Detektor Fluorescence

Detektor HPLC-Fluorescence HPLC-Fluorescence

Anita Sari Syafiana Anggota

Nunung Nurfaizah Irwan Agung Sutarno

PENGANTAR

Prinsip dasar HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sanpel untuk selanjutnya di identifikasi dan di hitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut. Dua hal yang krusial dalam metode HPLC adalah pada saat proses pemisahan dan padaa proses identifikasi, dua hal ini merupakan point penting penentu keberhasilan proses analisis

. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik Kromatografi cair yang modern

Fungsi detektor dalam HPLC adalah untuk mendeteksi komponen cuplikan hasil pemisahan kolom . Detektor HPLC yang baik harus memiliki sensitivitas yang tinggi atau mempunyai limit deteksi yang sangat kecil, sehingga dapat memberikan perubahan sinyal yang besar pada perubahan konsentrasi komponen cuplikan yang kecil

 jenis detektor Detektor universal

Detektor khusus

Yaitu detektor yang bisa langsung digabungkan ke dalam instrumen HPLC tanpa memerlukan tambahan sistem khusus Detektor Indeks bias

Yaitu detektor yang memerlukan sistem khusus agar bisa digunakan

Detektor UV-Vis

Detektor Fluorescence

Detektor Fluorescence Apa itu Fluorescence??

Fluorescence atau fluoresensi adalah emisi cahaya setelah penyerapan sinar UV atau sinar tampak oleh molekul fluoresensi atau disebut fluorophore. Dengan demikian, fluorophore menyerap energi dalam bentuk cahaya pada panjang gelombang spesifik untuk mencapai tingkat energi yang lebih tinggi (panjang gelombang eksitasi) lalu meng-emisikan cahaya yang diserap untuk kembali ke kondisi semula (panjang gelombang emisi).

Setidaknya 15% senyawa yang ada memiliki sifat fluorescence secara alami. Fluorescence sendiri aktivitasnya dipengaruhi oleh ikatan konjugasi elektron pi, terutama pada senyawa aromatik.

Contoh senyawa

Sangat bersifat fluorescence

Tidak bersifat fluorescence

Efek gelombang

Detektor Fluorescence Detektor Fluorescence merupakan detektor HPLC yang paling sensitif, spesifik, dan selektif diantara detektor HPLC yang lain. Detektor ini memungkinkan untuk mendeteksi sebuah molekul analit tunggal di dalam sampel dengan tepat. Detektor ini sangat cocok untuk ‘trace analysis’ karena bersifat spesifik dan sensitif. Detektor Fluorescence memiliki sensitivitas 10-10000 kali lebih kuat daripada detektor UV untuk sebuah senyawa yang menyerap sinar tampak. Prinsip dari detektor ini adalah sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Tipe-tipe Detektor Fluorescence : -Single wavelength excitation fluorescence detector -Multi wavellength fluorescence detector -Laser Induced Fluorescence Detector (LIFD)

Single wavelength excitation fluorescence detector Single beam biasanya lebih populer karena dapat meningkatkan efektifitas cahaya dan meningkatkan potensial untuk detection limit yang lebih rendah. Namun, single beam memiliki kelemahan yaitu rentan mengalami goyangan atau turun naiknya lampu, sehingga menyebabkan ketidakstabilan. Untuk mengatasi ini maka digunakan dual beam detektor.

Multi wavellength fluorescence detector Detektor ini merupakan pengembangan dari single beam detektor. Cahaya  yang berasal dari sumber akan dibelokkan oleh sebuah quartz beam splitter dalam diode atau photomultiplier. Pada detektor ini terdapat dua buah monokromator. Pertama untuk mengukur signal yang keluar dari lampu, dan  yang kedua untuk mengukur emisi dari analit. Sama seperti halnya pada single beam detektor, pada dual beam detektor juga memiliki potensi terjadinya goyangan pada lampu. Namun hal ini dapat diatasi dengan ditambahkannya magnet di sekitar lampu.

Laser Induced Fluorescence Detector (LIFD) Mendeteksi Emisi optical dari molekul yang mengalami eksitasi menuju tingkat energi yang lebih tinggi akibat penyerapan radiasi elektromagnetik. LIFD merupakan teknik deteksi optical yang paling sensitif. LIFD biasanya digunakan untuk analisis ‘capillary electrophoresis’. LIFD dipakai sebagai alat terpisah untuk analisis produk reaksi berantai polimer, penentuan larutan seperti protein, asam nuleat, siklik hidrokarbon aromatik, dan senyawa yang beracun seperti sianida

Sumber detektor fluorescence Deuterium Lamps : lampu ini merupakan pilihan yang baik jika eksitasi ultraviolet serta stabilitas yang panjang diperlukan. Lampu ini minim gangguan dan memiliki hasil yang terbatas. Ini akan menghambat ‘background’ mencapai photomultiplier. Xenon Lamps : saat ini banyak instrumen yang menggunakan Xenon lamp. Alasannya karena Xenon lamp dapat menghasilkan energi eksitasi melebihi  jangkauan UV-vis. Xenon lamp digunakan terutama untuk wilayah sinar tampak. Xenon lamp yang berbentuk rata dan memiliki permukaan yang luas, sangat cocok untuk proses eksitasi dan untuk tujuan scanning. Xenon lamp memiliki tegangan yang lebih tinggi daripada Deuterium yang menyebabkan xenon tidak stabil sehingga lampu ini tidak ber-umur panjang Xenon-Mercury Lamps : Lampu ini berisi gas xenon dengan sedikit penambahan mikroliter merkuri. Eksitasi terdapat pada pancaran maksimal paling dekat lampu dengan absorpsi komponen maksimal.

Skema Detektor Fluorescence

Double beam detector

Single beam detector

Detektor Fluorescence

Source : International research journal : High Performance Liquid Chromatography Detectors “ Kaushal Ramni, Kaur navneet, Suri O.P”  I.S.F college of pharmacy, India

Modern HPLC for Praticing Scientists Brian O’Flaherty”  2006, John willey & sons, Inc. New Jersey  “