COMPLEMENTO C3 Y C4 Introducción Objetivos General Específicos Marco teórico Definición. Es un sistema complejo de alrededor de 30 proteínas plasmáticas o tisulares presentes en el suero y en la superficie de numerosas células, que por su mecanismo de acción pertenece a los sistemas enzimáticos cuya activación se produce en forma de cascada, es el principal mecanismo efector de la inmunidad humoral y tiene un gran poder inflamatorio; su papel en la patogénesis es de gran relevancia en la Inmunología clínica. clíni ca. Importancia Opsonización: (Recubrir los patógenos para promover o mejorar la fagocitosis). Atracción de fagocitos y activación Lisis de bacterias y células c élulas infectadas Regulación de la respuesta de anticuerpos Favorece a la eliminación de complejos inmunes y de productos de la l a inflamación. Ofrece protección contra la infección por bacterias piógenas, las cuales causan pus, entre ellos se encuentran los estreptococos y estafilococos. Eliminación de células apoptóticas Funciones
Desventajas La activación del sistema de complemento puede causar Inflamación, lo cual es de mucha importancia para la Inmunología clínica.
Anafilaxis, por la liberación de la histamina Acumulación de las proteínas del C. Cambios en el medio y la carga de la membrana Modificación de las propiedades y func. Estimulación de la función celular Lesiones e hinchazón de la membrana Daño o desintegración de la membrana Vías de activación Indicadores de la activación. Deficiencias • C1q, C1r, C1s, C4, C2: LES, lupus discoide, vasculitis GN. • C3: Infecciones piógenas recurrentes. • C5, C6, C7, C8 : Infecciones diseminadas por Neisseria. • Inh. C1: Angioedema hereditario.
Mecanismos De Regulación Del Complemento Dado el potencial lesivo del sistema del complemento, éste se encuentra estrechamente regulado por diversos mecanismos y moléculas, cuyo objeto es evitar la lisis de las células autólogas. El mecanismo más simple de regulación es la baja concentración y labilidad de muchos de sus factores. No obstante los factores que actúan en la regulación del complemento ejercen su acción en distintos puntos tanto en la vía clásica como en la alternativa o lítica, centrándose fundamentalmente en la activación de C3.
Inhibición de C1 El inhibidor de la C1 esterasa (C1inh) inhibe la formación de C3b convertasa de la vía clásica por su capacidad de unión a los fragmentos C1r y C1s. En los casos de deficiencia en C1inh (edema angioneurótico hereditario), el C1 activado degrada elevadas cantidades de C2 produciendo un acumulo de C2b. Este factor es degradado anormalmente por plasmina lo que da lugar a C2-Kinina que es un potente vasodilatador y aumenta la permeabilidad vascular produciendo los edemas característicos del cuadro. Inhibición de C4 • El factor C4BP (C4-binding protein) tiene la capacidad de captar C4b facilitando su
disociación del complejo C4b2a e inhibiendo, por tanto, la actividad de convertasa de C3. • El factor I (FI) es una esterasa de tipo serina que circula en forma activada. El C4b
disociado es susceptible de ser atacado por el factor I y ser degradado en C4c y C4d. • Los receptores de membrana DAF (factor acelerador de la degradación) y la MPC
(cofactor proteínico de membrana) se encuentran ampliamente distribuidos en células inmunes y no inmunes. Tienen la capacidad de inhibir la unión, facilitar la disociación de C4b y C2a (DAF) o favorecer que el factor C4b pueda ser degradado por el FI (MCP). Estos receptores son de gran importancia en los mecanismos de prevención de lisis de las células autólogas. Inhibición de C3
La regulación de C3, al ser éste el factor central en la activación del complemento, es probablemente el mecanismo de regulación más importante. El factor H (FH) es una proteína plasmática homóloga a la C4BP que tiene la capacidad de unir C3b en la fase fluida. El Factor I ataca entonces C3b liberando una pequeña fracción C3f y convirtiéndolo en iC3b. Por otra parte FH también promueve la disociación del complejo C3bBb. Un defecto en este tipo de regulación acontece en un tipo de glomerulonefritis (membranosa tipo II), en la que aparecen autoanticuerpos (factores nefríticos) que se une al complejo C3bBb, estabilizándolo y haciéndolo resistente a la acción de FH. Los receptores de membrana CR1, DAF y MCP actúan sobre el C3b de forma semejante a su actuación sobre C4b: inhiben la unión o facilitan la disociación C3bBb (CR1, DAF) o actúan como cofactores del factor I en la degradación de C3b unido a la membrana (CR1, MCP). En este caso C3b también se degrada a iC3b, sobre el que el factor I puede seguir ejerciendo su actividad catalítica originando las fracciones C3c y C3dg. Todos estos mecanismos inhiben la capacidad de C3b de formar convertasa de C5, así como de que C3b medie la adherencia celular. Sin embargo iC3b sí mantiene la capacidad de adherencia a células fagocíticas por los receptores de estas células para iC3b (CR1, CR3 y CR4) (Tabla 13.2). Inhibición del MAC • La proteína S (vitronectina) es una glucoproteína plasmática con capacidad para unirse
al complejo C5b67 impidiendo que éste se una a la membrana celular. • CD59 es una proteína ampliamente distribuida en las membranas celulares que inhibe la
inserción de C9 en el complejo C5b-8. • El factor de restricción homóloga (Homologous Restriction Factor, HRF) también está
ampliamente distribuido en la membrana de las distintas células y presenta una función equivalente al CD59. • La capacidad de MAC de lisar las células puede ser modulada también por una proteína
circulante llamada SP-40,40, esta es un heterodímero que ha sido aislado de complejos solubles C5-9. Podría ser un componente normal de MAC cuyo efecto principal sería controlar la capacidad de MAC de lisar las células. El mecanismo de acción de SP-40,40 es desconocido. De los factores reguladores estudiados DAF (Facilita la disociación de C4b y 2a), HRF (Inhibe la inserción de C5b-8 y la polimerización de C9) y CD59 (Inhibe la inserción de C5b-
8 y la polimerización de C9), se piensa que actúan exclusivamente en la inhibición de la lisis de las células del propio organismo donde asienta. Estas proteínas de membrana se detectan fundamentalmente en eritrocitos y células endoteliales que son las células que se encuentran en mayor peligro de autolisis por el complemento. Kit del complemento REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT Los reactivos deben ser almacenados a 2°-8°C. Durante su almacenamiento, en el antisuero pueden aparecer sedimentos o turbiedad que no son debidos a contaminación microbiana y que no influyen sobre su actividad. En estos casos será necesario filtrar el antisuero antes de usarse. Para este fin, la opción más recomendable consiste en el uso de filtros desechables con tamaño de poro de 0.45 μm.
La fecha de caducidad es imprimida en la etiqueta del envase y se refiere al componente cerrado y almacenado a 2°-8°C.
A/S Antisuero: 1 vial (5 mL) de antisuero policlonal desarrollado en cabra, contra los factores de complemento humano C3c y C4 altamente purificados. Conservante: NaN3 (<0.1%). Listo para usarse. Después de cada utilización, almacenar el reactivo herméticamente cerrado a 2°-8°C por 4 semanas. No congelar. Los títulos de anticuerpos (T), nos indican la cantidad en mg de antígeno precipitado en gel de agarosa por 1 mL de antisuero. Estos niveles se determinan mediante inmunodifusión radial y están indicados en la etiqueta del vial. M293.es – Rev.7 – 11/2008 NPP4-NPP5 – C3c-C4 M293.es – Rev.7 – 11/2008 – Pag. 2/4
MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS El antisuero debe ser utilizado con los siguientes reactivos: • Calibrador Proteínas S, (Ref. NCPP1) • Control Proteínas S/L, (Ref. NCPP2L) • Control Proteínas S/M, (Ref. NCPP2M)
• Control Proteínas S/H, (Ref. NCPP2H) • Diluyente, (Ref. NDPP1) • Tampón de Reacción, (Ref. NDPP2) • Nefelómetro Delta (Ref. 010138) • Materiales desechables y muestras como descrito en el Manual de Uso para el
Nefelómetro Delta. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para obtener resultados correctos y reproducibles, ajustarse a las siguientes disposiciones: -
No usar los reactivos después de su fecha de caducidad. Evite que se produzca cualquier contaminación entre muestras y reactivos; para ello, deberán utilizarse puntas desechables para cada muestra y reactivo. Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo. Evite salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, lave cuidadosamente con una solución de hipoclorito de sodio al 3%. Todo este material de limpieza debe manejarse como potencialmente infeccioso y desecharse correspondientemente.
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Los reactivos para los cuales no se proporciona una ficha de seguridad, no contienen sustancias químicas peligrosas o, si las contienen, éstas están por debajo de los límites de concentración establecidos en el Decreto Italiano D.Lgs.285/98, de conformidad con la directiva 91/155 de la CEE. −
De acuerdo con el decreto Italiano D.L. no. 22, de fecha 05.02.97, de conformidad con las directivas de la CEE (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), todos los productos de desecho que se originen tanto a partir de los procedimientos manuales como de los automáticos están clasificados como material de desecho peligroso especial (clasificación europea código 180103). Como tales, deben entregarse a empresas especiales, calificadas para recoger y disponer de este tipo de desechos.
TOMA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Las muestras se realizan en suero humano. Los sueros tendrán que haber coagulado completamente y, después de haber sido centrifugados, deberán estar libres de partículas o trazas de fibrina en suspensión. Asegurarse de que las muestras estén perfectamente límpidas antes de ensayarlas. Por lo tanto las muestras extremadamente lipémicas o los sueros congelados que aparezcan turbios después del descongelamiento deben ser clarificados por centrifugación (10 minutos a aprox. 15000 g). Las muestras pueden conservarse a 2-8°C durante 8 días; para períodos más largos (1 año) se recomienda conservar las muestras a -20°C. Evitar repetidos ciclos de congelamientodescongelamiento de las muestras. Hay que tener en cuenta que la molécula de C3 puede fragmentarse, según el grado de envejecimiento y de conservación de las muestras examinadas, con producción del componente C3c. Siendo el antisuero dirigido contra el fragmento C3c, será posible observar resultados más bajos en los sueros frescos. Durante la conservación de las muestras, la escisión de C4 en C4c se verifica de manera mucho más lenta, en comparación con el componente C3. En este caso será posible observar valores aumentados de C4 después de un largo periodo de conservación. NPP4-NPP5 – C3c-C4 M293.es – Rev.7 – 11/2008 – Pag. 3/4 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Todos los pasos están realizados automáticamente por el equipo. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente (15°-25°C). Consultar el procedimiento del ensayo descrito en el Manual de Uso para el Nefelómetro Delta, que preveen la disposición de lo siguiente: −
Curva de calibración: preparada automáticamente por el equipo por medio de diluciones seriales del Calibrador (NCPP1) con su respectivo Diluyente (Ref. NDPP1). Estas diluciones se utilizarán para la calibración, que queda válida siempre y cuando los controles ensayados se mantengan dentro de los límites estimados. La calibración debe repetirse necesariamente cada vez que se use un nuevo lote de antisuero. −
Muestras: Antes de ser ensayados, los sueros serán diluidos automáticamente por el equipo en relación 1:20 para el ensayo de los factores de complemento humano C3c y C4
con el respectivo Diluyente (Ref. NDPP1). Si los valores resultaran fuera del margen de medición se recomienda repetir el ensayo utilizando una dilución mayor o más baja. −
Control de calidad interno: Para cada serie de muestras y cada vez que se use un nuevo vial de antisuero, es necesario aplicar un control de exactitud y precisión mediante los Controles para Proteínas S/L (Ref. NCPP2L), S/M (Ref. NCPP2M) y S/H (Ref. NCPP2H). Los controles se tratan como las muestras analizadas. Para los límites esperados, referirse a la relativa tabla suministrada con el envase de los controles mismos. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS La evaluación de las muestras se realiza automáticamente, por medio de la elaboración de los resultados con una función logit-log. VALORES NORMALES Los siguientes valores de C3 y C4 tan sólo son orientativos. Es aconsejable que cada laboratorio defina un rango de referencia propio. Proteína suero C3 0,9 - 1,8 g/L C4 0,1 - 0,4 g/L FUNCIONAMIENTO DEL ENSAYO ESPECIFICIDAD El antisuero utilizado resulta ser específico para la determinación de los factores de complemento humano C3c o C4. SENSIBILIDAD La sensibilidad del ensayo queda definida como el límite inferior de la curva de calibración y por eso depende de la concentración de las proteínas en el calibrador. Los rangos de medición están detallados en el Manual de Uso para el Nefelómetro Delta.
PRECISIÓN La precisión fue evaluada midiendo la variabilidad intraensayo e interensayo. Intraensayo Interensayo Proteína n° repl. Valor medio [g/L] CV % n° repl. Valor medio [g/L] CV % C3c 15 1.41 2.5 16 1.53 4.2 C4 15 0.36 1.3 15 0.35
4.1 CORRELACIÓN ENTRE MÉTODOS Las muestras de suero fueron examinadas con antisuero Radim contra los factores de complemento humano C3c(y) o C4 (y). Tales resultados fueron comparados con un sistema nefelométrico de referencia (x). La correlación de resultados se resume en la siguiente tabla: Proteína Regresión lineal Índice de correlación n° sueros C3c y = 0.77 x + 0.30 0.96 77 C4 y = 0.988 x + 0.02 0.97 36 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La presencia de turbiedad o partículas puede interferir con el procedimiento del ensayo. Por eso se recomienda remover por centrifugación eventuales partículas debidas a sueros no completamente coagulados o por desnaturalización de proteínas. Por causas técnicas relacionadas con la producción y/o el envejecimiento de las muestras, los resultados obtenidos con los sueros de control y con los sueros empleados para el control de calidad interlaboratorios pueden variar en función del método utilizado. Por lo tanto, podría ser necesario evaluar los resultados refiriéndose a valores específicos para cada método empleado.
