CINÉTICA ENZIMÁTICA Los principios generales de las reacciones químicas se aplican también a las reacciones enzimáticas. Por este motivo, antes de empezar con la cinética química, se van a repasar algunos conceptos básicos de cinética química.. química A continuación, se describirán los siguientes conceptos:
Cinética enzimática Modelo cinético de Michaelis-Menten Cálculo de la K M y la V max de un enzima Actividad enzimática
CONCEPTOS BÁSICOS DE CINÉTICA QUÍMICA En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A]. Así, en la reacción: sacarosa + agua
glucosa + fructosa
La velocidad de hidrólisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentración de sacarosa. Dicho matemáticamente, donde [A] es la concentración de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que ésta es una reacción de primer orden. Una reacción de
segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende
de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A1] [A2] del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A] 2
En la tabla siguiente se resumen los distintos tipos de reacción, y la parámetros cinéticos .
forma de calcular sus
ORDEN CERO
PRIMER ORDEN
[A] = -kt + [A]0
Ln[A] = -kt + Ln[A]0
SEGUNDO ORDEN
Expresión diferencial de la velocidad Ecuación integrada de la velocidad Vida media (t1/2) Representación que da lugar a una recta Signo de la pendiente Significado de la pendiente
[A] vs t
Ln[A] vs t
1/[A] vs t
negativo
negativo
positivo
-k
-k
k
Significado de la ordenada en el origen
[A]0
Ln[A]0
[A]0 es
b
eb
1/b
CINÉTICA ENZIMÁTICA estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas . Estos La cinética enzimática
estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la
velocidad máxima (V max). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción , o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v 0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa , ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción , manteniendo la cantidad de enzima constante. Para estudiar la cinética enzimática se mide el
Si representamos v 0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inical del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.
Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v 0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto , liberando el enzima libre:
En este esquema, k 1, k 2 y k 3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad . Según esto, podemos afirmar que:
v1 = k 1 [E] [S] v2 = k 2 [ES] v3 = k 3 [ES]
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima , [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es: [ET] = [E] + [ES] Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v 1= k 1[S] [ET] - k 1 [S] [ES]
Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario , según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v 1) es igual a la de su disociación (v 2+ v3):
v1 = v2 + v3 Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:
v = v3 = k 3 [ES] = constante. Como v1=v2+v3, podemos decir que: k 1[S] [ET] - k 1 [S] [ES] = k 2 [ES] + k 3 [ES]
Despejando [ES], queda que: , en donde la , siendo expresión (k 2+k 3)/k 1 se ha sustituído por K M, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la K M un parámetro cinético importante . Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es: v = v3 = k 3 [ES] = Para cualquier reacción enzimática, [E T], k 3 y K M son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:
A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << K M) v = (k 3 [ET]/K M) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, k obs, de forma que la expresión queda reducida a: v = k obs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden. A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k 3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero . Además, tanto k 3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k 3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato.
Si introducimos el parámetro V max en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten :
Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cinética sigmoidea , pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la K M) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.
