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Introduction à la microbiologie La microbiologie est la science qui a pour objet l’étude des microbes (du grec : mikros = petit ; bios = vie). Ce terme (microbe) englobe tous les organismes vivants, de petites dimensions nécessitant le microscope. Les microbes comprennent les microorganismes suivants : • Champignons inférieurs ; • Algues unicellulaires ; • Protozoaires ; • Microorganismes unicellulaires que leurs caractères ne permettaient pas de les rattacher à l’un ou l’autre de ces groupes : on les a denomés : bactéries (du grec bakteria = bâton) en raison de la forme en bâtonnet de certains d’entre eux. L’étude de chacune de ces catégories de microorganismes constitue une discipline spécialisée en raison de l’importance du nombre d’espèces de chacune, de leur diversité quant à l’habitat, leur mode de vie, leur morphologie et leur rôle dans la vie de l’Homme. La microbiologie est donc en fait une science pluridisciplinaire comprenant : • La mycologie ; • L’algologie ; • La protozoologie ; • La bactériologie. Quant aux virus, une science spéciale est consacrée à leur étude : la virologie. Les microorganismes se trouvent partout dans la nature. C’est la forme de vie la plus abondante et la plus répandue sur toute la planète.
Quelques grandes étapes de l’histoire de la microbiologie La découverte du monde microbien C’est le Hollandais LEEUWENHOEK (1632-1723) qui a révélé à l’Homme l’existence du monde microbien, en utilisant des microscopes simples. Ce naturaliste n’était pas un étudiant brillant. Il a quitté très tôt l’école pour se consacrer au commerce. Il consacrait ces moments de loisir à tailler des lentilles. Il observait tout ce qui était à sa portée : tige de plante, insectes, goutte d’eau, etc. Un jour il écrit « Je ne connais pas de spectacle plus fascinant que celui d’une goutte d’eau, avec les milliers d’êtres qui y vivent et s’agitent en même temps ». Les formes des bactéries qu’observait LEEUWENHOEK n’étaient pas toutes identiques. Il a dessiné des formes sphériques (cocci), des formes allongées en forme bâtonnets (bacilles), et des spirilles contournées en spirale. Génération spontanée et biogenèse La découverte d’un monde d’organismes invisibles à l’œil nu fait renaître un grand débat sur l’origine de la vie. D’où viennent ces microorganismes ? Certains naturalistes de l’époque prétendaient qu’ils provenaient de la décomposition des tissus animaux et végétaux morts (génération spontanée ou abiogenèse) = théorie selon laquelle la vie provient du non vivant. Au début du 19ème siècle, en se basant sur des expériences, plusieurs chercheurs essayent d’apporter des preuves en faveur de la biogenèse (tout organisme vivant provient d’un organisme vivant préexistant), contre la génération spontanée.
2 L’Italien Spallanzani faisait bouillir des solutions nutritives à base de bœuf dans des flacons avant de les sceller hermétiquement (fig. 1). Ces expériences n’ont pas convaincu les partisans de la génération spontanée. Ces derniers prétendent que l’air était essentiel à la génération spontanée. Plus tard Schwann et Schultze modifient l’expérience de Spallanzani : Schwann fait passer l’air dans un serpentin chauffé au rouge avant de l’envoyer dans la solution nutritive stérile. Schulze fait passer l’air dans une solution acide avant de l’envoyer dans le bouillon nutritif stérile. Dans les deux cas aucun microbe n’apparaît dans la solution nutritive (fig. 2-3). Mais les partisans de la génération spontanée n’étaient toujours pas convaincus. Ils prétendent que l’acide et la chaleur avaient modifié l’air. Vers 1850, Schröeder et Von Dusch ont fait une expérience plus convaincante en faisant passer l’air dans des tubes remplis de coton. Le coton retenait les microorganismes de l’air et aucun microbe ne s’est développé (fig. 4). A cette même époque, un nouveau nom apparaît dans le domaine de la science : Louis Pasteur (1822-1895). Pasteur a reçu la formation de chimiste, mais plus tard il s’est intéressé à la fermentation qui est un processus biochimique dû aux microbes. Cet intérêt pour les processus fermentatifs l’engage dans le débat sur la génération spontanée. Il s’oppose avec vigueur à cette théorie et entrepris des expériences pour démontrer que des microorganismes ne peuvent provenir que d’autres microorganismes. Ses expériences consistaient à préparer des solutions nutritives dans des flacons à col de cygne, sans empêcher le passage de l’air qui n’était ni traité, ni filtré. Il chauffe les bouillons nutritifs et les laisse reposer (fig. 5). Résultat : aucun microbe n’apparaît. Pasteur met ainsi un terme aux débats sur la génération spontanée. La biogenèse devient la théorie acceptée : tout microorganisme vivant ne peut provenir que d’organismes vivant préexistant. Ce chercheur met ainsi en évidence la présence des microorganismes dans l’atmosphère. Il montre que le développement de ces microorganismes dans certains liquides organiques est la cause de leur altération. Cette découverte de germes dans l’air va avoir des conséquences fondamentales en médecine, par l’application de l’asepsie (ensemble des méthodes de destruction des microbes). Ceci a permis d’énormes progrès en chirurgie. Contribution de Pasteur au développement de la microbiologie : • Mémoire sur la fermentation lactique (1857) • Recherches sur la fermentation alcoolique (1858) • Découverte de l’anaérobiose (1861) • Etude sur le vinaigre (1861-64) • Prévention de l’altération des boissons par chauffage (Pasteurisation) • Etude sur la maladie du ver à soie (1865-70) • Participation à la mise au point de la stérilisation par chaleur humide • Travaux sur la maladie du charbon • Recherches sur le choléra des poules et la découverte de l’immunisation des animaux par des cultures microbiennes atténuées (1880) • Vaccination anticharbonneuse (1881) • Vaccination contre la rage (1884)
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Les microorganismes et la fermentation Beaucoup de civilisations anciennes produisaient des boissons et des aliments produits par fermentation microbienne. • Kiu, boisson fermentée chinoise à base de riz, remonte à 2300 ans avant J-C ; • En chine et au Japon, on fabrique depuis des centaines d’années des sauces de soja à base de fèves fermentées ; • Pendant des siècles les populations des Balkans (Bulgarie, Yougoslavie, Albanie..) ont consommé des produits à base de lait fermenté. Les historiens ne connaissent aucune société où on n’a pas utilisé la fermentation pour faire de la nourriture ou de la boisson. Pendant longtemps, l’homme a cherché à améliorer la qualité de ses produits de fermentation sans même se douter qu’une meilleure qualité dépend de l’amélioration des conditions de croissance des microorganismes. Il a fallu attendre les travaux des microbiologistes sur le rôle des microorganismes dans la fermentation. Les microorganismes et les maladies Avant même que les microbiologistes ne prouvent expérimentalement le rôle joué par les microorganismes dans les maladies, beaucoup d’observations ont été faites dans ce domaine : • 1546, on suggérait que les maladies pouvaient être provoquées par des organismes trop petits pour être vu et sont transmis d’une personne à une autre ; • 1762, on prétendait que différents microorganismes provoquaient des maladies différentes ; • 1843, on suggérait que la fièvre puerpérale, infection que contractait la femme après l’accouchement, était contagieuse et causée par des microorganismes transportés d’une patiente à une autre par des sages femmes et les médecins ; • 1870, Robert KOCH a travaillé sur la maladie du charbon (maladie qui touche le bétail, les moutons et parfois l’homme). Il isola du sang des animaux morts le microbe du charbon. C’était la première fois qu’on prouvait qu’une bactérie provoque une maladie animale. Plus tard, KOCH découvrit les bactéries responsables de la tuberculose et du choléra. Prévention et traitement des maladies Après avoir analysé le rôle que joue les microorganismes dans les maladies, les chercheurs se sont penchés à chercher à développer des méthodes pour prévenir et traiter ces maladies. Très rapidement on a découvert, entre 1876 et 1898, les agents responsables de la plupart des maladies bactériennes connues de nos jours. La découverte par Pasteur de la vaccination par des germes atténués, appliquée à grande échelle à la maladie du charbon marque le début de la prévention des maladies infectieuses (immunisation) La découverte des germes dans l’air va avoir des conséquences fondamentales en chirurgie (pratique de l’asepsie). De même la chimiothérapie (traitement des maladies par des produits chimiques) commence à se développer. Les mesures de santé publique rentrent aussi dans ces méthodes de prévention pour contrôler les maladies microbiennes (purification de l’eau, traitement des eaux usées, conservation des aliments,etc.).
4 Développement des techniques de laboratoire et des procédés microbiologiques C’est à l’Allemand ROBERT KOCH et son école qu’on doit la découverte d’une technique fondamentale en microbiologie celle de l’isolement en culture pure d’un microbe (1881). Cette technique consiste en l’utilisation de milieux qui demeurent fermes et transparents aux températures d’incubation (températures auxquelles on place les bactéries à faire pousser). Après leur échec avec la gélatine (protéine ayant l’aspect d’une gelée), car elle fond à 25 °C, ils résolurent le problème en utilisant un extrait d’une algue marine. Cet extrait, appelé AgarAgar ou plus simplement Agar ou gélose, peut être dissout dans une solution nutritive. Une fois solidifié, il peut supporter de grands écarts de température sans se liquéfier. Culture pure : Les milieux gélosés constituent un excellent moyen pour séparer les différentes sortes de microorganismes présents dans un mélange. L’utilisation de ces milieux de culture permet de faire croître les microorganismes à une certaine distance les uns des autres. Chaque cellule microbienne peut ainsi former ce qu’on appel une colonie. Une colonie est une masse compacte de cellules visibles à l’œil nu. Toutes les cellules d’une colonie sont semblables, on suppose qu’elles constituent la descendance d’une seule cellule microbienne. C’est ce qu’on appel en microbiologie une culture pure. Application de la microbiologie à des domaines non médicaux Les travaux de WINOGRADSKY (1856-1953) et BEIJERINCK (1851-1931) ont élargi le champ de la microbiologie en montrant le rôle indispensable des bactéries dans la nature ce qui a permis la création de la microbiologie du sol. WINOGRADSKY a découvert la nature biologique de la nitrification (transformation de l’ammoniaque en nitrates). BEIJERINCK a découvert les bactéries fixatrices d’azote et symbiotiques des légumineuses et leur rôle dans la fertilité des sols. Dans le domaine alimentaire, Pasteur a démontré le rôle des microbes dans la transformation des aliments, création de la branche microbiologie alimentaire et industrielle. HANSEN a même crée une entreprise qui produit des microorganismes nécessaires à la fabrication du vinaigre et les produits laitiers. Plus tard BURRILL découvre qu’une bactérie causait chez les poiriers une maladie dite feu bactérien. Cette découverte a été à l’origine de la pathologie végétale.
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Nature et étendue du monde microbien Place des microorganismes dans le monde vivant A l’époque où l’on a découvert l’existence des microorganismes, les biologistes reconnaissaient deux grandes divisions dans l’univers des êtres vivants, qu’on appelait des règnes. Le règne des plantes et le règne des animaux. On a donc tenté d’intégrer ces organismes microscopiques à ces deux règnes déjà existants. Ceux qui parmi eux ressemblaient le plus à des plantes (organismes photosynthétiques ou immobiles) ont été incorporés au règne végétal et on les appelés les plantes inférieures. Ceux qui ne sont pas photosynthétiques, mais mobiles ont été incorporés au règne animal et on les appelés animaux primitifs. Cette division simpliste des microorganismes montre très tôt ses faiblesses. Par exemple que faire de l’Euglène qui a tout d’un protozoaire, mais possède de la chlorophylle ? Où placer les moisissures qui sont immobiles et non photosynthétiques ? En 1868, le biologiste Haeckel a eu l’idée de créer un troisième règne, celui des protistes. Dans ce règne on regroupe tous les organismes qui ne sont pas des animaux supérieurs ou des plantes supérieures. Donc quand nous parlons de façon générale des protistes, nous entendons les bactéries, les cyanobactéries, les protozoaires, les algues et champignons. Les virus sont mis à part car ce ne sont pas des organismes cellulaires. Si nous analysons de très près la structure cellulaire des protistes nous en arrivons très tôt à la conclusion que ces derniers comprennent deux groupes fondamentalement distincts : • Certains ont une organisation cellulaire très semblable à celle des cellules des plantes supérieures et des animaux supérieurs. La membrane cytoplasmique se prolonge à l’intérieur du cytoplasme d’un réseau membranaire (R.E), lui-même en continuité avec une membrane nucléaire bien définie et entourant parfaitement le contenu du noyau. Noyau complet, mitochondries, appareil de Golgi et chloroplastes dans le cas des cellules photosynthétiques. C’est le cas des algues, protozoaires et champignons microscopiques. On les appelle Eucaryotes et constituent le groupe des protistes supérieurs ; • Les autres microorganismes ont une organisation cellulaire beaucoup plus rudimentaire. La membrane cytoplasmique n’est pas prolongée à l’intérieur de la cellule par un réseau membranaire. Il n’y a pas de noyau vrai et pas de membrane nucléaire. L’appareil génétique est constitué d’un seul chromosome. Pas de mitochondries ni chloroplastes. Cette organisation caractérise les bactéries et les cyanobactéries. Ce sont des procaryotes et on les appelle protistes inférieurs. Classification des microorganismes Quelques définitions : Taxonomie = arrangement ordonné d’unités dans des groupes plus grands. Nomenclature = appellation des unités caractérisées et décrites dans la classification. Identification = établir l’identité des microorganismes inconnus. L’unité taxonomique : L’espèce constitue l’unité de base de la taxonomie. L’espèce telle qu’elle est définie chez les organismes supérieurs (plantes et animaux) repose sur : • L’apparenté (ressemblance) des organismes ; • L’interfécondité (capacité de se croiser). Il est difficile d’appliquer cette définition en microbiologie. Elle ne peut être appliquée chez les bactéries par exemple car la reproduction est asexuée. On a décrit certains phénomènes de sexualité au cours desquels des types ♂ et ♀ se conjuguent (phénomène de conjugaison) pourtant ces événements sont rares, par ailleurs la fusion nucléaire des deux cellules est partielle.
6 La définition de l’espèce a été dès le début de la microbiologie de nature descriptive et est encore d’usage actuel. Elle nécessite une caractérisation et une description précise qui permettent la comparaison entre individus et ainsi les rapprocher ou les éloigner dans la classification. Elle repose sur un ensemble de caractères artificiellement rassemblés : • Caractères morphologiques (caractères des colonies, forme des cellules, dimensions, présence ou absence des flagelles, capsule, etc.) ; • Aspects tinctoriaux (comportement vis à vis de différentes colorations) ; • Types trophiques (aérobies, anaérobies, phototrophes, chimiotrophes, etc.) ; • Métabolisme (glucides, protides, lipides, etc.) ; • Critères immunologiques ; • Critères pathologiques, etc. Nomenclature des microorganismes Avant leur classification, il faut nommer et identifier clairement les microorganismes. On désigne les microorganismes selon les règles du système binomial de nomenclature créée par Linné vers 1750 et encore utilisé de nos jours. On désigne chaque organisme par son nom de genre et aussi par un terme utilisé comme nom d’espèce. Ces deux noms sont en latin. Le nom de genre commence par une majuscule, celui de l’espèce par une minuscule. Le genre et l’espèce forment le nom scientifique du microorganisme. Groupes taxonomiques Un système de classification biologique est basé sur une hiérarchie taxonomique. C’est à dire une suite de groupes qui place l’espèce à une extrémité et le règne de l’autre. Remarques : • La classification des microorganismes est d’un grand intérêt. Quand on nomme et qu’on classe un microorganisme il constitut un moyen de référence. Quand on étudie un microorganisme on le compare avec ceux déjà existant. Il existe des collections de microorganismes classées ; • Les concepts taxonomiques sont en changement (non statiques). Les procédés de classification en microbiologie connaissent régulièrement de modifications. Les anciens arrangements taxonomiques laissent la place à de plus récents fondés sur de nouvelles connaissances (accumulation de nouvelles données sur ces microorganismes). Il y a donc apparition et disparition d’espèces.
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LES BACTERIES Introduction Dans cette partie nous verrons les principales propriétés des bactéries. Cela nous sera utile pour découvrir la grande diversité de types morphologiques et physiologiques des bactéries. Nous ouvrirons ce chapitre avec une description de la morphologie grossière des bactéries, puis nous étudierons leur ultra structure. La connaissance de la morphologie et de l’ultra structure des bactéries a été acquise à deux moments différents : • Observations de LEEUWENHOEK (révélation de l’apparence grossière des microorganismes). L’amélioration de la microscopie optique associée aux techniques de coloration a permis d’avoir plus de précisions sur la forme caractéristique des cellules (dimension, groupement, forme et certaines structures externes) ; • Utilisation de la microscopie électronique (1940). Observation des coupes ultraminces de la cellule bactérienne (ultrastructure). Les techniques de désintégration de la cellule ont permis l’isolement des constituants cellulaires et l’analyse chimique. Ce qui a permis la découverte de la fonction.
Morphologie des bactéries Dimensions : Il est facile de comprendre pourquoi le microscope est nécessaire à l’étude des bactéries puisque les plus grandes d’entre elles atteignent à peine une centaine de µm de longueur. La longueur d’une bactérie coliforme comme Escherichia coli (bâtonnet) peut être de 5 à 10 µm. Une goutte d’eau peut contenir plus d’un milliard de tels organismes. Les staphylocoques et les streptocoques qui sont des bactéries sphériques ont un diamètre variant entre 0,75 et 1,25 µm. Au plus fort grossissement du microscope optique (1000 à 1500X) les plus petites parmi les bactéries (Rickettsies et Chlamidies) sont à peine visibles. Forme : Les cellules bactériennes individuelles sont sphériques, en forme de bâtonnet ou spiralées. Chacune de ces formes est importante pour décrire la morphologie d’une espèce. Les bactéries en forme de petites sphères sont appelées des coques ou cocci. Les formes cylindriques droites sont des bacilles ou bâtonnets. Les formes recourbées en virgule sont des vibrions. Les formes hélicoïdales sont des spirilles. Ces formes sont les plus caractéristiques, mais dans la nature on trouve des intermédiaires de ces formes typiques comme les coccobacilles. Groupement : Parmi les cocci, une autre distinction morphologique s’impose : ces coques selon les espèces, peuvent former des groupements caractéristiques. Ils peuvent se rassembler en paires (diplocoques), en chaînettes (streptocoques), en grappes (staphylocoques), en grappe de 4 (tétrades) ou en groupe de 8 (sarcines) (fig.6). Les bacilles ne forment pas de groupements variés comme les cocci. Certaines espèces cependant ont tendance à se grouper par deux (diplobacilles) ou en courte chaîne (streptobacilles). Ces arrangements sont caractéristiques d’espèces, mais ne représentent qu’une tendance générale. Ils peuvent varier beaucoup selon les circonstances. Ainsi sur un frottis de streptocoques on peut aussi bien observer des amas de deux, quatre ou huit cocci, ainsi que des grappes, aussi bien que la forme en chaîne caractéristique.
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Ultrastructure des cellules bactériennes Structures extérieures à la paroi cellulaire Les flagelles : Chez les protistes inférieurs on rencontre deux types de mouvement : • Déplacement par glissement sur support solide. Le mécanisme de ce mouvement est pour l’instant inconnu ; • Mouvement utilisant des organes locomoteurs spécialisés les flagelles. Les flagelles ou ciles sont extrêmement fins, invisibles au microscope optique sur des cellules vivantes. Leur mise en évidence doit utiliser des techniques de coloration. L’observation au microscope électronique permet de détailler leur forme, leur mode d’insertion et leur dimensions. Ce sont des filaments sinueux généralement plus longs que la bactérie elle même, de l’ordre de 6 à 20 µm. le point d’insertion du flagelle est cytoplasmique. Les expériences au cours desquelles la paroi bactérienne est détruite par une enzyme (lysozyme) aboutissant ainsi à la formation des protoplastes ciliés prouvent en effet que le point d’origine du cil est le protoplasme et non la paroi. On distingue chez les bactéries deux types principaux d’insertion des flagelles : • Insertion polaire : le ou les cils sont insérés à une ou aux deux extrémités de la cellule. La bactérie est monotriche si l’on ne rencontre qu’un seul flagelle à une de ses extrémités. Amphitriche lorsqu’une touffe de flagelles émerge à chaque pôle. Lophotriche lorsqu’une touffe émerge à un pôle. • Insertion péritriche : la bactérie porte de nombreux ciles insérés surtout le pourtour de la cellule. (Fig.7) La connaissance du mode d’insertion peut être utilisé dans un but taxonomique. Par exemple dans la famille des Enterobacteriaceae toutes les bactéries mobiles possèdent un système flagellaire péritriche. Les pili ou Fimbriae : L’existence des pili a été révélée par la microscopie électronique. Ce sont des appendices filiformes différents des flagelles. Ils sont fréquents chez les bacilles Gram négatifs. On en distingue deux catégories de morphologie et de fonction distincts : • Pilis dits communs sont distribués en grand nombre autour de la bactérie (plusieurs centaines). Ils sont fins, courts et rigides. On pense que leur présence est en rapport avec les propriétés antigéniques de la bactérie. • Pilis sexuels sont plus longs. Atteignant 20 µm et se terminent par un renflement. Leur nombre est faible (1 à 4). Ils paraissent jouer un rôle indispensable au cours de la conjugaison bactérienne dans le transfert du chromosome de la cellule dite ♂ à la cellule ♀. La capsule : de nombreuses bactéries synthétisent des substances organiques visqueuses (polymères) qui entourent leur paroi d’une couche plus au moins compacte, sans structure visible au microscope électronique (couche amorphe). Cette couche est dite capsule. La nature des constituants capsulaires est fréquemment polysaccharidique quelquefois polypeptidique. La capsule ne joue pas un rôle vital pour la bactérie. Une cellule dépourvue de sa capsule peut croître et se multiplier. Les substances capsulaires, bien qu’elles ne soient pas indispensables à la bactérie, constituent un réservoir de nourriture. Elles sont le support des propriétés physiopathologiques et immunologiques (exemple : les pneumocoques capsulés sont pathogènes. Injectés à la souris, ils provoquent sa mort après 24 heures. Les mêmes cellules acapsulées perdent en même temps leur agressivité). Les capsules empêchent les défenses de l’organisme hôte de se manifester, en protégeant les bactéries de la phagocytose. Les substances capsulaires sont aussi le support de l’antigénicité. Injectées à un animal, elles
9 l’obligent à synthétiser des anticorps protecteurs. D’un point de vue général, la capsule protège la bactérie dans l’environnement contre de nombreux prédateurs (cas des protozoaires), contre les bactériophages (virus qui attaquent les bactéries). Enfin elle protège les bactéries contre les agents physiques et chimiques comme la dessiccation. Les capsules peuvent nuire à certaines industries (exemple : papeterie, par accumulation dans l’outillage comme les filtres). La paroi cellulaire : La paroi se trouve au-dessus de la membrane cytoplasmique et audessous de la capsule. Mis à part les mycoplasmes (groupe bactérien) toutes les bactéries possèdent une paroi cellulaire. C’est une structure rigide qui donne à la cellule sa forme. Si on enlève la paroi, on obtient des cellules sphériques des protoplastes. La paroi intervient également dans l’équilibre de la pression interne des bactéries, de l’ordre de 5 à 20 atmosphères grâce à la présence d’un complexe dit peptidoglycane ou muréine ou mucopeptide. L’épaisseur de la paroi varie de 10 à 35 nm chez la plupart des bactéries. La composition chimique de la paroi est très importante pour différencier les bactéries des autres protistes et aussi pour différencier les groupes des bactéries. La paroi est le site de fixation des bactériophages. Elle renferme de nombreux antigènes qui correspondent aux endotoxines de certaines bactéries. De nombreux enzymes peuvent détruire la paroi tel que le lysozyme des larmes. Beaucoup d’antibiotiques inhibent sa synthèse. C’est le cas des penicillines. Certaines bactéries sont caractérisées par la présence au niveau de leur paroi d’acides gras à très longues chaînes (> à C36), les cires. C’est le cas des mycobactéries (Mycobacterium tuberculosis). Ces acides gras sont responsables des caractères de coloration dits acidoalcoolo résistance ou Ziehl-neelsen positif. Structures à l’intérieur de la paroi cellulaire Membrane cytoplasmique : son existence chez les bactéries peut être déduite de plusieurs observations : • La plus ancienne, phénomène de plasmolyse au cours duquel le cytoplasme d’une bactérie placée dans un milieu hypertonique se rétracte, ne peut s’expliquer que par l’existence d’une membrane ; • En microscopie électronique, elle est individualisée morphologiquement sur des coupes ultrafines ; • Mieux encore, des membranes peuvent être isolées par centrifugation différentielle à partir de protoplastes lysés en milieu isotonique. Comme chez les eucaryotes, la membrane cytoplasmique chez les bactéries a une épaisseur de 7,5 nm environ. Chez les bactéries, la membrane contient plus de 50% de protéines : • Des perméases responsables du transport des nutriments organiques et minéraux ; • Des enzymes participant à la synthèse de l’ATP (enzymes de la chaîne respiratoire). Chez les eucaryotes ces enzymes se situent dans les mitochondries. La membrane intervient aussi dans la sécrétion des protéines, à l’image du réticulum endoplasmique des cellules eucaryotes. Une fraction importante des ribosomes cellulaires adhèrent à sa surface. Le mésosome : structure formée par l’invagination de la membrane cytoplasmique. Ils ont une forme vésiculaire, tubulaire ou lamellaire. Le mésosome est en étroite liaison avec le matériel nucléaire. On pense qu’il joue un rôle dans sa division et la naissance du septum séparant les deux cellules filles. On pense également que le mésosome joue un rôle dans la synthèse de la paroi. Des observations récentes ont montré que ces structures peuvent être des artéfacts de préparation.
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Cytoplasme et structures intra-cytoplasmiques : Le matériel cellulaire à l’intérieur de la membrane peut être divisé en : • Une région cytoplasmique d’apparence granulaire et riche en ARN ; il s’agit des ribosomes, sites de biosynthèse des protéines ; • Une région liquide renfermant des granulations et substances de réserve. Différentes substances chimiques peuvent s’accumuler dans le cytoplasme pour former des granules appelés inclusions. Ces substances sont variables suivant les genres de bactéries. C’est généralement du glycogène, de l’amidon, des lipides parfois chez certaines bactéries du soufre, du fer ou des phosphates, etc. • Chromatophores : chez les bactéries photosynthétiques, les ‘’organelles’’ spécialisés au niveau desquels s’effectue la photosynthèse sont appelés chromatophores. Leur structure est différente de celle des chloroplastes et leurs pigments photosynthétiques sont appelés bactériochlorophylles (leur composition est différente de celle des pigments chlorophylliens). • Vacuoles à gaz. Rencontrées chez les cyanobactéries et les bactéries photosynthétiques. Elles leur servent de flotteurs à la surface de l’eau ; • Matériel ‘’nucléaire’’. Rappelons que, contrairement aux cellules eucaryotes, la cellule bactérienne ne possède ni chromosomes denses, ni appareil mitotique pour la division cellulaire, ni nucléole, ni membrane nucléaire. Dans la bactérie, la région nucléaire, riche en ADN occupe une position près du centre et le matériel nucléaire est au contact avec le système mésosome-membrane cellulaire. Le matériel génétique de la bactérie est constitué d’un chromosome unique formé d’une boucle d’ADN en suspension dans le cytoplasme. Dans le cas d’Escherichia coli, la longueur a été évaluée à un millimètre (environ 500 à 1000 fois plus que la longueur de la cellule). Les plasmides : en plus du chromosome, on trouve souvent chez les bactéries des éléments génétiques extrachromosomiques : les plasmides. Ils sont capables de réplication autonome dans le cytoplasme bactérien (indépendamment du chromosome). Les plasmides sont des brins circulaires d’ADN bicaténaire, contenant des gènes supplémentaires (exemple : facteurs de résistance aux antibiotiques) Conjugaison chez les bactéries : La conjugaison chez les bactéries est une sorte de mécanisme sexuel primitif découvert en 1946 par Ledberg et Tatum chez Escherichia coli. Elle consiste en un transfert unidirectionnel de matériel génétique d’une cellule (donneuse) à une autre (receveuse). Le donneur peut être considéré comme le ♂ et le receveur la ♀, si on les compare avec les organismes supérieurs. Le donneur possède un morceau d’ADN particulier qu’on appelle facteur F (fertilité) ; on dit qu’il est génétiquement F+. Les cellules dépourvues de ce facteur sont dites F-. Lors de la conjugaison, il y a formation d’un pont cytoplasmique entre les deux cellules. Dans la majorité des cas, seul le facteur F est transféré à la cellule, celle-ci devenant automatiquement F+. Plus rarement, une partie du chromosome ♂ est transférée. Quelque fois, le facteur F est incorporé au chromosome de la cellule ♂. Dans ce cas, le transfert du matériel chromosomique ♂ à la cellule ♀ est beaucoup plus fréquent. Comme la durée du pont cytoplasmique est variable, la quantité du matériel ainsi injecté à la cellule ♀ est aussi variable. Elle peut aller d’un ou deux gènes au chromosome entier. Les cellules ayant ainsi un facteur F accroché à leur chromosome sont dites Hfr (Haute fréquence de recombinaison). Dans tous les cas, le facteur F est toujours le dernier à passer, s’il passe. Ainsi dans les
11 combinaisons Hfr x F-, la bactérie ♀ reçoit souvent de nombreux gènes mais elle devient rarement F+. On a découvert que le facteur F des cellules Hfr s’insérait toujours au même endroit sur le chromosome. De même l’emplacement de la coupure dans le chromosome est toujours le même. Le chromosome commence donc à pénétrer dans la cellule ♀ toujours par la même extrémité et les différents gènes dont il est porteur entrent toujours dans le même ordre. On a utilisé avec succès cette particularité du transfert chromosomique à des fins de cartographie chromosomique. Si par des ultrasons ou toute autre agent physique on interrompe la conjugaison à des temps croissants, on devrait s’attendre à ce que des recombinants nouveaux apparaissent dans le même ordre chez les cellules ♀ que l’ordre des gènes sur le chromosome ♂. C’est ainsi qu’on a déterminé l’ordre des gènes sur le chromosome d’Escherichia coli. Les spores Certaines espèces bactériennes sont capables de produire des spores, soit à l’extérieur de la cellule végétative (exospores), soit à l’intérieur de la cellule végétative (endospore). Ce sont des corps en sommeil métabolique produits à un stade avancé de la croissance. Exospores : plusieurs espèces bactériennes les produisent. Streptomyces par exemple fait une chaîne de spores (conidies) portées à l’extrémité d’un filament végétatif (hyphe). Endospores : processus présent seulement chez les bactéries. C’est une cellule à paroi épaisse, fortement réfringente et très résistante. Les endospores sont produites par les espèces du genre Bacillus, Clostridium et Sporosarcina. Ces bactéries peuvent croître et se multiplier pendant de nombreuses générations comme toute cellule végétative normale. Cependant à un moment donné de la croissance d’une bactérie sporulente a lieu à l’intérieur du cytoplasme végétatif la synthèse d’un nouveau protoplasme destiné à devenir une spore. (fig. 8) Propriétés des spores : Les spores peuvent résister à certains agents physiques et chimiques. Cas de la thermorésistance : les spores peuvent survivre après chauffage de 70 à 80° C durant 10 mn. Certaines résistent 8 H à 100° C. ce qui crée des problèmes au cours des opérations de stérilisation dans les hôpitaux et les industries alimentaires. Résistance aux U.V et rayons X supérieure à celle des cellules végétatives. Résistance aux désinfectants et antibiotiques supérieure à celle des formes végétatives. Résistance à la dessiccation. Cette résistance est attribuée à la tunique sporale et au cortex. La situation des endospores dans les cellules ainsi que leur grosseur ne sont pas les mêmes pour toutes les espèces. Certaines sont centrales : formées au milieu de la cellule. D’autres sont terminales : formées à l’extrémité de la cellule et d’autres sont subterminales : formées près de l’extrémité de la cellule. Le diamètre de la spore peut être plus grand ou plus petit que celui de la cellule végétative (spores déformantes et non déformantes). Les spores peuvent avoir des formes différentes : sphériques, elliptiques ou ovoïdes. La présence d’une endospore, sa situation dans la cellule et sa grosseur et sa forme sont utiles pour identifier et caractériser les bactéries. Mécanismes de la sporulation : • Arrêt total de la synthèse d’ADN et d’ARN. Invagination de la membrane cellulaire pour former une structure appelée préspore ; • Formation d’une série de couches qui vont recouvrir la préspore. Le cortex sporal suivi d’une tunique sporale multicouche imperméable qui est responsable de la grande résistance de la spore aux agents chimiques ; • Libération de la spore après lyse de la cellule-mère. La spore présente une structure complexe. Elle comprend des zones claires qui correspondent au matériel génétique et des régions sombres qui localisent les ARN et les substances de réserves.
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Germination de la spore : Lorsque la spore est placée dans des conditions favorables de croissance, elle subit une série de transformations progressives et devient finalement une nouvelle cellule végétative. • Activation de la spore par un agent capable de léser la tunique sporale (choc mécanique, acidité, chaleur, etc.) ; • En présence des conditions favorables d’hydratation et de métabolites effecteurs, les constituants de la spore sont progressivement dégradés par des enzymes ; • L’altération du cortex et des tuniques externes fait apparaître une nouvelle cellule végétative comprenant le protoplaste sporale entouré de sa paroi ; • Phase active de biosynthèse. La synthèse des protéines augmente progressivement. La paroi sporale devient la paroi cellulaire, la synthèse d’ADN reprend. La cellule double son volume et se libère de la tunique sporale.
Culture et croissance des bactéries Introduction : Pour étudier les bactéries, il faut être capable de les faire croître en culture pure. Pour cela, il faut connaître les types de nutriments dont elles ont besoin, ainsi que les différentes conditions physiques qui permettent une croissance optimale. Il n’existe pas un ensemble uniques de conditions pour cultiver toutes les espèces bactériennes. Elles sont hétérogènes quant à leur besoins nutritifs et physiques. Certaines bactéries ont des besoins nutritifs simples, d’autres en ont de très complexes. Il faut donc adapter les conditions de culture selon les besoins de chaque groupe de bactéries. Besoins énergétiques et élémentaires : Les bactéries se multiplient à partir des aliments présents dans les milieux de culture. Elles ont toutes un certain nombre de besoins communs : • Eau • Source d’énergie • Source de carbone • Source d’azote • Eléments minéraux Source d’énergie : En se référant à la source d’énergie, on peut reconnaître deux grandes classes de bactéries : • Les phototrophes : capables d’utiliser l’énergie lumineuse pour leurs activités anaboliques ; • Les chimiotrophes : obtiennent leur énergie de l’oxydation de composés chimiques. La photosynthèse est le mode de vie caractéristique des végétaux, des cyanobactéries et de quelques espèces bactériennes. Dans chaque cas, grâce à l’énergie lumineuse, le processus conduit à la synthèse d’ATP. La photosynthèse bactérienne peut donc faire appel à des composés minéraux ou organiques comme source d’électrons. On parle de bactéries :
13 photolithotrophes quand le donneur d’électrons est minéral : Bactéries capables de se développer dans un milieu purement minéral (bactéries sulfureuses pourpres et bactéries sulfureuses vertes) ; • photoorganotrophes qui nécessitent les composés organiques comme source d’électrons (bactéries pourpres sulfureuses). De la même façon, pour classer les bactéries chimiotrophes, elles puisent leur énergie des composés minéraux ou organiques. • Chimiolithotrophes si le donneur d’électrons est minéral ; • Chimioorganotrophes si le donneur d’électrons est organique. La grande majorité des bactéries rentre dans cette dernière catégorie : bactéries pathogènes, bactéries des contaminations alimentaires et les bactéries utilisées dans l’industrie pour la synthèse d’antibiotiques, de vitamines, d’acides aminés, etc. •
Eléments indispensables à la croissance : Source de carbone Tous les organismes vivants ont besoin de carbone. Certaines bactéries sont capables de se développer en milieu inorganique contenant le CO2 comme seule source de carbone. Ce sont les bactéries autotrophes. C’est le cas des bactéries phototrophes et la plupart des chimiotrophes. Les autres exigent au contraire des composés organiques pour se reproduire et sont nommés hétérotrophes. Source d’azote Les bactéries ont besoin de substances azotées pour synthétiser leur protéines. Quelques bactéries seulement sont capables de fixer l’azote moléculaire (cas des Rhizobium). D’autres composés inorganiques peuvent être utilisés : les nitrates, les nitrites, l’ammoniac, etc. La source d’azote peut enfin être organique. Soufre et phosphore Ils tiennent une place de choix parmi les constituants minéraux de la cellule bactérienne. Le soufre est présent dans certains acides aminés et donc dans les protéines. Le phosphore fait principalement partie des acides nucléiques, de l’ATP et de nombreux coenzymes. Autres éléments Sodium, potassium, magnésium et chlore jouent un rôle dans l’équilibre physicochimique de la cellule. D’autres beaucoup plus nombreux sont partie constituante d’enzymes ou de coenzymes tel que le fer des cytochromes. Le calcium, le magnésium, etc. jouent un rôle d’activateurs d’enzymes. Facteurs de croissance : Les facteurs de croissance regroupent trois catégories de substances : • Les acides aminés synthèse des protéines • Les bases puriques et pyrimidiques synthèse des acides nucléiques • Les vitamines coenzymes ou précurseurs de coenzymes (exemple : Nicotinamide NAD, transporteur d’électrons) On classe les bactéries en deux catégories : • Les prototrophes : ne nécessitent pas un apport de facteurs de croissance dans le milieu de culture. Les éléments habituels déjà cités leur suffisent ; • Les auxotrophes : exigent un ou plusieurs facteurs de croissance dans le milieu. Exemple : dans un milieu contenant une source de carbone comme le glucose, une source d’azote et des sels minéraux, Escherichia coli se développe normalement. Proteus vulgaris, de la même famille qu’E. coli en est totalement incapable à moins que l’on ajoute à ce milieu une faible quantité de Nicotinamide (vitamine). Cette substance, indispensable aussi bien à E.
14 coli qu’à P. vulgaris, est synthétisée chez E. coli et non chez P. vulgaris. Une expérience rapide peut le confirmer : un extrait d’E. coli peut remplacer la nicotinamide au cours d la croissance de Proteus.
Conditions physiques nécessaires à la croissance bactérienne En plus de donner aux bactéries les nutriments dont elles ont besoins, il faut aussi leur apporter les conditions physiques qui vont permettre le maximum de croissance. Les bactéries réagissent différemment aux conditions physiques de leur environnement. Pour réussir à faire croître une bactérie, il faut une combinaison de nutriments appropriés et un environnement physique convenable. Influence de la température : (fig. 9) Les mécanismes de croissance dépendent des réactions chimiques qui ont lieu dans la cellule. Les vitesses de réactions sont influencées par la température. Cette dernière va donc avoir une profonde influence sur le développement des bactéries. Chaque espèce bactérienne croît à des températures situées dans un intervalle déterminé. On distingue trois catégories de bactéries : • Bactéries psychrophiles (cryophiles) : isolées en grand nombre du sol, eau douce, salée, air, aliments, etc. Elles poussent de façon abondante à 0 °C avec un minimum à –10 °C, un optimum entre 15 et 20 °C et un maximum généralement vers 30 °C. Le froid ne tue pas les bactéries. C’est un excellent agent de conservation ; • Bactéries mésophiles : beaucoup de saprophytes et toutes les bactéries pathogènes pour l’homme et les animaux à sang chaud. La température optimale se situe à 18/25 °C pour les saprophytes et 25/37 °C pour les pathogènes. La température minimale voisine 10 °C et la température maximale 45 °C ; • Bactéries thermophiles : se développent à des températures élevées ; Variables suivant les espèces de 50 à 55 °C. C’est le cas des bactéries des sources thermales. La température minimale varie largement (25 à 45 °C). la température maximale atteint 60 à 70 °C, parfois même jusqu’à 90 °C. Influence des gaz atmosphériques : (fig. 10) L’oxygène et le CO2 sont les principaux gaz qui affectent la multiplication des bactéries. Celle-ci réagissent différemment en présence d’oxygène moléculaire. On peut diviser les bactéries de la façon suivante : • Aérobies strictes : ne croissent qu’en présence d’oxygène ; • Anaérobies strictes : ne peuvent pas se multiplier en présence d’oxygène ; • Aérobies/anaérobies facultatives : peuvent croître en présence ou en absence d’oxygène ; • Microaérophiles : se développent mieux en présence d’une faible quantité d’oxygène. Influence du pH : Les bactéries se multiplient en milieu neutre (pH : 7) ou légèrement alcalin. Contrairement aux moisissures qui supportent des pH acides (pH : 3 à 6). Pour chaque bactérie existe des limites de pH acides et alcalins au-delà desquelles elles ne peuvent se développer et un pH optimum convenant le mieux à leur multiplication. La plupart des bactéries pathogènes ne supportent pas des limites de pH > à 7,5 et < à 6,2. Le pH optimum est généralement compris entre pH : 6,8 et pH : 7,2. Les bactéries saprophytes peuvent se développer entre pH 5 et pH 8,5. Certaines bactéries ont une préférence marquée pour les milieux fortement acides
15 (acidophiles) ou basiques (basophiles). Par exemple : les Vibrio se reproduisent au pH optimal de 9 ce qui permet leur isolement sélectif. Thiobacillus thiooxydans a un optimum à pH2. Autres conditions : La température, le CO2, l’oxygène et le pH constituent les principaux facteurs qui déterminent les conditions optimales de croissance de la majorité des espèces bactériennes. Mais certains groupes de bactéries ont des besoins additionnels. Par exemple les bactéries photosynthétiques ont besoin de la lumière. La croissance peut aussi dépendre de la pression osmotique ; celle-ci est directement proportionnelle à la concentration totale des ions et des molécules en solution dans le milieu. • Des bactéries marines adaptées à un milieu contenant 35 g de sel/l doivent être cultivées dans des milieux avec au moins 10‰ de sel et sont dites halophiles ; • Les bactéries des saumures sont également adaptées à des concentrations élevées de sel. C’est le cas de certains vibrions tel que V. costiculus ; • Les bactéries cultivant sur les milieux hypersucrés comme les confitures sont dites osmophiles.
Cultures des bactéries Pour étudier une bactérie, il est nécessaire de cultiver celle-ci sur des milieux de culture. Les milieux de culture contiennent les substances nutritives indispensables à la croissance. Ils sont disposés dans des récipients stérilisés au préalable. Les milieux sont liquides ou solides. Les bactéries troublent uniformément le milieu liquide au cours du développement. Dans un milieu solide, elles s’accumulent en masse : colonies dont les dimensions, les contours, la structure, etc. constituent un ensemble de caractères précieux pour l’identification. Milieux de culture Le choix d’un milieu de culture est fonction du but que l’on veut atteindre (étude d’une cinétique de croissance, recherche d’une substance chimique, etc.) et des besoins de la bactérie recherchée. Milieux synthétiques et milieux empiriques : Les bactéries autotrophes ont des besoins simples. Elles possèdent un équipement enzymatique qui leur permet de synthétiser tous leur métabolites à partir de substances élémentaires. Les bactéries hétérotrophes exigent, pour leur croissance, les substances qu’ils ne peuvent pas synthétiser. Les milieux pour les hétérotrophes vont du simple au très complexe. Dans la plupart des cas on utilise des milieux dits empiriques, parce qu’on ne connaît pas leur composition chimique avec précision. Le plus simple et le plus utilisé est le bouillon nutritif qui est à base de viande de bœuf. Milieux d’isolement : Les milieux d’isolement sont des milieux solides de composition simple sur lesquels de nombreuses espèces bactériennes peuvent se développer. Milieux sélectifs : Quand un milieu de culture est ensemencé avec un grand nombre d’espèces bactériennes, il est possible de favoriser artificiellement la croissance de l’une d’entre elles (lorsqu’on connaît ses exigences nutritionnelles) ou en ajoutant au milieu un inhibiteur chimique qui bloque la croissance de la plupart des bactéries excepté celle de l’espèce recherchée : phénomène de sélection. Exemple : en cherchant des Staphylocoques dans un produit soumis à l’analyse, on inhibe les espèces saprophytes dans ces milieux en utilisant Nacl 75g/l qui sélectionne uniquement les bactéries recherchées.
16 Milieux d’identification : Les milieux d’identification comme leur nom l’indique permettent l’identification des bactéries. Ils servent à mettre en évidence une ou plusieurs propriétés chez une bactérie déjà isolée. Par exemple la fermentation d’un sucre, production de gaz comme l’hydrogène sulfuré, présence d’enzymes, etc. Culture pure des bactéries Les techniques d’étude des bactéries exigent toujours l’obtention de cultures pures. Les produits soumis à l’analyse, comme les substances alimentaires, des échantillons de sol ou des prélèvements d’air ou d’eau, contiennent la plupart du temps une grande variété de microorganismes. Pour identifier et étudier toutes ces différentes espèces, il faut obligatoirement les isoler les unes des autres et cultiver chacune d’elles séparément. Elles donnent alors naissance à des populations homogènes, des cultures pures. Méthode d’incorporation au milieu solide : La technique d’isolement consiste à incorporer la suspension de bactéries ou la substance à étudier ou une de leur dilution à un milieu gélosé préalablement refroidi à 45 °C. Après homogénéisation, les milieux sont coulés en boîte de Pétri, solidifiés, puis incubés à la température favorable. On obtient sur l’une ou plusieurs boites des colonies parfaitement isolées. Méthode des stries ou ensemencement par épuisement : (fig.11) A l’aide d’un fil de platine bouclé stérile, on dépose une petite quantité d’un produit renferment les bactéries à la périphérie de la surface d’un milieu solide. On fait en suite parcourir le fil sur le milieu, en effectuant des stries parallèles et serrées sur la première moitié de la boîte puis sur la deuxième moitié en partant du coté opposé. Finalement en faisant des stries perpendiculaires aux stries de la deuxième moitié. Les colonies très nombreuses au départ sont confluentes puis sont de moins en moins serrées pour être finalement isolées les unes des autres. Toutes ces techniques sont valables pour les bactéries aérobies, qui se multiplient au contact de l’air, pour les anaérobies il est nécessaire d’éliminer l’oxygène libre du milieu. On utilise pour cela la culture en profondeur en milieu solide ou la technique des jarres où la boîte de Pétri est mise en anaérobiose. Elle a l’avantage d’assurer la croissance et l’isolement des anaérobies à la surface des milieux solides. Conservation des cultures pures Après avoir isolé un microorganisme en culture pure, il peut être nécessaire de conserver cette culture vivante pendant un temps plus au moins long. Il existe plusieurs façons de conserver les cultures pures de microorganismes. Pour une conservation à court terme, pendant quelques mois, on peut entreposer les cultures à des températures froides (0 à 10 °C). Pour la conservation à long terme, on les place dans l’azote liquide à –196 °C ou encore déshydrater les cultures dans des tubes en même temps qu’elles sont gelées et scellées sous vide : technique de lyophilisation.
Croissance des bactéries La croissance est l’accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme. Chez les organismes pluricellulaires elle aboutit à une augmentation de taille ou de masse. Chez les microorganismes unicellulaires, elle conduit à une augmentation du nombre d’individus c’est donc l’équivalent d’une multiplication. Le milieu liquide constitue le milieu favorable à l’étude de la croissance bactérienne. Il y a une bonne dispersion des cellules ; d’autre part on peut suivre la croissance dans le temps par prise d’échantillons à des intervalles de temps.
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Méthodes de mesure de la croissance bactérienne : Les techniques de mesure de la croissance sont basées sur l’évaluation du nombre de bactéries ou de leur masse par unité de volume ou de poids du milieu. La plupart des méthodes permettent une estimation directe du nombre ou de la masse microbienne. On peut dans certains cas utiliser des méthodes indirectes en mesurant un paramètre lié à l’activité métabolique : consommation d’un substrat, une molécule excrétée dans le milieu, une variation physico-chimique, etc. Mesure du nombre : Lecture au microscope (numération totale) (fig. 12) : technique couramment utilisée. On se sert d’un hématimètre. Il s’agit d’une lame porte-objet dont l’une des faces est creusée d’une cavité de profondeur connue et dont le fond porte des quadrillages de surface également connue. La suspension bactérienne est placée dans la cuvette puis recouverte d’une lamelle. Des volumes précis sont ainsi délimités au niveau des quadrillages dans lesquels les cellules sont comptées au microscope. Dénombrement après culture (numération viable) (fig.13) : le dénombrement des bactéries viables est une méthode communément utilisée. Un volume fixe de la culture mère ou des dilutions est étalé à la surface d’un milieu gélosé ou incorporé au milieu avant sa solidification. Après incubation à une température convenable, le nombre de colonies apparues correspond au nombre de cellules microbiennes présentes dans le volume analysé de la suspension. Pour donner à la méthode le maximum de précision, la suspension doit être rendue homogène par agitation mécanique. Mesure de la masse : Détermination du poids sec : les microorganismes sont récoltés par centrifugation ou par filtration sur membrane. Après lavage, le culot ou le filtre est desséché à 100-110 °C jusqu’à poids constant que l’on exprime généralement en gramme de matière sèche/ litre. Mesure du trouble : c’est le procédé le plus utilisé pour évaluer la masse microbienne. Il s’agit d’une méthode optique générale, basée sur la propriété que présente toute solution d’absorber une partie de l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse en ligne droite. Des appareils spéciaux, spectrophotomètre et nephélomètre donnent directement la valeur de cette absorbance à une longueur d’onde de 650 nm. Constantes et expression mathématique de la croissance La croissance d’une bactérie placée dans des conditions idéales de culture peut être définie par deux constantes : le temps de génération et le taux de croissance. Temps de génération : C’est l’intervalle de temps entre deux divisions successives ou celui nécessaire au doublement de la population. Si nous partons d’une cellule bactérienne unique, son accroissement se fait selon une progression géométrique : 1 2 4 8, etc. Le temps de génération est donc le temps nécessaire à une bactérie de produire deux bactéries ou à 8 bactéries de donner 16 bactéries, etc. Dans une population microbienne, toutes les cellules ne se divisent pas au même rythme. La croissance ne s’effectue pas par paliers mais au contraire d’une façon continue. Malgré cela, le temps nécessaire au doublement de la population est constant et identique à celui exigé pour le doublement d’une seule cellule. Le temps de génération est donné par la formule : G = t/n. Taux de croissance : On le définie comme étant le nombre de divisions par unité de temps : µ = 1/G = n/t.
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Expression mathématique de la croissance : Si on considère une population bactérienne de concentration initiale X0, elle augmente à chaque génération de la façon suivante : • Après la 1ère génération : X1 = 2 X0 • Après la 2ème génération : X2 = 2 X1 = 2x2 X0 = 22 X0 • Après n génération : Xn = 2n X0 Cette équation peut être exprimée en fonction du taux de croissance (µ = n/t d’où n = µt) Xn = 2µt X0 La forme logarithmique de cette équation devient : log2 Xn = µt log22 + log2X0 µt = log2 Xn/X0 La représentation graphique de la croissance s’effectue en coordonnées semilogarithmique. Le nombre ou la masse bactérienne étant traduit en nombre logarithmique sur l’ordonnée, le temps en nombre arithmétique sur l’abscisse. Cette représentation a un double avantage : • Permet d’établir une courbe de croissance pour de très fortes populations bactériennes ; • La pente de la courbe exprime le taux de croissance.
Courbe de croissance Nombre de cellules
3
2
4
1 temps
La phase de latence : le taux de croissance est nul (µ = 0) ; La phase exponentielle : le taux de croissance est constant et maximal ; La phase stationnaire : au cours de laquelle µ = 0 La phase de déclin : le taux de croissance diminue (µ< 0) Phase de latence : après ensemencement d’un milieu de culture convenable avec une petite quantité de culture microbienne, on n’observe pas de développement immédiat. Il faut
19 attendre quelques heures pour constater un trouble visible. Cette période s’appelle phase de latence. La phase de latence peut avoir plusieurs significations : • L’âge des bactéries inoculées est le premier des facteurs qui conditionne cette phase. Lorsque l’inoculum est constitué de cellules jeunes, la phase de latence peut être très courte. Elle est au contraire prolongée avec des bactéries provenant de culture en phase stationnaire ou de déclin. ; • L’adaptation des bactéries au milieu constitue le 2ème facteur essentiel. Un inoculum prélevé en phase exponentielle et introduit dans un milieu neuf de composition chimique identique se multiplie instantanément sans aucune phase de latence. Si le milieu n’est pas identique, les bactéries sont obligées de synthétiser de nouvelles enzymes leur permettant la dégradation du nouveau substrat. Phase exponentielle : fait suite à la phase de latence. Les bactéries se multiplient avec un taux de croissance maximal et constant. Cette phase se traduit par une droite. La pente de celle-ci est déterminée par le taux de croissance lui-même sous la dépendance des conditions d’environnement comme la température, le pH, nature et concentration des aliments. Phase maximale stationnaire : la phase exponentielle est brève. Le milieu devient de moins en moins favorable à la croissance. Le nombre de cellules viables reste constant et correspond à un équilibre entre le nombre de cellules provenant de la multiplication et le nombre de cellules qui disparaissent par autolyse. Phase de déclin : au cours de cette phase, les bactéries ne se divisent plus ou très peu. Beaucoup d’entre elles meurent et sont lysées par les enzymes libérés. Le taux de mortalité peut être constant comme le taux de croissance. Dans ce cas il est représenté par une droite. Le nombre de cellules détruites est proportionnel au temps.
Les grands groupes des bactéries Les myxobactéries (fig.14) Toujours unicellulaires et se présentent sous forme de bâtonnets leur dimension varie de (0,6 - 0,9) x (3 – 8) µm.. elles sont Gram négatif. Leur caractère le plus remarquable est leur aptitude à former des corps fructifiants dans les conditions défavorables. Ce sont des agrégats cellulaires provenant de la migration de cellules végétatives et qui forment des structures plus ou moins élaborées et diversifiées. Leur structure et leur pigmentation constituent des caractères utiles pour la classification. Les cellules que contiennent ces corps fructifiants sont plus résistants aux agents physico-chimiques (température, dessiccation, irradiation, ultrasons, etc.) que les formes végétatives dont elles proviennent et sont pour cette raison appelées myxospores. Les myxobactéries ne présentent pas d’organes de locomotion. Ils se déplacent par glissement (gliding). Les myxobactéries ont une paroi mince et flexible ce qui permet aux cellules de se courber en arc. Elles sont non photosynthétiques. Physiologie et écologie : les myxobactéries sont aérobies stricts, mésophiles, chimioorganotrophes. Elles sont habituellement rencontrées dans le sol neutre ou légèrement acide, sur les végétaux en décomposition, sur les écorces d’arbres. Elles peuvent décomposer activement des macromolécules : protéines, amidon, cellulose, glycosaminopeptide des parois bactériennes. La plupart des espèces peuvent tuer et lyser les bactéries, les levures, les champignons et algues. Elles secrètent de puissants enzymes extracellulaires qui leur permettent de digérer les constituants cellulaires de ces organismes. Les spirochètes (fig. 15) Bactéries caractérisées avant tout par leur structure hélicoïdale, leur paroi mince et flexible et leur filament axiale organe locomoteur interne qui leur confère une grande mobilité
20 (déplacement par mouvement ondulatoire en tire bouchon). Ce filament est composé de très nombreuses fibrilles qui ont leur point d’insertion aux deux pôles de la cellule et qui viennent se rejoindre en son centre. Beaucoup de spirochètes sont Gram négatif, la longueur varie de 3 à 500 µm. la reproduction se fait par fission binaire transversale. Physiologie et écologie : Organismes hétérotrophes. La plupart sont anaérobies. En tant que forme libre, les spirochètes sont saprophytes communs de l’eau et des boues. La plupart vivent en anaérobiose dans les zones profonde des milieux aquatiques où il n’y a pas d’oxygène. Les autres sont des parasites qui peuvent être pathogènes. C’est le cas des tréponèmes. Exemple : Treponema pallidum, agent responsable de la syphilis. Parasite obligatoire qui ne croit que dans des tissus vivants. C’est un parasite exclusif de l’homme. La transmission de la maladie est directe et vénérienne. Les eubactéries : (fig.16) Groupe diversifié. Renferme plusieurs sous-groupes : Eubactéries photosynthétiques : Elles sont isolées pour la première fois des eaux thermales sulfureuses (eau chaude riche en soufre). Elles se présentent sous des aspects morphologiques divers. Leur multiplication se fait par fission binaire. Les eubactéries photosynthétiques ont des pigments chlorophylliens chimiquement distincts de la chlorophylle a des végétaux. Ce sont des bactério-chlorophylles. Il y en a au moins quatre : • Bactériochlorophylle a ; • Bactériochlorophylle b ; • Bactériochlorophylle c ou 660 ; • Bactériochlorophylle d ou 650. Le pouvoir photosynthétique des eubactéries photosynthétiques est particulier. Il est différent de celui des végétaux. Elles sont incapables de produire de l’oxygène au cours de l’assimilation du CO2. Elles n’utilisent pas l’eau comme donneur d’électrons. Elles exigent un donneur d’électrons qui peut être soit une substance minérale ou organique (H2, H2S, acide lactique ou succinique). Chez les végétaux : CO2 + 2 H2O Chez les bactéries : CO2 + 2 DH2
CH2O+ O2 + H2O CH2O + 2D + H2O
Les bactéries photosynthétiques se rencontrent dans les eaux douces ou marines où elles voisinent généralement avec des algues qui se développent en aérobiose dans les couches superficielles. Recevant des rayonnements pénétrants distincts de ceux des algues, elles peuvent se multiplier dans les zones les plus profondes des milieux aquatiques, en anaérobiose, sans que leur croissance soit apparemment inhibée par la végétation des algues. Les eubactéries au sens strict : Sont les plus nombreuses et les plus importantes dans tous les domaines de la microbiologie. Leurs propriétés physiologiques et biochimiques sont variées. Beaucoup d’entre elles se rencontrent dans les milieux extérieurs où elles participent aux transformations cycliques de la matière : cycle du carbone, d’oxygène, d’azote, du soufre et du phosphore. Quelques unes sont responsables de maladies infectieuses : famille des Neisseriaceae, exemple : Neisseria gonorrhoeae, Enterobacteriaceae, exemple : Salmonella typhi. D’autres sont utilisées dans l’industrie pour la production d’enzymes, de vitamines, d’antibiotiques, etc. Exemple : Lactobacillus.
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Bactéries pédonculées (Prosthécates) : Forme un groupe de bactéries Gram négatif, aérobies. Leur nom provient des pédoncules ou tiges prolongeant la cellule et lui donnant une forme particulière. Exemple : Caulobacter
Corps cellulaire Tige
renflement
Les caulobacter sont des formes bacillaires ou vibrioniques. Leur diamètre est compris entre 0,5 et 1 µm et leur largeur varie de 1 à 3 µm. En culture pure, les caulobacter s’associent en amas caractéristique ou rosette : tous les pédoncules se fixent les uns aux autres par les extrémités adhésives. Les cellules émergent à la périphérie. Les eubactéries pédonculées ont pour habitat le sol et les milieux aquatiques.
Les eubactéries filamenteuses : Se présentent sous forme de très longues chaînes de cellules en bâtonnet, englobées dans une gaine rigide et transparente, donnant l’impression d’être contenues dans un tube. Cette gaine de nature organique est formée d’un complexe glucido-lipido-polypeptidique. Elle est imprégnée d’oxyde de fer ou de manganèse. D’où le nom de bactéries ferrugineuses. Les eubactéries filamenteuses sont Gram négatif. La reproduction se fait par libération de cellules par l’apex des filaments. Ce type de bactéries est présent dans les eaux ferrugineuses, mais surtout dans les eaux de surface riches en matière organique. Elles forment de longs filaments floconneux flottant en surface des eaux industrielles et des eaux usées. Elles se trouvent également dans le sol, les eaux douces de rivières et des nappes souterraines. Les bactéries mycéliennes (Actinomycétales) : Elles forment le groupe important des Actinomycètes. Très diversifié, caractérisé par : • Le polymorphisme : présence de formes différentes chez des microorganismes de la même espèce ; • Tendance à former des filaments ramifiés (hyphes) qui les rapproche de champignons. Ce qui a fait que leur appartenance aux bactéries n’a pas toujours été reconnue. Les actinomycètes sont bien des bactéries car : • Leur structure interne est celle des procaryotes ; • Sont sensibles aux bactériophages (virus qui attaquent les bactéries) ; • Sont sensibles aux antibiotiques antibactériens et résistants aux antifongiques ; • Ont des dimensions cellulaires comparables à celles des bactéries. Les actinomycètes sont morphologiquement variés : • Des bâtonnets irréguliers ; • Des filaments ramifiés et non ramifiés ; • Structure mycélienne. Elles sont immobiles, Gram positif. De nombreuses actinomycètes sont fortement protéolytiques (capables de dégrader des protéines en substances plus simples). Certaines sont
22 pectinolytiques, chitinolytique, cellulolytique. Les actinomycètes sont fréquemment bactériolytiques grâce à des enzymes hydrolytiques capables de fragmenter le peptidoglycane des parois cellulaires. La propriété antimicrobienne des actinomycètes est aussi bien connue et nombre d’antibiotiques thérapeutiques disponibles aujourd’hui sont produits par des espèces du genre Streptomyces. Les actinomycètes ont une distribution très large dans la nature. On peut les isoler de l’air, du milieu aquatique, des aliments, du sol et des animaux. Certaines espèces sont dotées d’un pouvoir pathogène. C’est le cas de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium bovis qui sont les agents de la tuberculose humaine et bovine. Mycobacterium leprae responsable de la lèpre. Les rickettsies : Parasites intracellulaires de certains groupes d’arthropodes suceurs de sang (poux, puces et tiques) qui sont des hôtes-vecteurs, capables de transmettre l’infection par morsure ou piqûre aux animaux ou à l’homme et d’engendrer ainsi des maladies graves d’allure épidémique (contagieuses qui peuvent atteindre un grand nombre d’individus). Morphologie et structure : Les rickettsies comptent parmi les plus petites bactéries (300 à 600 nm). Elles se présentent sous une forme bacillaire ou coccoïde. Elles sont Gram négatif et immobiles. Pathogénicité : Les rickettsies se multiplient seulement en présence d’une autre cellule vivante. Ce sont des parasites obligatoires. Elles sont toutes potentiellement pathogènes pour l’homme. Elles sont les agents des Rickettsioses, maladies graves souvent fatales comme le typhus (fièvre avec des taches rouges sur la peau) transmis par le pou. Généralement transmises par des insectes piqueurs, ces derniers deviennent infectés lorsqu’ils prélèvent le sang d’une personne infectée et ils transmettent l’infection directement par la piqûre ou par les excrément qui pénètrent à travers les couches endommagées de la peau. Les réservoirs naturels de ces bactéries sont essentiellement les rongeurs sauvages (rats, lapins, etc.) avec des hôtes vecteurs privilégiés.
Réservoir
hôte-vecteur
Rongeur sauvage
arthropodes
Hôte définitif Homme hôte-vecteur arthropodes
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Les chlamydies : Ont de nombreux points d’analogie avec les Rickettsies. Mais n’infectent que des hôtes vertébrés. Elles sont parasites endocellulaires comme les rickettsies. Elles sont pathogènes pour l’homme et les animaux. Morphologie et structure : Organismes coccoïdes de petite taille, immobiles. Sous leur forme infectieuse, rigide (corps élémentaires). Ils pénètrent dans la cellule par phagocytose. A l’intérieur d’une vésicule cytoplasmique, ils s’organisent en particules plus grandes à paroi mince non infectieuses dites corps initiaux dont la multiplication intra-cytoplasmique donne naissance à des agglomérats dits inclusions, facilement visibles au microscope. Puis de nouveaux corps élémentaires apparaissent qui se libèrent de la cellule hôte altérée. Ces corps élémentaires sont capables d’entreprendre un nouveau cycle de multiplication sur d’autres cellules intactes. Pathogénicité : Les chlamydies sont largement répondues. Elles sont responsables d’infections humaines ou animales comme l’ornithose ou la psittacose (pneumopathie transmise par les perroquets et les perruches) et le trachome, infection oculaire grave qui peut entraîner une cécité. Les mycoplasmes : Sont des microorganismes dont la nature est restée longtemps obscure. Le premier représentant décrit dans ce groupe est l’agent responsable de la péripneumonie (maladie contagieuse du bétail). Leur structure mycélienne leur ont fait attribuer le nom de mycoplasme (forme de champignon). Mais leur propriété la plus caractéristique est l’absence de la paroi (ce sont des bactéries sans paroi). Les mycoplasmes sont caractérisés par leur polymorphisme. Ce sont des cellules de très petite taille, immobiles, de grande plasticité et d’une relative fragilité due à l’absence de la paroi.
Les cyanobactéries (fig. 17) Ce sont des procaryotes mais ne font pas parti des bactéries. Plus de 2000 espèces sont connues jusqu’à aujourd’hui. Elles sont uni ou pluricellulaires et autotrophes. Elles sont constituées d’éléments identiques, isolés ou disposés en file linéaire. Les dimensions des cyanobactéries varient entre 5 et 15 µm. Structure cellulaire : La cellule est entourée d’une paroi, essentiellement pectocellulosique. Elle comprend deux parties fondamentales : • Le chromoplasme périphérique ; • Le centroplasme granulaire et incolore. Chromatoplasme : zone située entre la membrane cellulaire et le centroplasme. Il se compose d’un cytoplasme riche en pigments. Ces pigments sont nombreux : chlorophylle verte, phycocyanine bleu-vert, phycoérythrine rouge, des carotènes et xanthophylles jaunes. Chez les cyanobactéries existent la chlorophylle a et c, absence de b. Le rapport quantitatif phycocyanine/phycoérythrine varie d’une espèce à l’autre ce qui explique la diversité des couleurs que présentent les cyanobactéries et qui varie du bleu gris au rouge en passant par le bleu vert. Les cyanobactéries ne possèdent pas des plastes mais la microscopie électronique a révélé que le chromatoplasme contient des thylakoïdes. Chacun d’eux est une vésicule membranaire très aplatie. Ils correspondent aux doubles membranes des chloroplastes. Ces thylakoïdes sont
24 responsables de la photosynthèse. Le pouvoir photosynthétique des cyanobactéries est identique à celui des plantes supérieurs. Centroplasme : région centrale de la cellule. Il fait fonction du noyau. Il renferme de l’ADN. Celui-ci n’est pas contenu dans des chromosomes. Il est à l’état non condensé. Multiplication et reproduction : La multiplication asexuée est leur seul mode de reproduction. La division binaire (scissiparité) des cellules assure la multiplication des espèces unicellulaires et la croissance des formes pluricellulaires. La multiplication asexuée est assurée par : • Fragmentation des filaments trichomes donnant des hormogonies ; • Des éléments résistants spécialisés : certaines cellules modifient leur contenu et s’entourent d’une épaisse membrane ce qui leur permet de résister à la dessiccation et de disséminer l’espèce. Ces éléments sont appelés spores. Biologie et écologie : Les cyanobactéries ont une distribution géographique très vaste. Elles ont une très grande faculté d’adaptation. Elles peuvent être terrestres, d’eau douce ou marine. Elles peuvent être planctoniques (développement en surface des eaux) ou fixées. Les cyanobactéries sont remarquables par leurs exigences nutritionnelles extrêmement réduites. En plus de leur capacité de photosynthèse, elles peuvent fixer l’azote atmosphérique. Il existe parmi les cyanobactéries des symbiotes (vivent en symbiose avec d’autres organismes vivants) qui s’associent avec des algues (exemple de Glaucocystis, algue unicellulaire d’eau douce) ; avec des champignons (cas de certains lichens ou l’algue est une cyanobactérie). Certaines cyanobactéries vivent en symbiose avec des animaux comme les éponges. Certaines cyanobactéries résistent à des températures élevées. On les trouve dans les eaux thermales (60 à 70 °C). D’autres à des températures basses dans les neiges et les ruisseaux de montagne.
Les virus Historique La découverte des virus remonte à la fin du 19ème siècle. En 1892, IVANOWWSKI, botaniste russe, réussit à transmettre à un plan de tabac sain, une maladie végétale dite mosaïque du tabac par l’intermédiaire d’un filtrat d’un jus provenant d’une plante malade. Cette filtration, éliminant toute bactérie suggéra à cet auteur le rôle d’une toxine filtrable comme responsable de la maladie. En 1898, un autre botaniste BEIJERINCK, ayant repris les expériences d’IWANOWSKI démontra que ce n’était pas une toxine qui passait à travers les filtres mais bien l’agent infectieux lui-même, responsable de la mosaïque du tabac (le caractère infectieux du filtrat permet de le distinguer d’une toxine). A la fin du 19ème siècle les pathologistes étudiants les maladies de l’homme et des animaux domestiques reconnaissent qu’un certain nombre de maladies infectieuses n’étaient pas dues à des bactéries ou à des protozoaires mais à des agents inconnus qui traversent les filtres utilisés pour les bactéries. Au début du 20ème siècle, le caractère invisible et filtrant des agents d’un grand nombre de maladies (poliomyélite, rage, etc.) fut démontré. Tous ces agents infectieux, plus petits que tous les microorganismes jusque là connus furent alors dénommés ultra-virus ou virus filtrant ou plus simplement virus. En 1935, on réussit à obtenir à l’état pur et cristallisé le virus de la mosaïque du tabac. Une année après on découvre la nature nucléoprotéique des cristaux obtenus. A partir de 1939, grâce au microscope électronique, on a pu préciser la teille des virus et montrer pour la 1ère fois leur forme. La méthode de diffraction aux rayons X a révélé les détails de l’organisation interne des particules virales. Le rôle prédominant de l’acide nucléique dans le pouvoir infectieux fut
25 démontré en 1952. En 1956, on a démontré que l’acide nucléique purifié extrait des virus de la mosaïque du tabac produit l’infection d’une plante saine. Caractères généraux des virus Un certains nombre de caractères sont communs à tous les virus : • Petite taille : ce caractère explique : 1. Leur filtrabilité : les virus ont la propriété de traverser les filtres bactériologiques usuels ; 2. Leur invisibilité : les virus ont des dimensions inférieures à la limite de résolution du microscope optique, ce qui pendant longtemps a empêché la connaissance de leur forme et de leur structure ; • Parasitisme intracellulaire obligatoire : dépourvus de tout équipement enzymatique, les virus ne peuvent croître sur les milieux bactériologiques usuels et ne peuvent se multiplier qu’à l’intérieur d’une cellule-hôte vivante ce qui provoque une atteinte profonde de la cellule qui se traduit par une modification importante de son comportement métabolique ou des lésions qui entraînent le plus souvent la mort de la cellule infectée ; • Spécificité : la spécificité des virus est en rapport avec leur constitution chimique et elle est sous l’étroite dépendance du génome viral qui est responsable à la fois du pouvoir infectieux et de l’élaboration des protéines de structure qui constituent les antigènes viraux. Morphologie et structure des virus Les particules virales ou virions se présentent sous différents aspects : • Forme cylindrique ; • Forme arrondie ; • Forme allongée en bâtonnet Structure générale Tous les virus sont constitués par une molécule d’acide nucléique enclose à l’intérieur d’une couche de protéines qui forme la capside. L’ensemble capside et acide nucléique constitue la nucléocapside. La capside est formée par l’assemblage de molécules de protéines. Cet assemblage se fait d’une façon précise et caractéristique selon deux types bien distincts : • Formation d’une coque fermée ; • Tube hélicoïdale. A ces deux types d’assemblage correspondent deux types différents de capsides : • Capsides icosaèdrique, caractérisée par une symétrie cubique ; • Capsides hélicoïdales, avec une symétrie hélicoïdale. Dans certains cas, la capside est enclose à l’intérieur d’une enveloppe dite peplos.
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Capside icosaédrique : Tous les virus sphériques ou polyédriques ont une capside icosaédrique constituée par l’assemblage de molécules de protéines qui se groupent pour former les capsomères. L’icosaèdre résultant de l’assemblage des capsomères possède : • 12 sommets ; • 20 faces constituées par des triangles ; • 30 arêtes.
sommet
face
arête capside hélicoïdale : Les virions de nombreux virus des plantes possèdent une capside hélicoïdale tout à fait différente de la capside icosaédrique. Le plus connu de ces virus, le virus de la mosaïque du tabac, a servi comme prototype de description. Au microscope électronique, le virion se présente comme un bâtonnet rigide et creux, de 30 nm de long environ et de 17 nm de large, constitué par un long filament d’ARN monocaténaire enroulé en hélice comme un ressort. Sur cette hélice viennent s’insérer les sous-inités protéiques toutes identiques entre elles et constituées par une simple molécule protéique. Ces sous-unités se disposent à leur tour en hélice.
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Constituants chimiques des virus L’analyse chimique nécessite des préparations pures de particules virales. La méthode de purification la plus ancienne est basée sur la centrifugation différentielle dans des alcools mais les préparations ne sont que partiellement purifiées. Les méthodes modernes ont permis l’obtention de préparations hautement purifiées. Parmi ces méthodes les meilleurs sont la chromatographie sur colonne de cellulose, l’ultracentrifugation en gradient de densité. Sur ces préparations, on peut alors déterminer avec précision la nature chimique de l’acide nucléique du virus, la composition chimique des protéines structurales et des autres constituants viraux. Acide nucléique : Pour obtenir l’acide nucléique d’un virus à l’état purifié et libéré de toutes les protéines, on utilise plusieurs techniques. Les principales sont : • Extraction par le phénol ; • Extraction par des détergents anioniques qui dénaturent et solubilisent les protéines et libèrent l’acide nucléique dans la solution. ADN viral : dans la plupart des cas l’ADN viral est bicaténaire (molécule à double brin). Cependant certains ont une molécule à simple brin (ADN monocaténaire). Le poids moléculaire de l’ADN viral est très variable : 1,2 à 1,8.106 à 160.106 daltons (1 dalton ≡ poids d’un atome d’hydrogène). Cet ADN est linéaire ou circulaire. ARN viral : comme l’ADN, on rencontre chez les virus à ARN des types monocaténaire et bicaténaire. De nombreux virus des bactéries, des plantes et des animaux contiennent un ARN monocaténaire. L’ARN bicaténaire est rencontré surtout chez les virus animaux. Protéines virales : Les protéines codées par le génome viral durant la multiplication intracellulaire du virus peuvent être réparties en trois groupes principaux : • Protéines permettant la duplication de l’acide nucléique viral (enzymes) ; • Protéines altérant quelques fonctions ou structure de la cellule hôte ; • Protéines de structure incorporées dans les particules néoformées du virus. Les protéines capsidales protègent l’acide nucléique enclos à l’intérieur. Dans le cas des virus dépourvus d’enveloppe, elles jouent en plus un rôle dans l’attachement spécifique des virions aux cellules-hôtes par suite de leur affinité spéciale pour les récepteurs situés à la surface des cellules sensibles. Lipides : Absents dans les virions non enveloppés. Constituent l’essentiel des enveloppes virales. Les constituants des enveloppes virales sont des lipides d’origine cellulaire. La teneur en lipide de ces enveloppes dépend des cellules sur lesquelles se sont multipliés les virus. Classification des virus A l’époque où les virus étaient encore inaccessibles aux méthodes courantes d’études morphologiques et physico-chimiques on les avait classés en trois groupes majeurs en rapport avec les hôtes qu’ils infectent : • Virus des bactéries (bactériophages) ; • Virus des plantes ; • Virus des animaux.
28 Cette division bien classique n’est cependant pas strictement exacte car d’une part, certains virus des vertébrés se multiplient chez les insectes qui sont aussi les vecteurs de l’infection chez l’homme et les animaux et d’autre part, certains virus des plantes se multiplient également chez les insectes. On a pendant longtemps et traditionnellement utilisé une nomenclature des virus qui a consisté à donner le nom de la maladie produite dans l’hôte principal. Exemple : virus de la mosaïque du tabac, virus de la variole, virus de la poliomyélite, virus de la rage, etc. Par la suite, en raison d’une meilleure connaissance des virus, la nécessité d’une classification en groupes de virus présentant des propriétés similaires est devenue évidente. Le comité international de nomenclature a choisi le système de classification basé sur des critères chimiques et structuraux : • Nature de l’acide nucléique ; • Symétrie de la nucléocapside ; • Présence ou absence de l’enveloppe, diamètre de l’hélice pour les virus à symétrie hélicoïdale et nombre de capsomères pour les virus cubiques. Culture des virus L’impossibilité pour les virus, entités dépourvues de tout équipement enzymatique, de se multiplier sur des milieux inertes a imposé dès leur découverte des méthodes spéciales permettant d’obtenir leur multiplication sur des cellules vivantes. La première méthode utilisée est l’inoculation aux animaux. Exemple : virus de la rage obtenu par Pasteur et qui est encore à l’heure actuelle conservé par passage régulier dans le cerveau de lapin. Par la suite cette méthode est peu à peu abandonnée lorsqu’on a découvert que la multiplication des virus pouvait se faire dans l’œuf de poule embryonné et surtout sur des cultures cellulaires. Culture dans l’œuf embryonné : Procédé simple et économique. Il permet d’obtenir la multiplication de nombreux virus. Utilisée d’abord pour le diagnostic d’un certain nombre d’infections virales et ensuite pour l’obtention de grandes quantités de matériel viral nécessaire pour des études chimiques ou pour la préparation de vaccins. On utilise des œufs provenant d’élevages sains exempts de toute maladie à virus. Les œufs doivent être fécondés et pondues depuis moins de 10 jours et conservés à une température de 10 à 15 °C. les œufs sont mis à incubation à 39,5 °C dans des étuves spéciales et doivent être contrôlés après incubation pour s’assurer que l’embryon est bien développé. Voies d’inoculation : sont nombreuses et varient suivant les virus. Après inoculation, les œufs sont remis à incuber pendant un temps variable qui dépend du virus. On procède ensuite aux divers prélèvements de la membrane chorio-allantoïdienne, des liquides allantoïques et amniotique, etc. ensuite il faut rechercher les lésions qui traduisent la multiplication du virus. Cultures sur tissus ou sur cellules maintenues en survie : C’est la méthode la plus utilisée. Les milieux de culture utilisés pour faire ces cultures cellulaires doivent être stables pour obtenir une bonne croissance des cellules. Les milieux doivent contenir des éléments indispensables : • Sels minéraux (Na+, Ca++, K+, Mg++, Cl-, etc.) ; • Corps organiques simples (glucides, acides aminés, etc. ); • Vitamines.
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Effets des virus sur les cultures cellulaires : Lorsqu’un virus entre en contact avec une cellule, plusieurs éventualités peuvent se produire : • La cellule ne possède pas à sa surface des récepteurs spécifiques nécessaires à la fixation du virus. Il ne pourra pas se fixer sur la membrane cellulaire, ni pénétrer dans la cellule et celle-ci ne sera pas infectée ; • La cellule possède des récepteurs spécifiques permettant la fixation, puis la pénétration du virus dans le cytoplasme. Le virus est ensuite débarrassé de sa capside et l’acide nucléique viral, qui constitue le génome, est libéré. Le virus se multiplie activement dans la cellule ce qui entraîne souvent la mort de la cellule. De nombreux virions sont alors libérés. Multiplication des virus Le fait que les virus ne renferment qu’un seul type d’acide nucléique ; qu’ils soient dépourvus de tout métabolisme et incapables de se multiplier sur milieu inerte et qu’ils ne peuvent se reproduire qu’au sein d’une cellule vivante à partir de leur seul matériel génétique implique un mode de multiplication particulier. Le virion représente la forme statique d’un virus qui est incapable de se reproduire dans son état extracellulaire et qui doit obligatoirement pénétrer dans une cellule vivante pour utiliser les systèmes de synthèse de la cellule normale qu’il infecte. Schémas général de la multiplication des virus : 1. Pénétration dans la cellule-hôte Les virions se fixent d’abord sur la cellule sensible au niveau des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire, puis pénètrent dans le cytoplasme. 2. Décapsidation La capside du virion est ensuite dégradé par l’intermédiaire d’enzymes (décapsidases). La décapsidation libère alors l’acide nucléique viral dans le cytoplasme. 3. Phase d’éclipse Caractérisée par la disparition des particules virales infectieuses. C’est une phase durant laquelle a lieu la réplication virale. Le génome viral libéré va servir de source d’information à la fois pour sa réplication et la biosynthèse de différentes protéines : les unes sont des enzymes de réplication, les autres sont des protéines structurales qui vont former les capsides et éventuellement certains constituants de l’enveloppe. 4. Maturation Dès qu’une certaine quantité d’acide nucléique et de protéines de structure est accumulée dans la cellule, l’assemblage des capsides commence et au fur et à mesure de leur production elles entourent l’acide nucléique viral pour former la nucléocapside des virions. C’est le phénomène d’encapsidation. Pour certains virus, l’acquisition d’une enveloppe se fait ultérieurement par bourgeonnement lors de leur passage au travers des membranes nucléaires ou cytoplasmiques. 5. Libération Etape finale de la multiplication au cours de laquelle les virions complets ainsi formés sont libérés dans le milieu extérieur soit par lyse de la cellule-hôte, soit par bourgeonnement à la surface cellulaire. Les bactériophages Ce sont les virus des bactéries. Ils représentent pour les bactéries les agents infectieux qui entraînent généralement la lyse et la mort des bactéries.
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Historique La découverte du phénomène de bactériophagie remonte au début du 20ème siècle (1915) par Twort qui a observé que des colonies de microcoques se lysaient en boite de Pétri. Plus tard on découvre qu’il s’agit d’une attaque par des virus (bactériophages). Expérimentalement, on peut provoquer la lyse sur une culture d’E. coli en nappe. On dépose des gouttes d’une suspension de coliphage (bactériophage qui infecte E. coli).
Dépôt de coliphages
plages de lyse
Morphologie et structure Cas du phage T2 (phage actif sur E. coli)
tête
collier
gaine contractile queue cylindre central
fibres caudales spicules
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Le phage T2 est constitué de deux parties : • Une tête hexagonale (950 A° de long/650 A° de largeur). C’est une capside formée de capsomères qui renferment l’acide nucléique pletonné à son intérieur. • Une queue (1000 A°). Elle comprend un canal creux de 80 A° de diamètre entouré d’une gaine contractile de 250 A° de diamètre. L’extrémité de la queue est constituée par une plaque terminale de forme hexagonale sur laquelle sont fixées six spicules et six minces filaments (fibres). Cycle de multiplication du bactériophage T2 : Phase d’adsorption et de pénétration : • Récepteurs bactérien : l’adsorption résulte de l’existence de structures complémentaires présentes sur les bactéries et le phage. Un bactériophage ne se fixe pas sur n’importe quelle bactérie. Cette spécificité se situe chez la bactérie au niveau de la paroi (les phages sont incapables de se fixer sur les protoplastes). Les récepteurs phagiques sont situés sur la couche lipoprotéique de la paroi d’Escherichia coli pour les phages T2. • Fixation : elle s’effectue par l’intermédiaire des fibres caudales et de la plaque terminale. (en mettant en présence des débris de phages et des bactéries, seules les queues ou les fibres caudales se fixent ; les têtes ou l’ADN en sont incapables). Une enzyme, lysozyme, située dans la queue du phage entre ensuite en action. Elle dépolymérise le mucopéptide de la paroi bactérienne. Les destructions locales diminuent la rigidité et la résistance de la paroi. • Injection de l’ADN : la contraction de la gaine externe est alors déclenchée. Le tube interne de la queue traverse la zone de moindre résistance, perce la membrane livrant ainsi passage au filament d’ADN. Celui-ci pénètre dans le cytoplasme tandis que les enveloppes phagiques vides restent à l’extérieur. Ceci peut être mis en évidence par le marquage radioactif : ADN marqué au 32P et les protéines 34S. Au contact des bactéries sensibles, si on les sépare on remarque que l’ADN est contenu dans les bactéries tandis que les protéines marquées restent à l’extérieur. Phase d’éclipse : Le virion après avoir injecté son ADN cesse d’exister en tant que particule infectieuse indépendante. D’importants événements se succèdent alors. Cette étape est caractérisée par de nombreuses synthèses phagiques : • Inhibition des synthèses bactériennes : dès l’infection, la croissance bactérienne est stoppée, ainsi que la synthèse de l’ADN bactérien. C’est alors l’arrêt total de toutes les synthèses bactériennes enzymatiques et protéiques. Les autres structures cellulaires restent pourtant intactes et fonctionnelles. Elles vont servir aux synthèses bactériophagiques. • Synthèse des constituants phagiques précoces : le premier élément synthétisé est un ARN messager de type phagique. En même temps des protéines nouvelles apparaissent. Ce sont des enzymes nécessaires à la réplication de l’ADN viral (polymérases, kinases, etc.) • Synthèse d’ADN : l’ADN viral est mis en évidence dans la bactérie 6 mn environ après le début de l’infection. Sa synthèse est dirigée par l’ADN phagique injecté au cours de la 1ère phase. Elle s’effectue au dépens des débris d’ADN bactérien et également grâce aux métabolites présents dans le milieu. • Synthèse des protéines : les protéines de structure (tête et queue) apparaissent 9 mn environ après l’infection. Leur synthèse est dirigé par l’ADN phagique et les ARN messagers. Elle s’effectue au niveau des ribosomes de la bactérie. Ainsi, la bactérie continue
32 son travail de synthèse mais c’est l’ADN phagique qui dirige les synthèses. Toutes les substances élaborées sont alors de nature phagique. Phase de maturation et de libération : • Maturation : c’est vers la 12ème mn après infection qu’apparaissent les premiers virions dans la cellule bactérienne. Leur nombre augmente ensuite jusqu’à la phase de libération. Le mécanisme de maturation, assemblage, est mal connu. L’ADN du phage se condense puis s’entoure d’unités protéiques reconstituants la tête du phage. Les éléments de la queue s’associent en suite. De nombreux virions sont ainsi formés. • Libération : les virions formés au cours de la maturation sont au nombre de 100 à 200. ils agissent sur la paroi grâce à une enzyme, cette fois de l’intérieur de la cellule. La bactérie éclate et libère son contenu vers la 25ème mn après infection. Cycle lysogénique : Il est propre aux phages dits tempérés, qui sont des phages à ADN bicaténaire. Dans la lysogénisation, la phase d’adsorption et de fixation du bactériophage est la même que dans le cycle lytique. Après la phase d’injection de l’ADN phagique dans la bactérie, il n’y a pas de multiplication végétative. Le génome du phage est incorporé dans le chromosome de la bactérie et se réalise ainsi un équilibre bien toléré pouvant se maintenir indéfiniment : c’est la lysogénie. Les bactéries qui survivent à l’infection par un phage tempéré sont des bactéries lysogènes. Dans certaines conditions on peut assister au passage au cycle lytique spontanément ou après une induction par des agents physiques ou chimiques (rayons U.V, rayons X, peroxydes, etc.) Cette propriété lysogène est héréditaire et transmissible à la descendance plusieurs générations successives.
phage tempéré
prophage
b Intégration de d’ADN viral (prophage) cellules filles avec ADN viral
Nature de la lysogénie : Pourquoi un bactériophage est-il virulent chez certaines cellules bactériennes alors que chez d’autres il est réduit au prophage ? Le chois entre les deux possibilités est dicté par la présence ou l’absence d’une substance cytoplasmique de nature protéique qu’on appelle répresseur.
33 Si le répresseur est présent, le phage ne peut pas s’exprimer. Il est réduit en prophage inactif. Lorsqu’il est absent le phage entre immédiatement en phase végétative. C’est à dire formation de phages fils et lyse de la bactérie. Le mécanisme de l’induction s’explique donc. Les agents physiques et chimiques cités ( U.V, R.X, peroxydes, etc.) détruisent le répresseur. Le prophage se transforme en phage végétatif. La preuve de l’intégration du prophage dans le chromosome bactérien et de l’existence d’un répresseur cytoplasmique a été apporté par des expériences de conjugaison chez E. coli K12 au cours de croisement entre une bactérie Hfr lysogène et une bactérie F- non lysogène. Le prophage, inséré sur un segment de chromosome de la bactérie Hfr, après pénétration dans la bactérie F- est activé et va pouvoir se multiplier et provoquer la lyse de la bactérie réceptrice par suite de l’absence de répresseur cytoplasmique chez la bactérie non lysogène. prophage
Hfr
F-
F-
Hfr
F-
éclatement de la cellule F-
Conséquences de la lysogénie : L’intégration d’un prophage dans le chromosome d’une bactérie sensible, qui devient ainsi lysogène, détermine chez elle des propriétés nouvelles qui n’ont aucun rapport avec le cycle de multiplication. C’est le cas, entre autre, des changements de morphologie ou de pigmentation des colonies, de la production de toxines ou d’antigènes nouveaux. Ce phénomène s’appelle la conversion lysogènique. Intérêt médical des bactériophages : Dans certains cas, un bactériophage spécifique peut être utilisé pour l’identification d’une espèce bactérienne ou la différenciation de types bactériens au sein d’une même espèce. Les résultats de lyse d’une souche bactérienne par un phage donné est une indication de l’identité de la bactérie. Cette technique porte le nom de lysotypie.
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Notions d’immunologie Introduction : Un individu qui a déjà eu une maladie d’enfance, comme la rougeole, les oreillons, etc., résiste habituellement à une seconde infection. Il a développé une résistance à une maladie causée par un pathogène spécifique. On appelle immunité cette résistance. Comme elle s’acquiert lors d’un premier contact avec l’agent infectieux, on parle d’immunité acquise. L’immunité peut s’acquérir à la suite d’une vaccination ou d’une infection naturelle. Les vaccins et les microorganismes stimulent donc les mécanismes de résistance de l’hôte. C’est à dire son système immunitaire. L’immunité acquise s’explique par le fait que le système immunitaire peut faire la différence entre les cellules ou les substances de leur propre organisme et celles qui leur sont étrangères. Principalement des cellules d’autres animaux, des virus, des toxines, des bactéries et des vaccins. Il existe un 2ème type de résistance, résistance naturelle ou non spécifique. Elle dépend d’un grand nombre de facteurs : état de santé général de l’hôte, son état nutritif, son âge, etc. Quelques définitions : La résistance : ensemble de mécanismes et des facteurs qui permettent à l’homme de se défendre contre les microorganismes. L’immunité : production de molécules spécifiques = résistance spécifique. Mécanismes généraux : résistance non spécifique. Ne sont pas dirigés contre des microorganismes particuliers. Ils englobent : • Les barrières mécaniques ; • Les facteurs de l’environnement ; • La réaction inflammatoire et la phagocytose ; • L’âge, l’alimentation, etc.
Résistance non spécifique :
La 1ère ligne de défense de l’organisme est l’ensemble de ses barrières mécaniques. • La peau : saine, elle est infranchissable par les bactéries et les virus. Les secrétions de la peau, sébum et sueur, sont bactéricides. Quand il y a lésion au niveau de la peau, il y a pénétration et installation des bactéries. Ceci entraîne la réaction inflammatoire avec la production de pus. • Surface des yeux : elle est protégée par le mouvement des paupières et l’action nettoyante des sécrétions lacrymales qui renferment le lysozyme bactéricide. Malgré cela l’œil reste une porte d’entrée pour les bactéries tels que les gonocoques, les staphylocoques, les pneumocoques, les chlamidies, etc. • Les poumons : sont protégés par la complexité des voies nasales et les parois bronchiques (épithélium cilié recouvert d’une couche de mucus). Les particules de poussières et les bactéries s’accrochent au mucus ; constamment véhiculé vers les vois supérieures par un mouvement des cils. Certaines bactéries arrivent à vaincre ces obstacles. C’est le cas des pneumocoques, de Mycobacterium, etc. • Muqueuses gastro-intestinales : sont protégées par l’acidité gastrique et les sécrétions biliaires et le mucus de la paroi intestinale. Cette protection varie avec les aliments. Certaines bactéries arrivent à surmonter ces obstacles. Exemple de Salmonella typhi, Vibrio cholera, etc.
35 • Muqueuses urogénitales : barrières mécaniques relativement efficace avec des sécrétions de mucus et d’acide lactique à activité antimicrobienne. Beaucoup de bactéries peuvent franchir ces obstacles. C’est le cas de Neisseria gonorrhea, Treponema pallidum, etc. • Phagocytose : il s’agit de nôtre principal moyen de défense contre les bactéries après la formation des anticorps. On rencontre les phagocytes à deux niveaux : Au niveau des tissus (macrophages et autres) ; Dans le sang (monocytes et granulocytes). • Processus inflammatoire : c’est une réponse défensive des tissus. Il s’agit d’un processus complexe impliquant une série de réactions dont l’ensemble contribue à la destruction de l’agent infectieux. Ses manifestations sont : La rougeur (hyperémie) ; L’enflure (tuméfaction) ; La chaleur et la douleur. L’hyperémie est l’engorgement sanguin de la zone impliquée du à une dilatation locale des capillaires et une certaine effusion du sang dans les tissus. Les leucocytes peuvent envahir la zone et venir phagocyter les bactéries. Il en résulte la formation du pus. L’élévation de la température est due à l’afflux sanguin et les réactions chimiques dans les tissus.
Résistance spécifique à l’infection Introduction : Le fait de contracter une maladie infectieuse donne habituellement une immunité envers le microorganisme responsable de cette maladie. Cette immunité est spécifique en ce qu’elle ne protège que contre le microorganisme en question et non contre les autres. La durée de cette résistance varie énormément d’un microorganisme à l’autre et d’un sujet à l’autre. Certaines infections induisent une immunité permanente comme la rougeole, la varicelle, la coqueluche, la poliomyélite, la diphtérie, etc. L’immunité peut s’acquérir à la suite d’une infection naturelle ou d’une vaccination. Les vaccins et les microorganismes stimulent donc les mécanismes de résistance de l’hôte c’est à dire son système immunitaire. Le système immunitaire peut faire la différence entre les cellules et les substances de son propre organisme et celles qui lui sont étrangères. C’est à dire les cellules d’autres animaux, des virus, des toxines, des anatoxines, des bactéries et des vaccins. La formation d’anticorps spécifiques Dans la majorité des cas, ce sont des substances en provenance de l’extérieur, génétiquement et chimiquement étrangères à nous, qui induisent la formation des anticorps. Les antigènes Ce sont des substances capables de stimuler un processus biologique complexe impliquant la prolifération des cellules lymphoïdes et aboutissant à la synthèse par ces dernières de molécules de reconnaissance, dites anticorps, avec lesquelles elles réagissent spécifiquement. Ce sont les antigènes qui commandent la nature et les modalités des réponses immunitaires Les déterminants antigéniques : Toute substance, virus, bactérie ou autre qui agit comme antigène, possède sur sa surface un certain nombre de sites réactifs ou déterminants antigéniques. Ces derniers sont responsables de la spécificité de la réponse immunitaire et sont les sites qui réagissent avec l’anticorps ou les lymphocytes sensibles.
36 Antigène
anticorps
déterminants antigéniques
Les anticorps L’injection à un animal d’un antigène entraîne l’apparition de molécules de nature protéique se liant spécifiquement à cet antigène. Les protéines douées de cette fonction de reconnaissance spécifique sont appelées anticorps ou immunoglobulines Ig. Les anticorps font parti des globulines, protéines du sérum sanguin. Structure de base de la molécule d’anticorps : La molécule de base d’Ig est le monomère. Il est constitué de 4 chaînes : 2 chaînes lourdes ; 2 chaînes légères. site de fixation de l’Ag
chaîne légère (L) Chaîne lourde (H)
Classes d’immunoglobulines Il y a cinq classes d’Ig. Elles ont toutes le même type d’unité structurale ou monomère. • Immunoglobuline G (Ig G): 70 à 90% de la totalité des anticorps circulants. Leur durée de vie moyenne est de 21 jours. Ce sont les anticorps les plus efficaces dans la défense de l’organisme contre l’infection, et notamment contre les infections bactériennes et virales. Les Ig sont transmises par voie trans-placentaire. Ce sont les anticorps qui protègent l’enfant à la naissance. Elles sont également transmises par l’allaitement maternel. • Immunoglobuline M (IgM) : 3 à 10% de la totalité des anticorps circulants. Elles ne traversent pas le placenta comme les Ig G. Les Ig M sont surtout formées lors du début de la réponse anticorps primaire, c’est à dire au 1er contact avec un antigène. Elles
37 laissent ensuite place aux Ig G. Chez les nourrissons les premiers anticorps élaborés sont pratiquement toujours des Ig M. • Immunoglobuline A (Ig A) : elles se trouvent : Dans le sérum (Ig A sériques). Elles représentent 5 à 25% des anticorps sériques. Elles ne traversent pas le placenta. Dans les sécrétions (Ig A sécrétoires). Elles se trouvent en abondance dans les sécrétions digestives, salive, larmes, mucus bronchique, le colostrum et le lait maternel. Elles jouent un rôle de défense anti-infectieuse au niveau des muqueuses digestives et respiratoires. • Immunoglobuline D (Ig D) : représentent une très faible proportion des anticorps circulants. Leur fonction n’est pas connu avec exactitude. On pense qu’elles interviennent dans la régulation de la synthèse des autres Ig. • Immunoglobuline E (Ig E) : représentent moins de 1% des anticorps sériques. Ce sont les principaux anticorps de l’allergie. Lorsqu’elles sont associées à des antigènes, elles provoquent des réactions allergiques ou d’hypersensibilité (réponse exagérée de l’organisme). C’est le cas de l’hypersensibilité aux piqûres d’insectes, au pollen, à la poussière, etc. Mécanismes d’action des anticorps Les anticorps réagissent contre des microorganismes spécifiques, leurs produits toxiques et d’autres composés. Selon leur type de réaction avec les antigènes on reconnaît : • Les antitoxines : neutralisent les toxines. Les plus connues sont l’antitoxine diphtérique, tétanique et botulinique. D’autres sont dirigées contre les venins de serpents et d’insectes. Chacune de ces antitoxines est rigoureusement spécifique à la toxine qui l’a induite. • Les agglutinines : agglutinent les cellules bactériennes. • Les précipitines : entraînent la précipitation ou la floculation d’extraits bactériens ou d’autres antigènes solubles. • Les lysines : brisent les bactéries ou d’autres cellules sensibles à leur action. • Les anticorps fixateurs de complément : participent aux réactions de fixation du complément. • Les opsonines : n’exercent aucun effet destructeur direct sur les microorganismes mais les rendent plus facilement phagocytables. Anticorps (opsonines) bactérie
Récepteur d’Ac.
macrophage
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Les cellules de défense de l’organisme Les leucocytes sont des cellules sanguines dont il existe différentes sortes. Ils ne renferment pas d’hémoglobine, sont incolore, d’où leur nom ( Leukos = blanc). Les cellules phagocytaires : il existe trois catégories : •
Les polynucléaires
les monocytes
les macrophages
Les cellules phagocytaires sont définies par leur aptitude à ingérer et digérer les particules vivantes ou inertes (phagocytose). Les lymphocytes : ont le même aspect au microscope. Néanmoins ils sont hétérogènes par leur densité, leur durée de vie et surtout par leur fonction. Il en existe deux familles importantes : • Les lymphocytes T : interviennent dans la phagocytose ; • Les lymphocytes B : sont précurseurs de cellules productrices d’anticorps (les plasmocytes). La réponse immunitaire Les microorganismes qui ont vaincu les mécanismes de résistance naturelle de l’hôte font alors face à ses mécanismes de résistance acquise. La réponse immunitaire à un antigène prend deux formes : • Réponse humorale : production d’anticorps ; • Réponse à médiation cellulaire.
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La réaction immunitaire
Agent pathogène
Macrophage
signal
signal
Lymphocytes T4 auxiliaires
Lymphocytes T8 cytotoxyques
lymphocytes B
anticorps
cellules mémoires
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Applications diagnostiques des réactions Ag-Ac. Introduction • On peut faire des épreuves in vitro pour mettre en évidence les anticorps dans les liquides organiques comme le sérum (plasma débarrassé de la fibrinogène). • On peut observer des réactions d’agglutination, de précipitation, de lyse des bactéries, etc. • Les anticorps responsables de ces réactions sont respectivement des agglutinines, des précipitines et des lysines. • L’étude de ces réactions antigène-anticorps porte le nom de sérologie. Elle mesure les antigènes et/ou les anticorps présents dans le sérum. Si seulement un des composants est connu, une réaction positive va révéler l’identité de l’autre. Réaction d’agglutination Dans les réactions d’agglutination, l’antigène est une cellule ou une particule. L’addition d’anticorps complémentaires provoque l’agglutination ou agrégation des cellules. Il se forme un réseau entre les anticorps et les antigènes et cela entraîne la formation d’agrégats. On obtient la confirmation au laboratoire de certaines maladies infectieuses par l’agglutination d’antigènes comme les bactéries avec le sérum du patient. On peut aussi identifier des bactéries inconnues grâce à des réactions d’agglutination avec des sérum contenant des anticorps connus. Les tests d’agglutination peuvent être faits en tube ou sur lame.
Test en tube
Suspension bactérienne (antigène)
+
antisérum spécifique (anticorps)
agglutination
Test sur lame (observation microscopique)
Agglutination
pas d’agglutination
41 La majorité des réaction d’agglutination bactériennes se font par dilutions successives d’antisérum (sérum contenant les anticorps) dans des tubes contenant des antigènes. Après incubation, on observe une agrégation et on détermine le titre. Le titre est une valeur correspondant à l’inverse de la plus grande dilution d’antisérum donnant une réaction positive. Exemple : le titre d’un antisérum qui produit une réaction positive à une dilution 1/256 (mais pas à 1/515) est 256. un titre élevé indique une plus forte concentration d’anticorps. Réaction de fixation du complément Système de complément : le complément trouvé normalement dans le sérum sanguin, forme un groupe de protéines apparentées. On l’appel ainsi à cause de son effet complémentaire sur certaines réactions immunitaires mettant en jeu des anticorps. Ce n’est pas un anticorps en ce sens qu’il n’est pas fabriqué à la suite d’une stimulation antigénique. Il exerce une action complémentaire aux anticorps (sans spécificité). La réaction de fixation du complément se fonde sur la présence, dans le sérum, d’anticorps fixateurs de complément : en présence de complément, ces anticorps lysent des cellules spécifiques. Cette réaction détermine la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Elle comprend deux phases : • Phase de fixation : consiste à incuber ensemble le sérum test, l’antigène et le complément. S’il y a réaction entre l’antigène et l’anticorps sérique, le complément est alors fixé ; • Phase d’hémolyse : on utilise des anticorps anti-hématies (hémolysines, préparées en immunisant des lapins avec des globules rouges de mouton). Si le complément a été fixé pendant la réaction de fixation, il n’y aura pas d’hémolyse. Une hémolyse est donc signe d’une réaction négative.
phase 1
Ag
phase 2
Ac spécifique complément (sérum)
complément fixé
hématies hémolysine de mouton pas d’hémolyse Réaction complémentaire positive
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Ag
absence Ac ( sérum)
complément complément non fixé
hématies
hémolysine
lyse des hématies
Réaction complémentaire négative NB : les hémolysines sont des anticorps anti-hématies de mouton. Ils lysent les hématies en présence du complément.
Réaction de précipitation Dans les réactions de précipitation, un antigène soluble réagit avec un anticorps complémentaire. La réaction se manifeste in vitro par la formation d’un précipité visible à l’interface de l’antigène et de l’anticorps. Antigène Anticorps
Interface
43 Test de l’anneau : C’est le test le plus simple des réactions de précipitation. On introduit dans un tube une solution d’antigènes sur une solution d’antisérum. Ces deux solutions diffusent jusqu’au moment où les concentrations sont idéales pour la précipitation. Il apparaît alors une zone dense ou un anneau entre les deux zones claires.
Antigène précipité (témoin d’une compatibilité entre l’Ag et l’Ac) anticorps
Diffusion en milieu gélosé : On pratique dans l’Agar d’une boîte de Pétri des petits puits circulaires dans lesquels on peut déposer de petites quantités d’antigènes et d’anticorps en solution. Après un certain temps, les molécules ont diffusées dans la gélose et à leur point de rencontre, si elles sont spécifiquement complémentaires, elles forment une ligne visible de précipité.
Anticorps
Antigène
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Immunofluorescence : Les immunoglobulines peuvent être conjuguées avec des composés fluorescents divers, sans perdre leur propriétés immunologiques, qui soumis à un rayonnement U.V émettent une lumière verte, rouge, orange, jaune en fonction des composés fluorescents. L’observation est faite au microscope à fluorescence. Fluorescence directe Nécessite un marquage de l’anticorps spécifique à l’antigène. Cette technique est surtout utilisée pour le diagnostique bactérien : identification rapide des bactéries. Les anticorps spécifiques du microorganisme recherché, marqués par un composé fluorescent se fixent sur les antigènes de la bactérie en émettant une fluorescence au microscope.
Ac marqué
bactérie Bactérie avec Ac fluorescents
Fluorescence indirecte Permet la recherche d’anticorps dans un sérum sanguin : Anticorps dirigés contre un antigène connu. Lavage fluorescence
Ag stabilisé
Ac (sérum)
Ac anti-Ac marqué Fluorescence persiste
NB : Si l’anticorps est présent dans le sérum, la fluorescence persiste après lavage. Si l’anticorps est absent, après lavage pas de fluorescence.
45 Expériences réalisées au 19ème siècle en faveur de la biogenèse Expérience de Spallanzani (fig.1) solution nutritive
flacon fermé hermétiquement Résultat :aucun microbe
Expérience de Schwann (fig.2)
serpentin
bouillon stérile
entrée d’air
Résultat : aucun microbe
Expérience de Schulze (fig.3) Entrée d’air bouillon stérile acide Résultat : aucun microbe
Expérience de Schröder et Dusch (fig.4) coton
Expérience de Pasteur (fig.5) Entrée d’air
bouillon
bouillon entrée d’air
Résultat : aucun microbe dans les deux cas
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Le groupement chez les cocci (fig. 6)
Coques isolés :
Diplocoques :
Streptocoques :
Staphylocoques :
Tétrades :
Sarcines :
Arrangement des flagelles chez les bactéries (fig.7)
Monotriche
Lophotriche
Amphitriche
Péritriche
47 Spores bactériennes (fig. 8)
Spores elliptiques, centrales et non déformantes :
Exemple : Bacillus cereus
Spores sphériques, terminales et déformantes :
Exemple : Clostridium tetani
Spores ovoïdes, subterminales et déformantes : Exemple : Clostridium subterminale
Constituants d’une endospore : Tunique sporale
Cortex sporal
Protoplaste
Matériel ‘’ nucléaire’’
48 Influence des conditions physiques sur la croissance des bactéries Température : (fig. 9) croissance
température minimum
optimum
minimum
Gaz atmosphériques : (fig.10)
Aérobies stricts
anaérobies stricts
aéro/anaérobies Facultatifs
microaérophiles
Méthode d’isolement par stries (ensemencement par épuisement) : (fig.11) Goutte à analyser
colonies
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Hématimètre pour Numération au microscope (fig. 12) Vu de face quadrillages lamelle vu de profil
Dénombrement après culture (fig.13) Echantillon
1 ml
1 ml
1 ml
dilutions
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml ensemencement
incubation
dénombrement
50
myxobactéries (fig. 14)
spirochètes (fig. 15)
eubactérie (fig.16)
cyanobactéries (fig. 17)
