UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN CAMPO 1
“INGENIERÍA QUÍMICA” LABORATORIO DE CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS PROFESORA: Juana Cabrera Hernández GRUPO: 1601 B
INFORME “DESCOMPOSICIÓN DE UREA POR UREASA” UREASA ” EQUIPO Ángeles Bazán José Francisco Cervantes Rojo Blanca Areli Soto González Luis Enriqueº
Objetivos académicos
Investigar la cinética de descomposición de urea por ureasa Utilizar a la enzima ureasa extraída de soya Estudiar el mecanismo de reacción para reacciones biocatalíticas Obtener los parámetros cinéticos: constante de Michaelis (K m) y rapidez máxima (r máx) mediante la ecuación de Lineweaver-Burk. Seguir el avance de reacción por medidas de conductividad Investigar el efecto de la temperatura sobre la rapidez de reacción en la catálisis enzimática. Obtener la temperatura de máxima actividad de un biocatalizador (ureasa) Determinar la energía de activación de una reacción. Calcular energía interna, entalpía, entropía y energía de Gibbs de activación (ΔU≠, ΔH≠, ΔS≠ y ΔG≠) de hidrólisis biocatalítica de la urea.
Introducción
Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que sólamente aceleran las que espontáneamente podrían producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH. La urea es una sustancia nitrogenada que producen abundantes seres vivos, para eliminar el amoníaco de sus organismos, ya que es considerablemente tóxico. En los hombres y otros animales, se encuentra presente en sangre, hígado, linfa, sudor, órganos, huesos, etc. En la naturaleza, también encontramos la ureasa , una enzima producida por unas bacterias que se encuentran en el suelo. Esta enzima es de tipo hidrolítica, y cataliza las reacciones de descomposición de la urea que tienen lugar en el agua, dando la formación de anhídrido carbónico y amoniaco. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son en general proporcionales a la primera potencia de la concentración de la enzima (son de
primer orden respecto a la enzima). Sin embargo, es frecuente encontrar una dependencia de la concentración del sustrato (sobre el que actúa la enzima). La velocidad varía linealmente con la concentración de sustrato a concentraciones bajas (primer orden respecto al sustrato) y se hace independiente de la concentración de éste (orden cero) a concentraciones elevadas. Este tipo de comportamiento fue explicado por Michaelis y Menten Reacción catalizada por la ureasa:
La ureasa, de acuerdo con la clasificación internacional de enzimas, pertenece al grupo de las hidrolasas un ejemplos es el anterior. . La actividad enzimática, definida como cantidad de p roducto formado o cantidad de sustrato degradado por unidad de tiempo, es afectada por una serie de factores tales como: Temperatura El pH La concentración de sustrato La concentración de enzima
Desarrollo experimental
Diagrama de flujo DESCOMPOSICION DE UREA POR UREASA
Extracción de ureasa de soya Triturar en un mortero 1.0 g de so ya y agregue 20 mL de una solución etanol/agua al 30% (v/v).
Centrifugue a 2500 r.p.m. durante 15 min. Mezcle todos los sobrenadantes en un recipiente
Parámetros cinéticos
Temperatura de actividad
En el tubo de ensaye perfectamente limpio y seco, ponga una barra de agitación magnética y adicione 10 mL de la disolución de urea 0.004 M. Coloque el tubo en un baño de temperatura de máxima actividad y fijar el tubo al soporte universal agua, en la otra boca conecte un tubo desprendimiento
En el tubo de ensaye perfectamente limpio y seco, ponga una barra de agitación magnética y adicionar 20 mL de la disolución de urea 0.02 M. Colocar el tubo en un baño de temperatura contante a 30 o C y fije el tubo al soporte universal Medir la temperatura del baño, agregue con la jeringa sin aguja 0.5 mL del extracto de ureasa al tubo de ensayo y poner en marcha el cronómetro en el momento de mezclar. Inmediatamente introduzca la celda al tubo
Medir la temperatura del baño, agregue rápidamente, 0.5 mL del extracto de ureasa al tubo de ensayo y ponga en marcha el cronómetro en el momento de mezclar. Inmediatamente introduzca la celda al tubo
Hacer medidas de conductividad para la reacción cada 10 segundos, por dos minutos.
Haga medidas de conductividad para la reacción cada 10 segundos, por dos minutos
Repetir el experimento a las temperaturas de 40, 50 y 60 °C, res ectivamente
Repetir los puntos 1,2 y 3 con las concentraciones 0.008, 0.012, 0.016 M.
Residuos
Los residuos son biodegradables y se pueden desechar en la tarja
RESULTADOS Tabla 1. Variación de la conductividad con respecto al tiempo a diferentes
temperaturas. Tiempo (s)
30°C
40°C
50°C
60°C
10
35.6 37.4 37.6 37.8 38.6 28.4 23.7 23.5 23.4 23.6 38.3 37.3
41.4 38.3 43.4 43.1 43.1 27.3 27.3 27.3 27.5 27.7 27.8 28.1
35.4 21.4 21.1 21.1 21.1 21.3 21.3 21.3 21.3 21.3 21.3 21.3
26.9 27.2 27.6 27.7 27.7 27.7 28 28 28.2 28.2 28.4 28.4
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Tabla 2. Variación de la conductividad con respecto al tiempo a diferentes
concentraciones. Tiempo (s)
0.004M
0.008M
0.012M
0.016M
10
76.3 76.4 76.5 77 77.4 77.5 77.8 77.9 78.5 78.9 79.5 80
60.1 60.5 71.6 71.9 72.4 72.8 73.8 74.3 75 75.3 75.7 76
62 63.8 64.9 67.1 69 74 78.6 79.3 80 80.2 83 83.7
74.3 74.6 75.4 76.6 77.7 77.9 78.2 78.5 78.9 79 79.4 79.6
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Grafica 1. Variación de la conductividad con respecto al tiempo a 30°C
30°C
y = -0.0676x + 36.491 R² = 0.12623
45 40 35 D30 A D I V I 25 T C U20 D N O15 C
10 5 0 0
20
40
60
80
100
120
140
TIEMPO
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.0676 Grafica 2. Variación de la conductividad con respecto al tiempo a 40°C
40°C
y = -0.1665x + 44.345 R² = 0.645
50 45 40 D35 A D I 30 V I T C 25 U D20 N O C 15
10 5 0 0
20
40
60
80 TIEMPO
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.1665
100
120
140
Grafica 3. Variación de la conductividad con respecto al tiempo a 50°C
50°C
y = -0.0535x + 25.911 R² = 0.22299
40 35 30 D A25 D I V I T C 20 U D N15 O C
10 5 0 0
20
40
60
80
100
120
140
TIEMPO
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.0535 Grafica 4. Variación de la conductividad con respecto al tiempo a 60°C
60°C 28.8
y =0.0119x + 27.094 R² = 0.90763
28.6 28.4 28.2
D A D 28 I V I T C 27.8 U D N27.6 O C
27.4 27.2 27 26.8 0
20
40
60
80 TIEMPO
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = -0.0119
100
120
140
Tabla 3. Temperatura y rapidez inicial Temperatura
ro
30 40 50 60
0.0676 0.1665 0.0535 -0.0119
Grafica 5. Variación de la rapidez inicial con respecto a la temperatura
ro vs Temperatua 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 -0.02
0
10
20
30
40
50
60
70
-0.04
En el grafico se observa una temperatura de máxima actividad biocatalítica de 40°C
Grafica 6. Variación de la conductividad con respecto a la temperatura a 0.004M
0.004M
y = 0.331x + 145.656 R² = 0.96607
82 80 d 78 a d i v i t c 76 u d n o C 74
72 70 0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.331
Grafica 7. Variación de la conductividad con respecto a la temperatura a 0.008M
0.008M
y = 0.5133x + 93.439 R² = 0.68339
85 80 75 d 70 a d i v i 65 t c u d 60 n o 55 C
50 45 40 0
20
40
60
80 Tiempo
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.5133
100
120
140
Grafica 8. Variación de la conductividad con respecto a la temperatura a 0.012M y = 0.6311x + 139.741 R² = 0.95331
0.012M 90 85 80 d a 75 d i v i t c 70 u d n o 65 C
60 55 50 0
20
40
60
80
100
120
140
Tiempo
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.6311 Grafica 9. Variación de la conductividad con respecto a la temperatura a 0.016M
0.016M
y = 0.7923x + 101.306 R² = 0.91846
82
80
78
d a d i v i t c 76 u d n o C
74
72
70 0
20
40
60
80 Tiempo
Obteniéndose una rapidez inicial de ro = 0.7923
100
120
140
Grafica 10. Variación de la rapidez inicial con respecto a las concentraciones
ro vs (S)
y = 37.543x + 0.1915 R² = 0.9939
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 r
0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
S/M
De la gráfica podemos observar que presenta una cinética de primer orden Grafica 11. Variación del inverso de la rapidez inicial con respecto al inverso de la
concentración 1/ro vs 1/S
y = 0.0091x + 0.7723 R² = 0.9936
3.5 3 2.5 o r / 1
2
1.5 1 0.5 0 0
50
100
150 1/S
200
250
300
Con la ecuación de Lineweaver-Burck se obtuvo la rapidez máxima (r máx) y la constante de Michaellis (KM) 1
=
1
+
∗
1 [] r max KM 1.29516902 0.011786038
Para calcular las constantes de velocidad para cada temperatura se tomó en cuen ta que la reacción presentaba una cinética de primer orden. Se obtuvieron las constantes de velocidad a cada temperatura experimental Temperatura 30 40
k
0.0045 0.0063
Grafica 12. Variación de la constante de velocidad respecto a la temperatura.
Ln K VS 1/T -4.95 0.023 -5
0.025
0.027
0.029
0.031
0.033
-5.05 -5.1
y = -3306x + 10.1536 R² = 1
-5.15 K n l
-5.2 -5.25 -5.3 -5.35 -5.4 -5.45
1/T
0.035
=
3306 =
8.314 − −
= 27486 − =
(0.0063) =
−
− . .
A=
Determinación los parámetros de activación: ΔU≠, ΔH≠, ΔS≠ y ΔG≠ (utilizar la ecuación de Eyring), a cada temperatura de experimentación ∆ ∗ = ∗ ∆ ∗ = 27486 − (1)(8.314 − −)(313.15) ∆∗ = 24802 −
Análisis de resultados.
En la gráfica 1 se puede observar una gran variación de la conductividad respecto al tiempo a 30 ºC ya que el grafico va subiendo y bajando confirmando que la reacción se está llevando a cabo en esta grafica se obtuvo la velocidad de reacción esto puede ser a que ah esa temperatura la reacción no es muy favorecida. A partir de la gráfica 2 a 4 se observa que el comportamiento de los gráficos se comporta de una manera un poco más lineal de la conductividad respecto al tiempo en la temperatura de 40 ºC es donde obtuvimos una mayor velocidad de reacción, esto es debido a que el aumento de temperatura incrementa la energía media y la velocidad de las moléculas reaccionantes, aumentando el número de choque s entre ellas y el número de moléculas que alcanza o supera la energía de activación, necesario para que el choque entre ellas sea eficaz. En la temperatura de 50 ºC hay un descenso en la velocidad de reacción ya que la enzima entra a un proceso de desactivación ya que a esta temperatura la energía de desactivación es muy alta, estos cambios se conocen con el nombre de desnaturalización y son los responsables del decrecimiento de la actividad de la enzima. Obtuvimos una temperatura de máxima actividad catalítica de 40 ºC debido ah que la velocidad de una reacción enzimática se incrementa la aumentar la temperatura en un determinado rango llegando a una temperatura optima y a valores super iores de temperatura como toda proteína esta presenta procesos de desnaturalización y por ende de inactividad. En las gráficas 6,7,8, y 9 graficamos la conductividad respecto al tiempo a diferentes concentraciones, se observa que al aumentar la concentración la velocidad de reacción va aumentando debido a que esta es proporcional a la concentración de la enzima.
En la gráfica 10 se obtiene un comportamiento lineal por lo que se deduce que la reacción presenta una cinética de primer orden. Para poder determinar la velocidad máxima de la reacción enzimática la concentración del sustrato se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formación de producto. En ese caso, los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato. Conclusiones
La velocidad de una reacción enzimática incrementa a medida que la temperatura se eleva en un determinado rango alcanzando su temperatura óptima. Esta velocidad es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración que tenga el substrato. Las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones al aumentar su energía de activación sin ser consumidas en la reacción. La actividad catalítica de una enzima determina la velocidad inicial de reacción. Bibliografía
Chang, R. (2000) Fisicoquímica para las ciencias químicas y biológicas, Mc Graw Hill. 3ª Ed, México. Vargas, M. & Obaya A. (2005). Cálculo de parámetros de rapidez en cinética Química y enzimática. (1ª Ed.) Universidad Nacional Autónoma de México, México. Cibergrafia
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/1.4.ENZIMAS_24470.pdf https://es.khanacademy.org/science/biology/energy-andenzymes/introduction-to-enzymes/a/activation-energy
Anexos Calculo de la constante de michaellis y rmax 1
=
1
+
∗
1 []
Para calcular rmax de la ordenada al origen obtenida en la grafica Grafica 11. Variación de la rapidez inicial con respecto a las concentraciones se obtuvo un valor de: b = 0.7723 1
0.0091x
=
1 1 = = = 1.29 0.7723
=
= ∗ =0.0091*1.29=0.0117
