Încadrarea în clasa de compuşi şi structura clorofilei [1] Clorofila, hidrocarbura aromatică policiclică cu nuclee condensate, este un pigment specific vegetalelor verzi, care îndeplineşte un rol esenţial în fotosinteză. Are structura semănătoare hemului, dar conţine magneziu în loc de fier. Clorofila prezintă patru nuclee pirolice (I, II, III, IV) unite în centru printr-un ion de magneziu, prin 2 valenţe şi prin 2 legături fizice. Toate acestea formează împreună un nucleu porfirinic. În macromoleculă apare şi un homociclu pentanonic acid (V). Cu cifre arabe, de la 1 la 8, se notează, în sensul acelor de ceasornic, punctele externe ale celor 4 inele pirolice.
Structura generală a clorofilei Nucleul porfirinic împreună cu homociclul pentanonic formează doar o parte a clorofilei, care poartă numele acid clorofilinic sau clorofilină. În punctul 7, de fapt, clorofila se continuă printr-o prelungire moleculară monocatenară numită fitol. Fitolul este monoalcoolul unei hidrocarburi superioare.
Componentele structurale (acidul clorofilinic şi fitolul)
Ca şi în cazul hemului, clorofila nu se află liberă, ci se combină cu o proteină numită plastina, împreună cu care realizează cloroplastina, un compus asemănător ca structură cu hemoglobina.
Structura clorofilei a
Structura clorofilei c1
Structura clorofilei b
Structura clorofilei c2
Structura clorofilei d
Tabel 1. Structura chimică a clorofilei [2] Clorofila a
Clorofila b
Clorofila c1
Clorofila c2
Clorofila d
Clorofila f
Formula moleculară
C55H72O5N4M C55H70O6N4Mg C35H30O5N4Mg g
C35H28O5N4Mg
C54H70O6N4Mg
C55H70O6N4Mg
Radicalul C2
-CH3
-CH3
-CH3
-CH3
-CH3
-CHO
Radicalul C3
-CH=CH2
-CH=CH2
-CH=CH2
-CH=CH2
-CHO
-CH=CH2
Radicalul C7
-CH3
-CHO
-CH3
-CH3
-CH3
-CH3
Radicalul C8
-CH2CH3
-CH2CH3
-CH2CH3
-CH=CH2
-CH2CH3
-CH2CH3
Radicalul C17
-CH2CH2COOCH2CH2COO -CH=CHCOOH Phytyl -Phytyl
-CH=CHCOOH
-CH2CH2COOPhytyl
-CH2CH2COOPhytyl
Legătura C17C18
SImplă
Simplă
Dublă
Dublă
Simplă
Simplă
Răspândire
Universal
Majoritatea plantelor
Diferite specii de Diferite specii de Cianobacterii alge alge
Cianobacterii
Surse de clorofilă Clorofila se găseşte în toate plantele verzi, de exemplu în plantele cu frunze verzi care se găsesc în grădină (salată, pătrunjel, broccoli etc.), în alge şi în numeroase alte plante verzi ( lucernă, urzică etc.). Concentraţiile tipice ale clorofilei sunt cuprinse îmtre 0,1 şi 0.3% din greutatea proaspătă a frunzelor. [3] Tabel 2.Distribuţia clorofilelor la diverse organisme [3] Grupul Alge: Cyanophyta Rhodophita Pyrrophyta Baxxillariophyta Phaeophyta Chrysophyta Xanthophyta Euglenophyta Chlorophyta Cryptophyta Plante vasculare Briofite
clorofila a b + + + + + + + + + + + +
c
d
± + + + ± + + + + +
Rolul clorofilei în fotosinteză Clorofila este una dintre substanţele fundamentale ale Terrei, prezenţa sa în celulele plantelor şi algelor, la nivelul cloroplastelor energetică şi respiratorie aproape tuturor celorlalte organisme de pe Terra. Graţie clorofilei, plantele verzi sunt organisme autotrofe, iar fotosinteza este cel mai important proces biochimic de pe Pământ. Orice organism de pe Terra (cu excepţia unor bacterii chemosintetizante) care nu este capabil să-şi producă singur substanţe organice din substanţe minerale, trăieşte, direct sau indirect din sintezele clorofilei, deci pe seama ei. Practic, viaţa tuturor animalelor şi oamenilor atârnă de această moleculă. Fotosinteza reprezintă procesul de utilizare a energiei solare pentru activarea reacţiei chimice între dioxid de carbon şi hidrogenul din componenţa apei, pentru sinteza compuşilor organici şi eliberarea oxigenului.
Utilizările clorofilei în tratarea bolilor [4] Clorofila prezintă efecte şi asupra organismului uman. Extern, acţionează ca dezodorizant, dezinfectant şi tonic cutanat iar intern, stimulează respiraţia, ajută la epurarea reziduurilor şi contribuie la combaterea anemiei. 1. Anemia Băuturile bogate în clorofilă reprezintă unul dintre cele mai bune stimulente pentru refacerea globulelor roşii. Datorită compoziţiei foarte asemănătoare cu aceea a hemoglobinei, precum şi prin faptul că aceste băuturi se absorb cu extrem de mare uşurinţă în organism, un tratament de 1-2 luni cu “elixir verde” poate modifica radical în bine starea celor care suferă de anemie. Se mai recomandă consumul de frunze de ţelină, curele cu verdeţuri de 2-3 săptămâni, băutura din mlădiţe de grâu sau ovăz, frunzele de pătrunjel şi salată consumate ca atare sau sub formă de macerat. 2. Intoxicaţiile lente datorate alimentaţiei greşite, colita de putrefacţie Mâncarea gătită, precum şi alimentele “moderne” (conservate, cu conservanţi sau coloranţi sintetici) se descompun (mai plastic spus “se strică”) în intestin mai repede decât vegetalele naturale. În intestin, carnea putrezeşte şi se degradează mai repede decât orice alt aliment. Pentru cei mai mulţi dintre oameni, după câteva zeci de ani de viaţă colonul este deja mult încărcat cu sedimente ce nu pot fi eliminate, constituind o continuă sursă de toxicitate a corpului. Verdeţurile, germenii, legumele şi fructele proaspete, precum şi “băuturile verzi”, care sunt adevărate concentrate de clorofilă, prin acţiunea lor drenoare şi prin efectele antiseptice şi antiputride stopează şi elimină problemele generate de o astfel de alimentaţie. 3. Afecţiunile ficatului (hepatita cronică şi acută, ciroza hepatică) Se recomandă extractele lichide (realizate prin metoda prezentată mai sus) din urzică şi păpădie. Conţinutul în fier şi potasiu al acestora, precum şi valenţele lor regenerante vor
determina efecte notabile în cazurile unor sechele post-hepatice. Alte plante bogate în clorofilă indicate în aceste boli sunt: brusturele, sparanghelul, frunzele de ţelină. 4. Mirosurile corporale neplăcute Sunt eliminate cu rapiditate prin programul rapid de purificare a organismului. Dintre cele mai eficiente surse de clorofilă sunt mlădiţele proaspete de cereale, în special cele de grâu şi ovăz. Acestea se recoltează atunci când au dimensiunea de 10-15 cm şi se prepară în modul prezentat mai sus. 5. Tulburările de ciclu menstrual, eczeme care apar pe fondul dezechilibrelor endocrine, acneea în toate formele În special ciclul menstrual lung şi dureros, hemoragiile uterine şi tulburările gonadelor şi cortico-suprarenalelor care au tendinţa de a reveni şi de a rezista tratamentelor clasice, pot fi mult ameliorate prin consumarea zilnică a unei cantităţi de 1-1,5 litri de macerat vegetal proaspăt timp de minim 3 săptămâni. Ca o alternativă, se recomandă realizarea unei cure pe bază de sucuri şi crudităţi, cură ce trebuie să dureze o perioadă de minim 2-3 luni de zile. 6. Gastrita, ulcerul gastric şi alte afecţiuni ale stomacului Studii recente realizate în Germania pe zeci de pacienţi suferinzi de ulcer gastric au evidenţiat faptul că extractele cu clorofilă pot accelera foarte mult procesul de regenerare şi însănătoşire. Diminuarea considerabilă a durerilor s-a produs într-un interval cuprins între 24 şi 72 de ore de la administrarea extractelor, iar la 78% dintre pacienţii ce au participat la experiment, ulcerele s-au vindecat complet într-o perioadă cuprinsă între 2 şi 7 săptămâni de la începerea tratamentului intensiv. 7. Rănile şi infecţiile cu vindecare dificilă Încă din anii ’50, numeroase laboratoare testau capacitatea clorofilei de a distruge prompt germenii nedoriţi, constatând că bacteriile nu pot supravieţui în contact cu clorofila. Sa remarcat că folosirea extractelor cu clorofilă, inclusiv în uz extern conduce la reducerea durerii, diminuarea inflamaţiilor şi eliminarea mirosurilor neplăcute cauzate de unele infecţii (mai ales cele dentare). Cercetările în această direcţie au evidenţiat efecte notabile în ameliorarea infecţiilor vaginale, rectale, în tratarea sinuzitelor cronice şi acute şi chiar în infecţiile unor ţesuturi din vecinătatea inimii. “Băuturile verzi”, chiar dacă nu sunt recomandate ca remediu unic, pot ajuta la refacerea mai rapidă a ţesuturilor şi pot accelera mult vindecarea lor. Rezultate notabile au fost obţinute cu frunzele proaspete de pătrunjel, ţelină, varză de Bruxelles, sucul de orz verde (preparat din plantă atunci când aceasta atinge înălţimea de 20-30 de cm). În 1980, dr. Chiu Nan Lai, de la Universitatea din Texas menţiona într-un raport faptul că atât clorofila, cât şi alţi nutrienţi care se găsesc în alimentele verzi reprezintă veritabile bariere de protecţie împotriva chimicalelor toxice şi radiaţiilor. El a constatat că extractele realizate din mlădiţe de grâu şi alte vegetale de culoare verde, stopează efectele mutagene şi generatoare de cancer ale mai multor substanţe chimice recunoscute ca fiind carcinogene. În plus, cercetări mai recente realizate în mai multe laboratoare din lume au evidenţiat faptul că vegetalele verzi (proaspete) şi extractele naturale bogate în clorofilă reprezintă adevăraţi
agenţi anti-oxidanţi care diminuează într-o măsură considerabilă efectele agresiunilor produse asupra organismului de către poluare, fumul de ţigară, alimente prăjite excesiv, etc. A. Extracţia şi determinarea clorofilei [5] În funcţie de cantitatea de ţesuturi din plantă care necesită a fi extrase, se poate alege extracţia "macro" (> 150 mg greutate în stare proaspătă) sau "micro" (diametru disc frunze de ± 1.0 cm). Extracţia macro Funzele se taie în bucăţi pentru a obţine un eşantion reprezentativ şi pentru a determina greutatea (± 150 mg) şi zona (± 8 cm2) cât mai rapid posibil, apoi se pun într-un mojar ce în prealabil a fost pus în gheaţă. Se adaugă în mojar nisip de cuartz, câţiva ml de acetonă 80% şi metanol (nu mai mult de 10 ml), care au fost răcite înainte în frigider sau în gheaţă. Acestea se pisează până la formarea unei suspensii omogene. Suspensia se pune întrun tub de centrifugare mare unde se centrifughează timp de aproximativ 5 minute la viteza maximă (4500 rpm - 2649 g) pentru ca apoi produsul să fie decantat într-un balon cotat de 25 ml. Produsul se extrage cu 5 ml acetonă 80% şi metanol şi se centrifughează din nou la 3000 rpm (1250g), timp de 5 minute. Procedeul se repetă până când culoarea verde al extractului dispare (nu trebuie să se adauge mai mult de 25 ml acetonă şi metanol, altfel balonul cotat este prea mic). Probele se pregătesc şi se lasă să se incălzească uşor după ce au fost scoase din gheaţă, se păstrează la întuneric. Supranantul se pune în balonul cotat şi se aduce la semnul de 25 ml folosind acetonă 80% şi metanol. Extractul de clorofilă este pregătit pentru a fi măsurat în spectrofotometru. Extracţia micro Se calculează zona exactă a frunzei ce urmează a fi tăiată pentru realizarea experimentului şi se decuperază cu atenţie in forma de cerc ( aria cercului= ∏r2). Într-un mojar se pune materialul peste care se adaugă mai puţin de 5 ml de acetonă 80% şi metanol şi se mojarează folosind pistilul până se formează o suspensie omogenă. Aceasta se pune într-un tub de centrifugare cu mai puţin de 10 ml de acetonă 80% şi metanol. Se centrifughează aproximativ 5 minute (4500 rpm – 2649 g) şi se decantează supranatantul într-un balon cotat de 10 ml. Supranantul se aduce la semnul de 10 ml cu acetonă 80% şi metanol. Balonul se pune într-o cutie specială impenetrabilă de lumină. Extractul de clorofilă este pregătit pentru a fi măsurat în spectrofotometru. Determinarea absorbţiei de acetonă 80% a extractului Absorbţia extractului se măsoară cu un spectrofotometru la lungimile de undă 663, 646 şi 710 nm. Absorbţia 0 se determină la fiecare lungime de undă. Lungimea de unde de 710 nm este folosită pentru a determina posibila absorbţie a compuşilor care ar putea interveni în măsurarea clorofilei. Pentru a afla conţinutul total de clorofilă din probă este suficientă absorbţia la 652 nm.
Determinarea absorbţiei de metanol a extractului Absorbţia extractului se măsoară cu spectrofotomentru prin luarea spectrului între undele de frecvenţă 750 nm şi 640 nm. După ce se ia spectrul unui eşantion se află maxima pentru clorofila a prin setarea spectrofotometrului, acesta fiind aproximativ 665.2 nm. Pentru a calcula lungimea de undă necesară aflări clorofilei b se scade din ultima lungime de undă citită 13.2 nm. Se utilizează din nou opţiunile din meniu pentru a ajunge la punctul pentru a se calcula absorbţia. Calcule Extract cu acetonă 80% Concentraţia în extract (mg l -1) [Chl a ] = 12.21 * (A 663 - A 710 ) - 2.81 * (A 646 - A 710 ) [Chl b ] = 20.13 * (A 646 - A 710 ) - 5.03 * (A 663 - A 710 ) [Chl a+b ] = 7.18 * (A 663 - A 710 ) + 17.32 * (A 646 - A 710 ) sau [Chl a+b ] = 27.80 * (A 652 - A 710 ) Concentraţia în frunze: [Frunze] = ((C * extras Vol extract) / DW frunze)
Extractul cu metanol Concentraţia în extract (μmol l -1 ) Chl a = 18.22 * A peak Chla - 9.55 * A peak Chla - 13.2nm Chl b = 33.78 * A peak Chla - 13.2 nm - 14.96 * A peak Chla Chl a+b = 24.23 * A peak Chla + 13.2nm + 3.26 * A peak Chla Concentraţia în extract (mg l -1 ) Chl a = 16.29 * A peak Chla - 8.54 * A peak Chla - 13.2nm Chl b = 30.66 * A peak Chla - 13.2 nm - 13.58 * A peak Chla Chl a+b = 22.12 * A peak Chla - 13.2 nm - 2.71 * A peak Chla
B. Extracţia şi purificarea clorofilei a din Spirulina maxima [6] Procedura de extracţie Într-un balon Erlenmeyer de 250 ml se adaugă 5 g de Spirulina maxima, apoi se amestecă cu atenţie cu 50 ml de CH2Cl2 la temperatura camerei. Suspensia se agită timp de 20
min apoi se filtrează prin hârtie de filtru dublă păstrând filtratul. Reziduurile solide se mai supun de 3 ori aceleaşi operaţii cu CH2Cl2 şi se combină cu primul filtrat. Produsul obţinut se pune în evaporatorul rotativ şi se concentrează până la un volum final de aproximativ 5 ml. În acest caz pe lângă clorofilă mai sunt extraşi şi alţi pigmenţi, cum ar fii β-caroten şi xantofile. Pentru comparaţia cu următorii produşi ce urmează să fie purificaţi în continuare se face o analiză UV a extractului, diluând o picătură de extract în 4 ml de CH2Cl2 (Figura 1).
Figura 1. Spectrele de absorbţie ale pigmenţilor din cloroplaste în diferite radiaţii ale luminii [7] Purificarea extractului şi analiza produsului Purificarea extractului se realizează pe o coloană de gel de siliciu (200-400 ochiuri, diametru de 2 cm, înăltime de 15 cm) umplută cu toluen într-o capelă de epuizare. Prezenţa luminii în mediul în care se realizează cromatografia poate induce degradarea parţială a clorofilei a, cu toate acestea, timpul necesar procesului (4 h) este relativ scurt şi nu implică pierderi mari. Se recomandă a nu se utiliza nici un fel de iluminare internă a capelei de epuizare pe parcursul eluării. Eluarea se realizează cu acelaşi eluent pe coloană (toluen) pentru a elimina benzile galben şi portocaliu, beta-caroten şi xantofil, această etapă având nevoie de puţin mai mult de 150 ml de toluen. Apoi se eluează cu CH2Cl2 pentru a se obţine o fracţiune verde/albastru corespunzătoate clorofilei a. (Figura 2). Această fracţiune bogată în clorofila a (C55H72N4O5Mg) se caracterizează prin UV în CH2Cl2 (Figura 2, (nm): 413, 506, 539, 610 şi 668) prin diluarea a 1-2 picături din fracţiunea colectată în 4 ml CH2Cl2. În continuare toată fracţiunea este supusă concentrării prin eliminarea cu solvent sub presiune redusă, iar proba astfel obţinută este depozitată în întuneric pentru a preveni procesele de auto-oxidarea. De asemenea, se realizezează analiza prin spectrofotometrie în UV a fracţiunii eluate în toluen (bogate în caroten şi xantofite). Suprapunerea spectrelor în UV a extractului
brut, a carotenoizilor şi a clorofilei a este o bună modalitate de a indica compoziţia extractului.
Figura 2. Procesul de purificare al clorofilei a pentru cromatografia pe coloană [6] Aşa cum se poate observa în Figura 1 se poate observa ca profilul spectrului Uv=V al extractului este egal cu cel al clorofilei a izolate, arătând că marea parte a extractului este format din acest pigment. Se remarcă faptul că coeficienţii molari de absorbţie ai clorofilei şi a carotenoizilor sunt de acelaşi ordin de mărime (1 - 1.5 x 10 5 L mol -1 cm -1)6 , fapt ce confirmă că prezenţa de carotenoizi din compus este foarte mică, dar poate fi identificată în spectrul UV al extractului brut şi evidenţiază două date importante pentru identificarea clorofilei. Prima este prezenţa pe banda principală de absorbţie a unui derivat de tip porfirină/clorină, ce se găseşte de obicei între 400-420 nm. Al doilea aspect este faptul că banda principală este identificată la 668 nm, este relativ intensă, tipic derivaţilor de clorofilă (banda Q este mai intensă). Aceste două date se utilizează pentru caracterizarea acestui experiment. Randamentul final de clorofilă este de 1.0% (50 mg), având în vedere că masa de Spirulina maxima este de 5 g.
Clorofila a poate fi, de asemenea, stocată în forma sa liberă (fără Mg2+) care evită fotodegradarea. Pentru aceasta, clorofila se tratează cu 5 ml de soluţie de etanol (~1%) şi acid acetic timp de 2 ore. Solventul se evaporă sub presiune redusă, iar reziduul se diluează cu 50 ml de CH2Cl2 . Amestecul se extrage de două ori cu 50 ml de apă distilată folosind o pâlnie de decantare, după care se separă faza organică, se usucă folosind aproximativ 5 g de sulfat de sodiu anhidru, se fitrează iar solventul este îndepărtat sub presiune redusă (evaporator rotativ), obţinându-se un produs numit feofitină, care se recristalizează folosind 1 ml de metanol. Formula moleculară- C55H74N4O5 , caracteristicile spectrale ale UV (nm) sunt: 412 (bandă Soret), 507, 540, 610, 667. Prin implicarea proceselor de bază a extracţiei de produse naturale, a tehnicii de separare cromatografică şi de identificare a compuşilor heterociclici aromatici, ca pigmenţii de fotosinteză, această metodă este eficintă deoarece implică un cost redus iar rezultate finale sunt uşor de interpretat.
Note: 1.http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteClorofil a.html 2. http://en.wikipedia.org/wiki/Chlorophyll 3. N. Sălăgeanu, L. Atanasiu, 1981, Fotosinteza, Editura Academiei Republicii România, Bucureşti, pag. 72 4. http://liviugheorghe.wordpress.com/2010/07/30/remedii-pentru-viata-episodul-6/ 5. Lichtenthaler, HK & Wellburn, AA, 1983, Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, Biochem. Soc. Trans Ac. 603 : 591-592. 6. http://www.scielo.br/pdf/qn/v32n6/54.pdf 7. N. Sălăgeanu, L. Atanasiu, 1981, Fotosinteza, Editura Academiei Republicii România, Bucureşti, pag. 99
