Cromatografía

República Bolivariana de Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Cátedra: Análisis Instrumental

Técnicas Cromatográficas

Maracaibo, 24 de Julio de 2008

Cromatografía de Gases:

1. Estudie Estudie las definicio definiciones nes y términos términos siguie siguientes ntes Cromatografía Cromatograma Elusión Fase Móvil  Tiempo de Retención Ancho de base Fase Estacionaria Altura del plato teórico. Eluyente Resolución  Tiempo muerto Números de platos teóricos 2. Estab Establez lezca ca difer diferenci encias as entr entre los métodos métodos de Croma Cromatog tograf rafía ía de Gases Cromatografía Cromatografía de Gases Cromatografía Cromatografía de Líquidos 3. Identifique Identifique los compon componentes entes generale generaless de un Cromatógr Cromatógrafo afo de Gas y estudie la función de cada una de ellas. 4. Clasifique Clasifique los diferentes diferentes detector detectores es utilizados utilizados en Cromatog Cromatografía rafía de Gases. 5. Enumere Enumere las caracterís características ticas de la Fase Fase Estacionar Estacionaria ia y Fase Móvil en Cromatografía de Gases 6. Como es norm normalmen almente te un Cromató Cromatógrama grama en en Gases. Gases. 7. Enum Enumer ere e las las aplic aplicac acio ione ness cual cualit itat ativ ivas as y cuan cuanti tita tati tiva vass de la Cromatografía Cromatografía de Gases            

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Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

1. Descri Describa ba el funda fundamen mento to de HPLC HPLC 2. Establezc Establezca a la clasifica clasificación ción de los los tipos tipos de HPLC 3. Elab Elabor ore e un esqu esquem ema a co con n los los co comp mpon onen ente tess esen esencia ciales les de un Cromatógrafo Cromatógrafo líquido, y estudie la función de cada uno de ellos. Enumere las características de la l a Fase Fase Estacionaria Enumere las características de la Fase Móvil Establezca las características del soporte ideal en la fase est5acionria de HPLC. 4. Enumere Enumere los los tipos de Detector Detectores es usados usados en HPLC HPLC 5. Estab Establez lezca ca difer diferenc encia ia entre entre separa separació ción n isocrá isocrátic tica a y separa separació ción n con gradiente 6. Como Como afecta afecta los siguien siguientes tes paráme parámetr tros os en la Resolu Resolución ción de la columna: 7. Enumere Enumere las aplicacio aplicaciones nes de de la HPLC   

1.-Estudie las definiciones y términos siguientes: 1.1.1.1.- Cromatogra Cromatografía fía: Es un conjunto de técnicas basadas en el

principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición. La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida. 1.2.- Cromatograma: Es una gráfica u otro tipo de presentación de

la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. Registro producido por el cromatógrafo de gas / líquido. Es también una medida del funcionamiento del instrumento. 1.3.- Elución: Es el procedimiento en el que la fase móvil se pasa de

forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la mues muestr tra a se sumi sumini nist stra ra al sist sistem ema a de for forma disc discrreta, eta, co como mo una una pequeña cantidad en un tiempo breve. 1.4.1.4.- Fase Móvil: Móvil: Puede ser un líquido o un gas que recorre la

column colu mna a crom cromat atog ográ ráfi fica ca tran transp spor orta tand ndo o los los co comp mpon onen ente tess de la mezcla a través de dicho sistema.

1.5.1.5.- Tiempo Tiempo de Retenc Retención ión:: Es el tiempo tiempo trans transcur currid rido o entre entre el

instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatográfica. 1.6.- Ancho de Base: Es la separación de la longitud de las bases

interceptado por agentes delongados en el detector. detector.

Es la que recubre la columna cromato cromatográfic gráfica, a, interiorm interiormente ente sin desplazar desplazarse. se. La fase estacionar estacionaria ia consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo supe superf rfic icia ial. l. Puede uede esta estarr em empa paqu quet etad ada a en for forma de co colu lumn mna a o extendida en forma de capa. 1.7. 1.7.--

Fase ase

Esta Estaci cion onar aria ia:

1.8.- Altura del Plato Teórico: Se utiliza como una medida de la

efic eficien ienci cia a de la co colu lumn mna, a, este este dir direc ecta tame ment nte e rela elaci cion onad ado o co con n la

varianza, por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los términos de varianza y longitud de la columna. 1.9.- Eluyente: Es aquella sustancia que se pone en contacto con la

fase estacionaria y permite que se desplace la muestra.

presa el grado de 1.10.1.10.- Resolución Resolución: Es el parámetro que expre separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes  A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma cromatograma de los anteriores componentes. 1.11.- Tiempo Muerto: Es el tiempo de retención del componente

inerte o gas portador.

1.12.- Número de Platos Teóricos: Se utiliza como una medida

eficiente de la columna.

2.- Establezca las diferencias Cromatografía de Gases.

entre

los

métodos

de

En cromotografía de gases se incluyen todos los métodos croma cromatog tográf ráfico icoss en los que la fase fase móvil móvil es un gas (gas portad portador) or),, siendo la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS). 

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La cromatografía gas-sólido (CGS): Tiene una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos debido a la adsorción física sobre la superficie del sólido. Esta técnica ha tenido una aplicación limitada debido a la tendencia de los picos de elución a formar colas y a la retención semipermanente semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria. La cromatografia gas-líquido (CGL): Se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líqui líquida da inmo inmovi vili liza zada da sobr sobre e la supe superf rfic icie ie de un sóli sólido do iner inerte te (soporte) o en las paredes interiores de la columna, si ésta es capilar.

3.Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas, y estudie la función de cada una de ellas:

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Gas Portador: es un gas inerte, generalmente generalme nte helio, nitrógeno o argón, de elevado grado de pureza. El caudal del mismo que pasa por la columna, ha de ser conocido y controlado. Cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Inyector: Es sólo una pequeña cámara colocada inme inmedi diat atam amen ente te ante antess de la(s la(s)) co colu lumn mna( a(s) s) de sepa separa raci ción ón,, donde se accede mediante una jeringa adecuada o con una válv válvul ula a de inye inyecc cció ión. n. El Inye Inyect ctor or es el luga lugarr por por dond donde e se introduce una pequeña cantidad de muestra (del orden de 1 cm3 de gas o 1 micro-litro de líquido) en medio de la corriente de gas. También se encarga de vaporizar las muestras cuando éstas no son gaseosas. Así, la temperatura del inyector ha de ser superior a la del punto de ebullición del componente de la mezcla menos volátil. Columnas: El sistema de columnas cromatográf cromatográficas icas constituyen el corazón de todo cromatógrafo. Cada columna se diseña para aprovech aprovechar ar alguna alguna propieda propiedad d de los diferentes diferentes componente componentess que resul resulte te adecua adecuada da para para genera generarr distin distinta ta veloci velocidad dades es de avan avance ce para para ca cada da uno uno de ello elloss dura durant nte e el rec ecor orri rido do de la columna. Existen dos tipos: Las column columnas as de rellen relleno: o: Suelen Suelen ser de cobr cobre, ace acero ro inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La efic eficac acia ia está está en tor torno a 1.00 1.000 0-2.0 -2.000 00 (pla (plato toss teóric teóricos/ os/m). m). Suelen Suelen emplea emplearse rse para para muestr muestras as poco poco complejas, máximo 10 componentes. Las columna columnass capilar capilares: es: Tienen ienen un diámet diámetro ro interi interior or inferior a 1 mm (320-250 μm) y una longitud de 5 a 50 m. Suelen construirse con sílice fundida que le dan gran gran resis esiste tenc ncia ia físi física ca y flexi flexibi bilid lidad ad.. Alca Alcanz nzan an una una eficacia hasta de 4.000 (platos teóricos/m) y se usan para para mues muestr tras as co comp mple leja jas. s. La fase fase esta estaci cion onar aria ia se depo deposi sita tada da sobr sobre e las las par paredes edes inte interi rior ores es del del tubo tubo capilar. capilar. Las columnas semicapilares tienen un diámetro interior de 530 μm que admiten cantidades de muestra similar similares es a las column columnas as de relle relleno, no, y propo proporc rcion ionan an mayor eficacia que éstas. Detector: Detector: Es un dispositivo dispositivo para revelar revelar la presenci presencia a de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica. Podem demos expres presar ar que el det detec ecto torr son los los "o "ojo jos" s" de un crom cromat atóg ógra rafo fo.. Es un disp dispos osit itiv ivo o ca capa pazz de co conv nver erti tirr una una prop propie ieda dad d físi física ca,, no me medi dibl ble e dir direc ecta tame ment nte, e, en una una seña señall elab elabor orab able le y ofr ofrec ecer erno noss info inforrma mació ción n sobr sobre e la natu natura rale leza za y magnitud de la propiedad física. El sistema de detección genera una señal cuando un componente de la mezcla completa el recorrido recorrido del sistema de separación. Un sistema de Integración: para cuantificar la l a señal generada por cada componente en el Detector. o

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4.4.- Clas Clasif ifiq ique ue los los dife difere rent ntes es dete detect ctor ores es util utiliz izad ados os en la cromatografía de Gases:

Estos pueden ser clasificados: 

Detectores según su Grado de Selectividad : Universal Universales: es: Responde Responde a la mayoría mayoría de los solutos que pasan por él. Específicos ó Selectivos: Exhibe una gran respuesta a un grup grupo o part partic icul ular ar de subs substa tanc ncia iass co con n un míni mínimo mo de respuesta a otras. Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificación, obviamente, es en referencia a si la muestra es destruída o no. Detectores según su Modo de Respuesta: Dependientes Dependi entes del de l Flujo Másico : Producen una señal se ñal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a través de él en la unid unidad ad de tiem tiempo po per pero es inde indepe pend ndie ient nte e del del volúmen de gas portador requerido para la elución. Depe Depend ndie ient nte e de la Co Conc ncen entr trac ació ión: n: Dan Dan una una seña señall prop propor orci cion onal al a la ca cant ntid idad ad de solu soluto to por por unid unidad ad de volúmen de gas portador que pasa a través de él. Detectores según el proceso de detección Ionización, Ópticoespectroscópico, espectroscópico, Electroquímico, etc. o

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o

o

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5.- Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases:

Fase Estacionaria:   

Es la forma más habitual La fase estacionaria es no polar y la móvil es polar Utiliza disolventes no polares

Fase Móvil M óvil   

Es habitual Utiliza una fase estacionaria polar y una móvil no polar Utiliza disolventes polares

6.- Como es normalmente una Cromatografía de Gases.

La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las siguientes etapas: 1.-Una vez elegida la columna y fase estacionaria, se ajustan las temperaturas de la cámara de inyección, columna y detector, así  como el caudal de gas portador. Cuando la señal del detector es cons co nsta tant nte e (sin (sin ruid ruidos os la líne línea a base base)) se hac ace e la inye inyecc cció ión n de la muestra. 2.-Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 µl cuando son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas; se introducen en la cámara de inyección, donde se vaporizan, y son arrastradas hasta cabeza de columna. 3.-Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna; por equili ilibrios ios sucesivos entre fase móvil y estacion ionaria cada componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes. 4.-Finalmente, los solutos que salen de la columna, pasan al detector y se obtiene el cromatograma. cromatograma. 7.- Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases:

CUALITATIVAS Identificación Cromatográfica: Cromatográfica: Por Datos de Retención Por Serie Homólogas (Indices de Retención de Kovacs) Identificación No Cromatográfica: Cromatográfica: Análisis Clásicos Identificación por: Adición de Estándar Formación de Derivados Sustracción de un Componente Identificación con Técnicas Auxiliares: UV, IR, MS, RMN 

o o

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o o

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CUANTITATIVAS Normalización de Área Normalización de Área con Factores de Respuesta Estandarización Externa Estandarización Interna    

1.- Describa el fundamento de la HPLC:

La cromatografía líquida es una técnica cuyo objetivo es la separación de los los disti istin ntos tos co com mpone ponent ntes es de una una mezcl ezcla a de susta ustan ncias cias,, basá basánd ndos ose e en las las dife diferrente entess reten etencio cione ness que que expe experi rime ment ntan an los los componentes de la misma al pasar a través de una fase estacionaria,

cuan cuando do la mues muestr tra a es elui eluida da por por una una fase fase mó móvi vill líqu líquid ida. a. Así, Así, la separación de los componentes de la muestra se produce debido a sus interacciones entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida, contenida en una columna cromatográfica. Para explicar el fenómeno cromatorgráfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro próximo Fundame undamento nto remot remoto: o: Este Este fundam fundament ento o se encuen encuentra tra en alguna alguna o algu alguna nass prop propie ieda dade dess físi física cass o físi físico co quím químic icas as de los los anal analit itos os:: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divi dividi dido dos) s),, vola volati tili lida dad, d, tama tamaño ño,, ca carrga, ga, rea eact ctiv ivid idad ad quím químic ica a o bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situ situac ació ión n exper xperim imen enta tall diná dinámi mica ca dond donde e exhib xhiben en dos dos de esta estass propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones condi ciones siguientes: - Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. Funda undame ment nto o pró próximo ximo:: Se encu encuen entr tra a en el hech hecho o de que que es muy muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica. 2.- Establezca la Clasificación de los tipos de HPLC: 

Cromatografía Cromatografía de fase normal:

Fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante pola polarr. El co comp mpue uest sto o pola polarr se asoc asocia ia y es reten etenid ido o por por la fase fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en factores estericos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

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Cromatografía Cromatografía de fase reversa:

Consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. moderada. Una de las fases fases estacionar estacionarias ias más comunes comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatogr c romatografía afía de fas fase reve eversa rsa se basa asa en el prin princi cipi pio o de las las inte interrac acci cion ones es hidr hidrof ofób óbic icas as que que resul esulta tan n de las las fuer fuerza zass de repul epulsi sión ón entr entre e un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del comp co mpue uest sto o a la fase fase esta estaci cion onar aria ia es la dism dismin inuc ución ión del del área área del del segm segmen ento to apol apolar ar del del anal analit ito o expu expues esto to al diso disolv lven ente te.E .Est ste e efec efecto to hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuestodisolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las características del compuesto de interés juegan un papel muy impo import rtan ante te en la reten etenció ción. n. En gene genera ral, l, un co comp mpue uest sto o co con n una una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor por porque que aume aument nta a la hidr hidrof ofob obic icid idad ad de la mo molé lécu cula la.. Aun Aun así, así, las las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la supe superf rfic icie ie del del co comp mpue uest sto o y la fase fase esta estaci cion onar aria ia.. El tiem tiempo po de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte Aparte de la hidrofobic hidrofobicidad idad de la fase móvil, otras modificacio modificaciones nes de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adic adición ión de sales sales inor inorgá gáni nica cass prov provoc oca a un aume aument nto o linea lineall en la tensión superficial, y como que la entropía de la interfase compuestodisolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención. Otra Otra vari variab able le impo import rtan ante te es el pH pues puesto to que que pued puede e ca camb mbia iarr la hidr hidrof ofob obic icid idad ad del del co comp mpue uest sto o. Por este este mo moti tivo vo,, la mayor ayoría ía de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor alor del pH. pH. Estos stos tamp tampon ones es co cont ntrrola olan el pH, pH, per ero o tambié mbién n

neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que que haya aya qued uedado ado expu xpuest esta y actú ctúan co como mo co con ntra traion iones que que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC.

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Cromatografía Cromatografía de exclusión molecular

 También  También conocida como cromatografía por filtración fi ltración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy muy útil útil par para la det deter ermi mina naci ción ón de la estr estructur uctura a ter terciari ciaria a y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. La cromatogra grafía de filt iltración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular, o más precisamente, según su radio de Stokes. En esta esta crom cromat atog ogra rafí fía, a, la fase fase esta estaci cion onar aria ia co cons nsis iste te en lar largos gos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los los fine finess prác prácti tico cos, s, la co colu lumn mnas as se em empa paqu quet etan an co con n pequ pequeñ eñas as partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los por poros es tal tal que que algu alguna nass mo molé lécu cula lass (las (las dema demasi siad ado o gran grande des) s) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.

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Cromatografía Cromatografía de intercambio iónico:

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atra atracc cción ión elec electr tros ostá táti tica ca entr entre e los los ione ioness en solu solució ción n y las las ca carg rgas as inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores intercambiadores iónicos son: i) Resinas de

polies poliestir tireno eno,, ii) inter intercam cambia biador dores es iónico iónicoss de celulo celulosa sa y dextra dextranos nos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En genera generall los inter intercam cambia biador dores es iónico iónicoss favor favorece ecen n la unión unión de iones iones elevada carga y radio pequeño. Un incremento en la concentración del contraión (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio catiònico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías cromatografías de intercambio aniònic. 

Cromatografía Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, Waals, inte in tera racc ccio ione ness electr ele ctros ostá táti tica cass, inte in tera racc ccio ione ness dipo di polo lo-d -dip ipol olo o, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria. 3.- Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido, y estudie la función de cada uno de ellos.

Un equi equipo po para para crom cromat atog ogra rafí fía a líqu líquid ida a de alta alta resolu esoluci ción ón pued puede e representarse representarse por el siguiente esquema: Bomba: a: Enví Envía a al solv solven ente te a trav través és de ca caño ñoss de diám diámet etrro - Bomb pequeñ pequeño, o, gener generalm alment ente e de ace acero ro inoxid inoxidabl able. e. El sistem sistema a de bombeo debe seguir los siguientes requerimientos: 1. Generación de presiones por encima de 6000 psi(~410 atmósferas) 2. Flujo libre de pulsaciones 3. Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min(con control del 0.5%) 4. Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o Teflón) 5. Reproducible  Tipos de Bombas: • Bombas reciprocas • Bombas de desplazamiento • Bombas neumáticas álvula Inyectora: Inyectora: Consiste Consiste en una válvula de seis vías que - Válvula permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeñas cantidades de muestra (0.1-100μL) -

Columna: Se produce la separación de los componentes. Son, generalmen generalmente te de Acero Acero inoxidab inoxidable, le, con una longitud longitud de 10-30

cm y un diám diámet etro ro inter interno no de 4-10 4-10mm mm.. De 1-10 1-10μm μm tama tamaño ño particula-40,000-60,000 platos/metro. platos/metro. PRECOLUMNAS

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

Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y contaminantes de las disolvente. La composición del relleno debe ser semejante a la columna analítica

-

Detector: Detecto r: Produce Produce una señal eléctrica eléctri ca proporcional a la cantidad de ma mate teri ria a y esa esa seña señall es envi enviad ada a al regist egistra rado dorr. Debe Deben n de tener un volumen interno pequeño para reducir el ensanchamiento de pico. Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción (refracción,, densidad densidad etc.) y en una propiedad propiedad del soluto (absorbancia en UV, fluorescencia etc.)

-

Registrado egistradorr Integrado Integrador: r: Realiza un gráfico gráfico de intensidad intensidad en función del tiempo (cromatograma) que idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. Este que El integrador calcula además el área correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia

3.1.- Características de la Fase Estacionaria:  

Puede ser alúmina, alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico. Para ara que que el líqu líquid ido o inmo inmovil viliz izad ado o sea sea útil útil debe debe pose poseer er diferentes coeficient5es de participación con los solutos.

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Para ara que que un solu soluto to pres presen ente te un tiem tiempo po de resid esiden encia cia razonable en la columna, debe poseer por lo menos, una cierta compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria. Entre Entre soluto solutoss de polari polaridad dad simila similar, r, el orden orden de elusió elusión n gene genera ralm lmen ente te sigu sigue e al orde orden n de punt puntos os de ebul ebullic lició ión; n; cuan cuando do ésto éstoss difi difier eren en sufi suficie cient ntem emen ente te son son fact factib ible less separaciones limpias. Los solutos con puntos de ebullición casi idénticos, pero de diferentes polaridades, retendrán selectivamente uno o máss de los má los co comp mpon onen ente tess por por inte intera racc cció ión n dipo dipolo lo o por por formaciones de abducto

3.2.- Características de la Fase Móvil: 

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Es un solv solven ente te líqu líquid ido, o, el cual cual pued puede e ser ser pur puro o una una mezcla de solventes. El tiem tiemp po de reten etenci ción ón aumen umenta ta co con n la adici dició ón de dis disolve olven nte polar olar a la fas fase mó móv vil y dis disminu minuye ye co con n la introducción de disolventes más hidrofóbicos. El líquido, se obliga a pasar a través del sólido bajo presión o bien se deja percolar a través de él, por efecto de la gravedad.

3.3.- Características estacionaria de HPLC 



del

soporte

ideal

en

la

fase

La func funció ión n básic ásica a del sopo soport rte e es la de “m “man ante ten ner er”” (sotener, retener) la fase estacionaria La mayoría d elos soportes cromatográficos está hecha de diatomita. Químicamente es casi todo sílice, con algunas impurezas.

4.- Enumere los tipos de detectores utilizados en HPLC:

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . •

Ejemplo: Detector de Indice de Refracción •

Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta

Los detectores más utillizados en HPLC son: Detector UV. Hay básicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos Detector de Indice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:  Tipo Deflexión  Tipo Fresnel •

o o o

•

o o

•

•

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización . Detector de Fluorescencia Inducida por Laser Según la Fuente de Excitanción Según el sistema óptico Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperométrico Detector Conductimétrico Detector Potenciométrico o o

•

o o o

5.- Establ Establezc ezca a difere diferenci ncia a entre entre una separa separació ción n isocrá isocrátic tica a y separación con gradiente:

En la HPLC HPLC isoc isocrát rátic ica a el compuesto pasa por la columna cromatogràfica a través de la fase estacionaria (normalme (normalmente, nte, un cilin lindro con pequeñas partícu ículas redondeadas con ciertas caract caracterí erísti sticas cas químic químicas as en su super superfici ficie) e) median mediante te el bombeo bombeo de líquido (fase (fase móvil) móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retra etrasa san n difer diferen enci cial alme ment nte e depe depend ndie iend ndo o de las las inte intera racc ccion iones es químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un comp co mpue uest sto o a ser ser elui eluido do de la co colu lumn mna a se deno denomi mina na tiempo tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un co comp mpue uest sto o en una una dete deterrmina minada da fase fase mó móvi vill y esta estacio ciona nari ria. a. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difu difussión ión den dentro tro de la co colu lum mna mejo ejora rand ndo o la reso esoluci lución ón de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, agua, el metanol y el acetonitrilo. acetonitrilo. El agua gua pued puede e co cont nten ener er tam amp pone ones, sale ales, o comp co mpue uest stos os co como mo el ácido trifluor trifluoroacét oacético ico,, que ayudan a la separación de los compuestos. Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/a agua/acet cetoni onitri trilo lo los compue compuesto stoss más hidro hidrofíl fílico icoss eluirá eluirán n a ma mayor yor concentración ión de agua, mientras que los los compuestos más

hidro hidrofób fóbico icoss eluirá eluirán n a concen concentra tracio ciones nes ele elevad vadas as de ace aceton tonitr itrilo ilo.. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos. 6.- Cómo afectan los siguientes parámetros en la Resolución de la columna: 

Diámetro de la partícula:

La mayoría de HPLC tradici icionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto sign signif ific ica a que que dism dismin inui uirr la me medi dida da de las las part partíc ícul ulas as a la mita mitad, d, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho. 

Longitud de la columna:

Es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las colu co lumn mnas as de diám diámet etrro inte intern rno o má máss gran grande de (>10 (>10 mm) mm) se utili utiliza zan n normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen deno denomi mina narr co colu lumn mnas as de rang rango o anal analít ític ico o y nor norma malm lmen ente te está están n asoc asocia iada dass a un detector detector UVUV-VIS. VIS. Apar Aparte te,, exis existe ten n otr otros tipo tiposs de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas. masas. 7.- Enumere las aplicaciones de la HPLC 

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Compuest Compuestos os iónicos, iónicos, como aminoácido aminoácidos, s, sales inorgánica inorgánicas, s, ácidos orgánicos, etc. Comp Co mpue uest stos os de alto alto peso peso mo mole lecu cula lar, r, co como mo polí políme merros, os, hidrocarburos hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc. Compue Compuesto stoss termol termolábi ábiles les y no voláti volátiles les,, como como vitami vitaminas nas,, pesticidas pesticidas,, esteroid esteroides, es, plastifican plastificantes, tes, drogas drogas y un producto producto muy grande de otros productos farmacéuticos. farmacéuticos. Análi Análisi siss de co comp mpue uest stos os vita vitamí míni nico coss es posi posibl ble e en co cort rto o tiempo.

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Dete Determ rmin inac acio ione ness de co cons nsti titu tuye yent ntes es de ác ácido idoss nucle nucleic icos os (nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico. Determinación de esteroides. El análisis de medicamentos (determinación de los los componentes activos de una tableta analgésica, análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc). En separaciones según el tipo químico, ya que su finalidad no es la separación de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.