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Guión de prácticas de citogenética Estudio del patrón de actividad NOR autosómica y del cromosoma X mediante impregnación argéntica INTRODUCCIÓN La especie de saltamontes Eyprepocnemis plorans (Orthoptera, Acrididae) fue descrita por primera vez por Charpentier en 1825. El tamaño del genoma es de 7900 x 10 6 pb aproximadamente. aproximadamente. Su complemento cromosómico es el típico de la familia Acridiae, es decir, está formado, en los machos, por 22 autosomas y un cromosoma X telocéntricos, que se clasifican en tres grupos según su tamaño: cromosomas largos, medianos y pequeños, siendo el X de tamaño intermedio entre los cromosomas largos y medianos. El sistema cromosómico de determinación del seco en esta especie es X0/XX, siendo los machos X0 y las hembras XX. Cada uno de los dos testículos de los machos de E. plor ans plor ans está formado por numerosos túbulos testiculares (también denominados folículos) en los que tiene lugar la espermatogénesis a lo largo de toda la fase adulta. Los folículos están organizados en cistos, que son grupos de células, incluyendo esper matogonias, esper matogonias, espermatocitos y espermátidas, que desarrollan la espermatogénesis o la espermiogénesis de forma sincronizada. En la parte apical de los folículos se encuentran las espermatogonias, que se multiplican por mitosis para dar lugar a numerosas espermatogonias, que entran en meiosis convirtiéndose en espermatocitos primarios. En la región basal de los folículos, los espermatozoides maduros se sitúan ordenadamente en paquetes espermáticos, que desembocan en los conductos deferentes. Hemos observado la presencia de nucléolos durante la meosis por medio de la técnica de impregnación argéntica En En los folículos testiculares de la especie Eyprepocnemis plorans plorans en fase de Leptotene, Cigotene, Paquitene, Diplotene y Diacinesis, es decir, hemos estudiado el patrón de actividad NOR autosómica y de cromosoma X. Los métodos de impregnación con nitrato plata para detectar las regiones organizadoras de los nucléolos en cromosomas metafásicos han sido muy usados, tanto como marcadores citogenéticos como para realizar estudios comparativos de la actividad NOR, dentro de cada especie y entre ellas. Las diferencias en el número de NOR por célula reflejan el número de NOR activos. Los NOR localizados mediante la técnica de impregnación con nitrato de plata representan las regiones cromosómicas que contienen múltiples copias de los genes de ADNr. En todas las especies estudiadas se encuentra, por lo menos, una pareja de cromosomas que contienen NOR, aunque puede haber más, de manera que debe existir un par de nucléolos por cada par cromosómico con actividad NOR. Sin embargo, los nucléolos tienden a fusionarse, y se puede apreciar un solo nucléolo por célula, independientemente de los pares de cromosomas con actividad NOR existentes. En Eyprepocnemis En Eyprepocnemis plorans las plorans las regiones organizadoras nucleolares se encuentran en los cromosomas 9, 10, 11 y X.
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OBJETIVOS En la presente práctica, hemos observado el número de nucléolos por célula, con el fin realizar varias determinaciones cuantitativas; 1) calcular la frecuencia media de actividad NOR del cromosoma X por célula, 2) la frecuencia media de actividad NOR autosómica por célula y 3) comparar los patrones de actividad NOR entre poblaciones. Se lleva a cabo el calculó de la media para cada variable, y los datos resultantes se utilizan para las comparaciones entre poblaciones de costa y montaña. Se realiza un análisis estadístico mediante un test de ! 2 contingencia, para determinar si existe independencia/relación entre dos variables categóricas.
MATERIAL El material utilizado para la realización de la práctica han sido preparaciones de folículos testiculares en fase de Leptotene, Cigotene, Paquitene, Diplotene y Diacinesis de saltamontes Eyprepocnemis plorans de poblaciones de costa (A) y montaña (B).
METODOLOGÍA En primer lugar para poner de manifiesto los nucléolos se utiliza la técnica impregnación argéntica desarrollada por Rufas et al. (1982):
de
1) Se prepara la solución donde se diluye el nitrato de plata, que está formada por 200 ml de agua destilada a la que se le añade una gota de ácido fórmico para bajar el pH a 3,0-3,5. 2) Para preparar la solución de nitrato de plata se añade, para una preparación, 0,1 g de nitrato de plata en 0,1 ml de la solución anterior. Esta solución se prepara en un tubo de 1,5 ml, recubierto con papel de aluminio para proteger la solución de la luz. La solución de plata debe ser agitada vigorosamente hasta asegurarse que los cristales de nitrato de plata están perfectamente disueltos. 3) En el lugar donde se encuentra el material en el portaobjetos, se añade una o dos gotas de la solución de plata y se coloca un cubreobjetos. Las preparaciones deben ser incubadas en cámara hú meda con agua destilada, a 60º C y en oscuridad, el tiempo que sean necesario. No hay un tiempo estipulado para que se lleve a cabo la tinción, y éste depende sustancia lmente del material. Las preparaciones estarán teñidas cuando adquieran un color amarillo -dorado. 4) Cuando tomen el color deseado se lavan con abundante agua de grifo, y después con agua destilada. Pueden visualizarse al microscopio para ver si están b ien teñidas y comprobar que se ven bien los nucléolos. En caso de que los nucléolos no se distingan, la preparación puede volver a teñirse de nuevo. 5) Finalmente las preparaciones se tiñen con Giemsa 5% (diluido en agua) durante menos de un minuto. 6) Una vez teñidas las preparaciones se montaron con DPX.
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Una vez realizada la técnica de impregnación, cada alumno disponía de una placa, y se lleva cabo el recuento de células, donde se podían distinguir diferentes tipos !"#$" & celulares:
X + + -
A + Presencia de actividad NOR en cromosoma X y autosomas (Imagen 1) Presencia de actividad NOR en cromosoma X (Imagen 2) + Presencia de actividad NOR en autosomas (Imagen 3) - No hay presencia de actividad NOR ni en cromosoma X ni en autosomas.
Imagen 1. Endofenotipo +/+
Imagen 2. Endofenotipo +/-
Imagen 3. Endofenotipo -/+
Tras el recuento que se realiza, se realiza la tabla de datos observados y se genera una tabla de datos esperados según la hipótesis de dependencia que ponemos a prueba en la práctica. Se determina si existe independencia/relación entre dos variables categóricas 2 mediante un test de ! de contingencia. (Apartado de resultados)
RESULTADOS Se realizó el recuento de células de cada preparación, cada alumno hizo su recuento. Los datos pertenecientes a las 20 células de mi placa fueron los siguientes: !"#$" '
Número de células
Tipos celulares
6 4 10
+-+ ++
A partir de estos datos, podemos calcular las diferentes variables para posteriormente llevar a cabo un análisis estadístico mediante un test de ! 2 contingencia.
En primer lugar calculamos la frecuencia media de la actividad NOR del X por célula. Como podemos observar en la tabla anterior (Tabla 2), el numero de células con actividad NOR del cromosoma X se corresponde con 16. Por lo tanto calculamos que la frecuencia media de la actividad NOR del X por célula es 16/20 = 0,8
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En segundo lugar calculamos la frecuencia media de actividad NOR autosómica por célula. Como podemos observar en la tabla anterior (Tabla 2), el numero de células con actividad NOR autosómica se corresponde con 4. Por lo tanto calculamos que la frecuencia media de la actividad NOR autosomica por célula es 14/20 = 0,7
Por último se realiza una tabla de datos observados para realizar la comparación de los patrones de actividad NOR entre poblaciones: Para la realización de esta tabla utilizamos los datos proporcionados por toda la clase. !"#$" (
Tipo de población Población A Población B
Tipos de células respecto a la actividad NOR ++ +-+ -Total 238 108 25 85 20 200 98 15 80 7 206 40 165 27 438
A partir de estos datos calculados, podemos obtener los datos esperados en cada casilla, se multiplican los totales parciales y se dividen por el Total.
POBLACION A Células ++ Células +Células -+ Células - -
(238x206)/438= 111,94 (238x40)/438= 21,83 (238X165)/438= 89,66 (238x27)/438= 14,67
POBLACION B Células ++ Células +Células -+ Células - -
(200x206)/438= 94,06 (200x40)/438= 18,26 (200x165)/438= 75,34 (200x27)/438= 12,33
Por lo tanto se realiza la tabla de datos esperados según la hipótesis de independencia que queremos poner a prueba.
Tipo de población Población A Población B
Tipos de células respecto a la actividad NOR ++ +-+ -Total 238 111,94 21,83 89,66 14,67 200 94,06 18,26 75,34 12,33 206 40 165 27 438
Una vez que tenemos todos los datos calculados, ya podemos realizar el cálculo 2 experimental el cual compararemos con una ! teórica como objetivo de la practica: !
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!! ! !! !
%
2
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2
2
Cálculo de ! experimental =
(108-111,94) /111,94 + (25-21,83)2/21,83 + 2 (85-89,63) /89,83 + (20-14,67)2/14,67 + (98-94,06)2/94,06 + 2 (15-18,26) /18,26 + (80-75,24)2/75,24 + 2 (7-12,33) /12,33 ! #$%&
Para comparar este valor de ! 2 experimental con el la ! 2 teórica, necesitamos conocer los grados de libertad que tenemos que aplicar, los cuales se calculan como (nº de filas-
1) x (nº de columnas-1)= 3 Sabiendo que el nivel de significación es de 0.05 y los grados de libertad, podemos determinar el valor de ! 2 teórica
Sabemos que: Si ! 2 experimental > ! 2 teórica: se rechaza la hipótesis de independencia Si ! 2 experimental < ! 2 teórica: se acepta la hipótesis de independencia Por lo tanto, concluimos que
2
!
experimental (6,12) <
2
!
teórica (7,8147), por lo que
se
acepta la hipótesis de independencia. DISCUSIÓN Los resultados obtenidos determinan que la técnica de impregnación argéntica ha permitido la observación de preparaciones de folículos testiculares de Eyprepocnemis plorans de poblaciones de costa y montaña, a partir de la cual hemos calculado que el valor de '( ) # *+,*-./*01(' (6,12) *2 /*03- 45* '( )# 1*6-.7( (7,8147), y por lo tanto hemos comprobado si existe independencia/relación entres las dos variables categóricas, determinando que las variables categóricas son independientes.
CONCLUSIONES 1. La técnica de impregación argentica es muy eficaz para detectar las regiones organizadoras de los nucléolos. 2. Las variables categóricas son independientes 3. Patrón de actividad NOR de la población de costa es independiente del patrón de actividad NOR de la población de montaña. 4. La población a la que pertenezca la preparación de folículos testiculares no influye en el patrón de la actividad NOR de sus células.
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