CROMATOGRAFIA informe labo química orgánica

Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Ingeniería Industrial

Informe Nro. 4: Cromatografía de compuestos

orgánicos

Profesor: Canales Martínez César

LABORATORIO DE QUIMICA ORGANICA

Horario: 6:00 – 8:00 8:00 pm


I.INTRODUCCION La cromatografía es un método físico f ísico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla. La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente: 

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).



Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.

II._ OBJETIVOS 1


-Conocer la cromatografía como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen.

-Estudiar la incidencia del coeficiente de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

- Analizar Analizar la influencia del solvente solvente en la separación cromatográfica. -observar las diferentes características de la placa en la cromatografía.

III.FUNDAMENTO TEORICO CROMATOGRAFIA

¿En qué consiste? La cromatografía comprende un conjunto de técnicas que tienen como finalidad la separación de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente en otra sustancia. De forma general, consiste en pasar una fase móvil (una muestra constituida por una mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente) a través de una fase estacionaria fija sólida. La fase estacionaria retrasa el paso de los componentes de la muestra, de forma que los componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el tiempo. Cada uno de los componentes de la mezcla presenta un em p o d e tiempo característico de paso por el sistema, denominado t i em retención . Cuando el tiempo de retención del compuesto deseado difiere del de los otros componentes de la mezcla, m ezcla, éste se puede separar mediante la separación cromatográfica. La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran en un líquido o gas es el resultado de las d iferentes interacciones de los solutos a medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase estacionaria). Las diversas técnicas para la separación de mezclas complejas se fundamentan en la diversidad de afinidades de las substancias por un medio móvil gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina, alúmina o sílice) a través del cual circulan.

¿Por qué se separan los componentes? Dejamos que se mueva la mezcla por un soporte y los componentes se separan por que se mueven a diferentes velocidades, debido a las diferentes fuerzas de adsorción que ejerce el soporte sobre cada elemento, así de fácil. Si no nos hemos equivocado equivocado es adsorción, adsorción, que puede confundirse confundirse con absorción pero no es lo mismo. m ismo. Vamos a explicarlo. La absorción es cuando una sustancia se introduce en la estructura de otra. Ejemplo: una esponja absorbe agua, entonces si cortamos la esponja en pedazos vamos a encontrar agua en todas partes de la estructura de la esponja La adsorción es un fenómeno superficial, la sustancia adsorbida no se introduce en el volumen del cuerpo, sino solo se adhiere a la superficie. 2


¿Queda claro la diferencia? Pues ahora que ya sabemos lo que es la adsorción veamos otra definición de cromatografía: La cromatografía es una separación física de los componentes de una mezcla basado en la adsorción selectiva de los componentes de la mezcla al moverse por un soporte. Imaginemos el rotulador anterior, si pintamos sobre una tira de papel de filtro o secante con el rotulador un poco más arriba de la base de la tira de papel (el papel será el soporte) y ahora lo metemos en un recipiente con alcohol en la base del recipiente, el alcohol moja la base de la tira de papel, asciende por las tiras de papel y al llegar a la tinta t inta del rotulador que pintamos, disuelve la tinta y sigue subiendo hasta provocar la separación de los pigmentos. Esto se produce por las distintas velocidades a las que se mueven los pigmentos por el papel cuando se mojan con el alcohol y se mueven. Abajo hay un video con ejemplo ya realizados para que los puedas ver. Como vemos hay una fase fija que será la colocación de la mezcla en el papel y otra móvil que será la subida del alcohol por el papel. La fase fija se hace con papel (sólido) y la móvil se hace con un líquido, el alcohol. Más adelante explicaremos las fases cromatografías. Aquí tienes una imagen del ejemplo de la tinta del rotulador.

¿Para qué se utiliza la Cromatografia? La cromatografía se utiliza para lograr la separación de los componentes de una mezcla como para medir la proporción de cada elemento en la mezcla.

Fases de la cromatografía Las cromatografías se hacen en dos fases. Una estática y otr a móvil. En la fase estática o estacionaria, la mezcla se coloca sobre un soporte fijo, por ejemplo papel. En esta fase tenemos ya la mezcla sobre un soporte, en nuestro ejemplo un papel.

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En la fase móvil se hace mover otra sustancia sobre la mezcla que ya está sobre el soporte de la fase estática, por ejemplo un líquido que se mueve por el papel con la mezcla. En la fase móvil empezará el proceso de separación de los componentes de la mezcla al moverse a distintas velocidades por el líquido los distintos componentes de la mezcla sobre el papel.

Tipos de Cromatografia Aunque hay muchas muchas y variadas técnicas técnicas cromatográficas, el objetivo objetivo de todas es separar las sustancias que forman una mezcla y enviarlas secuencialmente a un detector para que las determine y cuantifique.

Todas se basan en el mismo fenómeno: permitir que las sustancias que forman una mezcla entren en contacto con dos fases (un líquido y un gas, un sólido y un líquido, etc.). Una de las fases es estática (no se mueve) y tenderá t enderá a retener las sustancias en mayor o menor grado; la otra, fase móvil, tenderá a arrastrarlas. Cada sustancia química tiene distinta tendencia a ser retenida y a ser arrastrada. Dependiendo de la naturaleza de la fase estática y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estática o estacionaria es un sólido y la móvil un líquido. b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estática o estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido. c) Cromatografía líquido-gas. La fase estática o estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas. d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas. Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre. a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar. b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas. c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase móvil.

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TECNICAS DE SEPARACIÓN:

La cromatografía y métodos de separación separación clásicos se basa en la separación de componentes componentes de una muestra. Estas técnicas no son de caracterización caracterización propiamente dicha; las propiedades propiedades de los materiales dependen de los componentes y de la proporción existente entre ellos.

Estas técnicas no dan información de la naturaleza de los componentes, para eso se necesitan otros otros métodos de análisis. análisis.

1. Mecanism os de Separa Separación: ción:

a) Separación por adsorción adsorción (cromatografía (cromatografía de adsorción): adsorción): Diferente afinidad de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo (componentes con polaridad baja o media).

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b) Separación por reparto reparto (cromatografía (cromatografía de reparto): reparto): Diferente solubilidad solubilidad en fases estacionaria y móvil (Componentes (Componentes con polaridad media o alta).

c) Separación por tamaño tamaño molecular (Cromatografía (Cromatografía de permeación permeación de gel, de tamiz molecular o de exclusión por tamaños):

Parámetros de columna  

Intervalo de trabajo: intervalo de M que pueden ser separados Límite de exclusión: M mínimo a partir partir del cual las macromoléculas macromoléculas no experimentan retención. 6


Las moléculas pequeñas penetran en los poros de las partículas de gel, por lo que necesitan más tiempo para para salir salir al final de la columna. Las moléculas moléculas grandes, en cambio, al no penetrar en las partículas de gel se mueven con el disolvente a una velocidad mayor de elución y salen antes de la columna. Por tanto, a mayor masa molecular menor

tiempo de elución. Este método permite separar

por

tamaños

moleculares siendo posible obtener incluso distribuciones de masas moleculares a

d) Separación por Intercambio iónico: La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra.

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Las especies cargadas negativamente se unen a la matriz sólida cargada positivamente y

son retenidas, mientras que las especies positivas son

rechazadas. De esta manera en función de la carga las especies se eluyen a distintos tiempos dando lugar a la correspondiente separación. La elución de las especies especies retenidas se consigue cambiando cambiando el pH del disolvente disolvente

“Una separación puede estar basada en la conjunción de diversos mecanismos”

2.

Mé to do s de anális is cro m ato gr áfi co :

a) b) c) d)

Análisis por por desarrollo desarrollo (cromatografía (cromatografía en papel o capa fina). fina). Análisis por por elución (cromatografía (cromatografía de gases, cromatografía cromatografía líquida). líquida). Análisis frontal. Análisis por desplazamiento. desplazamiento.

Análisis por desarrollo 8


Análisis por elución

Análisis por desarrollo

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3. Clasificació Clasificación n de acuerdo acuerdo c on la forma del lecho lecho c rom atográfico: a) Cromatografía Cromatograf ía en columna. a. Columna empaquetada. b. Columna tubular abierta. b) Cromatografía Cromatograf ía plana (o de lecho abierto). a. Cromatografía Cromatografía en pape. b. Cromatografía Cromatografía en capa fina (TLC). 4. Clasific ación de acuerd o co n el estado físic o de la fase móvil: a) Técnicas cromatográficas. cromatográficas.  GLC  GSC  LLC  LSC b) Cromatografía de gases gases (siempre en columna). columna). c) Cromatografía Cromatograf ía Líquida (en columna o sobre plano). Cromatografía Líquida de Alta Eficacia o de Alta Presión, HPLC. HPLC.  Cromatografía d) Cromatografía con fluido supercrítico.

5. Té cn ic as es pec iale s:

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a) b) c) d) e) f)

Cromatografía con fase invertida Cromatografía con fase normal Análisis isocrático (composición (composición F. móvil constante) Elución con gradiente (Composición (Composición F. móvil cambia de forma f orma continua) Elución en etapas o escalonada (Composición F. móvil cambia de forma escalonada) Cromatografía Cromatograf ía bidimensional (etapas adicionales de separación)

CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA La cromatografía en capa fina (en ( en inglés thin layer chromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Química Orgánica. Entre otras cosas permite: - Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación. - Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia. - Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción r eacción ha acabado. La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente.

Adsorbentes y eluyentes 11


Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina anhidra es el más activo de los dos, es decir, es el que retiene con más fuerza a los compuestos; por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas). El gel de sílice, por el contrario, se utiliza para separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interacción dipolo-dipolo o mediante enlace enlace de hidrógeno si lo presentan. presentan. El orden de elución de un compuesto se incrementa i ncrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o eluyente. El eluyente puede ser un disolvente único o dos miscibles de distinta polaridad. En el siguiente recuadro se recoge por orden creciente de fuerza f uerza eluyente los disolventes más comúnmente empleados. Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona < 2-propanol < metanol < agua En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullición y viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un disolvente más polar que el metanol. Usualmente se emplea una mezcla de dos disolventes en proporción variable; la polaridad de la mezcla será el valor promediado en función de la cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idóneo para cada caso ha de encontrarse por "el método del ensayo y del error".

Determinación de Rf La retención se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar y la fase f ase móvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase estacionaria. Así, las l as moléculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que se produce la elución van siendo desplazadas por la fase móvil. La retención y la selectividad en la separación dependen de los valoresrespectivos de las constantes de los diferentes equilibrios químicos que tienen lugar, que están en función de: - la polaridad del compuesto, determinada por el número y naturaleza de los grupos funcionales presentes. Los solutos más polares quedarán más retenidos puesto que se adsorben más firmemente a los centros activos de la fase estacionaria, mientras que los no polares se eluirán con mayor facilidad. - naturaleza del disolvente. Así, para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad del disolvente facilita su desplazamiento en la placa.

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La relación entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen de la placa se conoce como Rf, y tiene un valor constante para cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas (adsorbente, disolvente, tamaño de la cubeta, temperatura, etc.) . Debido a que es prácticamente imposible reproducir exactamente las condiciones experimentales, la comparación de una muestra con otra debe realizarse eluyendo ambas en la misma placa. Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresión: Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)

La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si ésta es excesivamente grande se obtendrá un valor erróneo del Rf. Se recomienda elegir un eluyente en el que los componentes de la mezcla presenten un Rf medio entorno a 0.3-0.5. Para compuestos poco polares, se

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debe utilizar un disolvente apolar como el hexano.En el caso de compuestos con polaridad media, se aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de etilo en distintas proporciones. Los productos más polares, requieren disolventes más polares como mezclas de diclorometano/metanol en distintas proporciones.

Revelado de las placas La mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente que permite la visualización de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo en el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el producto, y el resultado es la visualización de una mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto. En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualización (o revelado) del cronograma requiere utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los l os productos adsorbidos proporcionando compuestos coloreados.

IV.MATERIALES -Tubo de prueba. -beaker

-capilares

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-mechero -camara de revelado -Cromatoplaca.

-papel whatman

-Silicagel G activado.

V.Procedimiento 

Se toma el capilar y en la parte central a cierta distancia se pasa fuego para partirla por la mitad de la forma que queden pequeños orificios .

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

Una vez separados y ya teniendo los 2 capilares ,se toma con estos parte de la muestra standart y se vierte en la cromatoplaca aprox. A 10mm hacia arriba desde el borde inferior y 5 mm al lado de los costados ,se repite esto tanto en derecha como izquierda.

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Introducir la cromatoplaca en la cámara de saturación y esperamos esperamos que el liquido el que a su vez contiene 2 ml del sistema solvente. Cuando el solvente este por llegar al borde superior retirarla de la cámara, marcar el frente de solvente, dejar secar.

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

Llevamos la cromatoplaca a que sea revelado ,con ayuda de una manguera y con el liquido revelador soplamos a cierta distancia del papel hasta que se produzca el revelado

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

Finalmente calculamos el Rf

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VI.CUESTIONARIO 1.¿Que es una serie eluotropica? La serie eluotrópica es la ordenación de los disolventes de acuerdo con su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente. La fuerza eluyente es una medida de la energía de adsorción del disolvente, supuesto el valor cero para el sistema pentano/sílice pura. La tabla 25.1 ordena una serie de disolventes de acuerdo con su fuerza eluyente respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la columna.

2.Mencione las aplicaciones de la cromatografía por HPCL y la cromatografía de gases

COMPARACIÓN ENTRE CROMATOGRAFÍA DE GASES Y HPLC: Como características de ambos métodos: Son eficientes, muy selectivos, ampliamente aplicables. Sólo se requiere una muestra pequeña. Pueden utilizarse sin destruir la muestra. Se adapta fácilmente al análisis cuantitativo.

Ventajas de la HPLC: Puede acomodar muestras no volátiles e inestables térmicamente. Es aplicable a iones inorgánicos. Ventajas de la CG: Se trata de un equipo sencillo y barato en comparación con HPLC. Es rápido. Tiene resolución en paralelo (columnas capilares). Se conecta fácilmente con la espectroscopia de masas, (MS). La CG, ofrece la ventaja de la velocidad y simplicidad del equipo, pero la HPLC es aplicable a sustancias no volátiles y materiales térmicamente inestables. Algunas diferencias instrumentales : En HPLC no existen detectores tan aplicables universalmente, ni tan tampoco tan fiables como en CG. El detector en HPLC no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. El detector usado en HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

3.Diga que es electroforesis y cual e su fundamento

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. Se fundamenta en la velocidad molecular y en la movilidad.

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VII.Resultados 1. Que precauciones debió tener en cuenta durante el desarrollo del cromatograma 



Al partir el capilar con el mechero se debe estirar por los extremos y asi sea mas rápido Al usar la manguera manguera para el revelado debe ser desde una cierta distancia

Y constante.

2. Que debes tener en cuenta para que la muestra pueda ser aplicada en la lacromatografia Son diferentes los factores que debemos tener en cuenta: 1.

El tiempo.- Es muy importante calcular calc ular el tiempo que debe estar sumergida la placa, en la muestra, ya que determinara la cantidad absorbida.

2.

Manipulación.-Con respecto al trato que se le debe hacer a la placa, pues una vez ya absorbida, entonces debemos manipularla con delicado, evitando que se “contamine”

3.

Haber hecho las marcas respectivas, para así lograr un buen cálculo de las distancias que serán necesarias en la razón que hallaremos.

4.

La temperatura.- Aunque sea un factor que en laboratorio no dimos cuenta del ambiente, deducimos que es determinante sobre todo para ver el nivel de evaporación del compuesto.

5.

L a placa debe ser aplicada en un ambiente libre de aire

Limpieza de las placas. placas. Muchas placas están contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas deben limpiarse

3.Que precauciones se deben tener en cuenta c uenta en el revelado del cromatograma:

1.- mantener la distancia prudente para que el liquido revelador logre su objetivo. 2.- El soplido debe ser constante para obtener un revelado parejo. 3.debe evitarse usar demasiada fuerza a la hora de soplar. 4.- No aspirar y cerciorarse que la manguera este limpia 4.El Rf de la muestra de la cromatografía en capa fina:

Muestra estándar:0.33

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VIII. CONCLUSIONES La cromatografía cromatografía de capa fina (TLC) es una una técnica muy simple, simple, que que presenta una gran utilidad en separaciones de compuestos para llevar a cabo un análisis cualitativo. Resulta particularmente útil en en la separación de colorantes, puesto que al tratarse de sustancias detectables a simple vista, no se requiere la etapa de revelado de las manchas. En los tintes comerciales estudiados, esta técnica ha permitido detectar la presencia de hasta 6 colorantes distintos en una misma formulación y comparar los constituyentes de los diferentes tintes. .Dado que que la cuantificación cuantificación de los compuestos separados por TLC presenta una dificultad notable, los resultados obtenidos por esta té cnica pueden emplearse como etapa previa a un estudio por HPLC. 

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