UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES – SUPERIORES – CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL.
INFORME EXPERIMENTAL DE LA CINETICA ENZIMATICA DE LA UREASA.
CARMONA BARAJAS ANGEL. PEREZ ALCALA ESTHER. LOPEZ ARTEAGA FERNANDO. GRUPO: 1603 07 DE NOVIEMBRE DEL 2007.
EQUIPO 1.
Cinética enzimática de la ureasa. Introducción. Las enzimas son los catalizadores que determinan el patrón de las transformaciones químicas en los sistemas biológicos. Casi todas las enzimas son proteínas que median la transformación de diferentes formas de energía; por ser proteínas, son susceptibles a los mismos factores que desnaturalizan a las proteínas, como el calor, ácidos fuertes, bases fuertes, metales pesados y detergentes. Pueden tener componentes no proteicos, como carbohidratos, fosfatos, lípidos, iones metálicos o pequeñas moléculas orgánicas. Un sustrato es el compuesto específico sobre el que actúa una enzima afectando la velocidad de la reacción. La cinética enzimática se encarga de la velocidad de la reacción y del modo es que ésta cambia en respuesta a cambios en los parámetros experimentales. Un inhibidor es una sustancia que, cuando interacciona con una enzima, provoca una disminución en la actividad catalítica. La inhibición enzimática puede ser:
Reversible, si se produce una formación de un complejo enzimático inhibidor no covalente. Irreversible, si se forma un complejo covalente enzima-inhibidor. Se combinan con o se destruyen un grupo del enzima que es esencial para su actividad, o aquellos que forman una asociación no covalente muy estable. Son útiles para estudiar los mecanismos de reacción. Los aminoácidos con funciones catalíticas clave en el sitio activo, pueden ser identificados, determinado qué aminoácido se ha unido covalentemente a un inhibidor después de la inactividad del enzima. Los inhibidores suicidas son relativamente poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de un enzima específico. Pasa a través de los primeros pasos de una reacción enzimática normal, a continuación se convierte en un compuesto muy reactivo que se combina irreversiblemente con el enzima en lugar de ser transformado en el producto normal. La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea en amoniaco y bicarbonato, donde el primero se difunde a través de la capa semipermeabe de acetato butirato de celulosa interpuesta entre el reactivo y las capas de indicador para minimizar la difusión de los iones hidroxilo del colorante. La función de la enzima es degradar la urea en amoníaco y dióxido de carbono. La ureasa se produce a partir de Lactobacillus fermentum. Dicha enzima pertenece al grupo se las ureasas denominadas « ureasas ácidas”. Se activa a pH bajo. L. fermentum se cultiva en medio sintético. Después de la fermentación se filtra el cultivo, se lava con agua y las células se matan en alcohol de 50 % vol. La suspensión se seca por liofilización o por pulverización. La preparación consiste en un polvo formado por células muertas enteras que contienen la enzima. La ureasa no debe contener ni substancias ni microorganismos ni actividades enzimáticas colaterales que puedan: - ser perjudiciales para la salud, - ser perjudiciales para la calidad de los productos tratados, - llevar a la formación de productos indeseables, - ocasionar o facilitar un fraude. La ureasa se presenta bajo forma de polvo cristalino, blanco, inodoro, de un sabor más bien dulce. Las enzimas tiene un pH óptimo en el que su actividad es máxima; a valores superiores o inferiores de pH la actividad disminuye. Algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio activo de la enzima que dependen del
mantenimiento de un cierto estado de ionización, mientras que en otras zonas de la proteína algunas cadenas laterales ionizadas pueden jugar un papel esencial en las interacciones que mantienen la estructura de la proteína. El intervalo de pH n el que cambia la actividad puede proporcionar alguna pista sobre qué aminoácido está implicado. En el ambiente compacto de una proteína, el pK a de las cadenas laterales de los aminoácidos puede cambiar significativamente. Los efectos de la temperatura en las enzimas con muy complejos. Las enzimas funcionan lentamente a grados de congelación, y sus actividades incrementan al aumentar la temperatura, puede llegar a elevarse lo suficiente como para destruir la actividad enzimática. La mayoría de las enzimas muestran actividad óptima entre 30 y 40° C. Una enzima es más estable a la temperatura si se encuentra en un tejido intacto o si está en presencia de carbohidratos, pectinas u otros proteínas. Los cambios a la temperatura afectan a: a) Estabilidad de las enzimas. b) Cambios en la ionización de grupos del sistema. c) pH del medio d) Afinidad de la enzima por el sustrato e) Rapidez de ruptura del complejo E-S f) Grado de asociación de las enzimas que tienen más de una subunidad. Las enzimas pueden ser inactivadas por el calor, algunas pueden existir en forma desnaturalizada reversible. Cuando esto pasa, adopta un estado conformacional activo, y se vuelve a observar la actividad enzimática. Dada la mayor energía (temperatura) de las moléculas, se sobrepone a la desnaturalización de la enzima debido a su origen proteico. El resultado global de estas dos interacciones da como resultado un perfil con un máximo de velocidad a una temperatura dada, denominada “temperatura óptima”. La actividad de una enzima se puede estudiar in vitro, bajo condiciones controladas añadiéndole una enzima a un substrato. Sí se trabaja con la condición de que la concentración del substrato sea saturante, variando entonces la concentración de enzima, se observa que aumenta el producto de la reacción, a pH y temperatura constantes. Si se mantiene la concentración de la enzima constante y variando la concentración de substrato se obtiene una curva hiperbólica. Al principio un aumento de la concentración de substrato produce un aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si se sigue aumentando la concentración de substrato, la velocidad de reacción comienza a disminuir y a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reacción, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reacción que se obtiene a esa alta concentración de substrato se define como la velocidad máxima (V) de la reacción enzimática bajo las condiciones especificadas. La concentración de substrato (S), a la semivelocidad máxima de reacción (V/2) representa la constante de Michaelis o Km, la cual es una característica para cada enzima. La inversa de Km, o 1/Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras más pequeño sea el valor de Km, mayor será la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, éste será transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad. La ecuación de Michaelis describe la relación cuantitativa entre la velocidad de reacción y la concentración de substrato [S], si se conoce Vmax o Km: v= En donde:
v= es la velocidad de reacción observada a una concentración de substrato determinada [S] Km= constante de Michaelis en moles/lítro Vmax= velocidad máxima a concentración saturante de substrato. Si v= Vmax/2; entonces = Km+[S] = 2[S] Km =[S] De tal forma que podemos concluir que Km es igual a la concentración de substrato a la semivelocidad máxima de reacción. Objetivos. A partir de la extracción de la ureasa del frijol de soya, estudiaremos los factores que alteran a la velocidad de reacción enzimática, bajo condiciones óptimas de la ureasa. Resultados. Concentración. Tubo Blanco Problema 1 0 0.1 2 0.1 0.5 3 0.05 0.8 4 0.1 1 5 0.1 1.6
Concentración 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
1
2
Concentración. Blanco
pH Tubos
Blanco 1 2
Problema 0 0 0.6 2
3
4
5
Concentración. Problema
6
3 4 5
0.6 2 1.2
2 1.1 0.1
pH 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
1
2
3
pH Blanco
Temperatura °C Blanco
4
5
6
pH Problema
Problema
0
0.2
0.3
20
0.5
1.3
50
1
2
70
0.4
1.6
90
0.2
0.8
Temperatura 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
20
40
Temperatura Blanco
Tiempo Segundos
Blanco
Problema
60
80
Temperatura Problema
100
10
0.1
0.3
20
0.1
0.2
30
0.1
0.1
40
0.1
0.1
Tiempo 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
10
20 Tiempo Blanco
30
40
50
Tiempo Problema
Análisis de resultados. Conclusión. Bibliografía.
VARGAS RODRIGUEZ YOLANDA MARINA, OBAYA VALDIVIA ADOLFO EDUARDO, “Cálculos de parámetros de rapidez en cinética qupimica y enzimática”, UNAM, Cuautitlán, México, 2005.
WISEMAN ALAN, “Manual de biotecnología de las enzimas”, Acribia, España, 1991.
NELSON L. DAVID, COX M. MICHAEL, “Lehninger, Principios de bioquímica”, 4ª edición, Ediciones Omega, España, 2005.
