Biorreactores Prof. Antonio Monzón
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1
Cinética de Crecimiento Microbiano
Introducción. Estequiometría, Rendimientos, Velocidad de Reacción Tipos de Modelos Cinéticos. Aproximaciones Crecimiento estacionario y no-estacionario Modelo de Monod. Linealizaciones. Modelos con Inhibición: Por sustrato Por producto
Tipos de Células Procaryota
Eucaryota 3
Células Eucariotas Estructura de una célula vegetal típica
Estructura de una célula animal típica
4
Crecimiento celular Condiciones ambientales: pH, humedad, temperatura, salinidad Carbono (nutriente limitante)
Célula Fuente de Energía (donor de e-)
Nutrientes
Célula
Aceptor de e(O2 en aerobio) (NO3-, NO2-, SO42- en anaerobio)
Subproductos Metabólicos (productos, CO2, H2O)
5
Crecimiento celular Consumo de sustratos (energía y materia prima) para síntesis de células y de productos de metabolismo El entorno debe tener todos los elementos necesarios para la formación de células
La DG de los sustratos consumidos debe ser superior que la DG de las células y productos formados (DG<0) Los elementos que constituyen los nutrientes deben ser compatibles con el medio enzimático de las células Obedece las leyes de conservación de materia y energía La cantidad de productos formados (metabolitos) , y el calor generado, son proporcionales a la cantidad consumida de sustrato, o de alguno de los productos 6
Crecimiento celular S (comida) (sustrato)
X Proceso autocatalítico
Para:
X + (células) (microorg.)
P (producto)
- Eliminar S: depuración de agua - Producir P: antibióticos - Producir X: producción de SCP - Primera etapa fermentación
Tipos de reactores: Biorreactor Fermentador Quimiostato
Veneno !!! (máximo 12% vol.)
A veces sucede que: Hidratos de carbono (mosto, cereales, patatas, frutas)
bichos
(bichos) + alcohol
7
Crecimiento celular Conservación de materia Estequiometría Fuente de C + Fuente de N + O2 + minerales + nutrientes específicos Masa celular + Productos + CO2 + H2O Ej. Crecimiento aerobio del Saccharomyces Cerevisiae:
C6 H12O6 aO2 bNH 3 cCH xOy N z dCO2 eH 2O
8
Composición elemental de los microorganismos Ejemplo. Determinación de los coeficientes estequiométricos para el crecimiento aerobio del Saccharomyces Cerevisiae sobre glucosa:
C6 H12O6 aO2 bNH 3 cCH xOy N z dCO2 eH 2O Fórmula empírica del Saccharomyces Cerevisiae sobre glucosa: Balance de Carbono: Balance de Hidrógeno: Balance de Oxígeno: Balance de Nitrógeno:
6=c+d 12+3b=1,703c+2e 6+2a=0,459c+2d+e b=0,171c
CH1,70 N0,17O0, 46
Dato adicional: Coeficiente respiratorio (RQ): mol CO2/mol O2 RQ = 1,033 = d/a
Solución: a=3,942 ; b=0,33 ; c=1,928; d=4,072; e=4,854
C6 H12O6 3,942O2 0,33NH 3 1,928CH1,703O0, 459N0,171 4,072CO2 4,854H 2O 9
Composición elemental de los microorganismos Microorganismo
Nutriente limitante Fórmula empírica
Aerobacter aerogenes
CH 1,78 N 0,24 O 0,33
Klebisella aerogenes
Glicerol
CH 1,74 N 0,22 O 0,43
Cándida utilis
Glucosa
CH 1,84 N 0,20 O 0,55
Cándida utilis
Etanol
CH 1,84 N 0,20 O 0,55
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa
CH 1,70 N 0,17 O 0,46
10
Composición elemental de los microorganismos Ejemplos de composición elemental
11
Definiciones de Rendimiento Símbolo YX/S
Definición
.
g de biomasa seca/g de substrato consumido Tasa de crecimiento molar: g de biomasa seca/mol de sustrato consumido
YX/O
g de biomasa seca/g ó mol de oxígeno consumido
YP/S
g ó mol de producto/g ó mol de sustrato consumido
YC/S
mol de CO2/mol de substrato consumido
12
Definiciones de Rendimiento
13
Velocidad de Reacción y Rendimientos Velocidad de Crecimiento Celular y Velocidad Específica de Crecimiento:
dX 1 dX rX m dt X dt
rX (g/l.s)
m (s-1)
Rendimientos: X (g/l) S (g/l)
P (g/l)
YX S
rX DX r DX ; YX O X (rS ) DS (rO ) DO
YP S
r DP r DP P ; YP X P (rS ) DS rX DX
YC S
r DC C (rS ) DS
rC (g/l.s) -rO (g/l.s)
-rS (g/l.s) rP (g/l.s)
Relación entre las velocidades de reacción: (rS )
r rX r P C (rS ) YS X rX YS P rP YS C rC YX S YP S YC S 14
Rendimientos Bacterianos con diversas fuentes de carbono Sustrato
Y X/S
Y X/O
YD
Malato
0,34
1,02
0,3
Acetato
0,36
0,7
0,21
Glucosa (melazas, almidón)
0,51
1,47
0,42
Metanol
0,4
0,44
0,12
Etanol
0,68
0,61
0,18
Isoporpanol
0,43
0,23
0,074
Parafinas
1,03
0,5
0,16
Metanol
0,62
0,2
0,061
15
Rendimientos Bacterianos con diversas fuentes de carbono
16
Rendimientos Bacterianos con diversas fuentes de carbono Ejemplo. Rendimientos en la producción de ácido acético
17
Rendimiento Entálpico Rendimiento entálpico: YD (g de células /kJ generado)
YD
YX
S
DH S YX S DH C
YX S (1 YD DH C ) YD DH S
DHS : Entalpía de combustión del sustrato: kJ/g sustrato DHC : Entalpía de combustión del material celular : kJ/g células DHG : Entalpía de reacción del sustrato para dar X, CO2 y H2O: kJ/g sustrato Balance de calor para un crecimiento aerobio:
DHS = YX/S.DHC + DHG (Calor generado por g de sustrato oxidado) = (Calor de combustión de las células producidas a partir del sustrato) + (Calor generado por g de sustrato consumido en la fermentación que produce células, CO2 y H2O) 18
Ciclo Entálpico Crecimiento celular Respiración
1
CO2 H 2O células
(kJ/g células)
YD
DHC (kJ/g células)
ΔHS (kJ/g sustrato)
Sustrato O2 CO2 H 2O 1
YX
DH S DH C S
g sustrato kJ g células g sustrato
YX S YD (DH S Y X S DH C )
1
YD DH S
YX
DH G
YX
S
YD YD
YX S DH C DH G YX S DH C
S
19
Factores clave en la Interacción Célula-Medio Ambiente Condiciones medioambientales
Población celular
• Multicomponente
Nutrientes
• Multicomponente
• Reacciones en solución
Sustratos
• Heterogeneidad de cada célula individual
• Equilibrio ácido-base
Productos
• pH y temperatura variable • Cambio de las propiedades reológicas • Multifásico (gas, líquido) • Distribución espacial no uniforme
Calor
• Reacciones múltiples • Mecanismos internos de control • Adaptabilidad
Interacciones mecánicas
• Aleatorio • Variabilidad genética
20
Crecimiento Celular, Consumo de Sustratos y Obtención de Productos Consideraciones sobre la evolución de la población celular: 1.Cada célula individual es un sistema multicomponente con una distribución interna no homogénea, incluso a nivel de célula individual. 2.El número de reacciones individuales que tienen lugar en la célula es muy elevado. También lo es el de mecanismos internos de control de la propia célula. 3.La célula tiene capacidad de adaptarse a cambios en la composición del medio ambiente. A lo largo del cultivo pueden ocurrir mutaciones que provoquen algún cambio en las características genéticas de la célula. En células modificadas genéticamente se puede producir inestabilidad, de forma que la información genética introducida se puede perder a lo largo del tiempo. 4.Cada célula individual evoluciona dentro de su ciclo de crecimiento, de forma que en el medio se encontrarán células con distintas edades, algunas acabadas de nacer, otras en proceso de división y otras al final de su ciclo celular.
5.A lo largo de las distintas fases del ciclo celular, las células varían su actividad metabólica. Además, en microorganismos no unicelulares, como los que desarrollan los micelios, la morfología y tamaño de los mismos varía sustancialmente a lo largo del crecimiento.
21
Crecimiento Celular, Consumo de Sustratos y Obtención de Productos Nomenclatura:
Sistema estructurado: Está formado por múltiples compartimentos distintos y todos intervienen en el crecimiento.
Sistema segregado: Está formado por un conjunto de células con características individuales, distintas en cada una de ellas.
“Crecimiento Balanceado”: Todo el proceso de crecimiento celular se define en función de un componente individual, el cual controla su velocidad. Se tienen diferentes células, pero cada una es tratada como un todo, i.e. todas crecen por igual.
“Célula Promedio”: Considera que todas las células de una población son iguales y se comportan de la misma forma.
22
Crecimiento Celular, Consumo de Sustratos y Obtención de Productos Consideraciones sobre los modelos cinéticos:
Un modelo cinético de crecimiento que intente contemplar todos los aspectos recogidos en el esquema anterior es imposible de formular.
Su aplicación sería poco práctica dada la gran cantidad de información que se requeriría conocer previamente (e.g. elevado número de parámetros cinéticos).
La solución habitual implica efectuar una serie de suposiciones que permitan simplificar el problema, pero que al mismo tiempo permitan obtener una representación útil de la cinética de crecimiento de una población celular.
En función del grado de aproximación adoptado se obtendrán modelos más complejos o más simples 23
No estructurado (un componente)
Estructurado (varios componentes)
CASO IDEAL La población celular se trata como un único componente en solución
Crecimiento Balanceado
Considera los multicomponentes de una célula promedio
Promedio celular
Promedio celular
Segregado (células diferentes)
No segregado (célula promedio)
Aproximaciones a la Cinética Microbiana
Considera los componentes simples de las diferentes células
Crecimiento Balanceado
CASO REAL Considera los multicomponentes de las diferentes células 24
Crecimiento Celular, Consumo de Sustratos y Obtención de Productos CASO REAL Sistema segregado y estructurado (Muy complejo de describir)
SIMPLIFICACIÓN MÁS UTILIZADA Sistema NO-segregado y NO-estructurado (Tratamiento más simple)
25
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo
J. Monod. “The Growth of Bacterial Cultures”, Annual Review of Microbiology; Vol. 3, p.p. 371-394 (1949).
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo 3
muerte estacionaria
4
X 2
crecimiento exponencial
1
Al agotarse los nutrientes disminuye la velocidad de crecimiento y comienzan a morir las células
tiempo Latencia o inducción
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo Fase de latencia. Características: 1) Es el tiempo que necesitan los microorganismos para adaptarse al nuevo medio (generar nuevas enzimas,…).
2) Velocidad de crecimiento despreciable (X X0). 3) Depende de la edad de los microorganismos. Puede haber una edad óptima, y normalmente los más jóvenes se adaptan más rápidamente.
4) Se reduce realizando el crecimiento previo en un ambiente análogo. 5) Se recomienda usar como siembra entre el 5-10% de la biomasa en contenida en el fermentador. 6) Puede haber varios periodos de inducción, si se van utilizando sucesivamente diferentes sustratos (crecimiento diáuxico). 29
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo Fase de Crecimiento Exponencial. Ley de Malthus (1798) dX m m X ; X X 0 t tlag dt mm : velocidad específica de crecimiento celular, min-1 mm y tlag = f (microorganismos, S)
Evolución Biomasa-tiempo:
X m m (t tlag ) X X 0 expm m (t tlag ) ; t tlag ln X0 Tiempo de duplicación celular, t2:
t2
X crece exponencialmente con el tiempo
ln(2)
mm
t2: tiempo necesario para duplicar la concentración celular 30
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo Fase de Crecimiento Exponencial. Valores típicos del tiempo de duplicación Tipo de organismo
td (h)
Bacterias
0,3 – 2,0
Levaduras
1,0 – 4,0
Hongos filamentosos
2,0 – 4,0
Microalgas
18 – 35
Células animales (in vitro)
20 - 40
31
Fases del Crecimiento Celular Discontinuo Fase de Crecimiento Exponencial. Ln(m)
log (X)
mm
Ley de Malthus No predice la fase estacionaria!!!! Tiempo Tiempo
latencia
32
Fases de Crecimiento Exponencial y Estacionaria Cambio condiciones ambientales a) Se acaba el sustrato
XF
alta S0
XF
media S0
XF
X
baja S0
XF = f(S0) La concentración final de células, XF , depende de la concentración inicial de sustrato, S0
tiempo
33
Fases de Crecimiento Exponencial y Estacionaria Velocidad de consumo de nutrientes (S) y Ley Malthus:
dS k S X dt X X 0 exp( m m t )
dS k S X 0 exp( m m t ) dt k : constante cinética de desaparición
s
de S, (g S/g X.min)
Evolución de la concentración de sustrato con el tiempo:
S S0
kS X 0
mm
exp(m m t ) 1
;
tlag t t final
Al agotarse el sustrato, S=0, se llega a la concentración máxima de biomasa (X):
X F X 0 S0
mm kS
X X 0 (S0 S )
Tiempo para agotar el sustrato, tfinal:
t final
S0 mm ln1 mm kS X 0 1
mm kS
YX S
mm kS
34
Fases de Crecimiento Exponencial y Estacionaria Dependencia de la población máxima, XF , respecto de la concentración inicial de nutriente limitante, S0 XF
X F X 0 S0
XF
mm kS
XF
35
Fases de Crecimiento Exponencial y Estacionaria Cambio condiciones ambientales b) Se acumulan materiales tóxicos (o se acaba el espacio disponible)
XF
alta S0 media S0 baja S0
X
XF≠f(S0) La concentración de células final es independiente de la concentración inicial de sustrato
tiempo
36
Fase de Crecimiento Estacionario
Población máxima (final)
XF
El factor limitante de crecimiento dependerá de la concentración inicial de sustrato
Factor limitante: productos tóxicos Controla el veneno
XF≠f(S0)
XF=f(S0)
Concentración inicial de nutrientes
S0
37
Crecimiento Diaúxico 80 Densidad bacteriana
El crecimiento diaúxico se produce cuando se observan diferentes periodos de latencia, debido a que en el medio hay diferentes sustratos que son consumidos a diferente velocidad por los microorganismos.
Crecimiento diaúxico de Escherichia Coli
60
Cuando uno de los sustratos es consumido totalmente, tras un periodo de latencia, los microorganismos consumen el segundo sustrato.
40
20
0
0
2
4 6 Tiempo, h
Utilización de glucosa
8
Utilización de xilosa
38
Crecimiento Diaúxico
39 J. Monod. “The Growth of Bacterial Cultures”, Annual Review of Microbiology; Vol. 3, p.p. 371-394 (1949).
Modelos de Crecimiento Microbiano Ley de Malthus (1789)
X X 0 exp( m m t ) X X0 l0 F X0
X F X 0 S0
X XF
rX
dX m m X m m X 0 exp( m m t ) dt
1
2,6
0,9
2,4
mm
0,8
2,2
kS
0,7
Thomas Malthus (1766-1834)
2 1,8
0,6
1,6
0,5
1,4 1,2
0,4
1
0,3
0,8
0,2
X0= k= l 0= XF=
0,1
0,6
5 0,015 35 180
0,4 0,2
0
0 0
50
100
150
200
Tiempo
250
300
rX
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Malthus (adimensional) Variables adimensionales: biomasa (), tiempo () X X0 X X X X 0 (1 l0 ) 1 F XF X0 XF X0
l0
XF X0 X0
X F X 0 (1 l0 )
m mt Relación Biomasa-Tiempo: exp( ) 1
l0 ln(1 l0 )
X 1 l0 1 exp( ) XF 1 l0 1 l0
Velocidad de reacción: d 1 l0 exp( ) r d l0 l0
41
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Malthus (adimensional)
1
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,9
0,8 0,7
80 60 45 33,75 25,3125 18,984375
exp( ) 1
l0
0,6 0,5
l0
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
42
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Malthus (adimensional)
r
1
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,9 0,8 0,7
80 60 45 33,75 25,3125 18,984375
r
exp( )
l0
0,6 0,5
l0
0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
43
Modelos de Crecimiento Celular Ley de Verhulst (1844); Pearl & Reed (1920).
El crecimiento celular está limitado por la acumulación de toxina La producción de toxina es proporcional al crecimiento celular Ct : Concentración de toxina; Pierre-Francois Verhulst Ct,max : Concentración de toxina letal o máxima (1804-1849)
Velocidad de reacción, rX: dX rX k ' X (Ct ,max Ct ) dt dCt dX dt dt Balance de materia a la toxina:
Ct ( X X 0 ) Ct ,max
dX k´ X ( X F X ) k X ( X F X ) ; k k ' ( X F X 0 ) dt
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst Velocidad de reacción, rX: dX rX k X (X F X ) dt Relación Biomasa-Tiempo: XF X 1 l0 exp(k X F t )
t
l X 1 ln 0 k XF XF X
Número de réplicas del inóculo inicial: XF X0 X0
l0 1
90
X 0,9 XF
80
(rX)max
0,8 0,7
70 60
0,6
Coordenadas de rX,max:
rX max k
2 F
X 4
X X max F 2 ln(l0 ) t max k XF
0,5
X0= k= l 0= XF= k*XF= Xmax= rXmax= tmax= X/XF_max=
(X/XF)max
0,4
0,3 0,2 0,1
4 50 0,012 40 40 164 1,968 30 82 80,688 1,8744306220 0,5 10
tmax
0 0
1
2
0 3
Tiempo
4
5
rX
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst (adimensional) Variables adimensionales: biomasa (), tiempo (), l0: X X0 X X X X 0 (1 l0 ) 1 F XF X0 XF X0
l0
XF X0 X0
X F X 0 (1 l0 )
k X 0t Relación Biomasa-Tiempo: 1 exp (1 l0 ) 1 l0 exp (1 l0 )
X 1 l0 1 XF 1 l0 1 l0 exp (1 l0 )
1 l0 1 ln 1 l0 1
Velocidad de reacción: (1 l0 ) 2 exp (1 l0 ) d r (1 l0 ) (1 ) d 1 l0 exp (1 l0 ) 2
max
l 1 0 ; r 2l0
max
(1 l0 ) 2 ln(l0 ) ; max 4l0 1 l0
46
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst (adimensional)
1 l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,9
max
l 1 0 2l0
r max
(1 l0 ) 2 4l0
max
ln(l0 ) 1 l0
0,8 0,7
50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625
l0
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2
0,1
1 exp (1 l0 ) 1 l0 exp (1 l0 )
0 0
X X0 l0 F X0
0,5
1
1,5
2
47
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst (adimensional)
1
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,9
max
l 1 0 2l0
r max
(1 l0 ) 2 4l0
max
ln(l0 ) 1 l0
0,8 0,7
50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625
0,6 0,5 0,4
l0
0,3 0,2
0,1
1 exp (1 l0 ) 1 l0 exp (1 l0 )
0 0
X X0 l0 F X0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
48
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst (adimensional)
r
14
12
max r max
l0 1 2l0
(1 l0 ) 2 4l0
max
ln(l0 ) 1 l0
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
l0
10
8
6
(1 l0 ) 2 exp (1 l0 ) r 1 l0 exp (1 l0 ) 2
4
l0
XF X0 X0
50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625
2
0 0
r (1 l0 ) (1 )
0,5
1
1,5
2
49
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst (adimensional)
r
14 l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
12
max r max
l0 1 2l0
(1 l0 ) 2 4l0
max
ln(l0 ) 1 l0
10
50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625
l0
8
6
4
l0
XF X0 X0
2
0 0
r (1 l0 ) (1 )
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
(1 l0 ) 2 exp (1 l0 ) r 1 l0 exp (1 l0 ) 2
50
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico de Verhulst (adimensional)
r
14
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
12
max r max
l0 1 2l0
(1 l0 ) 2 4l0
max
ln(l0 ) 1 l0
10
50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625
l0
8
6
4
l0
XF X0 X0
2
0 0
r (1 l0 ) (1 )
0,2
0,4
0,6
0,8
1
51
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico Generalizado
r
d (1 l0 ) a (1 )b d
1
a=2 b=1
0,9
a=2 b=2
0,8
0,7 0,6
a=1 b=1
a=1,6 b=0,9
0,5
a=1 b=2
0,4 0,3 0,2
l0=10
0,1
0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
52
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico Generalizado
r r
d (1 l0 ) a (1 )b d
20
a=2 b=1
18
l0=10
16 14 12
a=1,6 b=0,9
10
rX 11 rX 12 rX 21 rX 22 rX ab
a=2 b=2
8
6
a=1 b=1
4
a=1 b=2
2 0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
53
Modelos de Crecimiento Celular Modelo Logístico Generalizado
r r
d (1 l0 ) a (1 ) b d
20
l0=10
a=2 b=1
18 16 14 12 10
a=1,6 b=0,9
a=2 b=2
8
6
a=1 b=1
4
a=1 b=2
2 0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
54
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz (1825):
X X X F 0 XF X rX max k F e X X max F e 1 X t max ln ln F k X0 X X0 l0 F X0
l1 1 l0
XF X0
exp( k t )
X rX k X ln F X X XF
1
1
0,9
(rX)max
0,8
0,8
Benjamin Gompertz 1779 –1865
0,7
(X/XF)max
0,9
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
tmax
0 0
100
0 200
300
Tiempo
400
500
rX
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz (adimensional) Variables adimensionales: biomasa (), tiempo ()
X X0 XF X0
l0
XF X0 X0
X X 0 (1 l0 )
X F X 0 (1 l0 )
;
1
XF X XF X0
l1 1 l0
XF X0
k t Relación Biomasa-Tiempo:
(l1 )1exp( ) 1
l0
X 1 l0 1 XF l1 (l1 ) exp( )
ln(1 l1 ) ln(l1 ) ln(1 l0 )
Velocidad de reacción:
d 1 l0 l1 ln(l1 ) l1 exp( ) ln r d l0 1 l0 l0 (l1 ) exp( ) l l e max 1 ; r max 1 ; max ln(ln(l1 )) e l0 e l0
56
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz (adimensional)
1 0,9
l e max 1 e l0 l r 1 e l0 max ln(ln(l1 )) max
0,8 0,7
l0
0,6
0,5
(l1 )1exp( ) 1
l0
0,4 0,3
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,2 0,1
X X0 l0 F X0
l1 1 l0
XF X0
0 0
1
2
3
4
100 50 25 12,5 6,25 3,125
5
57
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz (adimensional)
r
0,5
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,45
l e max 1 e l0 l r 1 e l0 max ln(ln( l1 )) max
0,4 0,35
100 50 25 12,5 6,25 3,125
ln(l1 ) l1 exp( ) r l0 (l1 ) exp( )
0,3 0,25 0,2
l0
0,15 0,1 0,05
X X0 l0 F X0
l1 1 l0
XF X0
0 0
1
2
3
4
5
58
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz (adimensional)
r
0,5
l 0 0= l 0 1= l 0 2= l 0 3= l 0 4= l 0 5=
0,45
l e max 1 e l0 l r 1 e l0 max ln(ln( l1 )) max
0,4 0,35
100 50 25 12,5 6,25 3,125
0,3
l0
0,25 0,2 0,15 0,1 0,05
X X0 l0 F X0
l1 1 l0
XF X0
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
59
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz Generalizado a
l1 d 1 l0 r ln d l0 1 l0
1
a=1 b=1
0,9
0,8
b
a=1 b=2 a=2 b=2
0,7
a=1,8 b=1,2
0,6 0,5
a=2 b=1
0,4 0,3 0,2
l0=10
0,1 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
60
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz Generalizado a
r
l1 d 1 l0 r ln d l0 1 l0
b
0,6
a=1 b=2
l0=10
0,5
a=1 b=1
0,4
0,3
a=2 b=1
a=1,8 b=1,2 0,2
a=2 b=2
0,1
0 0
2
4
6
8
10
61
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Gompertz Generalizado a
r
l1 d 1 l0 r ln d l0 1 l0
b
0,6
a=1 b=2
l0=10
0,5
a=1 b=1
0,4
0,3
a=2 b=1
a=1,8 b=1,2
0,2
a=2 b=2
0,1
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
62
Fase de Muerte Celular Velocidad de muerte celular: dX d kd X dt Velocidad neta de crecimiento cuando hay muerte celular:
14
X Xd 12 XT
Xd: microorganismos muertos X: microorganismos vivos XT: microorganismos totales
10
dX mm X ( X F X ) kd X dt
dX m m X ( X F* X ) dt k X F* X F d
mm
Velocidad de crecimiento de la biomasa total:
XT
X
8
6
4
Xd
2
0 0
5
10
15
20
25
30
tiempo
XT X X d dX T d ( X X d ) mm X dt dt
63
Modelos de Crecimiento Celular Modelo de Monod (1942): Sustrato (S) + Células (X) mas Células (X) + Producto (P)
dX m m X S rX dt KS S
Jacques L. Monod 1910-1976
mm S rX 1 dX m X X dt K S S rX : velocidad de crecimiento celular m : velocidad específica de crecimiento celular mm: velocidad específica máxima de crecimiento celular KS: constante de Monod
J. Monod, “ Recherches sur la croissanece des cultures bacteriennes “ , Ed. Hermann & Cie., Paris, 1942. J. Monod. “The Growth of Bacterial Cultures”, Annual Review of Microbiology; Vol. 3, p.p. 371-394 (1949).
Modelo de Monod J. Monod. « Recherches sur la croissance des cultures bactériennes ». PhD thèses, Paris, 1941. Ed. Herman, Paris, France, 1942.
Modelo de Monod Evolución de la rX y m en función de la concentración de sustrato
m
0,6
4,0 3,5
rX
0,5 3,0 0,4 2,5 X 0 = 0,04
0,3
2,0
y X/S = 0,95 S 0 = 10
m m = 0,6
0,2
1,5
K S = 0,35
mm S rX m X KS S
0,1
1,0 0,5
0
0,0 0
1
2
3
4
5
S
6
7
8
9
10
66
Modelo de Monod Evolución de la concentración de biomasa y sustrato en un cultivo discontinuo
X S rX
11 10
X
S
9 8 7 6
5
rX
4 X 0 = 0,04
3
y X/S = 0,95 S 0 = 10
2
m m = 0,6 K S = 0,35
1 0 0
rX
1
dX m m X S dt KS S
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
tiempo 67
Modelo de Monod Características de la ecuación de Monod
m
0,6
S K S m m m 0,5
m 0,4
0,6
0,5
0,4
m = mm/2
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0
m S r m X m X KS S
0,1
0
0,1
0,2
0,3
KS
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
S
0 0
S 0 m
mm KS
1
S
2
3
4
5
S
6
7
8
9
10
68
Modelo de Monod Linelizaciones de la ecuación de Monod 250
1/m
1
m
200
1
mm
KS 1 mm S
1/m
150
pte. 100
o.o.
KS
mm
1
mm
50
Lineweaver-Burk 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1/S
1/S
69
Modelo de Monod Linelizaciones de la ecuación de Monod 1800
S/m
1600
S
1400
m
KS
mm
1
mm
S
S/m
1200
pte.
1000
1
mm
800 600 400
o.o.
200
KS
Hanes
mm
0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
SS Eadie-Hofstee: m m m K S
m S
Pendiente: -KS Ord. origen: mm
70
Modelo de Monod 2.4
m
mm=2,24
mm
2.0
1.6
1.2
0.8
KS= mm= mm= mm= mm= mm= mm= mm= mm= mm= mm=
mm=0,95
0.4
0.3 0.950 1.045 1.150 1.264 1.391 1.530 1.683 1.851 2.036 2.240
0.0 0
1
2
3
S
4
5
6
71
Modelo de Monod m
1.2
KS=0,20 1.0
0.8
0.6
KS=2,979
0.4
mm= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS=
KS
0.2
1.100 0.200 0.270 0.365 0.492 0.664 0.897 1.211 1.634 2.206 2.979
0.0 0
1
2
3
S
4
5
6
72
Modelo de Monod Velocidad específica de crecimiento de Escherichia Coli
Crecimiento en glucosa
KS=0,22 mol/l mm=1,3 gener./h
Crecimiento en triptofano
KS=1,1 ng/ml mm=0,8 gener./h
73
Modelo de Monod Constate de Monod para crecimiento celular microbiano en diferentes azucares
74
Modelo de Monod Constante de Monod para distintos microorganismos
75
Modelo de Monod Constate de Monod y mmax para distintos microorganismos
76
Modelo de Monod Constante de Monod para distintos microorganismos
77
Modelo de Monod Ejemplo.
Determinar los parámetros de la ecuación de Monod a partir de los datos originales de la Tesis Doctoral de J. Monod.
Croissance de Escherichia coli avec le lactose comme substrat limitant. • • • •
t est le temps exprime en heures. x est la biomasse dans les unités de DO de Monod. 1 unité de DO = 0,75 mg de biomasse sèche par litre. s est la concentration en lactose exprimée en mg/l.
78
Modelo de Monod Ejemplo.
Determinar los parámetros de la ecuación de Monod a partir de los datos originales de la Tesis Doctoral de J. Monod.
Solución. Método integral de análisis de datos (Método de Euler).
rX
DX m m X S Dt KS S X F Xi Si YX S
X i 1 X i (rX ) i Dt X i
;
(rX ) i
X F .O.
m m X i Si K S Si
exp X calc
2
X exp
S
;
mi
m m X i Si K S Si
Dt
m m Si K S Si
exp S calc
2
S exp
79
Modelo de Monod Ejemplo.
Determinar los parámetros de la ecuación de Monod a partir de los datos originales de la Tesis Doctoral de J. Monod. tiempo 0 0,54 0,9 1,23 1,58 1,95 2,33 2,7
X 15,5 23 30 38,8 48,5 58,3 61,3 62,5
S 151 123 105 75 43 14 3,5 0,5
rX 12,1123384 17,4083867 22,0655913 26,4938675 27,9098794 19,0254206 6,83744398 1,11262473
time 0 0,54 0,9 1,23 1,58 1,95 2,33 2,7
X calc 15,5 23,5078686 30,7514243 38,8673726 48,6104771 57,8527545 61,7459708 62,1996496
S calc 151 125,126334 101,722186 75,4993117 44,0190458 14,1569676 1,57786799 0,11201812
rX calc 12,1123384 17,8441707 22,4785532 26,5839509 28,214169 19,0148009 3,32861823 0,2518885
m 0,78144119 0,75688638 0,73551971 0,68283164 0,57546143 0,32633655 0,11154068 0,017802
m calc 0,78144119 0,75907225 0,730976 0,68396573 0,58041333 0,32867581 0,05390827 0,00404968
80
Modelo de Monod Ejemplo.
Determinar los parámetros de la ecuación de Monod a partir de los datos originales de la Tesis doctoral de J. Monod.
160
70
S 140
60
0,9
X
30
m 0,8
rX 25
0,7
120
50
0,6
100 40
0,5
30
0,4
80
20 15
60
0,3
20
40
10
0,2 5
10
20 0
0,1
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
0
3
0 0
50
Tiempo (h)
100
150
Sustrato (mg/L)
m m=
valor 0,911
error estándar % variación 0,033 3,6%
Int. Conf. 0,077
Lim. Inf. 0,834
Lim. Sup. 0,989
KS =
25,10
3,86
15,4%
0,33
24,76
25,43
y X/S =
0,309
0,005
1,5%
0,032
0,277
0,342
Efectos Ambientales sobre el Crecimiento Celular
Temperatura de operación pH Salinidad Oxígeno Presión
Fuera de las condiciones óptimas, la adaptación (compensación celular) puede reducir la velocidad de crecimiento y, por tanto, el rendimiento.
Extremófilos: Organismos que pueden tolerar, o quizás requerir, condiciones extremas para vivir y desarrollarse (pH, T, P,...).
82
Efecto de la Temperatura m m Am exp Ea RT
k d Ad exp Ed RT
Ea 10-20 kcal/mol Ed 60-80 kcal/mol
La velocidad de muerte celular es más sensible a la temperatura que la de crecimiento celular
83
Efecto de la Temperatura Cinética de muerte celular por efecto de la temperatura dX kd X dt X X 0 exp k d t
(rd )
X k d t ln X0 E k d k d 0 exp d RT
kd
84
Efecto de la Temperatura Ejemplo. Cinética de muerte celular por efecto de la temperatura
Efecto de la Temperatura Ejemplo. Cinética de muerte celular por efecto de la temperatura
86
Efecto de la Temperatura Ejemplo. Cinética de muerte celular por efecto de la temperatura
kd
Ed/R
87
Efecto de la Temperatura Ejemplo. Cinética de muerte celular por efecto de la temperatura
88
Efecto de la Temperatura
89
Efecto de la Temperatura Efecto de la temperatura en el crecimiento de Escherichia Coli Problema: El punto óptimo de temperatura está muy cerca del punto de muerte
td
ln 2
m
m m Am exp Ea RT
k d Ad exp Ed RT
Ea 10-20 kcal/mol Ed 60-80 kcal/mol
La velocidad de muerte celular es más sensible a la Temperatura que la de crecimiento celular 90
Efecto de la Temperatura Clasificación de los microorganismos según su temperatura óptima de operación 40 a 70 ºC 70 a 100 ºC
90 a 115 ºC
10 a 45 ºC
15 a 18 ºC
91
Efecto de la Temperatura Clasificación de los microorganismos según su temperatura óptima
Efecto de la Temperatura Clasificación de los microorganismos según su temperatura óptima de operación Temperatura (ºC)
Grupo
Mínima
Óptima
Máxima
Termófilos
40 a 45
55 a 75
60 a 80
Mesófilos
10 a 15
30 a 45
35 a 47
• Obligados
-5 a 5
15 a 18
19 a 22
• Facultativos
-5 a 5
25 a 30
30 a 35
Psicrófilos
93
Efecto de la Temperatura mm
A exp E g RT
1 B exp DGd RT
Klebsiella pneumoniae
m m A exp Ea RT
Escherichia coli
94
Efecto del pH Clasificación de los microorganismos según su tolerancia al pH
95
Efecto del pH m
m m ( pH )
mm [ H ] K a2 1 K a1 [ H ]
Efecto del pH en el crecimiento celular (Sinclair & Kristiansen, 1987)
96
Efecto del pH m
Efecto del pH en el crecimiento del Methylococcus capsulatus
97
mm
Efecto del pH
mm=0,3 h-1 Ka1=0,004 Ka2=2,0.10-8
mm
0,35
Aspergillus oryzae
mm
m m ( pH ) 1
[ H ] K a2 K a1 [ H ]
0,3
0,25
0,2 0,15 0,1 0,05
98
0 0
2
4
pH
6
8
10
Efecto del pH X Saccharomyces Cerevisae
Efecto del pH en el crecimiento de Saccharomyces Cerevisae 99
Efecto del pH td
td
ln 2
m
Escherichia Coli
Al aumentar la temperatura aumenta el pH para la máxima velocidad de crecimiento disminuye td
Efecto del pH en el crecimiento de Escherichia Coli 100
Efecto de la Salinidad Clasificación de los microorganismos según su tolerancia a la Salinidad
NaCl 101
Efecto del Oxígeno Clasificación de los microorganismos según su respuesta al oxígeno a. Aeróbicos b. Anaeróbicos c. Facultativos d. Microaeróbicos e. Aerotolerantes
102
Efecto de la Presión Clasificación de los microorganismos según su tolerancia a la presión
103
Estratificación en sistemas Naturales
104
Efecto de vertidos de aguas residuales en sistemas acuáticos • Aumenta el número de bacterias heterótrofas
• Disminuyen los niveles de O2 después del vertido de materia orgánica • Aumenta NH4+ y después aumenta NO3- proceso de nitrificación en dos etapas • El aumento en el nº de algas y cianobacterias es una respuesta a los nutrientes, especialmente PO43• Los niveles de O2 regresan a sus valores iniciales una vez que se han agotado los compuestos orgánicos e inorgánicos oxidables
105
Otros Modelos Cinéticos Ecuación de Monod:
m mm
S KS S
Otros Modelos Empíricos
S KS
Ecuación de Tessier:
m m m 1 exp
Ecuación de Moser:
Sn m mm KS S n
Ecuación de Contois:
m mm
S B X S
;
KS B X
106
Modelos Cinéticos con Inhibición por Sustrato S
Ecuación de Andrews y Noack:
m mm
Ecuación de Webb:
S S 1 K iS m mm S2 KS S K iS
Ecuación de Aiba y cols.:
m m m
Ecuación de Tessier:
S m m m K iS
Ecuación de Tseng y Wymann:
m m m
S2 KS S K iS
S S exp KS S KS S exp KS
S K iS ( S SC ) K S S 107
Otros Modelos Cinéticos dm p k m m m dS
Modelo de Konak (1974): Ec. de primer orden (p=0):
m mm S
Ec. de Tessier (p=1):
S m m m 1 exp KS
Ec. de Webb (p=3/2):
S S 1 K iS m mm S2 KS S K iS
Ec. de Monod (p=2):
m mm
Ec. de Andrews y Noack (p=3/2, =0):
;
S KS S
m mm
mm k
;
KS
;
;
KS
KS
1 k mm
1 k
K iS 1 ; 1 4 k mm
S S2 KS S K iS 108
Modelos cinéticos con sustratos múltiples Modelos sin inhibición competitiva entre sustratos: Modelos aditivos
m
m m S1 1
K S1 S1
mm S2 2
K S2 S 2
n
m i 1
m m Si i
K Si S i
Modelos multiplicativos
n S1 S 2 m m m Si m mm K S S1 K S S 2 i 1 K S i S i 2 1
The methanotrophs are aerobic bacteria that oxidize methane as an energy source and carbon source through the enzyme methane monooxygenase (MMO). Methane-oxidizing bacteria (Methylosinus trichosporium OB3b) S1: methane S2: oxygen 109
Modelos cinéticos con sustratos múltiples Modelos con inhibición competitiva entre sustratos. Modelos de crecimiento diaúxico m m S1 mm S2 m K S S1 S 2 K S S1 S 2 1
2
1
2
m
m m S1 1
K S1 S1
mm S2 2
S12 K S2 S 2 K iS1
110
Modelos Cinéticos con Inhibición por Producto
S (1 k P) KS S
Ecuación de Dagley y Hinshelwood:
m mm
Ecuación de Holzber y cols.:
m mm k1 ( P k2 )
Ecuación de Ghose y Tyagy:
m mm 1
Ecuación de Aiba y Shoda:
m mm
Ecuación de Jerusalimsky y Neronova:
m mm
Modelo de Han Levenspiel:
P m m m 1 * P
P Pmax
S exp( k P) K S S
S Kip K S S Kip P
n
S KS S
Pmáx=P*= concentración letal (máxima)
111
Modelo de Han y Levenspiel Se utiliza cuando hay inhibición y es una generalización del Modelo de Monod
S m kobs KS S obs
kobs
Ci m m 1 * Ci
K Sobs
n=0
kobs n<1
n
Ci K S 1 * Ci
m
n=1 n>1
Ci sustrato o producto, dependiendo cual ses el inhibidor Ci* concentración ó límite máximo P* n, m determinan el tipo de inhibición. Si son cero, no hay inhibición
P 112
Modelo de Han y Levenspiel Gráficos de Lineweaver-Burk
n > 0 y m=0
a Inhibición no competitiva
K Sobs 1 1 m kobs m m S 1
n=0ym<0
b Inhibición competitiva
n>m>0
c Inhibición generalizada (anticompetitiva)
113
Modelo de Han y Levenspiel Gráficos de Lineweaver-Burk
K Sobs 1 1 m kobs m m S 1
n= m>0
m>n>0
d
e
Inhibición generalizada (anti-competitiva)
Inhibición anticompetitiva
n>0ym<0
f Caso general
114
Cinéticas de consumo de sustrato y formación de producto X S P
m=rX/X
Tipo I
Tipo II
u=rP/X
Tipo III
u=rP/X
u=rP/X
s=rS/X s=rS/X
s=rS/X
m=rX/X
m=rX/X
•
Sistemas Tipo I: Productos asociados al crecimiento: La formación del producto es función del consumo de sustrato y proporcional al mismo. DG<0. Ej. Fermentación alcohólica
u qP •
1 dP rP m X dt X
=YP X
Sistemas Tipo II: Productos parcialmente asociados al crecimiento: La formación del producto depende sólo indirectamente del consumo de sustrato. DG<0. Ej. Producción de ácido cítrico
u qP m +
•
Sistemas Tipo III: Productos no-asociados al crecimiento: La formación del producto no depende del consumo de sustrato. DG>0. Ej. Producción de metabolitos secundarios (penicilina y otros antibióticos)
u qP
( m=0)
Cinéticas de consumo de sustrato y formación de producto Cinética de formación de Producto Ecuación de Luedeking y Piret:
rP rX X m X X X ( m ) : coeficiente asociado al crecimiento celular : coeficiente de mantenimiento, asociado a la masa celular
rP rX
Sistemas de Tipo I, = 0
;
YP X
Cinética de Consumo de Sustrato
1 rS ' YX S
m X mS X rP ' Y X S
asociado al crecimiento
asociado al mantenimiento de las células
Consumo de sustrato para formación de producto 116
Cinéticas de consumo de sustrato y formación de producto Estequiometría Rendimientos “verdaderos” o teóricos X , rSX d1S r g1 biomasa ... P , rSP d 2 S r p2 producto ...
d 3 S mantenimiento rSm
Rendimientos Globales (experimentales) X , rP , rS d S r g1 biomasa p2 producto ....
YX'
S
d d1
YX S YX'
d d2
YP S YP' S
S
YX' S
rX g 1 rSX d1
YP' S
rP p 2 rSP d 2
rX g 1 (rS ) d
YP S
rP p 2 (rS ) d
YX
S
Rendimiento teórico máximo de células producidas por unidad de sustrato consumido si se ignora el consumo de energía de las células 117
Cinéticas de consumo de sustrato y formación de producto Si no hay consumo de sustrato por formación de producto
(rS )
rX mS X ' YX S
Ecuación de Pirt (1965):
1
(rS ) mS 1 ' rX YX S m
YX Y
mS
m
YX
S
1 YX
S
1 Y
' X S
YX' S YX Y
' X S
YX
S
S
' X S
1 Y
' X S
mS
m
m mS Y X S m mS Y X S
si mS = 0
YX' S YX
S
S
rX (rS ) 118
Resumen de Cinéticas de Crecimiento Celular Cinética de producción celular: m
dX m m X S P k d X rX 1 dt K S S Pmax Cinética de consumo de sustrato: rX rP (rS ) ' mS X ' YX S YP S Cinética de formación de producto: dP rP rX X ( m ) X dt Cinética de consumo de oxígeno (proceso aeróbico):
1 (rO2 ) ' m X mO X YX O
119
Resumen de Cinéticas de Crecimiento Celular Coeficiente de mantenimiento para distintos microorganismos usando glucosa.
120
Resumen de Cinéticas de Crecimiento Celular Microorganismo
Sustrato
(h -1 )
Acetobacterium woodii
Lactato
0,07
Anaeróbico
Aerobacter aerogenes
Citrato
0,06
0,05
Aerobacter aerogenes
Glucosa
0,05
0,05
Aerobacter aerogenes
Glicerol
0,08
0,11
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa
0,02
0,02
Escherichia coli
Glucosa
0,05
0,02
Penicilium chrysogenum
Glucosa
0,02
0,02
m 0 (h -1 )
121
