MINISTERE DE L’ENSEIGNEMANT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE BADJI MOKHTAR -ANNABA MOKHTAR -ANNABA-
Faculté des Sciences Master Euro-Magrébin : Agro Ressources Fonctionnelles
Travaux pratiques sur l’extraction des substances
naturelles
Année universitaire 2013-2014
TP1 : Extraction des huiles essentielles des feuilles du Rosmarinus officinalis (Lamiacées) Les huiles essentielles ou essences sont des substances huileuses, volatiles et odorantes, produites par de nombreuses plantes aromatiques appartenant à différentes familles comme : composées, cupressacées, lamiacées, myrtacées, ombellifères et rutacées, etc. Elles se trouvent dans les fleurs, la peau de fruits, les feuilles, la résine, les branches et le bois de diverses plantes médicamenteuses sous forme de minuscules gouttelettes. Leurs chimie est complexe mais, en générale, elles sont un mélange de terpène, d’alcools, d’aldéhydes, de cétone et d’esters. Elles sont inflammables, solubles dans les huiles et les alcools mais ne le sont pas dans l’eau, par ailleurs, elles transmettent leur parfum. Il existe différentes techniques d’extraction des essences soit par l’entraînement à la vapeur, par pression, avec des solvants ou par enfleurage. L’entraînement à la vapeur est la méthode la plus populaire, elle convient aux huiles ayant une forte composante volatile et elle se fonde sur la caractéristique que possèdent ces composantes qui peuvent être facilement transportées par des particules de vapeur d’eau en mouvement. Cette méthode consiste à mélanger la matière végétale avec de l'eau et à chauffer jusqu’à l'ébullition. Les vapeurs émergentes sont recueillies et condenser par un réfrigérant, et l'huile est séparées de l'eau du fait de leurs poids spécifique. A travers un robinet, on fait couler l’eau qui contiendra les composants hydrosolubles de l’essence (eau aromatique) et on obtient ainsi l’huile essentielle pure.
Appareil d'hydro-distillation circulatoire de type Clevenger
TP2 : Extraction des huiles fixes des graines d’Opuntia ficus indica (Cactacées) Les graisses se composent principalement de triglycérides d'acides gras et d'une faible proportion de stérols. Leurs consistance à la température ambiante peut être solide ou liquide (appelée huile fixe) selon la nature des acides gras (l'insaturation et la longueur de la chaîne), cependant les graisses animales solides contiennent principalement des acides gras saturés, mais les huiles végétales contiennent de grandes quantités d’acides gras insaturés. O CH2
C
CH2
CH2
CH2 ….. CH3
C
CH2
CH2
C
CH2 CH2 CH2 ….. CH3 3 longues chaines carbonées issue des acides gras
O O
CH
CH2 ….. CH3
O O
CH2
O
Issue du glycérol L’acide linoléique (C18:2 ω-6) et l’acide alpha-linolénique (C18:3 ω-3) sont des acides gras essentiels parce que le corps ne peut pas les synthétiser à partir de précurseurs, ils doivent être inclus dans l’alimentation Les huiles fixes et les graisses sont non-polaire dans la nature et peuvent être extraites de manière efficace et peu sélective à l'aide de solvants tels que l'éther de pétrole ou l'hexane. Ils peuvent également se dissoudre dans le chloroforme, l'éthanol ou méthanol, mais ces solvants extraits également d'autres types de composés phytochimiques. A l'échelle industrielle, ces substances peuvent être obtenues par le procédé d'expression plutôt que l'extraction par solvant où la présence de graisses et d'huiles interfère avec l'extraction d'autres constituants, une étape de dégraissage impliquant l'extraction par solvant des graisses est parfois utile. Matériels :
-
Erlenmeyer Ampoule à décanter Becher Eprouvette Entonnoir Papier filtre
-
Ballon rodé
-
Produits : -
Graine du figuier de Barbarie Méthanol, CH3OH Dichlorométhane, CH2Cl2 Chlorure de sodium, NaCl Sulfate de sodium anhydre, Na 2SO4
Protocole d’extraction selon la méthode de Folch
10g de matière végétale broyée sont mélangés avec 200ml chloroforme - méthanol (2 : 1) et agités pendant 15 à 20 min dans un agitateur à température ambiante, puis le mélange est filtré. Le filtrat est lavé avec 40 ml de NaCl à 0,9%, et séparé dans une ampoule à décanté. La phase chloroformique inférieure contenant les lipides est séchée sur Na2SO4, puis évaporé sous vide dans un évaporateur rotatif. N.B : L'utilisation de dichlorométhane à la place de chloroforme a été évaluée dans l'extraction des lipides à partir d'échantillons de différentes natures. Les résultats indiquent que le mélange dichlorométhane-méthanol peut se substituer au chloroforme-méthanol, couramment utilisé.
Graines pulvérisées CH2Cl2-MeOH (2 :1) Agitation 20min Filtrat
Marc
Lavage avec NaCl 0.9% Phase organique
Phase aqueuse
- Séchage sur Na2SO4 - Evaporation sous vide Huile
TP3 : Extraction de la caféine des feuilles du Camellia sinensis (Theacées) Beaucoup de composés organiques sont obtenus de sources naturelles par extraction. Cette méthode utilise des caractéristiques de la solubilité d’une substance organique particulière avec un solvant donné. La caféine est classée comme un alcaloïde, ce qui signifie que la molécule a des caractéristiques basiques (par la présence d’azote), en plus elle possède un noyau purine qui joue un rôle important dans les systèmes vivants. O N
N
H3C
H N
N H
O
CH3 N
N
H N
N
CH3 Purine
Caffeine
La caféine est aisément soluble dans l’eau chaude et c’est comme ça qu’elle est séparée des sources naturelles (café ou thé) mais on trouve aussi des substances complexes appelées tanins soluble dans l’eau. Ce sont des composés phénoliques de haut poids moléculaires (500 à 3000) qui ont un comportement acide. Pour cela on ajoute un sel basique tel que Na 2CO3 à la solution d’eau pour réagir avec les tanins et former un sel qui est insoluble dans les solvants organiques tels que le chloroforme ou le dichlorométhane. Bien que la caféine est soluble dans l’eau (2g/100g d’eau froide), elle est plus soluble dans le dichlorométhane (14g/100g). Donc la caféine peut être extraite de l’eau par le dichlorométhane, mais les sels des tanins restent dans la solution aqueuse. L’évaporation du dichlorométhane donne la caféine brute.
Matériels : -
Papier filtre Plaque chauffante Ampoule à décanter Eprouvette Becher Erlenmeyer Ballon rodé Entonnoir
Produits : -
Feuille du Thé Dichlorométhane, CH2Cl2 Carbonate de sodium anhydre, Na2CO3 Sulfate de sodium anhydre, Na 2SO4
Protocole d’extraction
Dans un bécher, placez 10g du matériel végétal. Ajoutez 50ml d’eau distillée et 4g de carbonate de sodium anhydre (Na 2CO3) ; chauffez jusqu’à l’ébullition sur une plaque chauffante pendant 20min. Séparez le liquide chaud par filtration dans un erlenmeyer, puis lavez le marc avec 20ml d’eau chaude et filtré une autre fois. Laissez le filtrat refroidir à la température ambiante. Transférez le filtrat dans une ampoule à décanter et ajoutez lui 10ml de dichlorométhane. Procédez à une extraction liquide-liquide. Répétez l’extraction de la phase aqueuse avec 10ml supplémentaire de dichlorométhane. Combinez-là à la phase organique (du dichlorométhane) obtenue auparavant. Ajoutez 1g Na2SO4 aux extraits du dichlorométhane combinés puis tourbillonnez le flacon. Le sel anhydre est un agent du séchage, il enlève toute eau qui peut être présente. Filtrez le dichlorométhane dans un ballon prés-pesé. Rincez le sel sur le papier filtre avec 2ml supplémentaire de dichlorométhane. Evaporez le dichlorométhane au rotavapeur, le résidu qui reste est la caféine brute. Repesez le ballon refroidi puis calculez le poids de la caféine brute et déterminez le rendement. Feuille du Thé -Eau - Na2CO3 - Chauffage Marc
Filtrat CH2Cl2 Caféine dans CH2Cl2
- Séchage sur Na2SO4 -Evaporation sous vide
Caféine
Sels de tanins dans L’eau
TP4 : Extraction des alcaloïdes totaux des graines du Peganum harmala (Zygophyllacées) Les alcaloïdes sont des composés organiques d’origine naturelle, le plus souvent végétale, azotés, plus ou moins basiques, de distribution restreinte et dotés, à faible dose, de propriétés pharmacologiques marqués mais à fortes doses, ce sont des composés toxiques. L’extraction des alcaloïdes est fondée, en règle générale, sur le fait que ces derniers existent habituellement dans la plante à l’état de sels et sur leur basicité, c'est-à-dire sur la solubilité différentielle des base et des sels dans l’eau d’une part et dans les solvants organiques d’autre part. D’où les alcaloïdes sont déplacés de leurs combinaisons salines, par l’utilisation d’une base diluée : NH4OH, Ca(OH)2, Na2CO3 puis extraits avec solvant organique peu polaire comme dichlorométhane, chloroforme, acétate d’éthyle ou éther diéthylique, et finalement purifiés par extraction liquide-liquide en utilisant des solvants non miscible après changement du pH avec des acide dilué HCl ou H 2SO4. Le matériel végétal renferme souvent des quantités appréciables des graisses, « c’est particulièrement vrai pour les graines » mais aussi de cires, de terpènes, de pigments et d’autres substances lipophiles qui peuvent perturber le processus extractif, notamment en induisant la formation d’émulsion. On évitera plus au moins totalement ces problèmes en procédant à une délipidation préalable de la drogue broyée avec l’éther de pétrole ou l’hexane, qui conviennent bien pour cette opération : il est exceptionnel que les alcaloïdes soient extractibles par ces solvants lorsqu’ils sont employés en milieu neutre. Les graines du Harmel ou rue de syrie contiennent près de 2 à 6% d’alcaloïdes les plus actives sont harmine et harmaline.
N
N O
O N H Harmaline
N H Harmine
Matériels : -
Produits :
Papier filtre Ampoule à décanter Becher Erlenmeyer Eprouvette Ballon rodé Entonnoir Tube à essai Papier pH
Gaine du Harmel Hexane, C6H14 Dichlorométhane, CH2Cl2 Ammoniaque, NH 4OH Acide sulfurique, H2SO4 Sulfate de sodium anhydre, Na 2SO4 Réactif de Mayer
-
1- Identification rapide des alcaloïdes
Dans un tube à essai introduire 1g de poudre végétale avec 5 ml d’acide sulfurique dilué à 1%, agiter pendant 2min puis filtrer et divisé le filtrat sur 2 tubes. Ajouter au 1er tube quelque goute du réactif de Mayer Observé le 2ème tube sous lampe UV à 365nm présence du harmaline et harmine.
2
Protocole d’extraction des
une
Formation d’un précipité blanc.
intense fluorescence apparait due à la
alcaloïdes selon Stas-Otto
Dans un erlenmeyer de 100ml muni de son bouchon, placer 10g de graines sèches broyés avec 50ml d’hexane et laisser macérer pendant 24h puis filtrer. Le marc obtenue est humecté avec 20ml d’ammoniaque et laisser agir pendant au moins 2min. Ajouter 50ml de dichlorométhane et agiter de façon manuelle pendant 10min Filtrer sur papier filtre directement dans une ampoule à décanté et extraire la phase organique par 50ml d’acide sulfurique à 2%. Vérifier que le pH de la phase aqueuse après extraction est bien acide (avec papier pH). Extraire une 2ème fois la phase organique avec 50ml d’acide sulfurique à 2%. Refaire l’opération jusqu’à l’épuisement de la phase organique. Réunir les extraits aqueux puis les alcalinisés avec l’ammoniaque (vérifier avec papier pH) ensuite ré-extraire la phase aqueuse avec 25ml de dichlorométhane. Refaire l’opération plusieurs fois. L’épuisement de la phase aqueuse est poursuivi jusqu’à ce que tous les alcaloïdes soient repassés en phase organique « ce qui peut se vérifier aisément par la négativité de la réaction de Mayer effectuée sur la phase aqueuse ». Sécher les extraits organiques rassemblés sur Na2SO4 puis filtrer sur papier filtre directement dans un ballon de 100ml à col rodé et évaporer à sec sous pression réduite (le résidu obtenue est appelé les alcaloïdes totaux)
Plante pulvérisée -Hexane (24h) -Filtration Extrait lipophilique
Marc -NH4OH -CH2Cl2 -Filtration Marc
Extrait CH2Cl2 Acidification, H2SO4 2% Phase aqueuse (Alcaloïdes sels)
Phase organique (Impuretés lipophiles)
-Alcalinisation, NH4OH - CH2Cl2 Phase aqueuse (Impuretés hydrophiles)
Phase organique (Alcaloïdes) -Lavage avec H2O - Séchage sur Na2SO4 -Evaporation sous vide Alcaloïdes totaux
TP5 : Extraction des flavonoïdes des fleurs d’Anthé mi s nobi lis (Astéracées) L’Analyse des flavonoïdes dans les plantes nécessite une préparation adéquate de l'échantillon pour assurer l'extraction quantitative des substances à analyser en évitant la dégradation ou la modification de leur structure chimique. Les premières étapes de l'isolement et de l'extraction des flavonoïdes comprennent habituellement une homogénéisation des échantillons, frais ou sec par broyage. En général, il est conseillé d'éviter les températures élevées qui pourraient conduire à la dégradation thermique des flavonoïdes, ainsi que de travailler avec des matériaux frais, puisque les flavonoïdes (particulièrement les glycosides) peuvent être modifiés lors de la manipulation en raison de leur sensibilité à l'oxydation ou par hydrolyse enzymatique. La macération, l’agitation, l'extraction assistée par ultrasons, Soxhlet, et l'extraction sous reflux sont certains des procédés d'extraction les plus courantes utilisant des solvants liquides. Les conditions d'extractions appliquées à la préparation de l'échantillon peuvent avoir une influence importante sur le type de flavonoïdes isolés, ainsi que sur le rendement d'extraction, et donc les facteurs tels que le pH, la température d'extraction, et le type de solvant utilisé doivent être choisi avec soin. Le type de solvant utilisé pour l'extraction des flavonoïdes dépend principalement du type de composés à extraire, c'est de savoir si elles sont aglycones, glycosides, acylés ou méthoxylés, etc, ce qui pourrait affecter leur polarité et, par conséquent leur solubilité dans le solvant choisi. Le méthanol et les mélanges méthanol-eau (le plus souvent 50 %, 70% et 80 % de méthanol aqueux) sont les solvants les plus couramment utilisés. L’Alcools provoquent l'instabilité des membranes cellulaires, ce qui facilite l'extraction des composés phénoliques, d'ailleurs, ils inactivent les enzymes comme polyphénol oxydase et contribuent ainsi à une stabilité accrue des composés extraits. L'acétone et les mélanges acétone - eau ont également été utilisés pour l'extraction d'anthocyanes, flavonols , et xanthones , ou flavanols et les proanthocyanidines , ainsi que d'autres solvants tels que l'acétonitrile pour l'extraction d' isoflavones , et l'eau acidifiée pour les anthocyanines , etc Après l'extraction, la séparation de l'échantillon peut être réalisée par filtration ou de préférence par centrifugation, suivie par une concentration sous vide à basse température afin d'éliminer l'excès de solvant. Après ces étapes initiales, en outre l’extraction liquide-liquide pourrait suivre, le plus souvent avec des solvants non polaires tels que l'hexane, le chloroforme, l'acétate d'éthyle ou l'éther di-éthylique pour éliminer les graisses, les pigments, et d'autres composés à partir de l'extrait brut, la partition qui reste peut être suivie par l'utilisation de plus de solvants polaires tels que le n-butanol.
Matériels : -
Papier filtre Ampoule à décanter Becher Erlenmeyer Eprouvette Pipette Ballon rodé Entonnoir Tube à essai
Produits : -
Fleur de camomille romaine Hexane, C6H14 Méthanol, CH3OH Dichlorométhane, CH2Cl2 Acétate d’éthyle, CH3COOC2H5 (EtOAc) Sulfate de sodium anhydre, Na 2SO4 Hydroxyde de sodium, NaOH Acide chlorhydrique, HCl Rognure de magnésium, Mg Trichlorure d'aluminium hexahydraté, AlCl 3, 6H2O
1- Test rapide des flavonoïdes
Test 1 : Dans un tube à essai, placer 0.5g de poudre végétale avec 5ml d ’acide chlorhydrique dilué à 1% et chauffer au bain marie à 65°C pendant 3min puis filtrer. Ajouter au filtrat 0.5ml de NaOH à 10% une coloration jaune apparait indique la présence des flavonoïdes. Test 2 : Dans un tube à essai introduire 0.5g de poudre végétale avec 5ml méthanol-eau (80 : 20), porter au bain marie à 60°C pendant 10min puis filtrer Prélever 2ml de l’extrait méthanolique dans un autre tube et ajouter lui 0.5ml HCl concentré et quelque rognure de magnésium (placer le tube dans un bécher remplis d’eau froide afin d’éviter l’élévation de la température) La coloration qui apparait lentement indique le type des flavonoïdes majoritaires Rouge cerise Flavonoles Orange Flavones Rouge violacé Flavanone
2
Protocole d’extraction
Dans un erlernmeyer placer 2g de fleur de camomille romaine, avec 20ml méthanoleau (80 : 20) et laisser macérer pendant 24h puis filtrer. Ajouter 40ml d’eau distillé au filtrat puis commencer l’extraction liquide-liquide avec: 20ml d’hexane pour éliminé les huiles fixes, graisses et cires 2 fois successive, ensuite avec 20ml de dichlorométhane 2 fois successive pour récupérer les composés aglycones et peu polaire, et finalement avec 20ml d’acétate d’éthyle 6 fois successive jusqu’à épuisement pour récupérer les composés moyennement polaires Toutes les phases organiques récupérées au part avant sont séchées sur Na 2SO4 puis évaporées chaqu’une à sec dans un ballon de 100ml au rotavapeur.
Plante pulvérisée - MeOH 80% (24h) -Filtration H2O
Extrait aqueux
Extrait Hydrométhanolique
Hexane Phase organique (Graisse, chlorophylle)
Phase aqueuse CH2Cl2
Phase organique (Flavonoïdes peu polaire)
Phase aqueuse
EtOAc Phase organique (Flavonoïdes moyennement polaire)
- Séchage sur Na2SO4 - Evaporation sous vide
Phase aqueuse
Marc
3- Identification des Flavonoides par chromatographie sur couche mince (CCM)
Les phases organiques évaporées à sec sont dissout dans une petite quantité de méthanol (1ml)
Prendre une plaque CCM (10×2cm) verticalement et tracer une line droite à 1cm du bord (ligne de Start), marquer 2 points pour les extraits de dichlorométhane et acétate d’éthyle. Spotter chaque extrait au point indiqué puis placer la plaque dans une cuve contenant comme éluant acétate d’ethyle-acide formique-acide acétique glacial-eau ( 100 : 11 :11 : 26) et laisser migrais jusqu’au en haut (trait de Front). Après migration, sécher bien la plaque à l’étuve ou avec un séchoir puis passé là sous la lampe UV à 254nm, en suite sous la lampe 365nm et entourer les tache visionnés avec un crayon. Vaporisé la plaque CCM avec solution éthanolique de AlCl 3, 6H2O à 1%, puis visionner à nouveau sous l’UV à 365nm
CH2Cl2
EtOAc
TP6 : Extraction des cardénolides des feuilles du Neri um oleander (Apocynacées)
Laurier rose ( Nerium oleander) est l’un des nombreuses plantes qui contiennent l’hétéroside cardiotonique (cardénolides). Les cardénolides sont des composés avec un stéroïdes aglycone relié à un cycle de lactone insaturé et aussi à trois ou quatre molécule de sucre Le composé le plus caractéristique du laurier rose est l'oléandrine, un hétéroside à structure stéroïdique, qui ressemble beaucoup du point de vue chimique et pharmacologique à l'ouabaïne et à la digoxine, deux cardiotoniques très utilisés en cas d'insuffisance cardiaque. O O O O
H OH OH
O O
H
O Oléandrine
L’extrait hydro-éthanolique des feuilles du laurier rose ne contiendra pas seulement que des cardénolides mais aussi des polyphénoles comme les flavonoïdes, et d’autre pigment comme la chlorophylle. Ces contaminants peuvent être précipités sous forme de complexe de plomb en utilisant une solution de diacétate de plomb et l’excès du plomb est éliminé sous forme de sulfate de plomb. Les cardenolides peuvent être extraites en chloroforme (ou dichlorométhane). Un prétraitement de l'échantillon pour éliminer les composés phénoliques est important car ceux-ci seraient autrement présents dans l'extrait chloroformique (ou dichlorométhane)
Matériels : -
Plaque chauffante Papier filtre Ampoule à décanter Becher Erlenmeyer Eprouvette Pipette Ballon rodé Entonnoir Tube à essai
Produits : -
Feuilles du Laurier rose Ethanol, C2H5OH Acétate de plomb, Pb(CH3COO) 2 Hexane, C6H14 Dichlorométhane, CH2Cl2 Acide sulfurique, H2SO4 Sulfate de sodium anhydre, Na 2SO4 Réactif de Baljet Trichlorure de fer, FeCl3 Réactif de Kedde
1- Identification rapide des cardénolides et composés phénoliques
Dans un tube à essai introduire 1g de poudre végétale avec 10ml d’éthanol à 70%, chauffer pendant 5 à 10min puis filtrer et divisé le filtrat en 2 tubes. -
-
2
Ajouter au 1er tube quelque goute du réactif de Baljet, une coloration orangé apparaitra indiquant la présence des cardénolides. Ajouter au 2ème tube deux goutes de solution de FeCl 3 à 5%, une coloration bleu-vert ou vert indique la présence des composés phénolique. Protocole d’extraction
Dans un erlenmeyer placer 2g de feuille sèche et broyée avec 20ml d’éthanol à 70%, fermer avec un bouchon et chauffer pendant 20 min. Laisser refroidir le mélange puis filtrer la solution, ensuite ajouter au filtrat 20ml d’acétate de plomb à 10% (les composés phénoliques doivent précipiter sous forme de complexe de plomb insoluble) Filtrer le mélange et laver le filtrat avec 10ml d’acides sulfurique à 10% jusqu’à l’arrêt de formation de précipité. Ce traitement et pour éliminer l’excès de plomb sous forme de sulfate de plomb insoluble. Filtrer une autre fois puis extraire la phase aqueuse 4 fois successive avec 10ml de dichlorométhane. Laver les phases organiques combinées avec 20ml d’eau pour éliminer toute trace d’ion. Finalement sécher les extraits organiques rassemblés sur Na2SO4 puis filtrer directement dans un ballon et évaporer à sec sous pression réduite
Plante pulvérisée - EtOH 70% -Chauffage, 20min -Filtration Extrait éthanolique
Marc
-Eau distillé - Pb(CH3COO)2 -Filtration Précipité des polyphénoles
Filtrat -Lavage avec H2SO4 2% - Filtration
Précipité insoluble (sulfate de plomb)
Filtrat CH2Cl2
Phase aqueuse
Phase organique -Lavage avec H2O - Séchage sur Na2SO4 -Evaporation sous vide Résidu des cardénolides
3- Analyse avec CCM
Le résidu des cardénolides est dissout dans 1ml de méthanol et analysé par CCM. -
On utilise comme éluant Acétate d’ethyl-méthanol-eau (81 : 11 : 8) On utilise comme révélateur spécifique des cardénolide le réactif de Kedde : Une coloration violet apparait au visible qui disparait quelque minute après.
CH2Cl2
Index Réactif de Mayer Solution A : Dissoudre 2.72g de chlorure de mercure dans 120ml d’eau distillé . Solution B : Dissoudre 10g d’iodure de potassium dans 40ml d’eau distillé. Mélanger les deux solutions et porté le volume jusqu’à 200ml avec l’eau distillé AlCl 3 Dissoudre 1g de trichlorure d'aluminium hexahydraté dans 100ml d’éthanol à 96%. Réactif de Baljet Solution A : Dissoudre 1g d’acide picrique dans 100ml d’ethanol à 96% Solution B : Dissoudre 10g d’hydroxyde de sodium dans 100ml d’eau distillé . Mélanger 5ml de la solution A avec 5ml de la solution B immédiatement avant utilisation FeCl3 Dissoudre 5g de trichlorure de fer dans 100ml d’eau distillé Réactif de Kedde Solution A : Dissoudre 3g de 3,5-dinitro acide benzoïque dans 100ml d’éthanol. Solution B : Dissoudre 8g d’hydroxyde de sodium dans 100ml d’eau distillé . Mélanger 5ml de la solution A fraiche avec 5ml de la solution B immédiatement avant utilisation
