava samo pri izbalansiranom metabolizmu saharida i lipida. U slučajevima gladovanja ili dijaabetesa, oksalacetat se koristi za sintezu glukoze, tako da se u jetri formira višak acetil -S-CoA. U takvim uslovima znatna količina acetil-S-CoA ima drugu sudbinu – u jetri počinje proces ketogeneze, koji se sastoji u konverziji viška acetil-S-CoA u acetoacetat i D-β-hidroksibutarat . Ova dva jedinjenja, sa acetonom grade ketonska tela. Oni su važna metabolička goriva mnogih perifernih tkiva – ekvivalenti masnih kiselina, rastvorljivi u vodi. Acetoat se formira u tri koraka:
1. Kondenzacija dva acetil-S-CoA, koju katalizuje triolaza , čime se dobija acetoacetil-S-CoA 2. Kondenzacija
acetoacetil-S-CoA
trećim
molekul om
acetil-S-CoA,
pomoću
enzima
hidroksimetilglutaril-S-CoA sintaze , čime se dobija β-hidroksi-β-metilglutaril-S-CoA
3. Degradacija β-hidroksi-β-metilglutaril-S-CoA, preko enzima hidroksimetilglutaril-S-CoA liaze , u acetoacetat ; degradacija je mešavina aldolnog i Claisenovog razlaganja
4. Redukcija acetoacetata u β-hidroksibutarat , katalizom D-β-hidroksibutarat dehidrogenaze ; ili dobijanje acetona njegovom spontanom dekarboksilacijom
Nastala ketonska tela difunduju iz jetre i kroz kvrotok stižu do drugih tkiva. Oni su značajni za energetski metabolizam – njihovom oksidacijom se oslobađaju velike količine energije . Koriste se u bubrezima i mišićima, ali ne u mozgu i crvenim krvnim zrncima (u normalnim fiziološkim uslovima). U periodima 63
dugog gladovanja, veliki procenat energije za funkcionisanje mozga dolazi od acetoacetata. Krvotokom
dospeli u ćelije u kojima se koriste , acetoacetat i β-hidroksibutarat se prevode u acetoacetil-S-CoA, za šta je ključan enzim β-ketoacetil-S-CoA transferaza, koja koristi sukcinil-S-CoA. Uz učešće HS-CoA, enzim tiolaza prevodi acetoacetil-S-CoA u dva molekula acetil-S-CoA koja se uključuju u Ciklus limunske kiseline. Znači, ketonska tela su transportne forme acetilnih jedinica neophodnih za energetski metabolizam. Masne kiseline se oslobađaju iz adipoznog tkiva, transportuju se do jetre i tamo se konvertuju do acetilnih jedinica koje se eksportuju iz jetre u vidu acetoacetata. Jetra ne poseduje enzim β-ketoacetil-S-CoA transferazu, ali ima β-hidroksibutirat dehidrogenazu i zato ona može da snabdeva
ostala tkiva ketonskim telima. Visok nivo acetoacetata u krvi, označava da u živom sistemu postoji višak acetilnih jedinica, što utiče na to da se smanjuje lipoliza u adipoznom tkivu. Prema tome acetoacetat kontroliše korišćenje masnih kiselina adipoznog tkiva za energetski metabolizam.
78. Mehanizam delovanja citrat sintaze: Enzim citrat sintaza katalizuje mešanu aldolnu kondenzaciju i Claisenovu kondenzaciju estara acetil-SCoA i oksalacetata. Citrat sintaza funkcioniše po principu kiselinsko-bazne katalize, uz formiranje enolne forme acetil-S-CoA. Ovo je početna reakcija Krebsovog ciklusa i jedi no mesto ulaza novih C-atoma u vidu acetilnih ostataka. Kondenzacija oksalacetata i acetil-S- CoA se dešava sukcesivno, pri čemu se oksalacetat prvi vezuje za enzim. Citrat sintaza se sastoji iz dve subjedinice, od kojih svaka poseduje aktivno mesto, smešt eno u udubljenju koje formiraju mali i veliki domen subjedinice. Citrat sintaza podleže velikim konformacionim
promenama tokom reakcije. Nakon vezivanja oksalacetata dolazi do strukturnog rearanžmana, koje dovodi do uspostavljanja prave konformacije koja omogućava vezivanje acetil-S-CoA. Nakon vezivanja oksalacetata, enzim prelazi iz otvorene u zatvorenu formu, pri čemu mali domeni svake subjedinice rotiraju u odnosu na velike domene – mehanizam indukovanog uklapanja sa supstratom . Na taj način se formira ternarni kompleks, u kojem su oksalacetat i acetil-S-CoA u neposrednoj blizini, pravilno
orijentisani u odnosu na katalitički centar. U katalizovanju procesa najvažniju ulogu imaju dva histidinska ostatka, i jedan ostatak asparaginske kiseline. U katalizi direktno učestvuju N1-atomi imidazolnih prstenova bočnih grupa histidina, koji nisu protonizovani. Ostatak bočne grupe asparaginske kiseline se ponaša kao baza i omogućava da se ukloni proton sa metilnog ostatka acetil -S-CoA, pri čemu nastaje njegova enolna forma. Istovremeno histidin deluje kao kiselina i vrši protonizaciju kiseonikovog atoma enolne forme acetil-S-CoA. Protonizacija je olakšana formiranjem vodoničnih veza niske barijere. Enolna forma acetil-S-CoA vrši nukleofilni napad na oksalacetat i postaje citril-S-CoA, pri čemu histidin vraća izgubljeni proton; dok sad drugi histidin donosi proton karbonilnoj grupi oksalacetata. Nastali citril-S-CoA kao intermedijerni produkt ostaje vezan za enzim i indukuje konformacionu promenu citrat sintaze, čiji je cilj omogućavanje molekulu vode da hidrolizuje tioestarsku vezu citril-S-CoA, pri čemu se sa enzima
prvo oslobađa HS-CoA, pa onda i citrat . Nakon oslobađanja citrata, citrat sintaza se vraća u prvobitnu otvorenu formu.
79. MITOHONDRIJE: morfologija, hemi jska građa i funkcija:
64
Mitohondrije su organele eukariotskih ćelija ukojima se vrši najveći deo biohemijskih procesa vezanih za
energetski metabolizam ćelija. Ćelije imaju skoro konstantan broj mitohondrija po ćeliji – npr. sve ćelije jetre imaju u principu oko 800 mitohondrija; ali su različito zastupljene u zavisnosti od tipa ćelija – u jetri zauzimaju 20% zapremine ćelije, u srcu čak i 50%. One su zastupljen ije u strukturama koje zahtevaju ATP – gde je potrebna visoka biohemijska aktivnost (mišići srca, krila insekata, spermatozoidi) ili blizu citoplazmatičnih mesta gde je smešten materijal za oksidaciju (npr. kapljice masti). One imaju različiti oblik u zavisnosti od ćelija u kojim se nalaze – mogu biti okrugle, bubrežaste, ovalne... Sve mitohondrije poseduju dve membrane i matriks. Membrane se označavaju kao spoljašnja i
unutrašnja mitohondrijalna membrana , i između sebe zatvaraju intermembranski prostor . Ove dve membrane se veoma razlikuju po sastavu proteina i lipida. U spoljašnjoj membrani, koja je elastična i većinom lipidne prirode, se nalazi veliki broj porina i transportera lipida. Ona je jako permeabilna za veliki broj molekula i jona, i za nju su vezane aktivnosti nekoliko enzima – acil-S-CoA-sintetaze; fosfolipaze A; nukleozid difosfat kinaze... Unutrašnja membrana ima mnogo veću površinu – jako je naborana, formira veliki broj kristi ; i zatvara unutrašnjost mitohondrija – matriks, koji je bledo siv i često granuliran. Unutrašnja membrana sadrži kardiolipin koji je prisutan i u membranama bakterijskih ćelija. Ima mnogo manji sadržaj lipida nego spoljašnja i na njoj su smešteni svi enzimi respiratornog lanca – NADH-dehidrogenaza;
gvožđe-sumporni proteini, cithoromi a, b i c; ATP-sintaza,
i sukcinat
dehidrogenaza; kao i transportni proteini masnih kiselina – karnitin-aciltransferaza. Sam matriks mitohondrija je gel-faza – manje od 50% njgovog sadžaja je voda. U matriksu se nalazi cirkularna DNK, mitoskelet i mitoribozomi . Često se u matriksu mogu uočiti granulacije – depoi kalcijuma. U njemu se
nalazi i veliki broj solubilnih enzima oksidativnog metabolizma – enzimi Ciklusa limunske kiseline, dekarboksilacije piruvata, β-oksidacije masnih kiselina...; kao i raznorodni supstrati, koenzimi i inorganski
joni.
Već je rečeno da je spoljašnja membrana mitohondrija veoma permeabilna, i za razliku od nje unutrašnja je jako nepermeabilna za većinu hidrofilnih supstanci. Zbog toga mitohondrije imaju specijalne transportne sisteme koji omogućavaju da se m etaboliti sintetisani u mitohondrijama, prekursori za razne procese u citoplazmi, izbace iz mitohondrija; kao i sisteme koji omogućavaju ulazak NADH u mitohondrije.
80. ATP: građa i funkcija: ATP je univerzalan molekul energetskog metabolizma svakog živog sistema, i to zato što je promena standardne slobodne energije njegovom hidrolizom ∆G o'= -30,5 kJ/mol, što je neki prosek
visokoenergetskih veza fosforilisanih jedinjenja; on služi kao intermedijer između fosforilisanih molekula donora energije i niskoenergetskih akceptora te energije u obliku fosfata. Enzimi kinaze katalizuju transfer γ-fosforne grupe na alkoholne, karboksilne i gvanido grupe – kinazni efekat . On učestvuje i u prenosu difosfata (γ- i β-fosforne grupe istovremeno); prenosu nukleotidilnog dela (adenilacija); prenosu adenozina... Sa druge strane on se može sintetisati u živim sistemima na tri načina:
65
Oksidativni metabolizam formira gradijent protona na unutrašnjoj me mbrani mitohondrija i njeno vraćanje u normalu je povezano sa sintezom ATP -a od ADP-a i inorganskog fosfata; ovaj proces je u procesu fotosinteze označen kao fosforilacija Fosforilacija na nivou supstrata – ADP prihvata fosfornu grupu sa energijom bogatih fosforilisanih jedinjenja
Sinteza od AMP-a u dvostepenoj reakciji; prvi korak katalizuje adenilat kinaza (AMP + ATP ↔ 2
ADP); u drugom koraku se nastali ADP fosforiliše na neki od gore navedenih načina ATP se više ponaša kao slobodni prenosilac energije u živim sistemima, nego kao rezervoar energije – njegov poluvek je jako kratak. ATP se sastoji iz nukleozida adenozina za koga je vezana α-fosforna grupa fosfoestarskom vezom; dok su β- i γ -fosforne grupe sukcesivno vezane fosfoanhidridnim vezama. U tim uslovima postoji parcijalno pozitivno naelektrisanje na fosfornim atomima, koji su okruženi negativno naelektrisanim kiseonicima. Hidroliza ATP-a na ADP i jednu fosfatnu grupu daje energiju za mnoge
esencijalne biohemijske procese; i to je omogućeno konformacionim promenama koje se dešavaju na enzimima kada se za njih veže ATP. Egzergona hidroliza vezanog ATP-a, na ADP i jednu fosfatnu grupu koji napuštaju enzim omogućava da se reakcije dešavaju usmereno i ireverzibilno. U nekim reakcijama dolazi i do razlaganja ATP-a na AMP i pirofosfat, i tad se pirofosfat brzo hidrolizuje na dva ortofosfata što katalizuje anorganska pirofosfataza, i to je jako egzergona reakcija. Slobodna energija te hidrolize se
koristi u živim sistemima za odigravanje reakcija koje su po pr irodi egzergone. Pirofosfatno razlaganje ATP-a je vezano za aktivaciju masnih kiselina i biosintezu nukleotida, kao i za urea ciklus...
81. Koenzim Q - građa i funkcija: Ubikvinon (koenzim Q - CoQ) je izoprenoidni derivat rastvoren u lipidima, koji je uključen u
funkcionisanje u funkcionisanje samog respiratornog lanca u mitohondrijama. On je kvinonski derivat sa
dugačkim bočnim izoprenoidnim lancem (kod sisara je izgrađen od deset jedinica). Ubikvinon omogućava reverzibilno preuzimanje i odavanje dva H-atoma u respiratornom lancu. On se tako transfomriše u ubikvinol Q (QH 2), i to preko semikvinonskog intermedijera (Q●-). Ova u ulju rastvorna, vitaminu slična supstanca je prisutna u većini eukariotskih ćelija, prvenstveno u mitohondrijama. Ona je komponenta lanca transporta elektrona – respiratorni lanac; i učestvuje u aerobnoj ćelijskoj respiraciji , generišući energiju u obliku ATP -a. Stoga, organi sa najvišim zahtevom za
energiju, kao što su srce, jetra i bubrezi, imaju najviše koncentracije CoQ10 . Postoje tri redoks stanja koenzima Q10: potpuno oksidizovano (ubikvinon), semikvinon (ubisemikvinon), i potpuno redukovano (ubikvinol). Sposobnost ovog molekula da postoji u potpuno oksidovanoj formi i potpuno redukovanoj
formi omogućava mu da izvodi svoju funkciju u lancu transporta elektrona i da deluje kao antioksidans.
82. Protonski gradijent i respiratorni lanac: Respiratornom lancu pripada serija prenosilaca elektrona sa NADH i FADH 2, na molekularni kiseonik – respiratorni enzimi . Prenos elektrona je direktno povezan sa biosintezom ATP-a. Submitohondrijalni
fragmenti su u stanju da vrše određene delove respiratornog lanca, ali su za punu aktivnost potrebni
66
citohrom c i ubikvinon. Elektroni se respiratornom lancu, koji se sastoji od četiri kompleksa, pridružuju
na dva mesta preko NADH-CoQ-reduktaze i koenzima Q.
Četiri kompleksa respiratornog lanca su uronjena u unutrašnju membranu mitohondrija. Svaki kompleks se sastoji od nekoliko proteinskih komponenti za koje su vezane različite redoks-aktivne pro stetičke grupe , čiji je redoks potencijal sukcesivno rastuć. Kompleksi su lateralno mobilni u membrani – ne formiraju neku rigidnu strukturu; i prisutni su u ekvimolarnim odnosima sa specif ičnom topološkom organizacijom. Kompleks I je flavoprotein NADH-CoQ-reduktaza, koji poseduje FMN kao koenzim, kao i nekoliko gvožđe-sumpor proteina tipa 2Fe-2S i 4Fe-4S. Na ovom kompleksu dolazi do reoksidacije NADH, pri čemu on odaje svoje elektrone koji se prenose do koenzima Q. Uloga FMN-a i CoQ da
omoguće prenos po jednog elektrona sa donora NADH (koji nosi dva elektrona) na akceptora koji može primiti tačno jedan elektron (citohromi kompleksa III). Kompleks II je sukcinat-CoQ-reduktaza koja prebacuje elektrone sa sukcinata na CoQ. Kompleks III je citohrom c reduktaza, koja učestvuje u prebacivanju elektrona sa redukovanog CoQ na citohrom c. Citohrom c je periferni membranski protein,
koji je veoma slabo vezan za spoljašnju stranu unutrašnje membrane mitohondrija, a može se alternativno vezati i za citohrom c 1 ili citohrom c oksidazu na Kompleksu IV , tako da on predstavlja
prenosioca elektrona između ova dva kompleksa. Mesto vezivanja citohroma c za ove komponente izgrađuju bočni ostaci nekoliko molekula lizina, koji grade prsten oko hema uronjenog u citohrom. Lizinski ostaci su neophodni za pravilno funkcionisanje citohroma c, kao i za vezi vanje sa Kompleksom IV . Mesta za koje se citohrom c vezuje na obe komponente, su negativno naelektrisana i komplementarna su njegovom prstenu pozitivno naelektrisanih lizinskih ostataka. Citohrom c preoksidaza katalizuje
redukciju organskih hidroperoksida pomoću dva elektrona u ciklusu od tri sukcesivne reakcije, u kojima dolazi do oksidacije dva molekula citohroma c: CCP + ROOH + 2 H+ → CCP(I)2+ + ROH + H20 CCPI2+ + Cyt c [Fe2+] → CCP(II)+ + Cyt c [Fe3+] CCPII+ + Cyt c [Fe2+] → CCP + Cyt c [Fe3+] CCP(I)2+ predstavlja 2e-oksidovano stanje, a CCP(II)+ predstavlja 1e-oksidativno stanje citohrom c
peroksidaze. Ona se nalazi u istim količinama kao i citohrom c, a ima dva specifična mesta za njegovo vezivanje – jedno ima visok afinitet prema citohromu c, ali omogućava nisko efikasan prenos elektrona;
dok drugo ima nizak afinitet prema citohromu c, ali omogućava jako efikasan prenos elektrona. Kompleks IV je citohrom c oksidaza koja katalizuje prenos četiri elektrona sa redukovanog citohroma c na jedan O2. 4Cyt c [Fe2+] + 4 H+ + O2 → 4 Cyt c [Fe3+] + 2 H2O
Prenos elektrona se vrši pojedinačno, zato što je redoks centar citohroma gvožđe u porfirinskom prstenu hema i ono može prim ati ili odavati samo jedan elektron u jedinici vremena. Molekularni kiseonik je idealan terminalni akceptor elektrona, jer poseduje visok afinitet za elektrone. On ih prima postepeno,
tako da transfer četiri elektrona na njega rezultira u formiranju dva mo lekula vode. Primanje jednog 67
elektrona daje jako opasan superoksidni anjon ( O2-). Zato i citohrom oksidaza funkcioniše postepenim
uvođenjem elektrona, prevodeći kiseonik u njegov bezbedan proizvod – vodu. Reakcije redukcije kiseonika se odigravaju na binuklearnom kompleksu Cyt a [Fe 3+ ] CuB2+. Ovaj proces podrazumeva
pojedinačan transfer četiri elektrona sa citohrom c na molekularni kiseonik, gde je direktan i jedini donor elektrona specifično mesto citohrom c oksidaze za koje su vezani Cyt a i CuA. Serija reakcija otpočinje redukcijom Cyt a [Fe3+ ] CuB2+ kompleksa i to pojediničanim prenošenjem dva elektrona sa Cyt c preko Cyt a-Cu A-centra. Prvi elektron se koristi za redukciju jona bakra, čime se dobija poluredukovano stanje kompleksa - Cyt a [Fe3+ ] CuB+. Za ovaj kompleks se vezuje kiseonik i to između
jona gvožđa i bakra. Internom međusobnom distribucijom elektrona, nastaje stabilan adukt, odnosno kiseonik se konvertuje u dianjon (Fe3+-O---O-••CuB+). Prenos trećeg elektrona, zajedno sa prihvatanjem jednog protona, konvertuje dinajon kiseonika u novo stanje (Fe3+-O---OH••CuB+). Prihvatanje drugog protona i rearanžman elektrona rezultira u formiranju fenilnog oksidovanog intermedijera gvožđa ( Fe4+), koji za sebe ima vezan superoksidni jon kiseonika (O2-), i kao posledica toga nastaje novo stanje binuklearnog kompleksa (Fe4+==O2-••H 2O-CuB+). Prihvatanjem poslednjeg elektrona i rearanžmanom protona, binuklearni kompleks se modifikuje u novo stanje (Fe3+-OH -••-OH-CuB+). Na kraju ovog ciklusa prihvatanje još dva protona, daje finalani proizvod reakcije dva molekula vode, dok se kompleks
citohrom c oksidaza vraća u prvobitno stanje - Cyt a [Fe3+ ] CuB2+. Biološki značaj respiratornog lanca je u obezbeđivanju većeg broja koraka u prenosu redukcionog potencijala, što omogućava postepeno oslobađanje energije i njenu konverziju u ATP. U konverziju energije su takođe uključeni i protoni koji se oslobađaju i apsorbuju u ovom procesu. U procesu prenosa elektrona do molekularnog kiseonika kroz respiratorni ciklus, istovremeno se dešava i ispumpavanje protona iz matriksa mitohondrija , kroz unutrašnju membranu u intermembranski prostor. Ovaj proces generiše elektrohemijski gradijent protona kroz unutrašnju membranu . Matriks mitohondrija, inače ima jako manju kocentraciju protona nego intermembranski prostor, i formiranje elektrohemijskog gradijenta je uslov za funkcionisanje oksidativne fosforilacije. Translokacija protona se
vrši na tri mesta u respiratornom lancu i to omogućavaju NADH-CoQ-reduktaza, citohrom c reduktaza i citohrom c oksidaza. Izbacivanje protona se najverovatnije vrši mehanizmom redoks petlje ili mehanizmom protosnke pumpe.
U mehanizmu redoks petljom su redoks centri respiratornog lanca raspoređeni tako da se redukcija vrši simutlanim prihvatanjem elektrona i protona sa unutrašnje strane unutrašnje membrane . Reoksidacija
jednog redoks-centra drugim u respiratornom lancu uslovljava otpuštanje protona u međumembranski prostor i prebacivanje elektrona nazad na unutrašnju stranu unutrašnje membrane. Zato elektroni prelaze sa jednog na drugi redoks centar, dok se translokacijom protona formira elektrohemijski gradijent (∆pH) kroz unutrašnju membranu mitohondrije. Mehanizam redoks petlje podrazumeva da prvi redoks-nosač sadrži više vodoničnih atoma u svom redukovanom nego oksidovanom stanju, a da u drugom redoks nosaču nema razlike u sadržaju vodonikovih atoma između redukovanog i oksidovanog
stanja. Znači on zahteva postojanje alternativnih prenosioca protona i elektrona, i prenosioca samo elektrona. Neki redoks-nosači, poput FMN i CoQ zaista poseduju više vodonikovih atoma u redukovanom
68
nego u oksidovanom stanju i sposobni su da se ponašaju kao istovremeni nosači i protona i elek trona. Ako se oni prostorno kombinuju sa nosačima isključivo elektrona, onda mehanizam redoks petlje ima realnu osnovu za funkcionisanje. Međutim, postoji nedostatak nosača i protona i elektrona, koji bi alternirali sa nosačima elektrona – ima mnogo više nosača isključivo elektrona, dok i protone mogu nositi samo FMN i CoQ. U respiratonrom lancu postoje tri kompleksa sa promenama standardnog redoks
potencijala, što sugeriše da moraju postojati najmanje tri mesta gde se vrši translokacija protona. Pretpostavljeno je da je treće mesto ustvari opet CoQ – Peter Mitchell je mislio da ona dva puta učestvuje kao translator protona – CoQ ciklus. Ovaj ciklus omogućava i translokaciju protona u intermembranski prostor i prenos elektrona sa Kompleksa I na citohrom C. Koenzim Q učestvuje u dva ciklusa reoksidacije koji uključuju formiranje stabilnog semikvinonskog inermedijera ovog koenzima – CoQ •-. Kompletan ciklus se sastoji od dva podciklusa: 1. Podciklus 1:
Prenos redukcionog potencijala sa Kompleksa I na CoQ na unutrašnjoj strani unutrašnje membrane i dobijanje redukovane forme koenzima CoQH 2
Difundovanje QH 2 kroz unutrašnju membranu ka intermembranskom prostoru gde dolazi do otpuštanja dva protona i redukcije gvožđe -sumpornog proteina – ISP protein , pri čemu se formira semikvinonska forma - Q•-
Redukovani ISP sukcesivno redukuje citohrom c 1
Semikvinosnki derivat redukuje citohrom b ,I pri čemu se oslobađa oksidovana forma koenzima – Q
Q difunduje nazad ka unutrašnjoj strani unutrašnje membrane; istovremeno cithrom
bL redukuje citohrom bH , koji redukuje Q u semikvinonsku formu CoQ•2. Podciklus 2:
Semikvinonska forma CoQ•- redukuje, pomoću citohroma bH, dva protona iz matriksa
mitohondrije u CoQH 2
Opšti pregled transfera dva elektrona sa CoQH 2 na citohrom c1 se može pokazati jednačinom: CoQH2 + 2 Cyt c 1 [Fe3+] + 2 H+ (iz matriksa) → CoQ + 2 Cyt c 1 [Fe2+] + 4H+
Prema tome polovina elektrona solobođena oksidacijom CoQH2 u CoQ se koriste za ponovnu redukciju CoQ u CoQH2. Mehanizam protonske pumpe ne uključuje redoks-centre kao nosače protona u njihovo j translokaciji iz matriksa u intermembranski prostor, to jest u formiranje elektrohemijskog gradijenta protona. Po ovom mehanizmu, transfer elektrona indukuje konformacione promene protonske pumpe, i translokacija
protona je rezultat promena pK vrednosti bočnih grupa aminokiselina u protonskim pumpama i njihove izloženosti unutrašnjoj ili spoljašnjoj strani unutrašnje membrane. Na svakom mestu translokacije, neki broj protona se veže za bočne grupe specifičnih aminokiselina u protonskoj pumpi okrenutoj ka matriksu mitohondrije. Redukcija izaziva konformacione promene ove pumpe, što za posledicu ima izlaganje bočnih grupa aminokiselina intermembranskom prostoru u koga protoni disosuju. Reoksidacija pump e, rezultira u novoj konformacionoj promeni koja je prevodi u originalno stanje – okreće ga ka matriksu. 69
Navedena mesta translokacije protona su i mesta na kojima se formira dovoljan elektrohemijski gradijent protona, potreban za biosintezu ATP-a. Ta tri mesta su identifikovana upoređivanjem broja sintetisanih molekula ATP-a nakon oksidacije različitih supstrata i termodinamičkim izračunavanjima.
83. Komponente respiratornog lanca: Četiri kompleksa respiratornog lanca su uronjena u unutrašnju membranu mitohondrija. Svaki kompleks se sastoji od nekoliko proteinskih komponenti za koje su vezane različite redoks-aktivne prostetičke grupe, čiji je redoks potencijal sukcesivno rastuć. Kompleksi su lateralno mobilni u membrani – ne formiraju neku rigidnu strukturu; i prisutni su u ekvimolarnim odnosima sa specifičnom topološkom organizacijom. Kompleks I je flavoprotein NADH-CoQ-reduktaza, koji poseduje FMN kao koenzim, kao i nekoliko
gvožđe-sumpor proteina tipa 2Fe-2S i 4Fe-4S. Na ovom kompleksu dolazi do reoksidacije NADH, pri čemu on odaje svoje elektrone koji se prenose do koenzima Q. I FMN i CoQ mogu egzistirati u tri oksidaciona stanja – oni su u stanju da sukcesivno prihvate i predaju jedan ili dva elektrona, sa obzirom da su stabilni i u intermedijernom oskidovanom stanju, semikvinonskoj formi. To omogućava da se na FMN može prebacivati jedan po jedan elektron sa NADH, a odatle i na CoQ. Koenzim Q je solubilan u lipidnom sloju unutrašnje membrane, on poseduje mobilnost čime omogućava prenos elektrona na citohrome kompleksa III . Oni su u stanju da preuzmu samo jedan elektron u jednom koraku, pošto je njihov redoks-centar atom gvožđa hema – stoga je uloga FMN-a i CoQ da omoguće prenos po jednog elektrona sa donora NADH (koji nosi dva elektrona) na akceptora koji moće primiti tačno jedan elektron . Kompleks II je sukcinat-CoQ-reduktaza koja se sastoji od pet subjedinica – dve su dimer sukcinat dehidrogenaze, a ostale tri su male hidrofobne jedinice. Ima kovalentno vezan FAD kao koenzim, tri
gvožđe-sumporna proteina (dva 2Fe-2S i jedan 4Fe-4S) i citohrom b. Ovaj kompleks prebacuje elektrone sa sukcinata na CoQ. Kompleks III je citohrom c reduktaza, koja učestvuje u prebacivanju elektrona sa redukovanog CoQ na
citohrom c. On se sastoji iz dve identične subjedinice i poseduje i dva tipa citohroma b – cyt bH i cyt bL;
koji se razlikuju po talasnim dužinama maksimalne apsorpcije svetlosti. Pored nj ih kompleks poseduje jedan gvožđe-sumporni protein (2Fe-2S) i naravno citohrom c 1. Citohrom c je periferni membranski protein, koji je veoma slabo vezan za spoljašnju stranu unutrašnje membrane mitohondrija, a može se alternativno vezati i za citohrom c 1 ili citohrom c oksidazu na Kompleksu IV , tako da on predstavlja prenosioca elektrona između ova dva kompleksa. Mesto vezivanja citohroma c za ove komponente
izgrađuju bočni ostaci nekoliko molekula lizina, koji grade prsten oko hema uronjenog u citohrom. Lizinski ostaci su neophodni za pravilno funkcionisanje citohroma c, kao i za vezivanje sa Kompleksom IV. Mesta za koje se citohrom c vezuje na obe komponente, su negativno naelektrisana i komplementarna su njegovom prstenu pozitivno naelektrisanih lizinskih ostataka. Citohrom c preoksidaza je jedini
redokspartner citohroma c čija je atomska struktura definisana. To je monomerni protein koji ima za sebe vezan hem. CCP katalizuje redukciju organskih hidroperoksida pomoću dva elektrona u ciklusu od tri sukcesivne reakcije, u kojima dolazi do oksidacije dva molekula citohroma c. Ona se nalazi u istim
količinama kao i citohrom c, a ima dva specifična mesta za njegovo vezivanje – jedno ima visok afinitet 70
prema citohromu c, ali omogućava nisko efikasan prenos elektrona; dok drugo ima nizak afinitet prema citohromu c, ali omogućava jako efikasan prenos elektrona. Kompleks IV je citohrom c oksidaza koja katalizuje prenos četiri elektrona sa redukovanog citohroma c
na jedan O2. Prenos elektrona se vrši pojedinačno, zato što je redoks centar citohroma gvožđe u porfirinskom prstenu hema i ono može primati ili odavati samo jedan elektron u jedinici vremena. Kod
sisara Kompleks IV je transmembranski protein, čije su najveće i najhidrofobnije subjedinice kodirane od strane mitohondrijalne DNK. Na unutrašnjoj membrani mitohondrija, ovaj kompleks egzistira kao višesubjedinični dimer. Subjedinice I i II učestvuju u prebacivanju elektrona sa citohroma c na molekularni kiseonik. One sadrže dva molekula Hema A i dva atoma bakra. Oba hema su identične strukture, ali su označeni kao Hem a i Hem a3, dok atomi bakra imaju oznake Cu A i CuB. Cu A je vezan za subjedinicu II preko bočnih grupa cisteina i histidina. Mesto vezivanja citohroma c za ovaj enzim obrazuju subjedinica II i III, izgrađujući udubljenje u koje se on smešta. Hem a i Hem a3, kao i drugi atom bakra (CuB) su vezani za subjedinicu I.
84. Oksidativna fosforilacija: Potpunu oksidaciju glukoze omogućavaju respiratorni lanac u kome se prenosom elektrona oslobađa energija, i oksidativna fosforilacija, proces u kome dolazi do sinteze ATP-a.
Enzim koji koristi
elektrohemijski gradijent protona za sintezu ATP-a se naziva ATP sintaza. Eksperimenti su pokazali da sama biosinteza ne zavisi direktno od protoka protona, ali oslobađanje sintetisanog ATP-a sa enzima je uslovljeno gradijentom protona. Sinteza ATP-a se vrši tako što terminalni kiseonik ADP -a vrši nukleofilni
napad na fosforni atom inorganskog fosfata, čime se dobija nestabilni pentakovalentni intermedijer buduće γ-fosforne grupe ATP-a, koji će se transformisati u stabilne forme ATP-a i vode. Mehanizam katalize sinteze ATP-a od strane ATP sintaze, koja prolazi kroz konformacione promene zbog
prolaska protona kroz nju se može podeliti u tri faze: 1. Translokacija protona koji omogućava F 0- komponenta 2. Kataliza formiranja fosfoanhidridne veze između β - i γ -fosfornih atoma u ATP-u od strane F 1komponente
3. Povezivanje opadanja gradijenta protona sa sintezom ATP-a interakcijom F 1 i F 0 komponenti Komponenta F1 poseduje tri katalitičke subjedinice, od kojih se svaka nalazi u različitom konformacionom stanju. Jedna subjedinica labavo vezuje supstrat (ADP i PI) kao i produkt reakcije (ATP)
– L-stanje, bez katalitičke aktivnosti. Duga subjedinica je u konformaciji koja omogućava čvrsto vezivanje obe komponente za nju – T-stanje, sa katalitičkom aktivnošću. Treća je u konformaciji koja uopšte ne može da veže ni jednu komponentu – Q-stanje, bez katalitičke aktivnosti. Sve tri subjedinice ove komponente se mogu naći u bilo kojem od ovih stanja.
Proces sinteze ATP-a počinje vezivanjem ADP-a i Pi za subjedinicu u L-stanju, nakon čega protok protona kroz enzim omogućava promenu konformacionog stanja enzima, tako da subjedinica koja je bila u Lstanju prelazi u T-stanje, uz smanjenje gradijenta protona. Ovaj korak uslovljava i konformacione
71
promene druge dve subjedinice tako da subjedinica za koju je vezan ATP, sintetisan u prethodnom ciklusu, prelazi u O-stanje čime se on oslobađa; dok se poslednja subjedinica konvertuj e iz O- u L-stanje,
tako da će se u sledećem ciklusu za nju vezati ADP i Pi. U isto vreme dolazi do biosinteze ATP-a na subjedinici u T-stanju. Pretpostavlja se da se slobodna energija transfera protona kroz ATP sintazu koristi za rotaciju katalitičkog centra enzima, u odnosu na ostale delove enzima. U tom procesu γ-subjedinica omogućava
povezivanje iskorišćavanja energije gradijenta protona i konformacione promene katalitičkog centra. Sintetisani ATP u mitohondrijama se mora transportovati u citoplazmu za biosintetske reakcije koje ga
koriste i prevode u ADP i Pi, koji se moraju vratiti u mitohondriju. Ni jedno od ovih jedinjenja ne može slobodno difundovati kroz membranu, stoga moraju postojati nekakvi mehanizmi njhivog transporta. Translokaza fosfata je odovorna za transport inorganskog fosfora uz istovremeno ubacivanje jednog
protona u matriks – simport sistem. Translokaza adeninskog nukleotida transportuje ADP u matriks mitohondrija, i u isto vreme izbacuje novosintetisani ATP – antiport sistem. Ustanovljeni gradijent
protona kroz unutrašnju membranu omogućava i ove procese. Kompleks translokaza fosfata i adeninskog nukleotida, i ATP sintaze, se mogu izolovati kao jedan kompleks nazvan ATP sintaza. Translokaza adeninskog nukleotida je dimer, sastavljen od dve identične subjedinice sa jednim mestom vezivanja za nukleotid – za njega kompetitiraju ADP i ATP. Ona egzistira dva konformaciona, alosterička stanja – jedno stanje je okrenuto ka citoplazmi i za njega se vezuje ADP, a drugo je okrenuto ka matriksu mitohondrija i za njega se vezuje ATP . Pozitivno naelektrisanje intermembranskog prostora indukuje vezivanje ADP-a
i njegovu everziju koja omogućava oslobađanje ADP-a u matriks. Nakon toga za translokator se vezuje ATP koji indukuje everziju ka intermembranskom prostoru gde se on oslobađa – pozitivno naelektrisanje u intermembranskom prostoru favorizuje izbacivanje molekula sa većim negativnim naelektrisanjem. Respiratorni lanac i oksidativna fosforilacija su veoma usko povezani procesi. Respiratorni lanac formira i
uvećava elektrohemijski gradijent protona kroz unutrašnju membranu, koji se koristi u procesu oksdiativne fosforilacije za sintetisanje ATP-a, što dovodi do opadanja gradijenta na unutrašnjoj strani unutrašnje membrane, čime se membrana vraća u prvobitno stanje. U stanju mirovanj a elektrohemijski gradijent protona kroz unutrašnju membranu raste do određene granice, a tada sam sprečava dalju translokaciju protona kroz membran u u međumembranski prostor – time dolazi do sprečavanja transporta elektrona u respiratornom lancu.
Moguće je postići razdvajanje ova dva procesa i to tretiranjem mitohondrije slabom, lipofilnom kiselinom - 2,4-dinitrofenolom (DNP ); koja čini membranu permeabilnom za protone – ona ih prenosi kroz unutrašnju membranu mitohondrija niz gradijent koncentracije – iz intermembranskog prostora u matriks. Na taj način, on smanjuje vrednost elektrohemijskog gradijenta protona, a to za posledicu ima nastavljanje aktivnosti respiratornog lanca i transport protona bez oksidativne fosforilacije – dolazi do odvajanja ova dva procesa. Efekat DNP – smanjivanje elektrohemijskog gradijenta i njegovo odvajanje od oksidativne fosforilacije; rezultira generisanjem toplote. Ovaj fenomen se nalazi u mrkom adipoznom tkivu, koje poseduje veliku koncentraicju triacilglicerola i veliki broj mitohondrija. Mitohondrije ovog
72
tkiva poseduju protein termogenin koji formira kanale kroz unutrašnju membranu mitohondrija čime se
omogućava protok protona kroz nju. ATP, GDP i GTP inhibiraju protok protona kroz ovaj protein, ali se to prevazilazi slobodnim masnim kiselinama, koje same inhibiraju efekat ovih nukleotida. Koncentraciju slobodnih masnih kiselina u mrkom masnom tkivu kontroliše hormon norepinefrin, gde je cAMP sekundarni glasnik.
85. Energetika respiratornog lanca i sinteza ATP : Promena standardne slobodne energije (∆Goˈ) koja se dešava kada reaguje redoks par poznatih standardnih redoks potencijala se izračunava preko sledećeg izraza: ∆Goˈ= - nF∆εoˈ (n – broj elektrona koji se prenosi; F = 96.5 kJ/molV – Faradejeva konstanta koja označava promnu energije prelaska jednog mola elektrona kroz potencijal jednog volta; ∆εoˈ - promena standadnog redoks potencijala)
∆εoˈ= ∆εoˈA - ∆εoˈD ( ∆εoˈ A – promena redoks potencijala akceptora elektrona redoks para, ∆εoˈD – promena redoks potencijala donora elektrona redoks para) Shodno zakonima termodinamike, tok reakcije nema uticaja ni na promenu redoks potencijala ni slobodne energije – računa se samo početno i krajnje stanje. U slučaju respiratornog lanca, ova promena redoks potencijala je jedanaka:
∆εoˈ= ∆εoˈO2 - ∆εoˈNADH ∆εoˈ= O.815 – (-O.315) ∆εoˈ= 1.13 V Ubacivanjem ove vrednosti u jednačinu za izračunavanje slobodne energije dobija se: ∆Goˈ= - 2•96.494•1.13 ∆Goˈ= - 218.08 kJ/mol Ova velika promena slobodne energije rezultira u oslobađanju velike količine energije u tri energetska paketa zahvaljujući respiratornom lancu – on omogućava biosintezu po tri molekula ATP -a u procesu oksidativne fosforilacije. Biosinteza ATP-a od ADP-a i P I je enderogon proces koji zahteva dodatan izvor energije i katalizovana je enzimom ATP-sintazom. Proces korišćenja energije oslobođene u respiratornom lancu za biosintezu ATP -
a se može posmatrati u dva akpekta:
73
1. Egzergon proces prenosa elektrona od NADH do O 2 NADH + H+ + ½ O2 → NAD+ + H2O; ∆Goˈ= - 218,08 kJ/mol 2. Endergon proces korišćenja energije oslobođene u respiratornom lancu za biosintezu ATP-a ADP + PI + H+ → ATP + H2O; ∆Goˈ= +30,5 kJ/mol
86. Prebacivanje redukcionog potencijala iz citoplazme u mitohondriju: Već je rečeno da je spoljašnja membrana mitohondrija veoma permeabilna, i za razliku od nje unutrašnja je jako nepermeabilna za većinu hidrofilnih supstanci. Zbog toga mitohondrije imaju specijalne transportne sisteme koji omogućavaju da se m etaboliti sintetisani u mitohondrijama, prekursori za razne procese u citoplazmi, izbace iz mitohondrija; kao i sisteme koji omogućavaju ulazak NADH u mitohondrije. NADH , nastao glikolizom u citoplazmi, se mora reoksidovati i predati svoj redoks potencijal
respiratornom lancu u unutrašnjoj membrani, koja je potpuno nepropustljiva za njega. Kod insekata je prisutan glicerofosfatni transporter , koji daje 2 ATP-a za svaki reoksidovani NADH. On se oksiduje do NAD+ pod delovanjem 3-fosfoglicerol dehidrogenaze, i predaje svoj redoks potencijal dihidroksiacetonu
pri čemu se dobija 3-fosfoglicerol koji može slobodno da prođe kroz spoljašnju membranu i uđe u intermembranski prostor. Tamo se njegovi elektroni prebacuju na mitohondrijalnu 3 -fosfoglicerol dehidrogenazu, koja ima FAD kao koenzim. Novonastali dihidroksiaceton difunduje nazad u citoplazmu,
dok se FADH2 reoksiduje u FAD, predajući elektrone respiratornom lancu. Malatatransportni sistem prisutan kod sisara daje 3 ATP-a za svaki reoksidovani NADH. On se reoksiduje pod delovanjem enzima malat dehidrogenaze koja prevodi oksalacetat u malat. Nastali malat prolazi
kroz unutrašnju membranu mitohondrija preko malat↔α-ketoglutarat antiport transportnog sistema, preko koga se malat uvodi, a α-ketoglutarat izbacuje iz mitohondrije. Malat je u mitohondrijama supstrat za mitohondrijalnu malat dehidrogenazu koja ga vraća u oksalacetat i istovremeno redukuje NAD+ nazad u NADH koji će se opet reoksidovati u respiratornom ciklusu . Oksalacetat se procesom transaminacije prevodi u aspartat pod delovanjem enzima aspartat aminotransferaze, pri čemu se vrši konverzija i glutamata u α-ketoglutarat. Aspartat se transportuje iz matriksa u citoplazmu preko
glutamat↔aspartat antiport transportnog sistema ; i u citoplazmi se prevodi nazad u oksalacetat.
87. Struktura ATP sintaze: ATP sintaza ili Kompleks V je enzim koji koristi elektrohemijski graidjent protona za sintezu molekula
ATP-a. Ona je fizički odvojena od proteina koji učestvuju u transportu elektrona, i predstavlja
najkompleksniju strukturu unutrašnje membrane mitohondrija. Ovaj enzim je pečurkastog oblika, okrenut ka matriksu mitohondrija i sastavljen iz dve funkcionalne jedinice, međusobno povezane inhibitorom:
74
Komponenta F 1 – hidrofilni, periferni, membranski protein sastavljen iz pet subjedinica
stehiometrije – α3β3γεδ; katalitičko mesto formirarju tri β-subjedinice; δ-subjedinica je odgovorna za vezivanje komponente F1 za F 0; ovaj protein nema sposobnost sinteze ATP-a, ali ga mogu hidrolizovati; sjedivanje ove dve komponente rezultira u uspostavljanju aktivnosti enzima u sintezi ATP-a
Komponenta F 0 – hidrofobni, transmembranski protein, sastavljen iz 10-12 različitih tipova
subjedinica; šest istih subjedinica verovatno formira kanal za translokaciju protona Komponenta F 1-inhibitor – sastoji se iz nekoliko različitih proteina od kojih najvažniji onaj za koga se vezuje antibiotik oligomicin; vezivanje tog antibiotika izaziva prekid sinteze ATP-a usled
onemogućavanja korišćenja gradijenta protona kroz enzim Komponenta F1 poseduje tri katalitičke subjedinice, od kojih se svaka nalazi u različitom konformacionom stanju. Jedna subjedinica labavo vezuje supstrat (ADP i PI) kao i produkt reakcije (ATP)
– L-stanje, bez katalitičke aktivnosti. Duga subjedinica je u konformaciji koja omogućava čvrsto vezivanje obe komponente za nju – T-stanje, sa katalitičkom aktivnošću. Treća je u konformaciji koja uopšte ne može da veže ni jednu komponentu – Q-stanje, bez katalitičke aktivnosti. Sve tri subjedinice ove komponente se mogu naći u bilo kojem od ovih stanja.
88. Hemiosmotska hipoteza o sintezi ATP (po Mitchell-u): Hemiosmotska hipoteza o procesu sinteze ATP-a, koju je postavio Peter Mitchell, je hipoteza sa najviše
eksperimentalnih dokaza.
Po ovoj hipotezi, povezivanje reakcija koje oslobađaju energiju, sa reakcijama koje je koriste se odvija preko visokoenergetskih intermedijernih stanja, a ne preko molekula sa visokom energijom.
Elektrhemijski gradijent protona kroz unutrašnju membranu mitohondrija obezbeđuje tok energije od transporta elektrona ka oksidativnoj fosforilaciji, tako da unutrašnja membrana ustvari predstavlja pvoezujući mehanizam ova dva procesa. Uloga prenosioca elektrona u respiratornom lancu je da obezbedi translokaciju protona kroz unutrašnju membranu koja je za njih inače nepropustljiva. Formirani elektrohemijski gradijent je to što omogućava sintezu ATP-a. Na osnovu toga, opšta jednačina respiratornog lanca i oksidativne fosforilacije se može prikazati jednačinom: NADH + H+ + 3 ADP + 3 P I → NAD+ + 4 H2O + 3 ATP
Ova jednačina ukazuje da su ADP i fosforna grupa neophodni za prenos elektrona sa NADH na molekularni kiseonik, što je i eksperimentalno dokazano – akceptorska kontrola respiracije.
89. Amfibolička priroda Ciklusa limunske kiseline: Ciklus limunske kiseline je glavni biohemijski put u kome se završavaju katabolizmi saharida, lipida i
nekih aminokiselina pri čemu se dobija ATP. On predstavlja izvor prekursora i za anaboličke i kataboličke reakcije – amfibolička priroda Ciklusa limunske kiseline . 75
Oksalacetat je glavni prekursor za biosintezu saharida, i pošto on ne može napustiti mitohonrdije
prevodi se u malat, koji prolazi kroz membranu mitohondrija i odlazi u citoplazmu gde se dešava biosinteza saharida. Za biosintezu lipida, i samim tim sintezu masnih kiselina u citoplazmi, je potreban acetil-S-CoA kao startni molekul. Ni on se ne može transportovati kroz mitohondrijalne membrane, tako
da se on generiše u citoplazmi iz citrata, koji mogu izaći kroz membranu mitohondrija. Citrat je u citoplazmi supstrat za enzim ATP-citrat liazu koja ga prevodi u acetil-S-CoA. α-ketoglutarat i oksalacetat su bitni za biosintezu aminokiselina. Aminacijom α-ketoglutarata ili njegovom transaminacijom se dobija glutamat , koji je prekursor za sintezu glutamina, arginina i prolina. Transaminacijom oksalacetata se
dobija aspartat, prekursor za biosintezu asparagina, treonina, metionina i lizina. Sukcinil-S-CoA je prekursor za biosintezu porfirina.
Sa obzirom da se velike količine citrata, oksalacetata i α-ketoglutarata troše na druge biološke procese, morao se uspostaviti način na koji bi obezbedilo pravilno funkcionisanje Ciklusa limunske kiseline. To čine anaplerotičke reakcije .
90. Glioksalatni ciklus: Glikosalatni ciklus je hemijski put koji omogućuje konverziju C2-jedinice u C4-jedinicu (sukcinat ) za
dobijanje energije i biosinteze saharida počevši od acetil-S-CoA nastalog u degradaciji masnih kiselina. On omogućava preskakanje dva koraka dekarboksilacije citrata, prisutnih u Ciklusu limunske kiseline. Dok se u Ciklusu limunske kiseline, po ciklusu uključuje jedan molekul acetil-S-CoA, u Glikosalatnom
ciklusu se uključuju dva molekula acetil-S-CoA. On otpočinje na isti način kao i Ciklus limunske kiseline – kondenzacijom oksalacetata u citrat, i njegovom izomerizacijom u izocitrat . U Glikosalatnom ciklusu
izocitrat ne biva dekarboksilovan, već se razlaže na sukcinat i glikosalat i to pod dejstvom enzima izocitrat liaze. Glikosalat dalje reaguje sa drugim molekulom acetil-S-CoA dajući malat . Ovu reakciju katalizuje malat sintaza, koja je slična citrat sintazi. Nastali malat se pretvara u oksalacetat , čime se Glikosalatni ciklus završava. Suma reakcija ovog ciklusa je: 2 ACETIL-S-CoA + NAD + + 2 H20 → SUKCINAT + 2 HS -CoA + NADH + H+
Biljke i bakterije sintetišu acetil-S-CoA iz acetata u reakciji u kojoj se koristi ATP, a koju katalizuje acil-SCoA sintetaza. ACETAT + HS-CoA + ATP → ACETIL-S-CoA + AMP + PPI
Nastali izocitrat u biljkama i nekim bakterijama, ima dva glavna puta kojima može nastaviti. Pri niskim nivoima ATP-a – kada su nepovoljni energetski uslovi, izocitrat će se oksidovati i dekarboksilovati do αketoglutarata; a ako je energetsko stanje povoljno on će se razložiti na sukcinat i glikosalat. To znači da kod biljaka, ova dva ciklusa kompetitiraju za izocitrat na ovom mestu račvanja reakcija. Pri visokom nivou ATP-a, izocitrat dehidrogenaza se inhibira fosforilacijom, tako da se izocitrat usmerava u Glikosalatni ciklus za sintezu biosintetskih intermedijera. Izocitrat dehidrogenaza će se reaktivirati delovanjem
76
fosfataze koje će hidrolizovati fosfornu grupu sa enzima. Kinaza koja katalizuje fosforilaciju i fosfataza koja katalizuje defosforilaciju se deo jednog polipeptidnog lanca – tandem enzimi . Kod biljaka se Glikosalatni ciklus jednim delom odvija u mitohondrijama, a jednim delom u glioksizomima. U mitohondrijama se oksalacetat konvertuje u aspartat pomoću enzima aspartat aminotransferaze. Nastali aspartat će se transportovati u glioksizom, gde će se ponov o prevesti u
oksalacetat . On će se dalje u glioksizomima kondenzovati sa prvim molekulom acetil -S-CoA, dajući citrat koji će se izomerizovati i izocitrat , koji je supstrat za delovanje izocitrat liaze, koja ga razlaže na sukcinat i
glikosalat. Sukcinat će se transportovati u mitohondrije gde će se prevesti u oksalacetat. Glioksalat će se kondenzovati sa drugim molekulom acetil-S-CoA do malata, uz katalizu malat sintaze. On napušta glioksizom i citoplazmi se oksiduje do oksalacetata pod delovanjem malat dehidrogenaze, koja ima NAD+ kao koenzim. Oksalacetat će se u citoplazmi koristiti u biosintezi glukoze. Krajnji efekat Glikosalatnog ciklusa je konverzija dva acetil-S-CoA u oksalacetat preko glioksalata, umesto
oslobađanja dva molekula ugljendioksida što se dešava u Ciklusu limunske kiseline. Ukupan bilans ovog ciklus i mitohondrijama i glioksizomima se može prikazati na ovaj način. 2 acetil-S-CoA + 2 NAD + + FAD → OKSALACETAT + HS -CoA + 2 NADH + 2 H+ + 2 FADH2
Postojanje izocitrat liaze i malat sintaze u glioksizomima omogućava bilj kama da tokom klijanja semena koriste deponovane triacilglicerole iz semenja, za biosintezu glukoze, prethodno ih prevodeći u acetil-SCoA
91. Povezanost metabolizma preko Ciklusa limunske kiseline: Ciklus limunske kiseline, ili ti Krebsov ciklus, se odigrava u mitohondrijama i omogućava oksidativnu
degradaciju saharida, lipida i aminokiselina i u eukariotskim, i prokariotskim organizmima. Dobijaju se brojni produkti koji su prekursori za biosintezu osnovnih gradivnih blokova. Stoga je i Ciklus limunske kiseline amfibolički put – u njemu se odvijaju i katabolički i anabolički procesi. To je serija biohemijskih
reakcija koje omogućavaju oksidaciju acetilne grupe acetil-S-CoA u dva molekula CO2, pri čemu se oslobađa energija koja se privremeno konzervira putem biosinteze ATP -a. U ciklusu učestvuje osam enzima, i oni katalizuju proces transfera acetil-S-CoA u ugljen-dioksid, uz nastanak tri molekula NADH, jedan FADH2, i jedan GTP. Redukovane forme NADH i FADH2 daju energiju za biosintezu ATP-a u respiratornom lancu u procesu njihove reoksidacije. Energetski bilans Ciklusa limunske kiseline je sinteza 11 molekula ATP-a – devet u toku reoksidacije nastala tri NADH, i dva u toku reoksidacije FADH, u respiratornom lancu. Jedan GTP se dobija u procesu fosforilacije na nivou supstrata. Brzina Krebsovog
ciklusa je veoma precizno kontrolisana da bi se zadovoljile potrebe živog sistema za ATP -om. Ciklus limunske kiseline je glavni biohemijski put u kome se završavaju katabolizmi saharida, lipida i
nekih aminokiselina pri čemu se dobija ATP. On predstavlja izvor prekursora i za anaboličke i kataboličke reakcije – amfibolička priroda Ciklusa limunske kiseline . Oksalacetat je glavni prekursor za biosintezu saharida, i pošto on ne može napustiti mitohonrdije
prevodi se u malat, koji prolazi kroz membranu mitohondrija i odlazi u citoplazmu gde se dešava 77
biosinteza saharida. Za biosintezu lipida, i samim tim sintezu masnih kiselina u citoplazmi, je potreban acetil-S-CoA kao startni molekul. Ni on se ne može transportovati kroz mitohondrijalne membrane, tako
da se on generiše u citoplazmi iz citrata, koji mogu izaći kroz membranu mitohondrija. Citrat je u citoplazmi supstrat za enzim ATP-citrat liazu koja ga prevodi u acetil-S-CoA. α-ketoglutarat i oksalacetat su bitni za biosintezu aminokiselina. Aminacijom α-ketoglutarata ili njegovom transaminacijom se dobija glutamat , koji je prekursor za sintezu glutamina, arginina i prolina. Transaminacijom oksalacetata se
dobija aspartat, prekursor za biosintezu asparagina, treonina, metionina i lizina. Sukcinil-S-CoA je prekursor za biosintezu porfirina.
Sa obzirom da se velike količine citrata, oksalacetata i α -ketoglutarata troše na druge biološke procese, morao se uspostaviti način na koji bi obezbedilo pravilno funkcionisanje Ciklusa limunske kiseline. To čine anaplerotičke reakcije .
92. Povezanost Ciklusa limunske kiseline i Urea ciklusa: Urea se, kod terestričnih organizama, sintetiše u jetri od strane enzima Urea ciklusa.
Ciklus počinje biosintezom karbamoil fosfata, u reakciji koja je katalizovana enzimom karbamoil fosfat sintetazom (CPS). Ova sinteza se odigrava u matriksu mitohondrija i predstavlja kondenzaciju i aktivaciju
NH4+ i HCO3- jona uz hidrolizu dva molekula ATP-a. Karbamoilna grupa sintetisanog karbamoil fosfata se prebacuje na ornitin u reakciji koji katalizuje ornitin transkarbamilaza, i dobija se citrulin. Drugi N-atom uree se uključuje u sledećoj reakciji, koja se odvija u citoplazmi, kada se ureido grupa citrulina kondenzuje sa amino grupom aspartata u reakciji koju katalizuje argininosukcinat sintetaza, uz dobijanje arginino sukcinata. U sledećoj reakciji argininosukcinaza katalizuje njegovo razlaganje na arginin i fumarat . Finalna reakcija ovog ciklusa je hidroliza arginina na ornitin i ureu, uz katalizu enzima arginaze. Nastali ornitin se transportuje nazad u mitohondriju. Prema tome, Ciklus uree konvertuje dve
aminogrupe i jedan C-atom poreklom iz HCO3- u netoksični proizvod ureu, uz utrošak četiri molekula ATP-a. Fumarat , nastao razlaganjem argininosukcinata se vraća u Ciklus limunske kiseline, gde se
prevodi do oksalacetata, čijom se reoksidacijom dobijaju još tri molekula ATP-a. Znači Urea ciklus ne opterećuje organizam energetski. Nastali oksalacetat je supstrat za aspartat aminotransferazu koja omogućava regeneraciju aspartata za potrebe Urea ciklusa. Na taj način su povezani oksidativna deaminacija glutamata, Urea ciklus i Ciklus limunske kiseline.
93. Biosinteza saharoze: Saharoza, disaharid izgrađen od molekula glukoze i fruktoze povezani α1-β2 vezom. On se sintetiše u
šećernoj trsci u procesu od tri koraka: 1. I korak:
Sinteza glukozo-6-fosfata iz glukoze, katalizom enzimom heksokinazom uz utrošak jednog molekula ATP
Prevođenje glukozo-6-fosfata u glukozo-1-fosfat , uz katalizu fosfoglukomutaze
78
, uz oslobađanje PP I i katalizu glukozo-1-P Sinteza UDP-glukoze od glukozo-1-fosfata i UTP uridil transferazom
2. II korak:
Sinteza fruktozo-6-fosfata iz fruktoze, katalizom enzimom heksokinazom uz utrošak jednog molekula ATP
3. III korak:
Reakcija UDP-glukoze i fruktozo-6-fosfata, katalizovana saharozo-P-sintazom , i dobijanje saharozo-fosfata i oslobađanje UDP
Sinteza saharoze , uvođenjem molekula vode u reakcoji i oslobađanjem P ,i uz katalizu saharozo fosfatazom
94. Biosinteza laktoze: Laktoza je disaharid koji se sastoji od molekula β-D-galaktoze i β-D-glukoze koji su vezani preko β(1-4)
glikozidne veze. Biosinteza laktoze se dešava u mlečnim žlezdama sisara, i katalizovana je enzimom laktozo sintazom. Donor galaktozne jedinice je UDP-galaktoza, a akcpetor je glukoza. Laktozo sintaza se
sastoji iz dve subjedinice – galaktozil transferaza (katalitička sub jedinica) i α-laktalmbuin (nema
katalitičku aktivnost). Galaktoil transferaza katalizuje interakciju UDP-galaktoze i N-acetilglukozamina, pri čemu se dobija N-acetil-laktozamin. α-laktalmbuin menja specifičnost galaktozil transferaze, smanjujući afinitet za glukozu, tako da ona postaje akceptor galaktozne jedinice umesto Nacetilglukozamina sa UDP-galaktoze, pri čemu se kao proizvod dobija laktoza.
95. Biosinteza glikogena: Direktna konverzija glukozo-1-fosfata u glikogen i Pi nije termodinamički favorizovana reakcija pri bilo
kojoj fiziološkoj koncentraciji P I. Zbog toga se uvodi dodatni egzergorni korak – biosinteza uridinfosfat glukoze (UDP-glukoza). UDP-glukozo pirofosforilaza katalizuje reakciju bioseinteze UDP-glukoze. Kiseonik fosforne grupe sa
glukozo-1-fosfata vrši napad na α-fosforni atom UTP-a, pri čemu se dobijaju UDP -glukoza i pirofosfat PPI.
Iako je promena slobodne energije ove reakcije približno jednaka nuli, hidroliza PP i na dva PI je visoko egzergona reakcija, koju katalizuje inorganska pirofosfataza. Stoga je ukupna reakcija biosinteze UDPglukoze visoko egzergona. Sintetisana UDP-glukoza je donor glukoznih jeidnica u procesu biosinteze glikogena, pri čemu se glukozna jedinica ugrađuje na neredukujući kraj (C4-OH) postojećeg molekula glikogena, pri čemu se formira α(1-4) glikozidna veza, a UDP se oslobađa. Ove reakcije katalizuje glikogen sintaza. Oslobođeni UDP nukleozid-difosfat kinaza prevodi u UTP, uz utrošak jednog molekula ATP. Glikogen sintaza za svoju aktivnost zahteva starter molekul glikogena (minimum tetramer) i aktivnost ovog enzima raste sa
povećavanjem novoformiranog lanca. Glukogen sintaza nije u stanju da međusobno poveže dve glukozne jedinice, pa ukoliko u ćeliji nema starter molekula biosintezu glikogena otpočinje glikogenin. To je protein koji je svojom OH-grupom tirozina, vezan za molekul glukoze preko C1-atoma. Ovo vezivanje
79
katalizuje tirozin glukoziltransferaza. Glikozilovani protein produžava autokatalitički glukanski lanac do sedam glukoznih jedinica, gde je donor i dalje UDP-glukoza – što je starter molekul za glikogen sintazu.
Takođe, ona katalizuje formiranje samo α(1-4) veza, dok nije u stanju da katalizuje formiranje α(1-6) veza; takod a grananje glikogena katalizuje amilo (1,4→1,6) transglikozilaza , ili ti enzim grananja. Kada u toku sinteze glikogena, grana linearnog polime ra dostigne dužinu od jedanaest glukoznih jedinica, enzim grananja prekida α(1-4) vezu u toj grani i prenosi oko sedam glukoznih jedinica na –CH2OH grupu iste ili neke druge grane formirajući α(1-6) vezu. Novo mesto grananja mora biti udaljeno za najmanje četiri glukozne jedinice od prethodnog.
96. Biosinteza masnih kiselina: Biosinteza masnih kiselina se dosta razlikuje od procesa njihove razgradnje, čak iako je dosta
intermedijera identično. Biosinteza masnih kiselina predstavlja proces dodavanja, kondenzacije C 2 jedinica, dok je β-oksidacija reverzni proces – oduzimanje C 2-jedinica. Osnovne razlike između ova dva procesa jesu: mesto odigravanja (sinteza se odigrava u citoplazmi, a razgradnja u mitohondrijama); u sintezi je nosač rastućeg lanca masne kiseline ACP-protein, a u procesu razgradnje se koristi aktivirana
masna kiselina (u oba slučaja je masna kiselina povezana tioestarskom vezom); redoks koenzimi su različiti (NADPH u sintezi, FAD i NAD+ u β-oksidaciji). U višim organizmima najintenzivnija sinteza se
odigrava u jetri, adipoznom tkivu i mlečnim žlezdama – to su ujedno i mesta gde se sintetiše najveća
količina NADPH. Kod biljaka ovaj proces se vrši samo u hloroplastima. Enzimski kompleks odgovoran za sintezu masnih kiselina se naziva kompleks sintaze masnih kiselina –
omogućava sintezu palmitinske kiseline. Prekursor za sintezu masnih kiselina je, kod svih živih organizama, acetil-S-CoA. Samo jedan njegov molekul ulazi direktno u sintezu i služi kao starter molekul ovog procesa – njegovi atomi su terminalni C15- i C16-atomi palmitinske kiseline. Ostali ugljenikovi atomi su poreklom od malonil-S-CoA, koji se dobija karboksilacijom acetil-S-CoA, i lanac masne kiseline raste ka COOH-terminusu. Biosinteza palmitinske kiseline zahteva prisustvo citrata i CO2 u citoplazmi; a
novonastala palmitinska kiselina se koristi kao prekursor za sintezu ostalih masnih kiselina. Rastući lanac masne kiseline je vezan za sulfhidridnu grupu fosfapanteteina (funkcionalna grupa ACP-proteina), a ceo ACP-protein je samo deo kompleksa sintaze masnih kiselina. Sam proces biosinteze palmitinske kiseline se odvija u dva koraka: 1. Karboksilacija acetil-S-CoA u malonil-S-CoA , katalizovana acetil-S-CoA karboksilazom , uz trošenje jednog molekula ATP ; ovaj enzim ima vezan biotin kao prostetičku grupu
Aktivacija bikarbonatnog jona HCO3Karboksilacija acetil-S-CoA u malonil-S-CoA
2. Dekarboksilacija malonil-S-CoA u procesu rekacije kondenzacije, katalizovana kompleksom sintaze masnih kiselina (egzergona reakcija)
Biosinteza masnih kiselina je kontrolisana pozicijom ekvilibrijuma između protomera (neaktivna forma) i polimera (aktivna forma) acetil-S-CoA karboksilaze. Njihova inkonverzija je alosterički regulisana. Ključni
80
pozitivni modulator je citrat , koji pomera ekvilibrijum ka aktivnom stanju. Negativni modulator je palmitoil-S-CoA, koji pomera ekvilibrijum u suprotnom smeru. On je krajnji produkt biosinteze i kao
takav inhibira njen prvi korak. Znači kako raste koncentracija citrata u citoplazmi, kao posledica nagomilavanja acetil-S-CoA u mitohondrijama, aktivira se sinteza masnih kiselina, dok porast koncentracije palmitoil-S-CoA inhibira sintezu. Kod sisara ovaj enzim je i pod hormonskom kontrolom – glukagon, epinefrin i norepinefrin pomeraju ekvilibrijum ka neaktivnom stanju sprečavajući sintezu
masnih kiselina fosforilacijom enzima. Suprotno dejstvo i ma insulin, koje aktivira defosforilaciju i ponaša se kao aktivni modulator.
97. Kompleks sintaze masnih kiselina: Biosinteza masnih kiselina se odvija kroz sedam sukcesivnih reakcija koje katalizuje kompleks sintaze masnih kiselina. Kod bakterija ovaj kompleks čine sedam proteina, od kojih je jedan ACP-protein. Kod
kvasaca, je on multienzimski kompleks, sastavljen od dve vrste polipeptidnih lanaca i nakon disocijacije gubi svoju aktivnost – α-lanac i β-lanac . Kod sisara je ovaj kompleks slično građen – od dve identične subjedinice, od kojih svaka poseduje tri funkcionalna domena, koji su povezani fleksibilnim regionima. Domen I ima funkciju da omogući ulazak supstrata i fazu kondenzacije, pa sadrži enzimske aktivnosti acetil transacilaze, malonil transacilaze, i β-ketoacil-S-ACP sintaze. Domen 2 ima funkciju redukcione
jedinice i sadrži aktivnost ACP-a, β-ketoacil-S-ACP reduktaze, β-hidroksiacil-S-ACP dehidrataze I enoil-S ACP reduktaze. Domen 3 ima funkciju oslobađanja sintetisane palmitinske kiseline i sadrži palmitoil tioesterazu. Disocijacijom sisarskog kompleksa dolazi do gubljenja aktivnosti samo nekih enzima - β-
ketoacil-S-ACP sintaze i β-ketoacil-S-ACP reduktaze.
Elongacija lanca masne kiseline otpočinje formiranjem acetil-S-ACP kompleksa – prebacivanjem acetilnog ostatka sa acetil-S-CoA na ACP, što kazalizuje acetil transacilaza. U isto vreme se vrši i prenos malonilnog ostatka sa malonil-S-CoA na ACP, čime se dobija malonil-S-ACP , uz katalizu malonil transacilaze. Malonil transacilaza je visoko specifičan enzim, dok acetil transacilaza nije. Nakon toga, kod masnih kiselina sa parnim brojem C-atoma dolazi do kondenzacije acetil-S-ACP i malonil-S-ACP, dok se kod onih sa neparnim kondenzuju propionil-S-ACP i malonil-S-ACP. U slučaju palmitinske kiseline, postepenom kondenzacijom se dobija acetoacetil-S-ACP . Prvo se acetilni ostatak prebacuje sa acetil-SACP na enzim β-ketoacil-S-ACP sintazu čime nastaje acetil-S-enzim intermedijer . On stupa u kontakt sa malonil-S-ACP, pri čemu dolazi do transfera acetilnog ostatka na njega i time i sinteze aceto -acetil-S-ACP,
uz oslobađanje ugljen-dioksida. Ovaj proces ne troši energiju. Sledeći korak katalizuje β-ketoacil-S-ACP reduktaza, koja koristi NADPH kao donor redukcionog potencijala, i sintetiše D-β-hidroksibutiril-S-ACP . β-hidroksiacil-S-ACP dehidrataza uklanja vodu iz nastalog intermedijera i formira krotonil-S-ACP . Dalje, enzim enoil-S-ACP reduktaza katalizuje redukciju,
takođe koristeći NADPH, i daje butiril-S-ACP . U sledećim koracima acetilni ostatak, poreklom iz acetil-SCoA, se produžuje za dva C-atoma. Nastali butiril ostatak se prenosi sa butiril-S-ACP na aktivno mesto βketoacil-S-ACP sintaze, tako da nastaje butiril-S-enzim intermedijer . Prihvatanjem sledećeg malonil-SACP, reakcija se nastavlja i nakon šest uzastupnih ciklusa, sintetiše se palmitoil-S-ACP . On se delovanjem
81
palmitoil tioestaraze može prevesti u palmitinsku kiselinu, ili može biti prenet na HS -CoA, i kao takav se koristiti za sintezu fosfatidinske kiseline. Palmitinska kiselina je glavni produkt biosinteze masnih kiselina i glavni prekursor za sintezu masnih
kiselina dužeg lanca, koju katalizuju elongaze, i za sintezu nezasićenih masnih kiselina.
98. Biosinteza triacilglicerola: Triacilgliceroli (TAG) su dugoročni depoi energije i intenzivno se sintetišu kod biljaka i životinja. Glavni
prekursori za njihovu sintezu su glicerol-3-fosfat ili dihidroksiaceton fosfat . Inicijalni korak njihove sinteze katalizuju enzimi glicerol-3-fosfat aciltransferaza – u mitohondrijama i
endoplazmatičnom retikulumu, i dihidroksiaceton fosfat aciltransferaza – u endoplazmatičnom retikulumu ili peroksizomima. Dihidroksiaceton fosfat aciltransferaza, u reakciju uvodi acil-S-CoA, i uz
oslobađanje koenzima A, prevodi dihidroksiaceton fosfat u acil-dihidroksiaceton fosfat . Njega, uz reoksidaciju NADPH i H+, acil-dihidroksiaceton fosfat reduktaza prevodi u lizofosfatidinsku kiselinu. Glicerol-3-fosfat , se direktno uz katalizu glicerol-3-fosfat aciltransferaze, prevodi u lizofosfatidinsku kiselinu. Acilglicerol-3-fosfat aciltransferaza, ovu kiselinu prevodi u fosfatidinsku. Na nju deluje fosfatidat fosfataza i prevodi je u 1,2-diacilglicerol . Delovanjem diacilglicerol aciltransferaze, od njega
nastaje triacilglicerol . Triacilgliceroli mogu nastati i od 2-monoglicerola, poreklom iz digestije u intestinumu – delovanjem 2-monoglcierol aciltrasferaze, koja ga prevodi u 1,2-diacilglicerol .
Intermedijeri sinteze triacilglicerola kao što su fosfatidinska kiselina ili diacilglicerol , mogu biti korišćeni za sintezu fosfolipida. Acil trasferaze nemaju visoku specifičnost prema supstratu, ni za dužinu lanca, ni stepen njene zasićenosti. Ipak u triacil glicerolima adipocita čoveka palmitinska kiselina je najčešće prisutna na C 1-atomu, a oleinska na C2-atomu. Sintetisani triacil gliceroli se u ćelijama jetre pakuju u VLDL partikule koje se oslobađaju u krvotok i tako transportuju kroz organizam.
99. Biosinteza fosfolipida: Biosinteza kompleksnih fosfolipida se odvija i kod biljaka, i životinja i bakterija i to na različite načine.
Zajedničko im je samo da u procesu kod svih učestvuje CTP , kao nosač polarne ili nepolarne grupe pri sintezi različitih fosfolipida. Fosfolipidi imaju značajnu asimteriju u pogledu masnih kiselina vezanih za C1i C2-atom glicerola. Saturisana masna kiselina najčešće esterifikuje alkoholnu grupu C1-atoma, dok nezasićena esterifikuje alkoholnu grupu C2-atoma glicerola. Biosinteza fosfatidiletanolamina otpočinje fosforilacijom OH -grupe etanolamina, uz katalizu enzimom etanolamin kinazom gde je donor ATP . Fosforilisani etanolamin se vezuje za CTP, pri čemu se uz katalizu CTP-etanolamin citidil transferaze dobija CDP-etanolamin derivat , koji predstavlja aktivirani fosfoestar
polarne grupe. Zatim primarna alkoholna grupa na C 3-atomu 1,2-diacilglicerola vrši napad na fosfornu grupu aktiviranog etanolamina, pri čemu iz reakcije izlazi CMP i fosfatidiletanolamin. Tu reakciju katalizuje CDP-etanolamin-diacilglicerol-fosfoetanolamin transferaza.
82
Fosfatidilholin se sintetiše u jetri i sukcesivnom metilacijom NH 2-grupe fosfatidiletanolamina, koju
katalizuje fosfoetanol amin metiltransferaza (donor metil grupe je SAM). U slučaju viška holina u
organizmu sinteza fosfatidilholina se vrši aktivacijom holina identičnim putem biosinteze kao i fosfatidiletanolamin. Fosfatidilserin se sintetiše samo u animalnim tkivima. Izmenom polar ne grupe fosfatidiletanolamina, u
reakciji koju katalizuje fosfatidil etanolamin-serin transferaza, dobija se jedinjenje u kojem serin zamenjuje etanol-aminsku grupu fasfatidiletanolamina. Kod bakterija, sinteza fosfatidilserina se odvija vezivanjem CTP-a za fosfatidinsku kiselinu, koju katalizuje fosfatidil-citidil transferaza – ona vrši napad
na α-fosfornu grupu CTP-a, i tako nastaje CDP-diacilglicerol . Sledeću reakciju katalizuje CDPdiacilglicerol-serin-O-fosfatidil transferaza – uvodi se serin, oslobađa CMP i dobija se fosfatidilserin. Na sličan način se odvija i sinteza fosfatidilinozitola ili fosfatidilglicerola u animalnim tkivima.
100. Transport acetil-S-Coa iz mitohondrije u citoplazmu: Za sintezu palmitinske kiseline je potrebno 8 molekula acetil-S-CoA, koji se u procesu katabolizma
piruvata ili β-oksidacije masnih kiselina sintetišu u matriksu mitohondrija. Sa obzirom da se biosinteza vrši u citoplazmi, sintetisani acetil-S-CoA mora izaći iz mitohondrija. Unutrašnja membrana mitohondrija nije permeabilna za prolazak acetil-S-CoA, i taj problem je rešen evolucijom sistema transporta trikarbonskih kiselina.
U povoljnim energetskim uslovima aktivnost Ciklusa limunske kiseline i oksidativne fosforilacije je niska, pa se u mitohondrijama akumulira acetil-S-CoA. On se kondenzuje sa oksalacetatom u citrat . Kada se
citrat nađe u velikim koncentracijama u mitohondriji, on se preko sistema transporta trikarboksilnih kiselina prebacuje u citoplazmu gde je supstrat za enzim ATP-citrat liazu, koja katalizuje njegovu reakciju
sa koenzimom A, kojom se uz trošenje jednog molekula ATP -a, dobija acetil-S-CoA i oksalacetat . ATP je potreban za sintetisanje visoko energetskog citril-S-CoA intermedijera, čijim se razlaganjem resintetiše tioestarska veza u acetil-S- CoA i dobija oksalacetat, koji se vraća u mitohondriju. Unutrašnja membrana mitohondrija nije permeabilna za njega, tako da se dejstvom malat dehidrogenaze prevodi u malat , koji
će se dejstvom maličnog enzima prevesti u piruvat uz redukciju jednog NADP+. Piruvat može ući u matriks mitohondrija i tamo se prevodi nazad u oksalacetat.
Znači, jedan NADPH se sintetiše sa izlas kom svakog acetil-S-CoA, tako da će se za izlazak dovoljno molekula za sintezu palmitinske kiseline, sintetisati osam molekula NADPH. Transport citrata iz mitohondrije mora biti izbalansiran ubacivanjem anjona u mitohondriju, pa se prema tome nastali malat
može direktno vratiti u mitohondriju bez generisanja NADPH. Zato je glavni izvor NADPH za proces biosinteze masnih kiselina konverzija glukozo-6-fosfata u pentoze.
101. Biosinteza cisteina: Za biosintezu cisteina, potreban je serin koji se sintetiše od intermediejra glikolize 3-fosfoglicerata. Prvo dolazi do konverzije OH-grupe 3-fosfoglicerata u karbonilnu i na taj način dobijanje
3-
fosfohidroksipiruvata, što katalizuje enzim 3-fosfoglicerat dehidrogenaza. 3-fosfohidroksipiruvat
83
reaguje
sa
glutamatom – transaminira
se
pod
dejstvom
enzima
PLP- zavisne
specifične
aminotransferaze, čime nastaje fosfoserin i oslobađa se α-ketoglutarat . Fosforna grupa fosfoserina se
hidrolizuje, što katalizuje fosfoserin fosfataza i dobija se serin. Bioseinteza cisteina se ostvaruje interakcijom serina i homocisteina – intermedijera katabolizma metionina. Sa obzirom da je sinteza cisteina povezana sa katabolizmom esencijalne aminokiseline, metionina – sulfidrilna grupa cisteina je poreklom iz metionina, pa i cistein spada u esencijalne aminokiseline. Kod biljaka i bakterija se sinteza vrši na malo drugačiji način. U prvom koraku sinteze dolazi do aktivacije OH-grupe serina, putem acetilacije, dok se u drugom koraku acetilna grupa zamenjuje sulfidom. Acetilaciju katalizuje serin acetiltransferaza, i time se dobija O-acetilserin. Zamenjivanje acetilne grupe, sulfidnom kod ovog jedinjenja katalizuje O-acetilserin liaza, i nakon
završene reakcije se dobija cistein. Kod bakterija se sulfid dobija redukcijom sulfata – ATP sulfurilaza i adenozin-5'-fosfosulfat kinaza aktiviraju sulfat, formirajući 3'-fosfoadenozin-5'-fosfosulfat (PAPS), koga će PAPS reduktaza i sulfit reduktaza redukovati u sulfid.
102. Dekarboksilacija aminokiselina (biogeni amini): Biogeni amini su γ -aminobuterna kiselina (GABA), histamin, serotonin, dopamin, adrenalin i noradrenalin. Dopamin, adrenalin i noradrenalin se zajedno označavaju kao kateholamini . Svi biogeni
amini su fiziološki aktivni molekuli – hormoni ili neurotransmiteri . Biosinteza ovih amina od odgovarajućih aminokiselina je katalizovana specifičnim dekarboksilazama , koje kao koenzim imaju piridoksal fosfat (PLP ). Mehanizam njihovog delovanja se zasniva na stabilizovanju Šifove baze sa aminokiselinom nakon formiranja C α-karboanjona kao posledice eliminacije ugljen-dioksida, poreklom iz primarne COOH-grupe aminokiseline. Histamin nastaje dekarboksilacijom aminokiseline histidina, reakcijom koja je katalizovana enzimom Lhistidin dekarboksilazom. On je hidrofilni vazoaktivni amin. Prekursor za sintezu GABA je glutamat , a
enzim koji katalizuje njenu sintezu je glutamat dekarboksilaza. Serotonin nastaje od triptofana. Njegov indolni prsten se prvo hidroksiliše u reakciji koju katalizuje triptofan hidroksilaza, kojoj je donor redukcionog potencijala tetrahidrobioprotein. 5-hidroksitriptofan,
koji time nastaje se prevodi u serotonin, što omogućava dekarboksilaza aromatičnih aminokiselina . Prekursor za sintezu svih kateholamina je tirozin. Sinteza se vrši u ćelijama srži nadbubrežnih žlezdi, koji poseduju enzime neophodne za ovu sintezu. Tirozin se prvo hidroksiliše uz pomoć tirozin hidroksilaze do dihidroksifenilalanina (L-DOPA). Taj enzim za svoju aktivnost zahteva prisustvo tetrahidrobioproteina i
kiseonika. Zatim se DOPA procesom dekarboksilacije uz dejstvo enzima dekarboksilaze aromatičnih aminokiselina prevodi u dopamin. Dopamin se hidroksiliše preko enzima dopamin hidroksilaze i nastaje noradrenalin, još jedan od neurotransmitera U tu reakciju ulaze askorbat i kiseonik , a oslobađaju se
dehidroksiaskorbat i voda. Na kraju se dodaje metil grupa preko enzima feniletanolamin-Nmetiltransferaza, uz prelazak SAM u SAH, iz noradrenalina nastaje adrenalin. Adrenalin se skladišti u
sinaptičkim vezikulama, odnosno vezikulama ćelija srži nadbubrežnih žlezda, odakle se i oslobađa procesom egzocitoze. 84
Serin je prekursor za dobijanje neurotransmitera acetilholina, bitnog za pravilno funkcionisanje
skeletnih mišića. U njegovoj sintezi se prvo dekarb oksiluje serin (kataliza serin dekarboksilaze), čime se dobija etanolamin, čijom se transmetilacijom dobija holin koji se acetiluje. Holinacetilaza katalizuje tu reakciju, i uz uvođenje acetil-S-CoA, i oslobađanje koenzima a, dobija se acetilholin.
103. Biosinteza glutamata i glutamina: Glavni molekuli metabolizma azota u svim živim sistemima su am inokiseline glutamat i glutamin. NH 4+ joni se najviše iskorišćavaju za aminaciju α-ketoglutarata, intermedijera Ciklusa limunske kiseline, koju katalizuje enzim glutamat dehidrogenaza, pri čemu se dobija glutamat , koji će služiti kao donor amino grupe za sintezu drugih aminokiselina u procesima transaminacije. Glutamat se može dobiti i direktnom transaminaicjom α-ketoglutarata, koju katalizuje α-ketoglutarat aminotransferaza. Sa druge strane glutamin je takođe donor amino grupe u biosintetskim reakcijama, ali je i glavni rezervoar azota u živim sistemima. Zato je i enzim koji katalizuje njegovu sintezu – glutamin sintaza, veoma kompleksno regulisan – takvom regulacijom je obezbeđena kontrola metaboličkog fluksa azotnih jedinjenja. Glutamin sintaza preko intermedijera glutamat-5-fosfata (za čiji je nastanak utrošen jedan molekul ATP ), uvođenjem amonijaka prevodi glutamat u glutamin – proces amidacije. Kod sisara glutamin sintaze su aktivirane prisustvom α-ketoglutarata , koji je produkt oksidativne dezaminacije glutamata. Ovakva
kontrola ima za cilj da spreči akumulaciju toksičnog amonijaka u organizmu. Kod prokariota flavoprotein glutamin sintaza, iz dva molekula glutamata, redukovanjem NADP+,
sintetiše glutamin i α-ketoglutarat .
104. Biosinteza alanina, aspartata i asparagina: Biosinteza alanina i aspartata se odigrava u direktnoj transaminaciji odgovarajućih keto-kiselina piruvata i oksalacetata. Piruvat se prevodi u alanin katalizom piruvat aminotransferaze, a oksalacetat u
aspartat uz katalizu oksalacetat aminotransferaze. Asparagin se sintetiše amidacijom aspartata. U taj proces su uključena dva strukturno različita enzima u
živim sistemima. Jedan je NH 3-zavisna asparagin sintaza, kod koje je donor amino grupe amonijak i koja se nalazi samo u prokariotskim organizmima; a drugi je glutamin-zavisna asparagin sintaza, gde je
donor aminogrupe glutamin, koji se sreće i kod prokariota i eukariota.
105. Biosinteza purina: Biosintetički put purina otpočinje fosforibozil pirofosfatatom (PRPP ), i on ostaje isti za oba purinska nukleotida sve dok sinteze inozin monofosfata (IMP ). Od njega se putevi sinteze adeninskog i guaninskog nukleotida razdvajaju. Biosinteza se odvija formiranjem heterocikličnog prstena na ribozo -5-
fosfatu. Zajednički put biosinteze purina se ostvaruje kroz jedanaest sukcesivnih reakcija:
85
1. Aktivacija ribozo-5-fosfata – on je supstrat za ribozo-5-fosfat pirofosfokinazu, koja katalizuje
prebacivanje pirofosfatne grupe sa ATP na C 1-atom, čime se dobija fosforibozil-α-pirofosfat (PRPP)
2. Ugrađivanje N 9-atoma – enzim amidofosforibozil transferaza katalizuje zamenu pirofosfatne
grupe sa amino grupom, poreklom iz glutamina, pri čemu n astaje β-5-fosforibozilamin; u ovoj reakciji dolazi do promene konfiguracije C 1-atoma riboze – dobija se β-N-glikozidna veza kakva je i u finalnim nukleotidima 3. Ugrađivanje C 4-,C 5-, i N 7- atoma – glicinamid ribonukleotid sintetaza katalizuje uspostavljanje amidne veze između karboksilne grupe glicina i amino grupe β -5-fosforibozilamina, i tako nastaje glicinamid ribotid (GAR); zahteva hidrolizu ATP-a – troši se energija
4. Ugrađivanje C 8- atoma – prenos formil-grupe sa N-formil-THF na aminogrupu GAR- a, čime se dobija formilglicinamid ribotid (FGAR); ovu reakciju katalizuje GAR transformilaza 5. Ugrađivanje N 3-atoma – sekundarna aminogrupa drugog glutamina se prebacuje na FGAR, čime se dobija formilglicinamidin ribotid (FGAmR); ova reakcija je katalizovana od strane FGAmR sintetaze, a omogućena je hidrolizom ATP-a 6. Formiranje imidazolnog prstena – aminoimidazol (AIR) sintetaza , koristeći hidrolizu ATP-a,
katalizuje intramolekulusku kondenzaciju kojom se dobija 5-aminoimidazol ribotid (AIR) 7. Ugrađivanje C 6-atoma (poreklom iz CO2) – karboksilacija, katalizovana AIR karboksilazom, kojom se dobija 5-aminoimidazol-4-karboksilat ribotid (AICR); ona ne koristi biotin kao koenzim 8. Ugrađivanje N 1-atoma – amidna kondenzacija amino grupe asparaginske kiseline, sa AICR, koja je favorizovana hidrolizom ATP-a i kojom se dobija 5-aminoimidazol-4-sukcinilkarboksamid ribotid (AISCAR); enzim koji katalizuje ovu reakciju je AISCAR sintetaza
9. Eliminacija fumarata – adenilosukcinat liaza uklanja fumarat iz AISCAR- a, pri čemu se dobija 5aminoimidazol-4-karboksamid ribotid (AICAR); koristi energiju iz prethodne reakcije
10. Ugrađivanje C 2-atoma – poslednji atom purinskog prstena se dobija iz N-formil THF, i uz katalizu AICAR transformilazom, dobija se 5-foraminoimidazol-4-karboksiamid ribotid (FAICAR)
11. Formiranje purinskog prstena – IMP ciklohidrolaza katalizuje ciklizaciju FAICAR-a u inozinmonofosfat (IMP) uz eliminaciju vode; ne zahteva hidrolizu ATP- a AMP se sintetiše iz IMP-a zamenom 6-keto grupe IMP-a amino grupom u dve sukcesivne reakcije. U
prvoj reakciji, asparaginska kiselina se vezuje preko svoje amino grupe za IMP, uz hidrolizu GTP-a, čime nastaje adenilosukcinat – ovu reakciju katalizuje adenilosukcinat sintetaza. Drugu reakciju katalizuje adenilosukcinat liaza koja eliminiše fumarat, dajući AMP. GMP se od IMP takođe dobija kroz dve reakcije. Prvo se oksiduje u ksantozin monofosfat (XMP), što
katalizuje IMP dehidrogenaza, kojoj je koenzim NAD+. Dalje se, nastali XMP aminira amino grupom iz
glutamina, pri čemu se dobija GMP. Ova reakcija se odigrava uz istovremenu hidrolizu ATP-a na AMP i PPI.
Sintetisani nukleotid monofosfati se prevode u difosfate pomoću nukleozid monofosfat kinaza – specifične za svaki NMP, ali ne prave razliku između pentoza. Nastali NDP je supstrat za delovanje nukleozid difosfat kinaze, koja je nespecifična i koja ih prevodi u trifosfate. 86
106. Regulacija biosinteze purina: Regulacija biosintetskog puta purinskih nukleotida se vrši na dva mesta – u procesu biosinteze IMP – povratnom spregom, i na mestima grananju puta biosinteze AMP-a i GMP . Svrha precizne regulacije je
održavanje ekvimolarne koncentracije nukelotida potrebnih za sintezu nukleinskih kiselina. Biosinteza IMP je regulisana u prve dve reakcije biosintetskog puta. Aktivnost ribozo-5-fosfat pirofosfokinaze je inhibirana sa rastućim koncentracijama ADP-a i GDP-a; dok je regulacija aminofosforibozil transferaze višestruka – bivalentno regulisan enzim. On poseduje alosterička mesta za vezivanje AMP-a, ADP-a, i ATP-a, kao i GMP-a, GDP-a, i GTP -a koji su inhibitori njene aktivnosti. Inhibicija je kumulativan proces – aktivnost enzima postepeno opada, sa povećanjem koncentracije ovih nukleotida. Zato je brzina sinteze IMP- a nezavisno, ali sinergistički kontrolisana koncentracijama adeninskih i guaninskih nukleotida. Mesto grananja sinteze AMP-a i GMP-a, od IMP-a je regulisano, tako što su oni kompetitivni inhibitori IMP-a za sopstvenu sintezu, smanjujući brzinu reakcije koju katalizuju enzimi adenilosukcinat sintetaza, odnosno IMP dehidrogenaza. Sa druge strane GTP stimuliše biosintezu AMP-a, delujući kao stimulator adenilosukcinat sintetaze; dok je ATP stimulator aktivnosti GMP sintetaze. Na taj način se postiže koordinativna kontrola sinteze purinskih nukleotida.
107. Biosinteza pirimidina: Biosinteza pirimidinskih nukleotida je mnogo prostiji proces nego sinteza purinskih nukleotida. N1-,C4-,
C5- i C6-atomi pirimidinskog prstena su poreklom iz asparaginske kiseline, C2-atom iz bikarbonatnog jona (HCO3-), dok je N3-atom poreklom iz glutamina (ili iz amonijaka kod bakterija). U obom biosintetičkom putu prvo dolazi do sinteze pirimidinskog prstena za koga se vezuje pentozna komponenta poreklom iz PRPP. Prvi produkt biosinteze pirimidina je uridin monofosfat (UMP ). Ona se vrši u šest sukcesivnih reakcija: 1. Sinteza karbamoil fosfata – troše se dva molekula ATP-a (jedan kao energetski donor i drugi kao
donor fosfatne grupe), a sinteza se vrši iz bikarbonatnog jona i sekundarne amino grupe glutamina; ovaj proces katalizuje citoplazmatična karbamoil sintetaza II koja ne koristi biotin 2. Sinteza N-karbamoil fosfata – kondenzacija karbamoil fosfata i asparaginske kiseline, koju katalizuje aspartat transkarbamiolaza ( ATCaza) 3. Zatvaranje pirimidinskog prstena – sinteza dihidroorotata (intramolekulska kondenzacija), katalizovana dihidroorotazom 4. Oksidacija dihidroorotata – ireverzibilna oksidacija do orotata, koju kondenzuje dihidroorotat dehidrogenaza (koenzimi FMN i atom gvožđa; akceptor redukcionog potencijala je ubikvinon);
kod bakterija ovi enzimi su flavoproteini 5. Ugrađivanje ribozofosfata – orotat reaguje sa PRPP-om, čime se dobija orotidin-5-fosfat (OMP )
u β-konfiguraciji; ovu reakciju katalizuje orotat fosforibozil transferaza 6. Dekarboksilacija OMP – OMP dekarboksilaza prevodi OMP u UMP
87
Kod bakterija ovu sintezu katalizuje šest zasebnih enzima, dok su kod životinja prve tri enzimske aktivnosti (karbamoil sintetaza II; ATCaza; dihidroorotaza), locirane na jedinstvenom polipeptidnom
lancu, označenom kao CAD enzim (jedan enzim sa tri funkcionalna domena). Takođe su i orotatfosforibozil transferaza i OMP dekarboksilaza delovi jednog polipeptidnog lanca. Ovime se postiže visoka efikasnost reakcije, jer produkt enzimskog domena ne napušta multienzim, već je odmah supstrat za delovanje sledećeg – postiže se kanalisanje reakcije. Kanalisanje reakcije uvećava brzinu uzastopnih reakcija u istom biosintetskom putu i sprečava intermedijaere da dođu u kontakt sa drugim celularnim enzimima. Citidin trifosfat se formira u procesu aminacije UTP, koju katalizuje CTP sintaza. U ovom procesu donor
amino grupe je glutamin (ili amonijak ), a donor energije je ATP.
108. Regulacija biosinteze pirimidina: Regulacija biosinteze pirimidinskih nukleotida se razlikuje u zavisnosti od živog organizma. Kod bakterija, glavno mesto regulacije je ATCaza, koja je alosterički regulisana – inhibira je CTP , a aktivira ATP . Regulacija se ostvaruje i kontrolom karbamoil fosfat sintetaze, koja je inhibirana UMP-om.
Kod životinja ATCaza nije regulatorno mesto, već se regulacija vrši u nivou karbamoilfosfat sintetaze II – inhibiraju je CTP i UTP , a aktiviraju ATP i PRPP . Drugo mesto regulacije je u nivou OMP dekarboksilaze za koju je UMP , i u manjoj meri CTP, kompetitivni inhibitor.
109. Biosinteza dezoksiribonukleotida: Molekul DNK se hemijski razlikuje od molekula RNK po tome što njegovi nukleotidi imaju 2'dezoksiribozu i timin umesto uracila prisutnog u molekulu RNK. Biosinteza dezoksiribonukleotida se
ostvaruje redukcijom C 2'-atoma ribunukleotida. Enzimi ribunukleotid reduktaze, katalizuju redukciju ribonukleotid difosfata u dezoksiribonukleotid difosfate. Razlikuju se tri klase ovih enzima, i to na osnovu sastava enzimskih komponenti koje su
uključene u redukciju. Klasa I poseduje tirozni radikal stabilizovan mostom i zmeđu Fe3+ kompleksa i kiseonika. Klasa II koristi koenzim B12, a Klasa III sadrži gvožđe-sumporne proteine, i zahtevaju SAM i NADPH za svoju aktivnost . Klasa I i II su široko rasprostranjene kod prokariotskih orgnaizama, kao i Klasa III koja odlikuje neke aerobne prokariotske organizme koji ne mogu da sintetišu koenzim B12 (Klasa III je senzitivna na prisustvo kiseonika, dok klasa I zahteva kiseonik za svoju aktivaciju). Eukariotski organizmi se odlikuju reduktazama Klase I. Ribunukleotid reduktaza bakteri je E.Coli je dosta dobro izučen enzim. To
je tetramer koji se sastoji od dva katalitički neaktivna homodimera, i subjedinica R1 i R2 koje zajedno formiraju aktivno mesto ovog enzima. Subjedinica R 1 poseduje nekoliko redoks potencijala tiolnih grupa, a R 2 poseduje tirozni radikal (gvožđe koje se nalazi u ovoj subjedinici formira binuklearni Fe3+ kompleks sa kiseonikom; taj kompleks interaguje sa tirozinom pri čemu se stvara tirozni radikal). Tirozni radikal je
taj koji omogućava redukciju NDP u dNDP. On nastaje delovanjem enzima NADP-flavin oksidoreduktaze, pri čemu se oslobađa opasan superoksidni jon. On je supstrat za superoksid dismutazu koja ga
88
neutrališe, prevodeći ga u molekularni kiseonik uz stvaranje vodonik peroksida. Njega će neutralisati enzim katalaza. Ribonukleotid reduktaza , uz pomoć tiroznog radikala prvo uklanja H-atom sa C3-atoma NDP-a. To izaziva pregrupisanje elektrona i oslobađanje molekula vode, kao i formiranje nestabilnog intermedijera sa katjonom na C2-atomu. Taj katjon redukuje redoks-aktivna sulfhidrilna grupa subjedinice R 1. Formirana
disulfidna veza između dva cisteina subjedinice R1, se prevodi u redukovano stanje disulfidnom izmenom, čime se enzim prevodi u aktivno stanje. Cisteini subjedinie R 1 se lako redukuju spoljnim redukujućim agensima, čime se dobija radikal na C3-atomu, koji preuzima H-atom sa subjedinice R2, pri čemu nastaje dNDP. Enzim iz reakcije izlati sa restauriranom aktivnom strukturom subjeidnice R 2, dok subjedinice R1 izlazi sa disulfidnim mostom između cisteina, i on se mora redukovati do redoks-aktivnog disulfihidrilnog para. Donor redukcionog potencijala je NADPH, i ključnu funkciju u tom prenosu ima protein tioredoksin. Dezoksitocin deaminaza konvertuje dCMP u dUMP, koji je prekursor za biosintezu dezoksitimidin monofosfata (dTMP). Ovaj enzim je aktiviran dCTP-om, a inhibiran dTTP-om. Ipak glavni izvor dUMP za
biosintezu dTMP-a je dUTP, koga dUTP difosfohidrolaza hidrolizuje do dUMP-a. Svrha ovog procesa koji
troši energiju jeste obezbeđivanje minimalne koncentracije dUTP u ćeliji, da bi se sprečila inkorporacija uracila u njenu DNK – potenicjalnu mutageni događaj. Nastali dUMP je supstrat za enzim timidilat sintezu, koja koristi N-N-metilentetrahidrofolat (N5,N10-metilen-THF) kao donora metil grupe, i prevodi ga u dTMP. Tad dolazi do oksidacije THF do DHF, što je jedinstvena reakcija u živim sistemima. Nastali DHF mora biti recikliran u svoje prvobitno stanje – prvo se redukuje DHF u THF što katalizuje dihidrofolat reduktaza (donor redukcionog potencijala je NADPh + H+); zatim serin hidroksimetil transferaza
prebacuje hidroksimetilnu grupu serina na THF dajući N5,N10-metilen-THFm dok se iz reakcije oslobađa glicin.
110. Povezanost metabolizma lipida i saharida: Metabolizam lipida i saharida je povezan preko nekoliko metabolita od kojih su najvažniji acetil-S-CoA i pirvuat. Glikolizom se redosledom reakcija, iz glukoze dobija piruvat . On se tokom aerobne ćelijske
respiracije, u toku oksidativne dekarboksilacije piruvata, koja se odvija u matriksu mitohondrije, prevodi u acetil-S-CoA, uz ulazak koenzima A u reakciju i redukciju NAD +. On može nastati i oksidacijom masnih kiselina. Acetil-S-CoA u jetri može da se uključi u razne metaboličke procese koji ga povezuju sa metbolizmom lipida – sinteza masnih kiselina, holesterola ili ketonskih tela.
Sinteza masnih kiselina je metabolički put koji generiše lance masnih kiselina počevši od acetil -S-CoA kao osnovnog supstrata. Taj se proces aktivira u slučaju prevelike proizvodnje acetil-S-CoA kao posledica povećanog unosa ugljenih hidrata. Višak proizvedenog acetil-S-CoA biva preusmeren prema sintezi masnih kiselina, u procesu katalizovanom nizom enzima od kojih su najvažniji acetil CoA karboksilaza i sintetaza masnih kiselina. Pri visokoj koncentraciji glukoze u krvi, u jetri se procesi usmeravaju ka konzervaciji energije – stimuliše se biosinteza glikogena; a aktiviraju se i glikoliza i oksidativna dekarboksilacija piruvata, kako bi se 89
