CROMATOGRAFÍA INTRODUCCIÓN La cromatografía de capa delgada (CCD) es uno de los métodos más ampliamente utilizados para separar, identificar y, en algunos casos hacer el seguimiento de una reacción química. En principio del CCD es sencilla. se produce una capa uniforme de adsorbente sólido adecuado (fase estacionaria) sostenida sobre una placa de aluminio o vidrio. Se coloca con un capilar en el origen de de la placa una mancha de solución de compuesto orgánico o mezcla en estudio, se deja que un solvente adecuado (eluyente o fase móvil) ascienda por la capa del adsorbente por capilaridad. El compuesto o compuestos separados se localizan en la placa directamente en el caso de compuestos coloreados, con la ayuda de un indicador, o con luz ultravioleta cuando la fase estacionaria tiene el indicador ultravioleta (químicamente inerte) el cual produce fluorescencia al irradiarse con luz UV de onda corta (254 nm) u onda larga (366 nm) dependiendo el tipo de indicador utilizado. Los compuestos ascienden por la capa de adsorbente a diferentes velocidades con relación al eluyente realizándose de esta forma la separación de los compuestos de la mezcla. A veces es posible identificar los componentes midiendo la velocidad relativa de cada uno con relación a aquella del frente del solvente. Esta movilidad relativa se conoce como el valor del Rf del del compuesto y se define por: El valor de Rf es una constante de cada compuesto bajo un conjunto de condiciones definidas (eluyente, fase estacionaria, temperatura, espesor del absorbente y humedad). Los valores de Rf se encuentran en el rango de 0 a 0.999%. La distancia se mide al centro de la mancha. La cromatografía de columna (CC) es otro de los métodos más efectivos utilizados para la separación de compuestos, especialmente cuando otros métodos de separación más comunes han resultado poco efectivos. En esta técnica cromatográfica las mezclas se resuelven pasando una fase líquida móvil (eluyente) a través de la fase estacionaria sólida empacada en una columna de vidrio. En la CC clásica el sistema más empleado es el de adsorción; como las fuerzas de atracción son diferentes para los distintos compuestos, estos fluyen de arriba hacia abajo con velocidades diferentes, los menos atraídos eluyen primero. El tamaño de la columna depende de la cantidad de la muestra que se va a separar y el grado de resolución. Suelen usarse razones de 30:1 de peso adsorbente: peso muestra. En esta práctica se desarrollará el cromatograma de una mezcla de tintes. OBJETIVOS Aplicar la CCD y la CC como técnicas de separación de una mezcla de tintes. Comparar la eficiencia y aplicación de la CCD y CC como ejemplos de los métodos cromatográficos.
MATERIALES EQUIPOS E IMPLEMENTOS REACTIVOS Y SUSTANCIAS 1 Columna cromatográfica 10 cm Algodón 1 Gotero Papel de filtro 1 Lápiz o pedazo de manguera Alúmina
2 Beakers de 20 mL Mezcla de tintes 2 Vidrios de reloj Etanol 2 placas par CCD Arena 1 Gradilla 4 tubos de ensayo pequeños
Figura . Diferentes tipos de cromatografía: a) de capa delgada o f ina; b) de columna; c) esquema de cromatografía líquida.
RECOMENDACIONES Para golpear la columna durante su empaquetamiento utilice una varilla de vidrio forrada en un tubo de caucho u otro material que no se rompa. Los pares de tintes que puede utilizar para eta práctica son: fluoresceína y azul de metileno; naranja de metilo y azul de metileno; naranja de metilo y azul victoria B.) Trabaje con un miligramo de cada tinte, disuelto en etanol de 95%. La alúmina debe ser para columna y básica. Se recomienda utilizar lana de vidrio en lugar de algodón, debido a que algunos
componentes tiñen al algodón dificultando una buena separación. RIESGOS En contacto permanente y a largo plazo, la lana de vidrio y la alúmina pueden ser nocivas.
PROCEDIMIENTOS Parte A: Cromatografía de columna.
1. Se introduce en la columna un copito de algodón, luego 2.0 g de alúmina, usando para esto el mismo papel donde se pesó. Se coloca una capita fina de arena y/o algodón. Se golpe suavemente la columna para que la fase estacionaria se acomode, sin dejar espacios vacíos. 2. Se ajusta la altura para que debajo se pueda alinear una serie de 4 tubitos de ensayo colocados en la gradilla. Estos servirán para recoger las fracciones. Se rotulan #1, #2, #3 y #4. Se añade, con un gotero, suficiente etanol para que se humedezca toda la columna. Se golpea otra vez para lograr que se eliminen burbujas de aire y quede bien compacta la fase estacionaria. Se permite que empiece un goteo moderado de solvente y se recoge éste en el tubo de ensayo #1. Durante este proceso, se sigue añadiendo solvente para que la columna no se seque. 3. Cuando el solvente se encuentre 2-3 cm por encima de la fase estacionaria, se añaden 3 gotas de la mezcla de tintes, se adiciona etanol poco a poco hasta que la mezcla se introduzca en la fase estacionaria, luego se agrega etanol hasta casi llenar la columna de vidrio, se recoge la primera fracción en el tubo #2 hasta que el solvente sea incoloro (par notar esto mejor, se coloca un papel blanco detrás de las gotas que van cayendo). 4. Se cambia al tubo de ensayo #3 y el solvente a agua sin dejar secar la columna. Se añade suficiente agua para obtener una fracción de color claro hasta que nuevamente empiece a recoger gotas incoloras. Se cambia ahora al tubo #4 y se recoge la fracción del último tinte. 5. Mida el volumen de cada fracción y anote su color Parte B: Cromatografía de capa delgada.
1. Se toman dos beakers de 20 mL con dos vidrios de reloj como tapas) como cámaras para desarrollar el cromatograma. Se rotulan #1 y #2. Los solventes de elución (etanol-agua) en cada uno serán como sigue: beaker 1 (10:1) y beaker 2 (1:10) 2. Se coloca en los beakers alrededor por la parte interna, una tira de papel de filtro y
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4. 5. 6.
una cantidad de la mezcla de solventes para la elución, suficiente para que al introducir la placa, se humedezca completamente el borde inferior de ésta (el nivel del solvente debe quedar por debajo de las manchas aplicadas). Reciba de su profesor 2 placas para cromatografía de capa fina. Se coloca en cada una un punto de la mezcla de tintes y un punto de la solución de tinta puro soluble en etanol (que también le entregará el instructor), a aproximadamente 1 cm del borde. Para esto, se sumerge un capilar bien fino en la mezcla de tintes y se toca levemente la superficie de la placa para transferir una cantidad bien pequeña de mezcla. La mancha que se forma no debe ser más grane que la cabeza de un alfiler. Con capilares diferentes haga lo mismo con las soluciones de los tubos #2 y #4. Se coloca la placa en el beaker #1 hasta que llegue el solvente a 0.6 cm del borde superior de la placa. Note el tipo de separación que se obtiene. Se saca la placa y antes de que se evapore el solvente, marque con un lápiz hasta donde l legó éste. Se repite el proceso con otra placa, pero se desarrolla este cromatograma en el beaker #2. Se calcula Rf para cada mancha en las dos placas. ¿Cuál sistema de solventes es mejor para separar la mezcla de tintes?
GUÍA DE CONSULTA: 1. Consulte los fundamentos físicos y químicos de los procesos cromatográficos. 2. ¡Cuáles son algunos criterios que deben tenerse en cuenta en la elección de adsorbente en una separación cromatográfica determinada? 3. Descríbanse dos procedimientos húmedos y uno seco para el relleno de una columna cromatográfica. 4. ¿Cuáles son algunos de los métodos que se pueden emplear para la localización de las bandas de adsorción cuando una mezcla de compuestos incoloros se somete a una cromatografía de este tipo? 5. Explique por qué y cómo se separan los compuestos de la mezcla de tintes. 6. ¿Qué es la cromatografía de columna seca? ¿Cómo se desarrolla? 7. ¿Cuál es el desarrollo múltiple y el desarrollo bidimensional de CCD? 8. ¿En qué consiste la cromatografía de CCD preparativa? 9. ¿Qué es una resina de intercambio aniónica y una resina catiónica? 10. Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografía de adsorción en columna. 11. Usted tiene un compuesto impuro y quisiera saber cuántas sustancias están contaminando su compuesto. Explique cómo lo haría utilizando cromatografía de capa delgada o de papel. 12. Si una mezcla de naftaceno, antraceno y naftaleno se cromatografía sobre alúmina, ¡cuál de los tres hidrocarburos se eluirá primero y cuál el último?
