Sistema CRISPR-Cas9 El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta molecular utilizada para editar el genoma celular, donde incluimos el genoma humano. Podemos pensar en este sistema como unas “tijeras moleculares” capaces de cortar el DNA de manera muy precisa, controlada y efica z permitiendo así la modificación, eliminación o i nserción de secuencias en el DNA. Empezando con su historia, ya en el año 1987 se publicó un artículo en el que se describía cómo algunas bacterias (Streptococcus pyogenes) se defendían de las infecciones víricas. En concreto se observó que las bacterias tenían unas enzimas capaces de distinguir entre el material genético de la bacteria y el del virus infectivo y, una vez detectada la distinción, destruían el material genético vírico. Poco tiempo después, una vez que se consiguió mapear los genomas de algunas bacterias y otros microorganismos, se encontró que había una zona determinada del genoma de estos microorganismos llena de repeticiones palindrómicas separadas entre sí mediante unas secuencias denominadas “espaciadores” que se parecían a otras de virus y plásmidos. Delante de estas repeticiones hay unas secuencias “líder” a las que llamaron CRISPR (“Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente interespaciadas”). Cerca de este agrupamiento se podían encontrar unos genes que codificaban para un tipo de nucleasas: los genes cas. Se observó que todo este entramado servía a la bacteria como sistema de defensa frente al ataque vírico. Cuando el virus entra en la bacteria, su material genético interacciona con el complejo proteína Cas unida a un RNA producido a partir de las secuencias CRISPR, de esta manera es inactivado y posteriormente degradado. Las proteínas Cas cogen una pequeña parte del DNA viral, lo modifican e integran dentro del conjunto de secuencias CRISPR. De esta manera, si la bacteria (o la descendencia de esta) se encuentra con ese mismo virus, será capaz de inactivar de forma más eficiente al material genético viral.
En los años posteriores se continuó la investigación sobre este sistema y fue en el año 2012 cuando se convirtió en realmente una herramienta molecular útil en laboratorio. El equipo que consiguió esto estaba dirigido por Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna cuyo artículo publicado en Science demostró que este mecanismo podía usarse para editar de manera programable cualquier cadena de DNA in vitro. Es decir, lograron programar el sistema para que se dirigiera a una posición específica de un DNA cualquiera y lo cortaran. Básicamente lo que se hace es diseñar una molécula de RNA (CRISPR o RNA guía) que posteriormente es insertada en una célula, donde posteriormente reconoce el sitio exacto del genoma donde la enzima Cas9 debe cortar. Primero el RNA guía se asocia con la enzima Cas9 y se dirige a una secuencia concreta del DNA de la que es complementaria e hibrida con ella. En ese momento actúa Cas9, enzima con actividad endonucleasa, que corta el DNA en esa región. Posteriormente se activan al menos dos mecanismos de reparación naturales del DNA cortado. Uno es el indeI (inserción-deleción) que hace que en el sitio donde se ha cortado aparezca un hueco o que se inserte un trozo más de cadena. De esta manera se logra una pérdida de la función original del segmento de ADN cortado. Otro mecanismo permite incorporar una secuencia concreta exactamente en el sitio original del corte, dándole, evidentemente, esa secuencia para que sea integrada.
Como vemos, con la tecnología CRISPR/Cas9 podemos regular la expresión génica, “etiquetar” sitios específicos del genoma en células vivas, identificar y modificar funciones de genes y corregir genes defectuosos.
Este sistema nos permitirá, no en un futuro muy lejano, curar enfermedades cuya causa genética se conozca, lo que se conoce como terapia génica. Hoy día ya se está trabajando con esta tecnología en enfermedades como la Corea de Huntington, el
Síndrome de Down o la anemia falciforme. Otra aplicación que actualmente se está trabajando es la modificación genética de embriones humanos, tema que no escapa de controversias éticas. Uno de los estudios que se han llevado a cabo ha sido la introducción de una mutación en el material genético de embriones humanos para hacerlos resistentes al virus VIH. Aunque los resultados no han sido correctos en su totalidad, se ha cumplido el objetivo para el que se realizó el estudio, establecer principios para la introducción de modificaciones genéticas en embriones humanos tempranos.
Introducción de modificaciones genéticas en embriones humanos por edición genómica mediada por CRISPR/Cas9 El gen mutado ha sido el CCR5, que codifica el principal correceptor utilizado por VIH-1 para infectar las células humanas, y cuya mutación ha sido generar el alelo nulo CCR5Δ32, que en organismos heterocigotos y homocigotos para este alelo hace que sean saludables y tengan una progresión más lenta o resistencia a infecciones por el VIH. El procedimiento fue el siguiente: se obtuvieron 213 embriones 3PN (tripronuclear), que solo viven 3 días y son incapaces de desarrollarse in vivo, de un total de 87 pacientes. Estos se inyectaron con una mezcla de ARNm de Cas9 y ARN guía (RNAg), y dos oligos (oligodeoxinucleotidos o ssODNs de 90 bp) o DNA donante (1 kb).
Respecto al protocolo, para la producción del ARNm de Cas9, se llevó a cabo la transcripción in vitro (IVT), siendo añadido un promotor T7 a la región codificante de Cas9 por amplificación por PCR. El producto de PCR fue purificado y usado como plantilla para IVT. Para el ARNg, las plantillas IVT fueron generadas por amplificación por PCR usando las cartillas enumeradas en tabla S1. El producto de PCR de gRNA T7 fue purificado y utilizado como plantilla para IVT. Tras la amplificación de todo el genoma (Whole-Genome Amplification) y su purificación, el ADN purificado fue corrido en geles de agarosa para confirmar el éxito de dicha amplificación. En cuanto al procedimiento, los dos gRNAs diseñados tenían como objetivos cada extremo de la frontera de la secuencia de 32 bp deseada dentro del exón 4 del gen CCR5 (Fig. 1a). Cuando los DSBs (Double-Strand DNA) mediados por CRISPR/Cas son reparados por nonhomologous end-joining (NHEJ), pequeñas inserciones o deleciones (indels) pueden ocurrir y conducir a alelos mutantes de CCR5.
En primer lugar, se intentó evaluar el potencial del desarrollo in vitro de cigotos 3PN inyectados con el sistema CRISPR/Cas. El mRNA de Cas9 y los gRNA1 o gRNA2 fueron inyectados en los cigotos por inyección citoplasmática, y fueron cultivados durante 3 días hasta llegar a una etapa de 8-16 células (Fig. 1b). Aproximadamente el 72% de los embriones inyectados con agua (grupo control) llegaron a dicha etapa. En comparación, el 64 y 62% de los cigotos inyectados con mRNA de Cas9 y gRNA1 o gRNA2, respectivamente, llegaron a tal etapa de 8-16 células, lo que sugiere un efecto mínimamente perjudicial.
Cada embrión inyectado que se desarrolló fue aislado y su ADN genómico fue amplificado, y la región específica, secuenciada por método SANGER. Los productos PCR de mutantes identificados fueron clonados en plásmidos, y cada alelo fue identificado por secuenciación (Fig. 1 c). La eficacia de la modificación genética fue superior al 50% con gRNA1 o gRNA2, lo que indica que podrían introducirse potencialmente beneficiosas modificaciones genéticas en los embriones humanos tempranos con alta eficiencia (tabla 1).
A continuación, se probó si se podría presentar el alelo Δ32 precisamente en el lugar geométrico de CCR5 a través de la vía HDR (Homology Directed Repair) mediante el uso de ssODNs como donantes. Dos ssODNs largos (90 nucleótidos) fueron diseñados a partir de la cadena con sentido (ssODN1) y la cadena anti-sentido (ssODN2) del lugar geométrico del CCR5, cada uno con 45 nt homólogos a la secuencia de cada lado de la secuencia de 32 pb (tabla S2). Se inyectó la mezcla de mRNA de Cas9, gRNA1 y ssODN1. Esto dio como resultado la producción del alelo CCR5Δ32 en uno de los 20 embriones total es (Fig. 1 d, tabla 1). Se intentó mejorar esta eficiencia proporcionando un donante de 1 kb con homología total pero no se veía mejoría significativa (tabla 1).
Como NHEJ es más eficiente y como dos DSBs pueden unirse precisamente a través de la vía NHEJ, se co-inyectó el mRNA de Cas9 junto con ambos gRNAs a los límites de la región de 32 bp sin proporcionar ningún donante de ADN. Así se consiguieron generar embriones con el alelo CCR5Δ32 en 4 de las 26 muestras totales (tablas 1 y 2). Todos los alelos identificados de los embriones que contienen el alelo CCR5Δ32 se muestran en la figura 2, y los resultados del PCR subcloning se resumen en las tabla 2. En los embriones que contienen el alelo CCR5Δ32, los otros alelos en el mismo locus siguen siendo de tipo salvaje o contienen mutaciones indel diferentes que no estaban predefinidas.
Tabla 1. El sistema CRISPR/Cas fue inyectado por inyección citoplasmática en todos los cigotos 3PN, excepto el marcado con PN, por inyección pronuclear.
Tabla 2. Clonado (subcloning) de los productos de PCR de los embriones humanos 3PN que contienen el alelo CCR5Δ32.
En este estudio, se ha demostrado que un alelo beneficioso obtenido naturalmente puede ser introducido en embriones humanos tempranos 3PN a través de la inyección del sistema CRIPSR/Cas9 en el cigoto. Probando diferentes estrategias, se logró introducir el alelo CCR5D32 en el embrión humano temprano 3PN. Debido a la escasez de embriones humanos, se tiene un número relativamente bajo de muestras para cada grupo. Además, las diferencias en el desarrollo y las tasas de mutación entre los grupos no son significativas, y no se puede sacar ninguna conclusión precisa. Incluso en los embriones en los que se introdujo satisfactoriamente el alelo CCR5D32, los alelos que se encontraban en los embriones en el mismo locus no podían ser controlados por su naturaleza silvestre (wild type) o por contener mutaciones indel. Los posibles efectos fuera del gen diana son un gran problema para el sistema CRIPSR/Cas9. Algunos estudios han informado acerca de mutaciones heredables inducidas tanto en humanos como en ratones. A pesar de esto, se sigue investigando cómo poder optimizar este sistema de modificación genética para poder resolver, sin lugar a dudas, en un futuro no muy lejano un gran número de enfermedades.
Para acabar, vamos a hablar de otro logro en el que este sistema fue protagonista: Un equipo de investigadores del Instituto Tecnológico de Massachusets, consiguió curar ratones de una rara enfermedad del hígado causada por una mutación genética, usando este método del que ya hemos hablado. Este logro, según ellos, supuso la primera evidencia de que se pueden revertir síntomas de enfermedad en animales vivos y que la técnica CRISPR tiene potencial para tratar distintos trastornos genéticos. Utilizaron este sistema de igual forma a la ya relatada: cas9 se ligó a la hebra de ARN programada para vincularse a una secuencia de genoma específica, y esta sirvió como guía indicándole a Cas9 la parte de ADN que debía cortar. Introdujeron en células de ratones una hebra de ADN que funcionaba como patrón de manera que cuando la célula reparaba el daño producido con la enzima Cas9, lo hacía copiando ese modelo e introduciendo nuevo material genético en el genoma. El equipo diseñó tres hebras de ARN guías dirigidas a tres secuencias de ADN objetivo distintas, cercanas a la mutación genética que causa la enfermedad tirosinemia de tipo I, causante de que el cuerpo no pueda romper el aminoácido tirosina, lo que provoca alteraciones a nivel hepático y renal, además de
retraso mental. Esta enfermedad está ocasionada de manera más específica por una mutación en el gen que codifica la enzima fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH). El suministro de los componentes del sistema CRISPR a ratones con esta mutación se hizo mediante inyección de alta presión, con una jeringuilla potente que descarga rápidamente el material en las venas del animal. Así lograron insertar el gen correcto en aproximadamente uno de cada 250 hepatocitos de los ratones. Después de 30 días, esas células sanas comenzaron a proliferar y a sustituir a las enfermas, hasta formar aproximadamente un tercio del total de los hepatocitos. Esto fue suficiente para curar la enfermedad y permitir que los ratones sobrevivieran sin el medicamento que se suele suministrar.
Bibliografía: Sistema CRISPR: http://dciencia.es/que-es-la-tecnologia-crispr-cas9/ Introducción de modificaciones genéticas en embriones humanos por edición genómica mediada por CRISPR/Cas9: http://www.gwern.net/docs/genetics/2016-kang.pdf Artículo: “Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing” Technological innovations 2016
Última noticia: http://www.tendencias21.net/Eliminan-una-mutacion-genetica-aplicando-unmetodo-de-edicion-del-ADN_a32590.html
