Resultados A.
B. Espectro de absorción de la clorofila
1. Estado in vivo 0.07 0.06 0.05 a i c n a b r o s b A
0.04 Estado in vivo
0.03 0.02 0.01 0 400
450
500
550
600
650
700
Longitud de onda (nm)
Gráfico N°1: Medición de absorbancia entre 400 nm y 700 nm de una preparación de 1 ul de cloroplatos diluido a 1 ml con buffer de sacarosa. Se observan dos peaks significativos en las longitudes de onda 430 y 670 correspondientes a las tonalidades azul y rojo del espectro de luz visible, respectivamente.
2. Estado puro 0.8 0.7 0.6 a i 0.5 c n a b 0.4 r o s b 0.3 A
Estado puro
0.2 0.1 0 400
450
500
550
600
650
700
Longitud de onda (nm)
Gráfico N°2: Medición de absorbancia entre 400 nm y 700 nm de una preparación de 10 ul de cloroplatos diluido a 1 ml de acetona 80%. Se observan dos peaks significativos en las longitudes de onda 430 y 670 correspondientes a las tonalidades azul y rojo del espectro de luz visible, respectivamente.
Discusión El espectro de absorción de la clorofila, debiese tener dos peaks bastante notorios entre las longitudes de onda 400-500 nm (azul) y 600-700 nm (rojo). Esto indica que la luz visible correspondiente a las longitudes de onda entre 600-700 nm (verde), es reflejada por estos pigmentos, de ahí el color que los humanos logran percibir. Los peaks observados en las gráficas, fueron obtenidos a las longitudes de onda esperadas para la clorofila y las dos tenían su menor absorción entre los 600 -700 nm. La absorbancia obtenida para la clorofila in vivo fue mucho más similar al espectro de acción de la fotosíntesis que el obtenido para la clorofila pura. Esto puede deberse a que la clorofila convierte la energía lumínica en energía química solamente cuando ésta se encuentra asociada con ciertas proteínas e incluida en una membrana especializada. En cambio la clorofila pura, no se encontraba asociada a estas proteínas específicas, por lo tanto, su espectro aunque parecido, no lo fue tanto como el espectro de la clorofila in vivo. Otro detalle muy importante es el factor de dilución de las preparaciones de clorofila, el estado in vivo se encontraba mucho más diluido que el estado puro, además del medio en que fueron
preparadas no fue el mismo, buffer de sacarosa y acetona 80% respectivamente.
Metodología 1) 2) Extracción de cloroplastos
Se tomó hojas de espinaca, (unos 5 g de tejido que fueron pesados en la balanza), evitando la vena principal, ya que no contiene gran cantidad de c loroplastos. Se agregó 15 mL de buffer de sacarosa pre-enfriado, se molió con el mortero y luego se filtró el homogenizado en un vaso precipitado con ayuda de un trozo de gasa. Se dividió la suspensión en 2 tubos de 15 ml e n volumenes iguales. Se centrifugó a 3000 rpm 3 min, desechancho el sobrenadante, (se conservó el pellet que contiene a los cloroplastos), y se agregó 300 µl de buffer de sacarosa al pellet. Se resuspendió el pellet con suavidad para no romper los cloroplastos, y se agregó buffer hasta un volumen total de 1 mL. A. Estimación de clorofila
Se tomó 50 µl de la preparación, se completó el volumen de 5 mL con acetona al 80% en un tubo de 15 mL . Se centrifugó a 3000 rpm durante 2 minutos. Se restableció el blanco del espectrofotómetro, (0 abs), con 1 mL de acetona 80%, (como blanco). Se midió absorbancia a 652 nm inicialmente de la preparación de cloroplastos en acetona, (1 ml) y se realizó el siguiente cálculo: mg clorofila = 2.9 x A652 mL Se ajustó la preparación de 1 mL de cloroplastos en buffer a una concentración final de 0.5 mg/ mL. B. Espectro de absorción de la clorofila
Para el estado in vivo, (proteína unida a la clorofila) se tomó 1 ul de cloroplasto y se diluyó a 1 mL con buffer de sacarosa en un tubo de plástico. Se calibró el espectrofotómetro con un blanco, (buffer de sacarosa) y se llevó a cero. Luego se puso la cubeta con los cloroplastos en el espectrofotómetro, se fue midiendo aumentando la longitud de onda 30 nm hasta llegar a 70 0 nm. Se anotó los datos y se procedió a graficar. Para el estado puro, se diluyó 10 ul de cloroplastos en 1 mL de acetona 80% en un tubo de plástico. Se realizó en el espectrofotómetro lo descrito en el experimento anterior, sólo que se usó acetona 80% como blanco. Se anotó los datos y se graficó.
Introducción Los cloroplastos son organelos presentes en células vegetales, con forma de disco cuyo tamaño varía entre 4 y 6 micrómetros de diámetro. Aparecen en mayor cantidad en las células de las hojas, las que se orientan buscando la luz. En una célula puede haber entre 40 y 50 cloroplastos, y en cada milímetro cuadrado de la superficie de la hoja hay 500.000 cloroplastos. Cada cloroplasto está recubierto por una membrana doble: la membrana externa y la membrana interna. En su interior, el cloroplasto
(1)
contiene un líquido denominada estroma, la cual está
atravesada por una red compleja de discos conectados entre sí, llamados tilacoides, que se ordenan en pilas denominadas granas. En los tilacoides se encuentra la clorofila, que captura la energía luminosa, convirtiéndola principalmente en energía (ATP) mediante una serie de reacciones químicas que tienen lugar en los grana. Los cloroplastos también contienen gránulos pequeños de almidón donde se almacenan los productos de la fotosíntesis de forma temporal.
Referencias (1) McFadden, Geoffrey I (January 2001). "Chloroplast Origin and Integration". Plant Physiology Pag.125. 27 january 2013.
