INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACION EN BIOTECNOLOGIA APLICADA
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Clase: Química Instrumental Aplicada a la Biotecnología I.A. Gisela Clara Hernández Agosto 2013
Antecedentes Cromatografía en columna:
Fase estacionaria: sólido poroso Fase móvil: líquido
Columnas de vidrio de diámetro 1-5 cm y longitudes de 50 – 500 cm. Partículas sólidas: 150 a 200 mm Tasa de flujo bajas -- horas
Años 60’s :
Empaques de tamaño de partículas pequeños: 3- 10 mm. Instrumentos complejos para trabajar a altas presiones.
Cromatografía de líquidos de alta resolución HPLC
Campo de aplicación Ampliamente utilizada Sensibilidad Automatización Capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles. Amplia aplicabilidad a sustancias importantes en la industria: aas, proteínas, ac. Nucleicos, hidrocarburos , carbohidratos, fármacos, plaguicidas antibióticos, especies organometálicas
Instrumentos
Presiones de bombeo de cientos de atmosferas. Equipos complejos.
Recipientes para la fase móvil y sistema de tratamiento de solvente 40:60 metanol 8%
+ de un recipiente + Un de disolvente 500 ml de solvente o mezcla de composición constante: Sistema de purga: arrastrar elución isocrática de la con 2gases o masdisueltos sistemasfuera disolventes solución . polaridad distinta: Filtrar solventes y eliminar elución con gradiente. Lapolvo. relación se varia de manera programada Evita ensanchamiento de banda, malfuncionamiento .
por min
Mezcla de clorobencenos.
Metanol-agua 50:50 (v/v)
Sistema de bombeo
Generación de presiones de 6000 psi (lib-in2) o 414 Cámara en la que el disolvente es impulsado por el bares. pistón. Salida librecontrolan de pulsos. Válvulas el flujo. Desventaja: , ruido la línea base. Tasa de flujo de flujo 0.1 pulsado a 10 mL/ minenreproducibilidad Ventajas: pequeño volumen interno , altas presiones del flujo 0.5% relativo de salida, adaptación a la elución con gradiente, Componentes resistentes a la corrosión. independientes de la viscosidad del disolvente. • •
SISTEMA DE INYECCION
Rizos de muestreo: Intercambiable permiten la elección de muestra de 1 a 100 ml o más. Cromatografías actuales autoinyetores , medios controlados por temperatura. Programación de inyectores automaticos
Columnas para HPLC Columnas para HPLC Tubos de acero inoxidable Longitud: 5-25 cm Diámetro interno: 3-5 mm Partículas para empaquetamiento de la columna: 3 a 5 mm
Microcolumnas Longitud: 3-7.5cm Diámetro interno: 1-4.6 mm Partículas para empaquetamiento dela columna: 3 a 5 mm
Ventaja: Velocidad y mínimo consumo de fase móvil.
Pre-columna o guarda columna
Son usadas para aumentar la vida útil de la columna analítica. Eliminan materias en suspensión, contaminantes y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Su composición de relleno deberá ser semejante al de la columna analítica. Tamaño de partícula mayor. Se reemplaza cuando se contamina
Tipos de rellenos de la columna
PELICULAR Cuentas vidrio o de polímero, no porosas y esféricas diámetros característicos de 30 a 40 µm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de una resina de intercambio iónico.
PARTÍCULA POROSA Partículas de 3 y 10 µm y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado. sílice, alúmina o resinas de intercambio iónico,
Detectores Propiedad del soluto responden a una propiedad física o físico-química del soluto. selectivos y muy sensibles. Propiedad de la disolución comparan el cambio global de alguna propiedad física de la fase móvil con y sin soluto eluido. poco sensibles
Los detectores de absorbancia ultravioleta
254 nm de una lámpara de mercurio. dos terceras partes de los solutos orgánicos analizados por HPLC presentan absorción a esa longitud de onda, compuestos aromáticos.
Detectores de fluorescencia Propiedades fluorescentes absorber radiación electromagnética de una determinada longitud de onda y emitir radiación fluorescente a longitud de onda más larga . Comunicar fluorescencia a determinados analítos mediante el uso de reactivos apropiados. Esta derivatización puede realizarse en la muestra antes de la columna. •
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Detectores electroquímicos
En este sentido, cualquier especie capaz de ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de detección por via electroquímica en una variedad de matrices, como medioambientales, farmacéuticas y químicas. fenoles, aminas, peróxidos y mercaptanos pueden detectarse por oxidación, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas, aldehidos y nitrocompuestos aromáticos pueden ponerse de manifiesto mediante procesos de reducción.
Detectores de índice de refracción
el índice de refracción (IR) de la fase móvil deberá modificarse por la presencia de cualquier soluto que tenga un índice de refracción diferente de ella. la comparación del IR de la fase móvil pura con el de los efluentes que salen de la columna cromatográfica, indicará la presencia de cualquier soluto eluido. El principal inconveniente de este tipo de detectores es que son muy sensibles a los cambios de temperatura, la cual debe ser controlada con fluctuaciones de ± 0.0001 ºC.
Cromatografia de reparto
Técnica mas ampliamente utilizada. La fase estacionaria es un líquido inmiscible con la fase móvil líquida.
Cromatografía con fases unidas químicamente (enlazadas): la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte.
los soportes se preparan con sílice rígida formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 3, 5 o 10 µm.
Superficie de silice hidrolizada
Revestimientos de fase unida : siloxanos
organoclorosilano
En relación con las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, se distinguen dos tipos de cromatografia de reparto. En la cromatografía en fase inversa (o reversa), la fase estacionaria es no polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase móvil es relativamente polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo). En cromatografia en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el más soluble en la fase móvil y un aumento de la polaridad de la fase móvil provoca una disminución del tiempo de elución. Por contraste, en los métodos en fase inversa, los componentes más polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución
La fase estacionaria es un solido adsorbente de gran area superficial (silice, alumina). Tiempo de retención mas largas si la polaridad del analito aumenta. Centros activos interaccionan con gpos. Funcionales polares de los compuestos a separar. la separacion se produce como consecuencia de la intesidad de esas interacciones para los diferentes compuestos.
Cromatografía de adsorción o solido -liquido
Se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el solvente y los sitios cargados en la fase estacionaria. La fase estacionaria de una matriz (R) con gpos. Funcionales cargados (A) y contraiones de carga opuesta (M) , susceptibles de intercambiarse con especies de la misma carga contenidas en la fase movil.
Especie de elevada masa molecular . Rellenos: pequeñas particulas de silice o de polimeros que contienen una red de poros uniformes . Las moleculas que son mas grandes que el tamaño medio de los poros del relleno son excluidas . Las q tienen diametros menores que los poros pueden penetrar atrves de ellos . Se evita una interaccion quimica entre los analitos y
De exclusión por tamaño o de gel
