Biyokimya_Laboratuvari_I

Marmara Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı

Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

0


çindekiler Laboratuvar Kuralları ve Güvenlik………………………………………..... Güvenlik………………………………………..... 2 Deney I Amino Asitlerin Titrasyon Eğrileri Eğrileri Ve zoelektrik Nokta Tayini ……………….….... 3

Deney II Amino Asitlerin Kağıt Kromatografisi Kromatografisi le  le Ayrılmaları ………………………….......7

Deney III Amino Asitlerin Ve Proteinlerin Bazı Özelliklerinin Özelliklerinin ncelenmesi  ncelenmesi . …………………11

Deney IV Tampon Çözeltiler……………………………… Çözeltiler…………………………………………………..…… …………………..……..…………….19 ..…………….19

Deney V Katekolün Oksidasyonuna Polifenol Oksidaz Enziminin Etkisi………………………...23

Deney VI Proteinlerin Proteinlerin Saflaştırılması Saflaştırılması Ve Karakterizasyonu…………… Karakterizasyonu…………………………………….....32 ……………………….....32

Deney VII Proteinlerin Proteinlerin Kantitatif Tayini……………………………………… Tayini………………………………………………...………….39 ………...………….39

Deney VIII Proteinlerin Proteinlerin Elektrof E lektroforez orez le  le Ayrılmaları Ayrılmaları Ve Molekül Ağırlıklarının Tayini………....…45 Tayini………....…45

Deney IX Proteinlerin N- Terminal Amino Asitlerinin nce Tabaka Kromatografisi le Belirlenmesi……54

Deney X Memeli Dokularından Dokularından DNA  zolasyonu Ve Bazı Özelliklerinin ncelenmesi……….  ncelenmesi………..…60 .…60

Kapak resmi: nsan insülin parçalayıcı enziminin beta-amiloid (mavi) ile verdiği kompleksin kompleksin yapısı


1


çindekiler Laboratuvar Kuralları ve Güvenlik………………………………………..... Güvenlik………………………………………..... 2 Deney I Amino Asitlerin Titrasyon Eğrileri Eğrileri Ve zoelektrik Nokta Tayini ……………….….... 3

Deney II Amino Asitlerin Kağıt Kromatografisi Kromatografisi le  le Ayrılmaları ………………………….......7

Deney III Amino Asitlerin Ve Proteinlerin Bazı Özelliklerinin Özelliklerinin ncelenmesi  ncelenmesi . …………………11

Deney IV Tampon Çözeltiler……………………………… Çözeltiler…………………………………………………..…… …………………..……..…………….19 ..…………….19

Deney V Katekolün Oksidasyonuna Polifenol Oksidaz Enziminin Etkisi………………………...23

Deney VI Proteinlerin Proteinlerin Saflaştırılması Saflaştırılması Ve Karakterizasyonu…………… Karakterizasyonu…………………………………….....32 ……………………….....32

Deney VII Proteinlerin Proteinlerin Kantitatif Tayini……………………………………… Tayini………………………………………………...………….39 ………...………….39

Deney VIII Proteinlerin Proteinlerin Elektrof E lektroforez orez le  le Ayrılmaları Ayrılmaları Ve Molekül Ağırlıklarının Tayini………....…45 Tayini………....…45

Deney IX Proteinlerin N- Terminal Amino Asitlerinin nce Tabaka Kromatografisi le Belirlenmesi……54

Deney X Memeli Dokularından Dokularından DNA  zolasyonu Ve Bazı Özelliklerinin ncelenmesi……….  ncelenmesi………..…60 .…60

Kapak resmi: nsan insülin parçalayıcı enziminin beta-amiloid (mavi) ile verdiği kompleksin kompleksin yapısı


1


Labor atuvar atu var Kur Ku r allar allar ı ve ve Güvenl Güvenlik ik Biyokimya laboratuvarı güz döneminde, protein saflaştırılması ve karakterizasyonu, enzim kinetiği ve DNA izolasyonu gibi biyokimyada yaygın olarak kullanılan tekniklerle ilgili genel prosedürlerin tanıtılması hedeflenmektedir. Ayrıca biyokimyada sık olarak kullanılan kullanılan bazı cihazların cihazların kullanımı öğretilecektir. Her labarotuvardan önce o gün yapılacak olan deneyi mutlaka dikkatle okuyunuz. Her deneyden önce bir kısa sınav yapılacaktır. Bu sınav sonucunda sıfır almış olan öğrenci o deneye alınmaz. Laboratuvarda çalışırken laboratuvar önlüğü ve (steril olmayan) laboratuvar eldiveni kullanılır. Önlük ve eldivenlerinizi laboratuvardan ayrılıncaya kadar çıkarmayınız. Bazı yumuşak lensler laboratuvar kimyasalları ile tepkimeye girerek rahatsızlık oluşturacağından, eğer mümkünse kontak lenslerinizi laboratuvara girmeden önce çıkarınız. Deney esnasında asistanların talimatlarını dikkatle uygulayınız. Deney bitiminde tüm cihazları kapatıp, çalıştığınız çalıştığınız yerin temizliğini iyi bir b ir şekilde yapınız. Bazı kimyasallar zehirli, mutajenik, karsinojenik veya teratojenikdir (doğum kusurlarına yol açan). Bu kimyasalların kullanımında ve atılmalarında laboratuvardaki görevlilerin yaptığı uyarıları dikkate alınız. Tüm öğrencilerin bir laboratuvar defteri tutmaları istenmektedir. Deney esnasında yaptığınız her bir ölçümü, deney aşamasını, dikkatle laboratuvar defterinize not alınız. Her deneyin tamamlanmasından sonra en geç bir sonraki deneyden bir gün önce deney raporlarınızı raporlarınızı ilgili asistana teslim ediniz. Bu raporlar aşağıdaki şekilde hazırl h azırlanmalıdır anmalıdır..

Başlık: Deneyin adı Mat eryal ve Metod: Kısaca deneyin yapılışı ve kullanılan kimyasallar kimyasallar Sonuçl Sonuçlar ar ve tart ışma: Deney sonunda elde ettiğiniz veriler ve yorumlarınız Çalışma Soruları: Çalışma sorularına verdiğiniz yanıtlar Öğrenciler deneyleri guruplar halinde yapmaktadırlar ancak her bir öğrenci kendi yorumlarını, kendi hazırladığı deney raporu ile sunmalıdır. Birbirinin aynı olan raporlar kabul edilmez. Aynı şekilde çalışma sorularına cevap verilmemiş deney raporları da kabul edilmez. Deneylerin değerlendirilmesinde değerlendirilmesinde en önem verilen verilen kısım tartışma kısmıdır. Mutlaka her bir deneyin neden gerçekleştiği (veya neden gerçekleşmediği) konusunda kendi açıklamalarınızı ekleyiniz. Her dönemde bir ara sınav yapılır. Laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney raporlarının %20’si ve ara sınavın %70’i alınarak öğrencinin vize notu saptanır. Ara sınavdan sonra yapılan deneyler için de laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney raporlarının raporlarının %20’si ve finalin %70’i alınarak öğrencinin final notu saptanır. Biyokimya laboratuvarında devam zorunluluğu %80’dir. 3 kez laboratuvara gelmeyen bir öğrenci devamsızlıktan devamsızlıktan kalmış olur o lur ve sınavlar s ınavlaraa alınmaz. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

2


DENEY I

AMNO ASTLERN TTRASYON ZOELEKTR K NOKTA TAY N

EĞRLER

VE

Amfoterik maddeler olan amino asitlerde iki fonksiyonel grup bulunur. Bunlar karboksilik asit (-COOH) ve amino (-NH 2) gruplarıdır. Bu fonksiyonel gruplar nötral ortamda iç tuz oluştururlar.

Nötra l Ortamda:

( ç Tuz) Asidik Or tamda :

(Katyon)

Bazik Or tamda:

(Anyon)

Yukarıdaki denklemlerden de görülebileceği gibi amino asitlerin amino grubu hidrojen iyonu kabul edebilir, karboksil grubu ise hidrojen verebilir. Bu sebepten dolayı amino asitler hem asitler hem de bazlarla titre edilebilirler, yani amfoterik özellik gösterirler. Amino asitlerde titre edilebilir en az iki grubun olması, en az iki denge sabiti (K) ve iki iyonizasyon sabiti (K i) olduğu anlamına gelir. zoelektrik nokta (pI), aminoasitte bulunan artı ve eksi yüklerin birbirine eşit olduğu, yani amino asidin net yükünün 0 olduğu pH değeridir, yani K 1 ve K2’nin dengede olduğu noktadır.


3


Asit-baz titrasyonları protonların kademeli olarak eklenmesi veya uzaklaştırılmasıdır. Aşağıdaki şekilde glisinin titrasyon eğrisi gösterilmiştir. Şekilden glisinin iki tamponlama aralığına sahip olduğu görülmektedir. Bunlar pH 2.34 ve pH 9.6 merkezli +/-1 pH aralığına sahip dikdörtgen alanlar olarak gösterilmişlerdir. Glisin bu pH aralıklarında tampon çözelti olarak kullanılabilir. Şekilden de görüldüğü gibi glisinin izoelektrik noktasının teorik değeri 5.97’dir.

yonlaşabilen yan zincire sahip amino asitlerde ise üç bölgeli bir titrasyon grafiği beklenmelidir.

Şekil 1.1 - Glisinin titrasyon eğrisi

KÂĞIT

Şekil 1.2- Glutamik asidin titrasyon eğrisi Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

Şekil 1.3- Histidinin titrasyon eğrisi

4


KMYASALLAR HCl, NaOH, Glisin.

YÖNTEM 50 mL 0.1 N Glisin çözeltisi hazırlanır. pH metrenin kalibrasyonu yapıldıktan sonra, hazırlanan çözeltiden 20 mL’lik bir hacim bir behere aktarılarak pH metre yardımı ile pH tayin edilir. Daha sonra 0.1N HCl ile titre edilir. Her 1 mL asit ilavesinden sonra beher karıştırılarak pH ölçümü yapılır. şleme pH göreceli olarak sabit kalıncaya kadar devam edilir. pH metrenin elektrodu destile su ile yıkanır, kurulanır. Hazırlanmış olan 0.1N Glisin çözeltisinden bir başka behere 20 mL daha alınır ve pH metre yardımı ile pH ölçümü yapılır. Daha sonra 0.1N NaOH ile titre edilir. Her 1mL baz ilavesinden sonra beher karıştırılarak pH ölçümü yapılır. şleme pH göreceli olarak sabit kalıncaya kadar devam edilir. Elde edilen değerler veri tablosuna işlenir. Asit titr asyonu veri ta blosu: Eklenen HCl (mL)

0

1

pH

Eklenen HCl (mL) pH

Eklenen HCl (mL) pH

Eklenen HCl (mL) pH

Baz titr asyonu veri tab losu: Eklenen Baz (mL)

0

1

pH

Eklenen Baz (mL) pH

Eklenen Baz (mL) pH

Eklenen Baz (mL) pH


5


VERLERN KULLANIMI Milimetrik grafik kağıdı kullanarak x eksenine eklenen asit ve eklenen baz hacmini, y eksenine ise ölçülen pH değerlerini koyarak grafiği çiziniz ve grafikten pK a ve pKb değerlerini ve pI değerini bulunuz. Grafik üzerinden elde ettiğiniz verileri teorik değerler ile karşılaştırınız.

Şekil 1.4- Glisinin asit ve bazla titrasyon eğrisi

ÇALIŞMA SORULARI 1- Glutamik asit ve histidinin pI değeri nasıl hesaplanır? Aminoasitlerin farklı pI değerlerine sahip olmalarının önemi nedir? 2- Genel amino asit denklemi kullanılarak izoelektrik noktası formülü nasıl çıkarılır?


6


DENEY II AMNO ASTLERN KÂĞIT KROMATOGRAFS LE AYRILMALARI Kromatografi bir karışımdaki maddelerin iki faz arasında farklı dağılması esasına dayanan bir ayırma yöntemidir. Sistemdeki fazlardan biri sabit (stasyoner) faz, diğeri ise hareketli (mobil) faz olarak adlandırılır. Sabit faz genellikle destek ortamı oluşturmak amacı ile kullanılırken, hareketli faz, karışımı oluşturan bileşenleri taşımak amacı ile kullanılır. Karışımı oluşturan bileşenler hareketli ve sabit faz ile farklı oranlarda etkileşerek farklı hızlarda yürürler. Bu esasa dayalı olarak ayırma yapan yöntemlere kromatografik yöntemler denir ve ayırmayı sağlayan kuvvete göre adsorpsiyon, dağılım, iyon değişim, jel geçirgenlik ve afinite (ilgi) olmak üzere beş sınıfa ayrılır. Kromatografik yöntemler biyokimya alanında, istenen bir maddenin saflaştırılması (örneğin bir bitki ya da bir hayvan dokusundan proteinlerin elde edilmesi), seyreltik çözeltilerin konsantre edilmesi, bir maddenin saflığının kontrol edilmesi ve organizmadaki metabolitlerinin belirlenmesi gibi alanlarda kullanılır.

Kâğıt kromatografisi, dağılım kromatografisinin özel bir şeklidir. Burada kullanılan Whatman kromatografi kâğıtları saf selülozdan, herhangi bir katkı maddesi kullanılmadan üretilmiştir ve düzgün gözenek boyutuna sahiptir. Whatman kâğıdı, durağan faz olarak adsorplanmış su içerir. Hareketli fazın kapiler etkisiyle ayrımı yapılacak olan maddeler Whatman kâğıdı boyunca hareketli faz ile etkileşimlerine göre farklı hızlarda ilerlerler. Karışımı oluşturan bileşenler renkli ise kâğıt üzerinde yürüdükleri yerlerde yuvarlağa yakın lekeler şeklinde görülürler. Eğer renksiz iseler üzerlerine bir reaktif püskürtülerek ya da UV ışığı altında renk göstermeleri ile görünür hale getirilirler. Leke büyüklüğü ve renk şiddeti kullanılarak kantitatif veya semi-kantitatif analiz yapılabilir.

Retensiyon Faktörü (Rf) lekelerin merkez noktasının başlangıç noktasına uzaklığının, çözücü sınırının başlangıç noktasına olan uzaklığına bölünmesi ile elde edilir. Rf değeri bir karışımı oluşturan bileşenlerin tanımlanması için kullanılır. Aynı şartlarda (sabit ve hareketli fazın cinsi, sıcaklık vb.) kromatografisi yapılan her bir maddenin karakteristik bir Rf değeri vardır.


7


Şekil 2.1- Amino asitlerin ninhidrin reaksiyonu mekanizması

KMYASALLAR Asetik asit, n-butanol, ninhidrin, aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, fenilalanin, HCl, Whatman No.1 kromatografi kâğıdı.

YÖNTEM n-butanol: asetik asit: su (65:15:25) karışımı hareketli faz olarak hazırlanır. Kromatografi tankına 10 mL (yaklaşık 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde) çözücü konulur ve tankın ağzı kapatılır. Tankın çözücü buharı ile dengeye gelmesi için kromatografi kâğıdı yerleştirilinceye kadar kapağı açılmaz.


8


Size verilen 5cm x 8cm boyutundaki Whatman No:1 Kromatografi kağıdının kısa kenarından 1.2 cm uzaklığında kurşun kalemle bastırmadan çok hafif bir çizgi çizilir ve bu çizgi üzerinde 1cm aralıkla 4 nokta işaretlenir. 1N HCl içinde çözünmüş aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, fenilalanin çözeltilerinden grubunuza verilmiş olan üçü ve amino asit karışımı bilinmeyen örnek, ayrı ayrı işaretlenmiş 4 noktaya temiz bir kapiler tüp yardımı ile tatbik edilir. Tatbik noktasının çapı 4 mm’yi geçmemelidir. Birden fazla damla tatbikinde, her damla tatbikinden sonra leke yerinin kurutulması ve ikinci damlanın ondan sonra tatbik edilmesi gereklidir. Tatbik edilen noktalar kurutulduktan sonra kâğıt, bir pens ile tutularak tatbik noktaları aşağıya gelecek şekilde tanka yerleştirilir. Kâğıdın, tankın kenarlarına değmemesine ve tatbik noktalarının çözücü ile doğrudan temas etmemesine dikkat edilir. Çözücünün ilerlemesi takip edilir ve üstten yaklaşık Şekil 2.1- Kromatografi kağıdı 0.5 cm boşluk kalıncaya kadar yürütülür (Bu işlem yaklaşık 45 dakika sürer). Çözücünün yürüdüğü mesafe hemen kurşun kalemle işaretlenerek kâğıt etüvde kurutulur. Etüvden çıkartılan kâğıdın üzerine çeker ocakta ninhidrin reaktifi püskürtülür ve kurutulmak üzere yeniden etüve konulur. Oluşan mor lekelerin çevresi kurşun kalemle işaretlenerek Rf değerleri hesaplanır ve veri tablosuna kaydedilir. Karışımda bulunan amino asitlerin hangileri olduğu hesaplanan Rf değerleri ile karşılaştırılarak tayin edilir.

Amino Asit

Leken in Rengi

Rf Değeri

Aspartik Asit Lösin Valin Arjinin Prolin Fenilalanin

Örnek Şekil 2.2- Yürümesi tamamlanmış olan kromatografi kağıdı.


9


ÇALIŞMA SORULARI 1- Rf değerlerini hesapladığınız amino asitlerin yürüme hızlarının farklı olmasının nedenlerini araştırınız. Bu amino asitlerin formülleri aşağıda yer almaktadır. 2- Glutamik asit, histidin, glisin, triptofan ve izolösinden oluşan bir amino asit karışımı, NH3:Benzen (10:90) hareketli fazı kullanılarak kağıt kromatografisi ile ayrılmak isteniyor. Amino asitlerin yürüme hızlarının nasıl olmasını beklersiniz? 3- Amino asitler organizmada protein yapısına katılmaktan başka hangi görevleri yaparlar?

Şekil 2.3- Protein yapısında yaygın olarak bulunan amino asitler. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

10


DENEY III AMNO ASTLERN VE PROTENLERN ÖZELL KLER N N NCELENMES

BAZI

I- AM NO AS TLER Amino asitler yapılarında en az bir karboksil ve bir amino grubu içeren organik bileşiklerdir. Tabiatta bulunan yaklaşık 300 amino asidin 20 tanesi protein yapısına girer. Protein yapısına giren amino asitler L, - aminoasitlerdir. Amino asitler peptid (amid) bağları ile bağlanarak polipeptid ve proteinleri oluştururlar. Amino asitler polar olmayan organik çözücülerde çok az, etanolde az, suda çok çözünürler ve nötral çözeltiler verirler. Hem asidik, hem de bazik çözeltilerde artan bir çözünürlüğü, yani amfoter bir karaktere sahiptirler. Erime ve bozulma noktaları 120300 °C aralığındadır. Saf bir amino asidin suda çözülmesiyle meydana gelen çözeltinin pH değerine izoiyonik nokta denir. Amino asitlerin ve proteinlerin izoiyonik noktada çözünürlükleri maksimumdur. 8 amino asidi (valin, lösin, izolösin, treonin, metiyonin, fenilalanin, triptofan, lizin) organizma sentezleyemez. Bunlara esansiyel amino asitler denir. Bu amino asitlerin diyetle dışarıdan alınması gereklidir. Şekil 3.1 - Alanin amino asidinin stereoizomerleri

II- PEPT DLER Bir amino asidin amino grubu, ikinci bir amino asidin karboksil grubu ile reaksiyona girdiğinde bir molekül su ayrılması ile dipeptid oluşur. Arada oluşan kovalent bağa peptid bağı denir ve rezonans gösterdiği için son derece kararlıdır. 2 amino asit bir dipeptid, 3 amino asit bir tripeptid, 10 veya daha az sayıda amino asit bir oligopeptid, 50-100 amino asit ise bir polipeptid oluşturur. Peptidlerin asidik ve bazik özellikleri zincirin iki ucundaki amino ve karboksil grupları ile yan zincirlerde bulunan iyonlaşabilen gruplara bağlıdır. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

Şekil 3.2 - Peptid bağının oluşumu

11


Şekil 3.3 - Serilglisiltirozilalanillösin pentapeptidi

Peptidler N-terminali (peptid zincirindeki serbest amino grubu) solda, C-terminali (peptid zincirindeki serbest karboksil grubu) sağda kalacak şekilde yazılırlar ve bu şekilde isimlendirilirler. Bu pentapeptid serilglisiltirozilalanillösin veya Ser–Gly–Tyr– Ala–Leu olarak isimlendirilir.

III- PROTE NLER 100’den fazla aminoasit içeren polipeptidlere protein adı verilir. Bazen belirli bir biyolojik fonksiyonu gerçekleştirmek üzere, belirli bir konformasyonu almış olmak şartı ile 100’den daha az sayıda amino asit içeren polipeptidlere de protein adı verilebilir. Canlı hücrelerin kuru ağırlığının yarısından fazlasını proteinler oluşturur. Proteinler organizmada enzimlerin, hormonların, reseptörlerin, bağışıklık sistemi ve pıhtılaşma faktörlerinin yapısında bulunurlar. Yapı ve hareket sistemi içinde görev alırlar. Amino asitler birleşerek peptid zincirini oluştururlar. Bu proteinlerin primer yapısıdır. Peptid zincirleri daha kararlı bir hale gelmek üzere temel bir üç boyutlu yapı oluştururlar. Buna proteinlerin sekonder yapısı denir. Bir polipeptidde birden fazla sekonder yapı bir araya gelerek çeşitli kimyasal etkileşmeler sonucu üç boyutlu yapıda katlanırlar. Buna tersiyer yapı denir. Birden fazla tersiyer yapıda katlanmış polipeptid zincirleri bir araya gelerek kuaterner yapıyı oluştururlar.

Şekil 3.4- Proteinlerin yapısı

Proteinin doğal yapısındaki herhangi bir değişim denatürasyon olarak adlandırılır. Sıcaklık, asitler (HCl, trikloroasetik asit, perklorik asit vb.) organik çözücüler (etanol, aseton vb.), çapraz bağlayıcılar (formaldehit, glutaraldehit), kaotropik ajanlar (üre 6-8 M, guanidin klorür 6M), indirgeyici ajanlar (2-merkaptoetanol, ditiyotreitol, iyodoasetat), Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

12


yüksek konsantrasyonda tuzlar (amonyum sülfat), ağır metal tuzları (cıva(II)klorür, bakır(II)sülfat vb.) ve bazı deterjanlar (sodyumdodesilsülfat) proteinlerde denatürasyona yol açarlar. Eğer denatüre edici faktörün ortamdan kaldırılması ile protein doğal yapısını yeniden kazanabiliyorsa buna ger i dönüşümlü denatür asyon denir. Eğer denatüre edici faktörün ortamdan kaldırılması ile protein doğal yapısını yeniden kazanamıyorsa buna geri dönüşümsüz denatür asyon denir. Denatüre olan proteinlerde kuaterner, tersiyer ve kısmen sekonder yapılar bozulur ancak primer yapı bozulmaz. Eğer polipeptid zincirinde kopmalar meydana geliyorsa buna degradasyon adı verilir ve geri dönüşümsüzdür. Düşük konsantrasyonlarda tuzlar proteinlerin çözünürlüğünü arttırırlar. MgCl 2, (NH4)2SO4 gibi iki değerlikli tuzlar, NaCl ve NH 4Cl gibi tek değerlikli tuzlara göre daha etkilidirler. Bu tuzların konsantrasyonları arttıkça proteinlerin çözünürlükleri azalır ve yüksek tuz konsantrasyonlarında proteinler çöker.

KMYASALLAR Glisin, arjinin, glutamik asit, fenilalanin, tirozin, triptofan, histidin, sistein, sistin, kazein, yumurta albümin, sülfat asidi, nitrat asidi, hidroklorik asit, sodyum hidroksit, cıva(II)klorür, sodyumnitroprussiyat, bakır(II)sülfat, bakır(II)asetat, kadmiyum sülfat ve bizmut(II)nitrat.

YÖNTEM

I- Amino Asitlerin Reaksiyonlar ı Amino asitlerin çözünür lüğü ve pH’sı: 4 ayrı tüpe az miktarda glisin, arjinin, glutamik asit ve fenilalanin alınır. Üzerine eşit miktarda destile su ilave edilir ve karıştırılır. Amino asitlerin çözünürlükleri kaydedilir. Oluşan çözeltilerin pH’ları pH kâğıdı ile tayin edilir.

Ksantoprotein Reaksiyonu: Fenil halkası içeren aromatik amino asitler derişik nitrat asidi ile muamele edildiklerinde sarı renkli nitro türevlerine dönüşürler. Nitrat asidinin cilde temas etmesiyle oluşan sararmanın sebebi budur.

Şekil 3.5- Ksantoprotein reaksiyonu


13


Tirozin, triptofan, fenilalanin, histidin ve kazein’in sulu çözeltilerinden yaklaşık olarak 2 mL alınarak üzerine 5 damla derişik nitrat asidi konur. Reaksiyona zor giren fenilalanin tüpüne 5 damla daha nitrat asidi ve 5 damla derişik sülfat asidi eklenir. Tüpler su banyosunda ısıtılır ve renk değişimi kaydedilir. Daha sonra tüpler bir portüpe alınarak soğumaya bırakılır. Tüpler oda sıcaklığına geldiğinde %10 NaOH çözeltisi, ortam bazik oluncaya kadar eklenir. Renk değişimi kaydedilir.

Millon Reaksiyonu: Millon Reaktifi: 15 g HgCl 2, 100 mL %50 HNO3 içinde çözülerek hazırlanır. Fenol içeren bileşikler bu reaksiyonu verir. Tirozin amino asidi fenol grubu içeren tek amino asit olduğundan bu reaksiyon tirozine özgüdür. Önce tirozinin fenol grubu reaktif çözeltisindeki nitrik asit tarafından nitratlanır. Daha sonra nitratlanmış tirozin molekülü çözeltideki cıva (I) ve cıva (II) iyonları ile kırmızı renk verir. Ayrı tüplerdeki 3 mL tirozin ve kazeinin sulu çözeltilerine birkaç damla millon reaktifi eklenir ve tüpler kaynar su banyosunda ısıtılır. Renk oluşumu kaydedilir.

Nitr opr ussiyat Reaksiyonu Sülfidril grupları içeren bileşikler ağır metaller ve sodyum nitroprussiyat ile koyu renkli kompleksler oluştururlar. Sistein serbest –SH grupları içerdiğinden bu reaksiyonu verir. Sistin serbest –SH grubu içermediğinden bu reaksiyonu vermez.

Şekil 3.6- Sistin oluşumu

Şekil 3.7- Sodyum n itroprussiyat

2 tüpe ayrı ayrı sistein, sistin ve kazein çözeltileri alınır ve üzerlerine az miktarda %10 NaOH ve aynı hacimde %2 sodyum nitroprussiyat çözeltisi eklenir. Renk değişimi kaydedilir. Kazein tüpüne bir miktar derişik HCl eklenir ve gözlemler kaydedilir.


14


Triptofan Reaksiyonu ki ayrı tüpteki az miktarda triptofan ve glisin çözeltileri üzerine eşit hacimde derişik asetik asit konulur. Bu karışımın üzerine damla damla, tabaka oluşturacak şekilde derişik sülfat asidi ilave edilir. Turuncu-mor halka oluşumu triptofan varlığını belirtir. Bu triptofana özgü bir denemedir.

Aminoasitler in ver dikler i genel tanınma reaksiyonları: Reaksiyon

Reaktif

Amino asit

Renk

Ninhidrin Reaksiyonu

Ninhidrin

Serbest NH2 Grubu

Mor

Biüret

Alkali CuSO4

Amid Bağları

Mavi

Lowry Reaksiyonu

Fosfomolibdat

Tirozin

Mavi

Millon Reaksiyonu

HNO3, HNO2, HgNO3

Tirozin

Kırmızı

Ksantoprotein

Kaynar HNO3

Triptofan, Tirozin, Fenilalanin

Sarı

Ehrlich Reaksiyonu

Der. HCl içinde pdimetilamino benzaldehit

Triptofan

Mavi

Sakaguchi Reaksiyonu

- Naftol, NaOCl veya NaOBr

Arjinin

Kırmızı

Nitroprussiyat Reaksiyonu

Sodyum nitroprussiyat, NaOH

Sistein

Kırmızı

Su llivan reaksiyonu

Sodyum-1,2-naftokinon-4sülfonat ve NaHSO4

Sistein

Kırmızı

Kur şun Sülfür

NaOH, Seyreltik Kurşun

Reaksiyonu

asetat

Sistein

Siyah

Hopkins-Cole Reaksiyonu

Glioksilik asit, Sülfürik Asit

Triptofan

Mor

Pauly Reaksiyonu

Sülfanilik asit, HCl, Sodyum Histidin, Triptofan karbonat, Sodyum nitrit


Histidin: Sarı Triptofan: Mor

15


II- Proteinlerin Reaksiyonları Proteinler ile ilgili denemelerde yumurta albümin çözeltisi kullanılacaktır. Yumurta albümin çözeltisinin hazırlanması için bir yumurtanın akı, sarısından ayrılarak bir behere aktarılır. Hacminin altı katı kadar su ilave edilir ve çözeltinin köpürmemesine dikkat edilerek karıştırılır.

Proteinlerin Denatürasyonu: Isının etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve bir süre sıcak su banyosunda tutulur. Gözlemler kaydedilir. Konsantre asitlerin etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve üzerine hacminin iki katı kadar derişik nitrik asit ilave ederek gözlemler kaydedilir. Ağır metal tuzlarının etkisi: 4 ayrı tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve üzerlerine az miktarda bakır(II)asetat, kadmiyumsülfat ve bizmut(II)nitrat ilave edilerek gözlemler kaydedilir.

Biüret reaksiyonu: ki veya daha fazla peptid bağı ihtiva eden bileşikler alkali bakır sülfat ile menekşe veya mor renkli kompleksler oluştururlar. Rengin koyuluğu proteindeki peptid bağlarının sayısına bağlıdır. Bu test, peptid bağlarını belirlediğinden amino asitlerle reaksiyon vermez. Bu reaksiyon ayrıca azot veya karbon atomuna bağlı iki karbonil grubu ihtiva eden bileşiklerle de pozitif sonuç verir. Bu test proteinlerin kantitatif olarak tayini için de kullanılmaktadır ancak bu amaçla kullanılan biüret reaktifi sodyum potasyum tartarat, bakır sülfat ve potasyum iyodür içerir. Üç ayrı tüpe az miktarda glisin, yumurta albümin ve kazein çözeltileri alınır. Tüplere aynı hacimde %10 NaOH çözeltisi ve beşer damla %1 CuSO 4 çözeltisi eklenir ve renk değişimi kaydedilir.

Şekil 3.8 - Biüret reaksiyonu sonucunda oluşan bakır-protein kompleksi


16



17


ÇALIŞMA SORULARI 1- Glu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly dizisine sahip peptidi çiziniz. Bu peptidin pH 3, 8 ve 11’deki net yükü nedir? (Bir grubun pKa değerinin altında ve üstünde net yük değişiminin nasıl olduğunu hatırlayın). Bu peptidin pI değeri ne olabilir? 2- Organizmada görev yapan önemli peptidlere birkaç örnek veriniz ve ne görev yaptıklarını belirtiniz.

Şekil 3.9- Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının pK a değerleri Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

18


DENEY IV TAMPON ÇÖZELT LER Zayıf bir asidin kendisini ve anyonunu (konjuge bazını) veya zayıf bir bazın kendisini ve katyonunu (konjuge asidini) yan yana içeren çözeltilere tampon çözeltiler adı verilir. Tampon çözeltiler az miktarda asit veya baz ilavesiyle belirgin bir pH değişimi göstermezler. Bir çözeltinin tampon etkisini gösterebilmesi için ayrı ayrı hem H + iyonu veren hem de H + iyonu alan tanecikleri yeterli konsantrasyonda içermesi gereklidir. Tampon çözeltiler sabit pH aralıklarında çalışmak üzere hazırlanırlar. Henderson-Hasselbalch Denklemi (A-: Tuz / HA: Asit)

Bu denklem bir çözeltinin teorik pH değerini hesaplamak için kullanılır. Denklemden de görülebileceği gibi tamponu oluşturan maddeler arasında oran değişiklikleri yapılarak pH’sı farklı tamponlar elde edilebilir. Tampon çözeltiyi oluşturan maddeler her oranda değil sadece belirli bir oranda en iyi tampon etkisini gösterirler. A - /HA oranı bire eşit olduğunda log1 = 0 olacağından pH değeri de pKa değerine eşit olur. Bu pH değerine tamponun optimum pH değeri denir. Bu pH değerinin dışındaki değerlerde tamponun etkisi zayıflar. Tamponlar optimum pH değerlerinin bir birim altı ve bir birim üstündeki pH aralıklarında en etkili olarak kullanılabilirler Tamponlar biyolojik ortamların hazırlanmasında faydalanılan çözeltilerdir. Canlı organizmalarda pH değerleri son derece küçük bir aralıkta sabittir ve bu değerler sıkı bir şekilde kontrol altında tutulur. Çünkü pH’daki değişiklikler enzimler, hücre membranları ve nükleik asitler gibi birçok moleküler yapının yüklü bölgelerine etki eder ve fizyolojik aktivitelerini etkiler. pH değerlerindeki 0.5 birimlik bir değişim canlının yaşamını tehlikeye sokar. Organizmanın farklı bölgeleri farklı pH değerlerine sahiptir. (kan: 7.4, mide özsuyu 1.5, pankreas özsuyu 8.0, beyin omurilik sıvısı 7.4 gibi). Bu bölgelerdeki pH farklı tampon sistemlerince korunur. Bu sistemlere örnek olarak bikarbonat/karbonik asit (HCO3 /H 2CO3), protein/proteinat, oksihemoglobin/protonlanmış oksihemoglobin (HbO2 /HHbO2) ve fosfat (HPO 4 /H 2PO4 ) tampon sistemleri verilebilir. Organizma sıvılarının asit baz dengesinin asit tarafına kaymasına asidoz, alkali tarafına kaymasına ise alkaloz denir. Asit metabolizma ürünleri artarsa, oluşan H + iyonları HCO3 /CO2 tarafından tutulur ve H 2CO3 meydana gelir. Bunun dissosiasyonu ile oluşan H + iyonları diğer tamponlarca tutulur. Bir kısmı da karbondioksit ve suya dönüşür. Karbondioksidin artması nedeniyle pH 7.4’ün altına düşer. HCO 3- konsantrasyonunun azalması ile meydana gelen bu duruma metabolizma asidozu denir. Diyabette, açlıkta ve karbonhidratsız rejimlerde görülen asidozlar buna örnektir. HCO 3- konsantrasyonunun artması ile metabolizma alkalozu meydana gelir. Aşırı sodyum bikarbonat alınması ve şiddetli kusma sonucu midede HCl kaybı ile oluşan alkalozlar buna örnektir. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

19


KMYASALLAR Monopotasyum fosfat (KH 2PO4), disodyum fosfat (Na2 HPO4), NaOH, HCl.

YÖNTEM Tampon çözelti hazırlama tablolarından yararlanarak 50 mL pH 7.4 Fosfat (Sørensen) tamponunu hazırlayınız. Hazırladığınız tamponun pH değerini ölçünüz. Eğer 7.4 değerinden farklı bir değere sahip ise 1N NaOH veya 1N HCl kullanarak pH’sını 7.4’e getiriniz.

ÇALIŞMA SORULARI 1- Bir tampon litrede 0.01 mol laktik asit (pKa=3.86) ve 0.05 mol sodyum laktat içermektedir. a- Tamponun pH değerini hesaplayınız. b- 1 L tampona 5 mL 0.5 M HCl eklendiğinde pH değişimi ne olur? 2- Organizma sıvılarında pH düzenlemesinde en önemli görev üstlenen organlar nelerdir ve bunu hangi yollarla gerçekleştirirler.


20



21



22


DENEY V KATEKOLÜN OKSDASYONUNA OKS DAZ ENZ M N N ETK ETK S

POLFENOL

Enzimler canlı organizmalardaki reaksiyonları katalizlerler. Laboratuvar ortamında çok yüksek veya çok düşük basınç, pH ve sıcaklıkta oluşan kimyasal değişme ve reaksiyonlar, canlı hücrelerin bozulmadan kalabildikleri dar basınç, pH ve sıcaklık aralığında, ancak enzimler aracılığıyla gerçekleştirilebilirler. Küçük bir grup katalitik RNA moleküllerinin haricinde tüm enzimler protein yapısındadırlar. Katalitik aktiviteleri genellikle proteinin doğal yapısında olmasına bağlıdır. Eğer bir enzim denatüre olur veya alt ünitelerine ayrılırsa katalitik aktivitesi genellikle genellikle kaybolur. Bazı enzimler aktivite göstermek için bir veya daha fazla anorganik iyona veya kompleks organik veya metallorganik bileşiklere ihtiyaç gösterirler. Bu iyon ya da bileşiğe kofaktör adı verilir. Organik bileşik enzimin protein kısmı ile çok sıkı bir şekilde bağlanmış ise prostetik grup , çok sıkı bağlanmamış ve dissosiye olabiliyorsa koenzim adını alır. Katalitik olarak etki gösteren tam enzime holoenzim denir. Holoenzimin protein kısmına ise apoenzim adı verilir.

Şekil 5.1 - Enzim yapısı

Enzimin etki ettiği bileşiğe substrat adı verilir. Enzimin katalizlediği reaksiyonu proteinin tamamı değil, sadece “ aktif bölge” adı verilen belirli bir b ir bölgesi etkiler. E=Enzim, S= Substrat, ES= Enzim-Substrat kompleksi ve P= Ürün olmak üzere enzim reaksiyonu şu şekilde özetlenebilir.


23


Böyle bir reaksiyon genel kimyasal reaksiyon mekaniğine ve kinetiğine uyar. Diğer katalizörlerde de olduğu gibi enzimler reaksiyonun yönünü değiştirmezler sadece reaksiyonun hızına etki ederler. Reaksiyona ilerleyebileceği daha düşük aktivasyon enerjili ara yollar sunarak reaksiyonu hızlandırırlar.

Şekil 5.2 - Enzimli reaksiyonun serbest enerji d iyagramı

Şekilde

GEnzimsiz enzimsiz reaksiyonun reaksiyonun aktivasyon aktivasyon enerjisi, enerjisi, reaksiyonun reaksiyonun aktivasyon aktivasyon enerjisidir. enerjisidir.  H Reaksiyon entalpisidir entalpisidir..

GEnzimli ise enzimli

Reaksiyon başında substrat konsantrasyonu yüksek, ürün konsantrasyonu ise ihmal

edilecek kadar azdır. ES kompleksi büyük bir serbest enerji düşmesi ile ayrıldığından k 4 ihmal edilebilir. Öyleyse ES oluşumunun net hızı, ES bozunmasının net hızına eşit olacaktır ki denklem 1’e göre bu eşitlik; olur. Reaksiyonun Reaksiyonun başında [P] ihmal edilebilir olduğundan,

şeklinde yazılabilir. yazılabilir. Burada K m , kontrollü şartlarda reaksiyonun maksimum hızının yarısına eşit hız veren substrat konsantrasyonudur ve Michaelis-Menten sabiti olarak adlandırılır.


24


[E0], başlangıçtaki toplam enzim konsantrasyonu ve reaksiyonun herhangi bir anındaki enzim konsantrasyonu [E] ise, [E] = [E 0] – [ES] olur. Denklem 3 aşağıdaki şekle dönüşür;

Maksimum hız toplam top lam enzim konsantrasyonu ile orantılı olduğu kadar, başlangıç hızıyla da orantılıdır. Böylece V maks = K3 [E0] olduğundan denklem 4’te yerine konulursa aşağıdaki denklem elde edilir.

Denklem 5’te başlangıç hızı V 0 yalnız bırakıl b ırakılacak acak olursa;

eşitliği bulunur. Denklem 6’ya göre V 0 ile [S] arasında çizilen grafik aşağıdaki gibi olur. Bu eğriye Michaelis-Menten eğrisi denir.

ichaelis-Menten eğrisi Şekil 5.3- Michaelis-Menten Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

25


Düşük substrat konsantrasyonlarında denklem 6’nın paydasında K m >> [S] olduğunda [S], Km yanında ihmal edilebilir ve = V maks [S] / Km olur. Yüksek substrat konsantrasyonlarında denklem 6’nın paydasında K m << [S] olacağından Km, [S] yanında ihmal edilebilir, V 0= Vmaks olur ve denklem 6’daki eşitlikle bölünerek doğru denklemi verecek şekle dönüştürülebilir.

Y eksenine 1/V0, X eksenine de 1/[S] değerleri yerleştirilerek çizilen grafikte elde edilen doğrunun eğimi K m /Vmaks’a ve Y eksenini kesen nokta 1/V maks’a eşit olur. K m değeri de grafikte gösterildiği şekilde bulunabilir. Bu eğriye Lineweaver-Burk eğrisi adı verilir. Eğer V0 değerine karşı V 0 /[S] grafiği çizilecek olursa bu eğriye Eadie-Hofstee eğrisi elde edilir. Km değerlerinden enzimlerin ayırt edilmesinde, ES komplekslerine ilişkin sabitlerin bulunmasında faydalanılır K m substrat konsantrasyonu birimi cinsindendir (mol/L veya mmol/L).

Şekil 5.4- Lineweaver-Burk eğrisi

Şekil 5.5- Eadie-Hofstee eğrisi

Enzim aktivitesinin ölçülmesinde çeşitli birimler kullanılır. En çok kullanılan aktivite birimi enzim ünitesidir (aktivite).

Enzim ünitesi (U): 25°C’de 1 dakikada optimum şartlarda 1µ mol substratı ürüne çeviren enzim miktarıdır. Spesifik aktivite (U/mg protein): 1 mg protein başına enzim ünitesidir. Enzimin saflık derecesinin bir göstergesidir. Molar Aktivite: Bir tek enzim molekülü tarafından birim zamanda ürüne çevrilen substrat molekülü sayısıdır. Dönüşüm sayısı olarak da adlandırılır. Katal: 1 saniyede 1 mol substratı reaksiyona sokan enzim miktarıdır. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

26


Enzim miktarı çok küçük olduğundan direkt olarak ölçmek zordur. Optimum şartlarda katalizledikleri reaksiyon hızları diğer şartlar sabit kalmak üzere, enzim konsantrasyonu ile orantılıdır. Böylece enzim konsantrasyonu hız ölçülmesi ile tayin edilebilir. Enzimle katalizlenmiş reaksiyonların hızı inhibitör adı verilen bazı maddeler tarafından azaltılır veya tamamen durdurulur. Buna enzim inhibisyonu denir. Enzim inhibisyonu geri dönüşümlü veya dönüşümsüz olabilir. Polifenol oksidaz enzimi doğada yaygın olarak bulunan, bakır içeren bir enzimdir. Meyve ve sebzelerde hasar görmüş bölgelerin hava ile teması sonucu kararması ve cildin esmerleşmesi (melanin sentezi) gibi reaksiyonlardan sorumludur. Enzimin aktivitesi, fenollerin katekollere orto-hidroksilasyonu ve katekollerin orto-kinonlara oksidasyonu olacak şekilde ikiye ayrılabilir. Aktif merkezde substratın bağlanabileceği bir boşluk vardır ve bu merkezdeki histidin kalıntıları bakır bağlamada görev yaparlar.

Şekil 5.6- Polifenol oksidaz enziminin 3 boyutlu yapısı ve aktif merkezi

Bu denemede katekolün benzokinona enzimatik dönüşüm reaksiyonunun kinetikleri incelenecektir.


27


Şekil 5.7- Polifenol oksidaz enziminin katalizlediği oksidasyon reaksiyonunun mekanizması

Bu reaksiyonda kullanılan katekol çözeltisi renksizdir, oluşan 1,2-benzokinon ise kahverengidir. Böylece oluşan ürünün miktarı kolorimetrik olarak izlenebilir. 1,2benzokinon 480 nm dalga boyunda maksimum absorbans verdiğinden bu dalga boyunda yapılan spektrofotometrik ölçüm yardımı ile belli bir zamanda çözeltide bulunan ürün miktarı hesaplanabilir.

Şekil 5.8- Spektrofotometrenin çalışma prensibi

Spektrofotometrik ölçümde bir ışık kaynağı geniş bir spektrumda ışık yayar, monokromatör belirli bir dalga boyundaki ışığı seçer ve örnek küvetine gönderir. Işık küvetten geçerken absorblayıcı moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak bir kısmı absorblanır ve çözeltiden geçen ışık bir dedektör tarafından ölçülür. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

28


Bu denemede amaç iki anahtar parametrenin bulunmasıdır. Bunlar maksimum hız (V maks) ve Michaelis-Menten sabitidir (K m).

KMYASALLAR Sitrik asit-fosfat tamponu pH 6, katekol, benzokinon.

YÖNTEM Ham enzimin hazırlanması: Patatesler soyulur ve bıçakla küçük parçalara ayrılır. Daha sonra blender cihazı yardımıyla ve 200 mL pH 6 sitrik asit - fosfat tamponu varlığında homojenize edilir. Enzimlerin aktivitesi sıcaklıktan etkilendiği için bu aşamadan sonraki tüm işlemler hızlı bir şekilde ve buz üzerinde gerçekleştirilir. Elde edilen homojenizat, bir buz banyosuna önceden yerleştirilerek soğutulmuş erlen ve huni yardımıyla cam pamuğundan süzülür ve süzüntü deney süresince buz banyosunda tutulur. Substrat konsantrasyonunun reaksiyon hızına etkisi: 6 adet deney tüpü aşağıdaki tabloda gösterildiği şekilde (enzim konulmadan) hazırlanır. Enzim çözeltisi spektrofotometrik ölçümden hemen önce konulacaktır. Tüp No 1 2 3 4 5 6 7

Substrat Katekol 0.01 M (mL)

Su (mL)

Enzim (µL)

0 1 2 3.5 5 7 9

10 9 8 6.5 5 3 1

500 500 500 500 500 500

Absorbans 1. dk.

2. dk

3. dk

4. dk

5.dk

6.dk

Grafikten Hesaplanan Hız

Sıfırlama yapılır

2-7 numaralı tüplerin dakika başına verdikleri absorbans değeri ölçülecektir. Bu işlem şöyle yapılır; 1 numaralı tüpe 500µL enzim konulur ve tüp iyice karıştırılarak içeriği iki spektrofotometre küvetine aktarılır. Bu çözeltiler bizim şahit çözeltilerimiz olacaktır. ki şahit küveti kullanılarak spektrofotometre 480 nm dalga boyunda sıfırlanır. Daha sonra 2 numaralı tüpe enzim konulur ve enzim konulduğu anda kronometre çalıştırılır . çinde enzim bulunan 2 numaralı tüp iyice karıştırılır, içeriği bir spektrofotometre küvetine aktarılır ve spektrofotometreye yerleştirilir.


29


Bu sırada kronometre takip edilerek ilk enzimin konulmasından tam 30 saniye sonra 3 numaralı tüpe 500 µL enzim konulur ve iyice karıştırılarak içeriği bir spektrofotometre küvetine aktarılır ancak spektrofotometreye yerleştirilmez. Kronometre 01:00 değerini gösterdiğinde spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir. Spektrofotometrenin içindeki 2 numaralı çözeltiyi içeren küvet çıkarılır ve 3 numaralı çözeltiyi içeren küvet yerleştirilir. Kronometredeki değer 01:30 değerini gösterdiğinde spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir. Küvetler değiştirilerek her bir küvet için dakikada bir absorbans değeri ölçülür. Her bir küvet için 6 değer alınıncaya kadar bu işlem devam eder. Daha sonra aynı işlemler 4-5 ve 6-7 numaralı tüpler için de tekrarlanır. Her işlemin başında spektrofotometre şahit çözeltiler kullanılarak sıfırlanır.

Ekstinksiyon sabitinin bulunması: 100 mL 0.01 M benzokinon çözeltisi hazırlanarak 480 nm dalga boyundaki absorbansı ölçülür. Benzokinon zor çözündüğünden bu çözelti deney başladığında ha zır lanır ve ölçümü deneyin sonund a yapılır . VERLERN KULLANIMI 2-7 numaralı tüpler için 480 nm’de elde edilen absorbans değerleri ayrı ayrı, zamana karşı grafiğe çizilir.

Şekil 5.9 - Absorbans- zaman grafiği

Her grafikte, hiperbolik eğrilere teğet doğrular çizilir ve bu doğruların eğimleri hesaplanır. Eğim = A/ t, A= .c.l olduğundan her bir küvet için başlangıç hızı V = m / ε . l denkleminden hesaplanır. 2-7 numaralı tüplerin her biri için katekol konsantrasyonları hesaplanır. Bulunan başlangıç hızları ile substrat konsantrasyonları arasında Michaelis-Menten eğrisi çizilir. Bu hız ve substrat konsantrasyonları için Lineweaver-Burk ve Eadie-Hofstee grafikleri çizilerek V maks ve Km değerleri hesaplanır.


30


ÇALIŞMA SORULARI 1- Substrat ile doygun olduğu zaman 10 -6 M konsantrasyonundaki karbonik anhidraz enzimi saniyede 0.6 mol/L karbonik asit oluşumunu katalizler. Buna göre dönüşüm sayısı nedir. 2- Geri dönüşümlü enzim inhibisyonu, inhibitörün enzime bağlanmasına göre yarışmalı, yarışmasız ve yarı-yarışmalı olmak üzere üçe ayrılabilir. Aşağıda verilen şekilleri ve grafikleri inceleyerek her bir durum için inhibitör konsantrasyonu değişimi ile V maks ve Km değerlerinin nasıl değiştiklerini yorumlayınız.

Şekil 5.10 - Enzim inhibisyon mekanizmaları Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

31


DENEY VI PROTE NLERN SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTER ZASYONU I- Pr oteinlerin Ekstr aksiyonu ve Diyaliz Bir proteinin yapısının ve özelliklerinin araştırılabilmesi için, o proteinin saf bir şekilde elde edilmesi gerekir. Proteinler kolaylıkla denatüre olabildiklerinden ve biyolojik materyallerde (örneğin vücut sıvılarında ve doku ekstraktlarında) kompleks bir karışım halinde bulunduklarından, saflaştırılmaları oldukça zordur. Proteinlerin elde edilebildiği kaynaklar genellikle dokular ve hücrelerdir. Bir proteinin saflaştırılmasında yapılacak ilk işlem hücrelerin parçalanarak içerdikleri proteini bir çözeltiye almaktır. Bu çözeltiye ham ekstrakt denir. Bu ham ekstrakt istenen proteinin yanı sıra pek çok başka protein ve molekül de içermektedir. Daha sonra proteinlerin çözünürlük farkları, büyüklükleri, elektriksel yükleri ve polariteleri gibi çeşitli özelliklerinden yararlanılarak protein ekstraktı fraksiyonlara ayrılır. Bu özelliklere dayanarak proteinlerin saflaştırılması ile ilgili pek çok yöntemler kullanılmaktadır. Bunlara örnek olarak kademeli santrifüj, tuzla çöktürme, aseton ve alkolde soğukta çöktürme, ultrafiltrasyon ve çeşitli kromatografik yöntemler verilebilir. Aşağıda ham ekstrakttan bir enzimin kromatografik yöntemler kullanılarak saflaştırılması için örnek bir yöntem verilmiştir. abcde-

Ham ekstraktın elde edilmesi Tuzla (amonyum sülfat) çöktürülmesi yon değişim kromatografisi Jel geçirgenlik (moleküler elek) kromatografisi Afinite (ilgi) kromatografisi.

Proteinler saflaştırma işlemi sırasında her bir basamakta çeşitli kayıplara uğrarlar ve aktiviteleri azalır. Ancak istenilen enzim her bir basamakta daha saf hale gelir, bu nedenle daha derişik hale gelir ve spesifik aktivitesi artar. Enzimlerle çalışıldığında ortamın pH’sı ve sıcaklığının çok iyi bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. şlem Ba samağı

Fraksiyon Hacmi (mL)

Total Pr otein (mg)

Aktivite (Ünite)

Spesifik Aktivite (Ünite/mg)

Tu zla Çöktürme

1400 280

10000 3000

100000 96000

10 32

yon Değişim

90

400

80000

200

Jel Geçirgenlik

80

100

60000

600

Afinite

6

3

45000

15000

Ham Ek strakt


32


yon Değişim Kromatografisi

Şekil 6.1- yon değişim kromatografisi Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

33


J el Geçirgenlik (moleküler Elek) Kr omatografisi

Şekil 6.2 - Jel geçirgenlik (moleküler elek) kromatografisi Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

34


Afinite ( lgi) Kr omatografisi

Şekil 6.3 - Afinite (ilgi) kromatografisi


35


Tuzla çöktürme işlemi sonunda ortamda bulunan tuzlar saflaştırma işleminin ileri safhalarında ve protein karakterizasyonu işlemleri sırasında deneyleri bozarlar. Bu nedenle tuzların ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu amaçla jel filtrasyon, ultra santrifüj ve diyaliz yöntemleri kullanılabilir. Büyüklük farkına dayanan bir ayırma yöntemi olan diyaliz basit ve pahalı olmayan bir işlemdir.

Şekil 6.4 - Diyaliz

Diyaliz işleminde yarı geçirgen selüloz membranlar kullanılır. Bu membranların gözenek büyüklükleri bellidir ve sadece belli bir boyuttaki moleküllerin geçmesine izin verirler. Diyaliz tamponu olarak tuz konsantrasyonu düşük olan çözeltiler kullanılır. Membranın içindeki tuz konsantrasyonu, membranın dışındaki diyaliz tamponunun tuz konsantrasyonundan daha fazla olduğu için membran içindeki tuzlar membran dışına doğru hareket ederler. Proteinlerin molekül ağırlıkları tuzlar ile kıyaslandığında çok daha büyük olduğundan membranın gözeneklerinden geçemezler ve membran içinde kalırlar. Bu işlem diyaliz tamponu ve membran içindeki çözelti arasında bir tuz konsantrasyonu dengesi oluşuncaya kadar devam eder. Bu dengenin oluşması yaklaşık 4–6 saat kadar sürer. Dengeye ulaşıldığında diyaliz tamponu tazelenir, böylece denge bozulur ve tuzlar membran dışına çıkmaya devam eder. Bu şekilde protein molekülleri tuzdan kurtarılmış olur.


36


KMYASALLAR Potasyumdihidrojen fosfat, disodyumhidrojen fosfat, amonyum sülfat, üre, tiyoüre, trishidroksimetil aminometan, diyaliz membranı.

YÖNTEM Bu deneyde 3 farklı dokudan protein ekstraksiyonu yapılacaktır. Bu amaçla dana karaciğeri, yumurta akı ve yumurta sarısı protein kaynakları olarak kullanılacaktır.

Liziz tamponu: 9 M üre, 0.04 M Tris ve %0.1 SDS çözeltisinden oluşur. 0.484 g Tris ve 54.63 g üre 100 mL’lik bir balonjojeye alınır ve pH 7.4 Sørensen tamponu ile hacim tamamlanır. Daha sonra homojenizata 1 mL %10 SDS çözeltisi ilave edilir. Homojenizasyon Karaciğer yıkanır, parçalara ayrılır ve liziz tamponu varlığında blender cihazı kullanılarak daha küçük parçalar haline getirilir. Daha sonra homojenizatör yardımı ile homojenize edilir. Homojenizata 1 mL %10 SDS çözeltisi ilave edilerek karıştırılır. ve santrifüj tüplerine alınarak santrifüj edilir. Süpernatant (tüpün üst kısmındaki sulu çözelti) dekante edilerek bir behere alınır. Yumurta akı ve sarısı sıvı oldukları için bu homojenizasyon basamağına gerek duymazlar. Behere alınan yumurta akı ve sarısı üzerine liziz tamponu ve az miktarda %10 SDS ilave edilir. Köpürmemesine dikkat edilerek karıştırılır ve santrifüj edilerek süpernatantlar ayrı ayrı bir behere toplanır.

Çöktürme Tuzla çöktürme: Homojenize edilmiş olan çözeltilerden 10 mL alınır ve aşağıda verilmiş olan doygunluk hesabı tablosundan yararlanılarak istenen amonyum sülfat doygunluğunda çöktürme yapmak için gerekli olan amonyum sülfat miktarları hesaplanır.


37


Gerekli miktar tartıldıktan sonra, katı amonyum sülfat protein örneklerini içeren tüplere eklenir, dikkatle karıştırılır ve santrifüjlenir. Santrifüj sonunda süpernatant dekante edilerek atılır ve presipitat (çökmüş olan katı kısım) üzerinden deneye devam edilir. Asetonla çöktürme: Homojenize edilmiş olan çözeltilerden 4 mL alınır ve üzerine 8 mL soğuk aseton ilave edilir. Dikkatle karıştırılır ve santrifüj edilir. Santrifüj sonunda süpernatant dekante edilerek atılır ve presipitat üzerinden deneye devam edilir.

Çözünürleştirme Çöktürülmüş olan proteinlere az miktarda pH 7.4 Sørensen fosfat tamponu ilave edilir. Dikkatle karıştırılarak proteinlerin mümkün olduğunca çok çözünmesi sağlanır. Daha sonra tüpler santrifüj edilerek süpernatantlar alınır ve presipitatlar atılır.

Diyaliz Tuzla çöktürülmüş olan proteinler daha önceden hazırlanmış olan diyaliz torbalarına, torbanın en fazla 3/4’ü dolacak şekilde yerleştirilir ve diyaliz tamponu olarak destile su kullanılarak diyaliz edilirler. 4 saate bir diyaliz tamponu değiştirilerek soğukta 2 gün boyunca diyaliz edilirler. Diyaliz sona erdikten sonra diyaliz torbaları açılır ve diyalizatlar temiz bir tüpe alınır. Bu işlemler sonrasında elde edilen çözeltiler protein örnekleridir, proteinlerin konsantrasyon tayini ve elektroforez denemelerinde bu çözeltiler kullanılacaktır. Bu amaçla elde edilen protein çözeltileri hacimlere ayrılır ve -20°C soğutucuda saklanırlar.

ÇALIŞMA SORULARI 1- Günlük hayatta saflaştırılmış proteinler nerelerde kullanılmaktadır? Araştırınız.


38


DENEY VII PROTE NLER N KANT TAT F TAY N Protein saflaştırılması işleminde her basamakta elimizde bulunan protein konsantrasyonunun bilinmesi çok önemlidir. Sonraki basamaklarda hangi yöntemlerin kullanılacağı protein konsantrasyonuna bağlı olarak belirlenir. Çözünür proteinlerin çözelti içindeki konsantrasyonlarının ölçümü için birçok farklı yöntem geliştirilmiştir. Her yöntemin bazı avantaj ve dezavantajları vardır. En yaygın kullanılan 3 yöntem; basit absorbans yöntemi, Lowry yöntemi ve Bradford yöntemidir . Bu yöntemlerde bilinen konsantrasyonlardaki protein çözeltileri ile hazırlanan standart kalibrasyon grafikleri kullanılarak bilinmeyen örneğin konsantrasyonu bulunur. Her üç yöntem de proteinlerin analizi için spektrofotometrik ölçümleri kullanır.

Basit Absorbans Yöntemi Bu yöntem proteinlerdeki tirozin ve triptofan amino asitlerinin 280 nm’de maksimum absorbans vermesine dayanır. Bu absorbsiyona fenilalanin amino asidi ve disülfit bağları da az miktarda olmakla birlikte katkıda bulunur. Çok hızlı ve ucuz bir yöntemdir, az miktarda materyale ihtiyaç gösterir ayrıca protein örneği üzerinde herhangi bir kimyasal modifikasyon yapılmadığından örnek geri kazanılabilir. Ancak hassasiyeti düşüktür (0.05–2 mg protein/mL). Ayrıca farklı miktarlarda tirozin ve triptofan içeriğine sahip proteinler aynı konsantrasyonda olsalar bile farklı absorbans verirler. Yakın bir dalga boyunda maksimum absorbans verdiklerinden nükleik asitler ve başka kromofor gruplarda etkileşim yapabilir. Ayrıca uzak UV alanda da (190 nm) bu yöntem uygulanabilir. Peptid bağlarına bağlı olarak absorbans verildiğinden amino asit kompozisyonunun değişiminden bağımsızdır ve hassasiyeti yüksektir (0.01–0.05 mg). Ancak pek çok çözelti ve tampon bu bölgede absorbans verdiğinden girişimler de artar. Ayrıca oksijen absorbsiyonundan ötürü özelleşmiş cihazlara ihtiyaç duyar. Sığır serum albümin (BSA) çözeltisi bu denemede sıklıkla standart olarak kullanılır.

Lowry (Folin-Ciocalteau) Yöntemi Bu yöntem hem biüret hem de folin reaksiyonuna dayanır. Biüret reaksiyonunda alkali şartlarda bakır, proteinlerin peptid bağları ile reaksiyona girerek Cu + oluşturur. FolinCiocalteau reaksiyonunda ise fosfomolibdotungstat, aromatik amino asitlerin Cu katalizli oksidasyonu ile heteropolimolibden mavisine indirgenir. Sonuçta kısmen tirozin ve triptofan bileşimine bağlı olan, şiddetli koyu bir mavi renk elde edilir. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

39


Lowry yöntemi de tirozin ve triptofan içeriğine bağlıdır ancak proteinden proteine olan farklılıklar orta seviyededir. 0.01 mg/mL hassasiyete sahiptir ve 0.01–1 mg/mL protein içeren çözeltiler için kullanımı uygundur. Bu yöntemin bir dezavantajı girişimlerin fazla oluşudur. Çeşitli tamponlar, ilaç aktif maddeler, deterjanlar, EDTA, amonyum sülfat, Glisin, merkaptoetanol, nükleik asitler ve şekerler gibi bir grup madde deneme ile girişim gösterir. Hücre ekstraktları ve kompleks örnekler, örneğin perkloroasetik asit/ etanol çöktürmesi gibi bir temizleme basamağına ihtiyaç gösterebilir. Günümüzde denemenin ihtiyaçlarına göre modifiye Lowry yöntemleri kullanılmaktadır. Reaksiyon pH bağımlıdır, pH’nın 10–10.5 arasında olması önemlidir. nkübasyon basamağındaki süre kritik değildir 10 dakika ile birkaç saat arasında değişebilir. Tüplerin iyi karıştırılması çok önemlidir, çünkü folin reaktifi alkali ortamda kararsız olduğu için kısa bir süre aktivite gösterir. Deneme yüksek konsantrasyonlarda lineer değildir, kalibrasyon eğrisinin buna göre hazırlanması gerekir.

Brad for d Yöntemi Bradford yöntemi Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB) boyar maddesinin proteinlere kovalent olmayan bağlanmasına dayanır. CBB’nin asidik çözeltideki proteine bağlanması boyanın 465 nm’deki maksimum absorbsiyonunu 595 nm’ye kaydırır. 595 nm’deki absorbsiyon doğrudan protein konsantrasyonlarına aittir. Bu yöntem Lowry yöntemine göre daha hızlı, daha ucuz, daha kolay ve daha hassastır. CBB’nin protein örneğine katılması ile 2 dakika gibi kısa bir zamanda renk oluşu ve bu renk 1 saat sabit olarak kalır. 0.001 mg/mL protein ölçülebilir. Lowry ile karşılaştırıldığında, yaygın kimyasal bileşikler ve biyolojik örneklerdeki protein olmayan moleküllerden daha az etkilenir. Amfolitler, deterjanlar bu yöntemde girişim yaparlar. CBB arjinin ve lizin amino asitlerine daha kolay bağlanır bu sebeple farklı proteinler farklı renk yoğunluğu verebilirler. Bu yöntemin dezavantajlarından biridir. CBB serbest arjinin ve lizine, 3000 kDa’dan daha küçük peptid moleküllerine bağlanmaz.


40


Yukarıdaki tablodan da görüldüğü gibi her kantitatif protein tayin yönteminin kendine özgü avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Bu sebeple bir protein tayini yöntemi seçilirken yapılan çalışmanın özellikleri göz önünde bulundurulmalı ve çalışma ortamındaki moleküllerle girişim yapmayacak, yeterli hassasiyette, ucuz ve uygulanabilir bir yöntem seçilmelidir.

KMYASALLAR NaCl, Sığır Serum Albümin (BSA), Na 2CO3 , CuSO4·5H 2O, KNaC 4 H 4O6 ·4H 2O, Folin Reaktifi, Bradford Reaktifi, NaOH, Ovalbümin.


41


YÖNTEM Basit ab sor bans Serum Fizyolojik: %0.0897’lik NaCl çözeltisi hazırlanır. BSA Stok Çözeltisi: Serum fizyolojik içinde %0.2’lik 100 ml BSA çözeltisi hazırlanır. Aşağıdaki tabloya göre tüpler hazırlanır. Deneydeki hata oranını azaltmak ve tekrarlanabilirliği arttırmak için tüpler çift çalışılmalıdır. Serum fizyolojik çözeltisi şahit olarak kullanılarak her bir tüpün 280 nm’deki absorbansı ölçülür, kaydedilir ve protein konsantrasyonları 2–5 numaralı tüpler için hesaplanır. Bu konsantrasyon verileri kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilir. Bilinmeyen örneğin absorbansı grafik üzerine yerleştirilerek konsantrasyonu bulunur.

Tüp no

BSA Stok (mL)

Serum Fizyolojik (mL)

1

0

3.0

2

0.5

2.5

3

1.0

2.0

4

1.5

1.5

5

2.0

1.0

6

Absorbans (280 nm)

Protein Konsantrasyonu (µg/mL)

Bilinmeyen örnek (3.0)


42


Lowry Kompleks oluşturucu reaktif: Stok çözeltilerden taze olarak hazırlanmalıdır. 50 mL %2’lik Na2CO3 (Çözelti A), 10 mL %1’lik CuSO 4·5H2O (Çözelti B) ve 10 mL %2’lik KNaC4H4O6·4H2O (Çözelti C) stok çözeltileri hazırlanır. Bu çözeltiler A:B:C 100:1:1 oranında karıştırılarak hazırlanır. Protein stok çözeltisi: Serum fizyolojik içerisinde 2 mg/mL BSA çözeltisi hazırlanır. Bu çözelti protein stok çözeltisi olarak kullanılacaktır. Folin reaktifi: 1N Fosfomolibdat ve fosfotungstik asit çözeltisi (Bu çözelti hazır halde verilecektir.) Aşağıdaki tabloya göre tüpler hazırlanır. Deneydeki hata oranını azaltmak ve tekrarlanabilirliği arttırmak için tüpler çift çalışılmalıdır. 1 numaralı tüp şahit olarak kullanılarak her bir tüpün 550 nm’deki absorbansı ölçülür, kaydedilir ve protein konsantrasyonları 2-5 numaralı tüpler için hesaplanır. Bu konsantrasyon verileri kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilir. Bilinmeyen örneğin absorbansı grafik üzerine yerleştirilerek konsantrasyonu bulunur.

Tüp No

Protein Stok Çöz. (µL)

Serum Fizyolojik (µL)

%8’lik NaOH Çöz.(µL)

1

0

500

500

2

25

475

500

3

50

450

500

4

75

425

500

5

100

400

500

6

Bilinmeyen Örnek (500)

500

a d o e v r r i l u i l d u e t e u b ğ ü o k s n a i ı . n k ğ ı d l k 0 a 1 c e ı s d ’ C ° 0 0 1

Komp. Oluş. Reakt. (µL)

1000 1000 1000 1000 1000

r i l i d e e b ü k n i . k d 0 1 e v r ı l ı r ı t ş ı r a K

1000


Folin reaktifi

100 100 100 100 100 100

r i l i d e e b ü k n . k d 0 3 e v r ı l ı r ı t ş ı r a k e c i y

Absorb. (550 nm)

Protein Kons. (µg/mL)

43


Bradford Bradford reaktifi: Coomassie Brilliant Blue G-250 etanol içinde çözünerek hazırlanır. (Bu çözelti hazır halde verilecektir.) Protein stok çözeltisi: 2 mg/mL ovalbümin stok çözeltisi 0.1mg/mL olacak şekilde seyreltilerek hazırlanır. Tüp No

Pr otein Stok Çöz. (µL)

Destile su (µL)

Bradford Reaktifi (µL)

1

0 20 40 60 80 Örnek (2)

800 780 760 740 720 798

200 200 200 200 200 200

2 3 4 5 6

. k d r 0 i 1 l i e d v e r e ı b l ı ü r ı k t n ş i ı r a K

Absorb. Pr otein Kons. (595 (µg/mL) nm)

VERLERN KULLANIMI Bradford yöntemi kullanılarak, bir önceki denemede elde edilen tüm ekstraktların protein konsantrasyonları tayin edilir ve µg/mL cinsinden aşağıdaki tabloya kaydedilir.

Karaciğer % 20 Tuz

Karaciğer %80 Tuz

Yumurta Sarısı % 50 Tuz

Yumurta Akı Aseton

Yumurta Sarısı Aseton

Karaciğer Aseton

Yumurta Akı %50 Tuz

1. Grup 2. Grup 3. Grup

1. Grup 2. Grup 3. Grup

ÇALIŞMA SORULARI 1- Protein kimyasında Coomassie boyalarının kullanım alanları nelerdir?


44


DENEY VIII PROTENLER ELEKTROFOREZ LE AYRILMASI VE MOLEKÜL AĞIRLIKLARININ TAY N Elektroforez , bir elektrik alan altındaki moleküllerin, bu alanda farklı hareket etmeleri esasına dayanılarak yapılan bir ayırma yöntemidir. Bu elektrik alan altında pozitif yük taşıyan proteinler katoda, negatif yük taşıyan proteinler anoda doğru göç ederler. Bu göçün hızı çeşitli faktörlerden etkilenir; a- Yükü n büyüklüğü: Net yük arttıkça proteinlerin göç hızları da artar. b- Molekül büyüklüğü: Proteinin büyüklüğü arttıkça göç hızı azalır. Burada proteinin molekül ağırlığı olduğu kadar molekülün şekli de önemlidir. c- Destek ortamının özelliği: Destek ortamındaki gözeneklerin boyutu küçüldükçe, proteinin göç hızı azalır. d- Elektrik alanın b üyüklüğü : Voltaj arttıkça göç hızı da artar. e- Tamponun iyonik gücü : Tamponun iyonik gücü azaldıkça göç hızı artar. f- Sıcaklık : Sıcaklık arttıkça göç hızı artar. Elektroforez günümüzde saflaştırılmış bir protein örneğinin saflığının kontrolünde, küçük miktarlarda proteinin elde edilmesinde, bir örnekteki proteinlerin kalitatif ve kantitatif analizlerinde kullanılmaktadır. Kâğıt elektroforezi, bölge elektroforezi, SDSPoliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), immüno elektroforez, DNA elektroforezi gibi çok çeşitli elektroforez yöntemleri mevcuttur. Günümüzde proteinlerin analitik tayinleri için en çok kullanılan yöntem poliakrilamid jel elektroforezidir. Bu yöntemde destek maddesi olarak poliakrilamid polimerinden yararlanılır. Poliakrilamid jel uzun polimer zincirleri oluşturan, aktive edilmiş akrilamid moleküllerinin reaksiyonu ile oluşur. Çözeltide bu zincirler tek başlarına birleşemezler. Jelin oluşumunda zincirlerin çapraz bağlanması için N,N -metilenbisakrilamid kullanılır.

Şekil 8.1- Poliakrilamid polimeri Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

45


Bu elektroforez yöntemi de çeşitli alt gruplara ayrılır. PAGE’de yatay, dikey kasetler ve dikey diskler kullanılabilir. Kasetler farklı boyutlarda olabilir. Kaset boyutu büyüdüğünde yapılan ayırmanın çözünürlüğü ve gücü artar ancak işlem süresi uzar ve jelin çalışılması zorlaşır. a- Doğal şartlarda PAGE : Ayırma analizlenen proteinin yük ve boyutuna göre yapılır. Genellikle alkali (pH 8–9) tampon sistemleri kullanılır. Proteinler denatüre olmadan yürütüldükleri için elektroforez sonunda proteinler aktivitelerini kaybetmezler ve geri kazanılabilirler. Ancak bu sistem sadece çözünür proteinler ve elektroforez sırasında agregat oluşturmayan proteinler için kullanılabilir. b- Denatüre edici şartlar altında SDS-PAGE : SDS anyonik bir deterjandır. Negatif yüklü SDS molekülleri protein molekülünü kaplar ve proteinlerin net yükünü maskeler. Tüm proteinler negatif yükle kaplanmış olduklarından ayırma yüke göre değil sadece molekül boyutuna bağlıdır.

Şekil 8.2 - SDS ile proteinlerin negatif yüklenmesi

SDS-PAGE’e uygulanacak olan örnekler, merkaptoetanol, SDS, bromfenol mavisi ve gliserol içeren tamponla muamele edilirler. Merkaptoetanol proteinin tersiyer yapısını bir arada tutan disülfit bağlarını indirger. SDS proteini denatüre ederek doğal yapısını bozar ve molekülü eksi yüklü bir kılıfla kaplar. Farklı konsantrasyonlarda (%7.5, %10, %12.5 akrilamid/bisakrilamid konsantrasyonu içeren) jeller kullanılarak elektroforez gerçekleştirilebilir. Düşük konsantrasyonlu jeller büyük molekül ağırlıklı proteinlerin, yüksek konsantrasyonlu jeller ise küçük molekül ağırlıklı proteinleri ayırmak için kullanılır. c- ki boyutlu PAGE : ki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezinde proteinler izoelektrik odaklama (IEF) ve SDS-PAGE yöntemleri kullanılarak ayrılırlar. Bu yöntemlerin her biri jel başına 100 bileşeni ayırma gücüne sahipken, birleştiklerinde yaklaşık 10000 bileşenin ayrılmasını sağlarlar. IEF yönteminde pH gradyanı oluşturan çeşitli amfolitler kullanılarak proteinler önce izoelektrik noktalarına göre ayrılır. Daha sonra aynı proteinler SDS-PAGE yöntemi kullanılarak molekül büyüklüklerine göre ayrılırlar. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

Şekil 8.3- ki boyutlu jel elektroforezi

46


Şekil 8.4- ki boyutlu elektroforez ile elde edilmiş jel görüntüsü

Şekilde iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi sonucunda elde edilen bir jel gösterilmektedir. Buradaki her bir nokta bir protein veya polipeptide karşılık gelir.

KMYASALLAR Amonyumperoksodisülfat, akrilamid, bisakrilamid, tris, TEMED, SDS, glisin, HCl, merkaptoetanol, bromfenol mavisi, metanol, asetik asit, Coomassie G250, fosforik asit, amonyum sülfat.

YÖNTEM Çözeltilerin hazır lanma sı: Amonyumperoksodisülfat (APS): %10 (w/v) oranında taze olarak hazırlanır. Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi: 29.2 g akrilamid ve 0.9 g bisakrilamid destile su içinde

çözülerek hacmi 100 mL’ye tamamlanır ve +4 oC’de saklanır.

1.5 M Tris-HCl çözeltisi (pH 8.8): 18.15 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda

çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 8.8’e ayarlanır ve son hacmi 100 mL’ye tamamlanarak +4 oC’de saklanır. 1 M Tris-HCl çözeltisi (pH 6.8): 12.11 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda

çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 6.8’e ayarlanır ve son hacmi 100 mL’ye tamamlanarak +4 oC’de saklanır. SDS çözeltisi: %10 (w/v) oranında taze olarak hazırlanır.

PAGE Tamponu: 3 g Tris baz, 15 g Glisin ve 1 g SDS bir miktar destile suda çözüldükten sonra 1 L’ye hacmi tamamlanır (her elektroforez işleminde taze hazırlanır).


47


SDS-PAGE jel kasetinin hazırlanması: çinde jelin polimerize olacağı kuru ve temiz cam levhalar aralarına plastik ayırıcı konularak üst üste konulur. Kıskaçlar takılarak döküm standına yerleştirilir.

Şekil 8.5- Jel kasetlerinin hazırlanması

Poliakr ilamid jelin hazır lanması: Aşağıdaki tabloya göre jel çözeltisi hazırlanır.

65 mL % 12.5’lik Alt J el Kompozisyonu Akrilamid/Bisakrilamid

26 mL

Tris-HCl 1.5 M pH 8.8

16.25 mL

SDS %10 (w/v)

650 µL

Destile su

21,64 mL

APS %10 (w/v)

350 µL

TEMED

70 µL

20 mL % 4.5’lik Üst Jel Kompozisyonu Akrilamid/Bisakrilamid

3 mL

Tris-HCl 1 M pH 6.8

2.5 mL

SDS %10 (w/v)

200 µL

Destile su

15 mL

APS %10 (w/v)

70 µL

TEMED

20 µL


48


TEMED ve APS çözeltileri polimerleşmeyi başlatacak olan çözeltiler oldukları için jel çözeltisinin kasete dökülmesinden hemen önce ilave edilir. Hazırlanan alt jel çözeltisi iyice karıştırılır ve jel kasetlerinin içine kasetin 4/5’i dolacak şekilde dikkatle dökülür. Üzerine bir miktar n-butanol çözeltisi ilave edilir ve polimerleşmenin tamamlanması beklenir. Polimerleşme tamamlandıktan sonra n-butanol çözeltisi kasetin içinden alınır. Hazırlanan üst jel çözeltisine TEMED ve APS ilave edilerek iyice karıştırılır ve jel kasedine dökülür. Döküldükten hemen sonra örneklerin tatbik edileceği kuyuların oluşması için tarak yerleştirilir ve polimerleşme tamamlanıncaya kadar beklenir. Polimerleşme tamamlandıktan sonra tarak kuyuların bozulmamasına dikkat edilerek çıkartılır.

Şekil 8.6 - Jellere tarağın yerleştirilmesi

PAGE Yükleme Tamponu 1 M Tris-HCl (pH 6.8)

1.0 mL

Gliserin

1.6 mL

%10 SDS (w/v)

0.2 mL

-merkaptoetanol

0.4 mL

Destile su

8.0 mL

Bromfenol mavisi

Eser miktarda


49


Örneklerin yüklenmesi: Protein örneklerinin konsantrasyonları 3 µ g/µL olacak şekilde hesaplanır ve gerekli seyreltmeler PAGE yükleme tamponu ile yapılır. Örneklerden 100 µL alınarak ependorf tüplere konularak 1 dakika 100°C’lık su banyosunda ısıtılarak denatüre edilirler. Soğutulduktan sonra bir otomatik pipet yardımıyla her kuyuya aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi 10 µL (kuyu başına 30 µ g protein düşecek şekilde) protein tatbik edilir.

Şekil 8.7 - Örneklerin yüklenmesi

Kuyu Numarası

Yüklenen Pr otein

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Karaciğer %20 Tuz Karaciğer %80 Tuz Yumurta Akı %50 Tuz Yumurta Sarısı %50 Tuz Protein Standardı Karaciğer Aseton Grup 1 Karaciğer Aseton Grup 2 Karaciğer Aseton Grup 3 Yumurta Akı Aseton Grup 1 Yumurta Akı Aseton Grup 2 Yumurta Akı Aseton Grup 3 Protein Standardı Yumurta Sarısı Aseton Grup 1 Yumurta Sarısı Aseton Grup 2 Yumurta Sarısı Aseton Grup 3

Şekil 8.8- Jel üzerindeki kuyuların yerleşimi


50


Standar t Pr otein

Molekül Ağırlığı (kDa)

S ığır Albumin Yum urta Albumin Gliseraldehit-3-p-Dehidrojenaz Sığır Karbonik A nhidraz Tripsinojen Tripsin  nhibitör -Laktalbumin

66 45 36 29 24 20 14.2

Jellerin Elektroforez Cihazına Yerleştirilmeleri: Protein tatbik edilen kuyuların üzeri SDS-PAGE yürütme tamponu ile doldurulur ve kaset aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi merkezi soğutma aparatına yerleştirilir. Elektroforez sırasında bu aparatın içinden geçen su jelin fazla ısınmasını önleyerek yürümenin düzgün olmasını sağlar ve jeller için destek görevi görür. Ayrıca jel kasetleri soğutucu aparata yerleştirildiklerinde üst tampon haznesini oluşturur.

Şekil 8.9- Jel kasetlerinin tampon haznesine yerleştirilmesi.

Merkezi soğutma aparatı tampon haznesine yerleştirilir.

PAGE Yür ütm e Tamponu (1.5 L için) Tris-Baz Glisin %10 SDS (w/v)

4.5 g 22.5 g 1,5 mL

Taze olarak hazırlanmış 1500 mL SDS-PAGE yürütme tamponu, öncelikle üst tampon haznesi dolacak şekilde ve platin elektrotların ıslanmamasına dikkat edilerek tampon haznesine doldurulur. Üst tampon haznesi dolduktan sonra PAGE yürütme tamponun kalan kısmı tampon haznesinin altında jeller ile temas edecek seviyeye kadar yükselir ve alt tampon haznesini oluşturur. Platin elektrotların kuruluğu kontrol edildikten sonra doğru kutupların üst üste gelmesine dikkat edilerek güç kablolarını taşıyan kapak kapatılır. (Kapaktaki + ucun ( kırmızı) soğutma aparatındaki + uca (kırmızı) ve – ucun (siyah) soğutma aparatındaki – uca (siyah) denk gelmesine dikkat edilir). Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

51


Şekil 8.10 - Elektroforezde kullanılan güç kaynağı ve elektroforez aparatı

Jellerin yürütülmesi: Soğutma aparatının su bağlantıları takılır ve elektroforez sistemi bir güç kaynağına bağlanır. Jel başına önce 20 mA, daha sonra 30 mA verilecek şekilde güç kaynağı ayarlanır ve elektroforez işlemine başlanır. Bu işlemin süresi ortam sıcaklığına, jelin konsantrasyonuna ve boyutuna bağlıdır. Bizim deneyi gerçekleştirdiğimiz şartlarda jelin tam olarak yürümesi yaklaşık 5 saat sürer. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel kasedi soğutma aparatından ayrılır, plastik ayırıcılar çıkarılır ve cam levhalar açılarak jel içinde 500 mL fiksasyon çözeltisi bulunan bir kaba alınır. Bu aşamada jelin kırılmaması ve parçalanmaması için çok dikkatli olunmalıdır.

Jellerin boyanması: J el Fiksasyon Çözeltisi

%50 (v/v) Metanol %10 (v/v)Asetik asit

Boya Çözeltisi

% 0.065 (w/v) Coomassie G250 %34 (v/v) Metanol 3% (v/v) fosforik asit %17 (w/v)Amonyum sülfat

Boya Çıkarma Çözeltisi

%10 (v/v) Asetik Asit

250 mL metanol ve 50 mL asetik asit çözeltisi 500 mL’lik bir balon jojeye konulur ve destile su ile hac im tamamlanır. A: 55 g Amonyum sülfat /220 mL destile su. B: 0.2 g Coomassie G250/110 mL metanol + 10 mL fosforik asit. Boya çözeltisi, boyamadan hemen önce, karıştırılmakta olan B çözeltisi üzerine A çözeltisi ilave edilerek hazırlanır. 100 mL asetik asit çözeltisi 1 L’lik balon jojeye alınır ve destile su ile hacim tamamlanır.

Jel önce fiksasyon çözeltisi içinde bir gece boyunca bekletilir. Burada amaç proteinlerin jele sabitlenerek boyama sırasında protein kayıplarının önlenmesi ve iyi bir boyamanın sağlanmasıdır. Fiksasyon çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra jellere boya çözeltisi ilave edilir ve 2 gün boyunca (veya spotların görünür hale gelinceye dek) jellerin boyanması sağlanır. Bu aşamada bir orbital çalkalayıcı kullanılarak jellerin hafifçe çalkalanması sağlanır. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

52


Böylece boya çözeltisi jeldeki protein molekülleri ile bağlanır. Ancak boya jelin protein olmayan kısımlarına da bağlanır (spesifik olmayan bağlanma). Boya çözeltisinden çıkarılan jeller ayrı bir kaba konulurlar ve boya çıkarma çözeltisi ile muamele edilirler. Boya çıkarma çözeltisi jel üzerindeki spesifik olarak bağlanmamış Coomassie boyasını uzaklaştırılarak arka planın renginin koyu maviden, açık maviye (veya şeffafa) doğru değişmesini sağlar ve protein bantlarının daha net bir şekilde görülmesini sağlar. Boyamaları tamamlanmış olan jellerin görüntüleri alınır ve daha sonraki işlemlerde kullanılmak üzere saklanırlar.

Şekil 8.11- Boyama işlemi sonucu elde edilen jel görüntüsü

VERLERN KULLANIMI

5 ve 12 numaralı kuyulara tatbik edilmiş olan protein standardı örneklerine ait protein bandlarının her biri için Rf değerleri hesaplanır. Rf değerleri x eksenine ve molekül ağırlıklarının ln değeri y eksenine gelecek şekilde bir kalibrasyon grafiği çizilir. Bu grafikten yararlanılarak diğer protein örneklerindeki belirgin protein bantlarının hangi molekül ağırlığına karşı geldiği hesaplanır.

Şekil 8.12- Proteinlerin molekül ağırlığının bulunması

ÇALIŞMA SORULARI 1- Proteomik (proteomics) nedir? Araştırınız.


53


DENEY IX PROTENLERN N- TERMNAL AMNOASTLERNN NCE TABAKA KROMATOGRAFS LE BELRLENMES Proteinlerin fonksiyonları amino asit dizilimlerine bağlıdır. Çünkü bir proteinin aminoasit dizilimi (sekuansı) o proteinin hangi kimyasal özelliklere sahip olacağını ve 3 boyutlu yapısının nasıl olacağını belirler. Bu sebeplerden dolayı proteinlerin tanımlanmasında dizi analizlerinin yapılması gerekir. Dizi analizleri farklı yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Bu yöntemlerden biri Edman degradasyonudur. Aşağıda bir dizi analizi şematik olarak gösterilmiştir.

Şekil 9.1- Proteinlerin d izi analizi


54


Genel olarak bir dizi analizi çalışmasında şu basamaklar uygulanır. 1- Protein birden fazla alt birim içeriyorsa önce alt birimlere ayrılır. Protein ve alt birimler saflaştırılır. 2- Proteinde bulunan peptid içi (intra) ve peptidler arası (inter) disülfit bağları 2merkaptoetanol, ditiyotreitol (DTT) gibi bir ajanla indirgenir ve ortaya çıkan serbest –SH gruplarının sonraki basamaktaki asit hidrolizinde oksitlenmelerini engellemek için sisteinler iyodoasetat ile S-karboksimetilsistein’e dönüştürülür. Bu aşamadan sonra örnek birkaç kısma ayrılır ve devam eden işlemler ayrı ayrı bu protein kısımlarına uygulanırlar. 3- Protein 6N HCl ile sıcakta muamele edilerek amino asitlerine ayrılır ve kromatografik yöntemlerle her bir amino asitten ne miktarda içerdiği bulunur, yani toplam amino asit bileşimi tayin edilir. 4- Karboksil ve amino terminal analizleri gerçekleştirilir. 5- Proteaz enzimleri kullanılarak protein belirli bölgelerden kırılır ve Edman degradasyonu uygulanarak her bir parçanın amino asit dizilimi bulunur. (Edman yöntemi sadece 5060 aminoasitten oluşan parçaların tayinine izin verir, daha uzun proteinlerde hata oranı artmaya başlar) 6- Bu parçaların dizilimi, amino asit bileşimi, Nve C- terminal analiz bilgileri bir araya getirilerek proteinin amino asit dizilimi bulunur. Şekil 9.2 - Sığır insülin p roteinin amino asit dizilimi


55


Şekil 9.3- Disülfit bağının indirgenmesi ve oksidasyonu

Yukarıda anlatıldığı gibi proteinlerin parçalara ayrılmaları için proteaz adı verilen enzimler kullanılır. Bazı proteazlar peptid bağını sadece belli bir amino asitten sonra (veya önce) ve bu sayede tahmin edilebilir bir şekilde kırarlar.

Pr oteaz veya Kimyasal Ajan

Kır ılan Peptid Bağı

Tripsin

Lizin, Arjinin (C)

Kimotripsin

Fenilalanin, Triptofan, Tirozin (C)

Pepsin

Fenilalanin, Triptofan, Tirozin (N)

Termolizin

Fenilalanin, Triptofan, Tirozin (C)

Su bmaxillarus proteaz

Arjinin (C)

Endoproteinaz Lys C

Lizin (C)

Siyonejen Brom ür

Metiyonin (C)

Karboksipeptidaz A

C Terminal Aminoasit (N)

(C): C- Ter minalinden kır ma yapa r . (N): N- Ter minalinden kırma yapar . Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

56


Örneğin; glisinilfenilalaninilalanin tripeptidi kimotripsin ile muamele edilirse glisinilfenilalanin ve alanin elde edilir. Eğer pepsin ile muamele edilirse glisin ve fenilalaninilalanin elde edilir. Proteinin C- terminalinin bulunması için, protein karboksipeptidaz A ile muamele edilir ve kopan amino asit kalıntısı tayin edilir. Ancak enzim sürekli olarak C-terminalindeki amino asitleri koparmaya devam edeceğinden reaksiyonun istenilen basamakta kesilmesi önemlidir.

Şekil 9.4- Glisinilfenilalaninilalanin tripeptidi

Şekil 9.5- Karboksipeptidaz A enziminin mekanizması

Proteinin N- terminal analizi için Sanger yöntemi kullanılır. Bu yöntemde 2,4dinitroflorobenzen reaktifi kullanılarak proteinin N-terminal ucundaki amino asit 2,4dinitrofenil türevine dönüştürülür. Daha sonra asit hidrolizi ile protein amino asitlerine ayrılır ve bir amino asit karışımı oluşur. Bu karışımdaki N-terminal amino asidinin 2,4dinitrofenil türevi kromatografik yöntemler kullanılarak tanımlanır. Ancak protein tamamen amino asitlerine parçalandığından dizi analizinde kullanılamaz. Proteinlerin amino asit dizi analizlerinin tayini için Edman yöntemi kullanılır. Bu yöntemde N- terminal amino asidi fenilizotiyosiyanat ile reaksiyona sokulur. Bu amino asit feniltiyohidantoin oluşturarak peptid zincirinden ayrılır ve kromatografik yöntemlerle tayin edilir. Her seferinde sadece N- terminalindeki amino asit ayrıldığı ve zincirin geri kalan kısmı korunduğu için bu işlem tekrar tekrar yapılarak zincirdeki bütün amino asitler tanımlanabilir. Edman yöntemi tamamen otomatik cihazlar yardımıyla gerçekleştirilebilir. Ancak her bir döngüde bazı yan ürünler açığa çıktığından 50-60 amino asit sonrasında tayinde hatalar artar. Bu nedenle proteinlerin daha önceden proteazlarla parçalanması gerekir. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

57


Şekil 9.6- Edman ve Sanger yöntemi

Günümüzde elektroforez ile saflaştırılmış proteinlerin amino asit diziliminin bulunmasında MALDI-TOF yöntemi ve protein veri bankaları kullanılmaktadır. Bu yöntemde proteinler tripsin kullanılarak parçalara ayrılır ve kütle spektrofotometreleri ile her bir parçanın kütle analiz şablonları çıkarılır. Bu şablonlar internet üzerindeki veri tabanlarındaki proteinlere ait şablonlar ile karşılaştırılarak bilinmeyen proteinin ne olduğu ve dolayısıyla amino asit dizilimi bulunabilir. Ancak bu yöntem dolaylı bir analiz yöntemidir, daha önceden yapısı aydınlatılmamış bir proteinin amino asit diziliminin bulunması için kullanılamaz. Saflaştırılmış ve amino asit dizilimi belirlenmiş olan polipeptidin 3 boyutlu yapısı xışınları kristalografisi ve NMR teknikleri kullanılarak aydınlatılır. Böylece protein saflaştırılması ve karakterizasyonu tamamlanmış olur.


58


KMYASALLAR Aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, sistein, sistin, glisin, Na2CO3 , 2,4dinitroflorobenzen, HCl, kloroform, benzil alkol, glasiyel asetik asit.

YÖNTEM 50 mL’lik bir erlen içinde 20 mg amino asit %5’lik 10 mL Na 2CO3 çözeltisinde çözülür. Üzerine 0.5 mL 2,4-dinitroflorobenzen (DNFB) ilave edilir. DNFB bazı insanlarda alerjik reaksiyonlara sebep olabileceğinden çalışma sırasında eldiven takılmalı ve dikkatli olunmalıdır. Karışım 40°C sıcaklıkta 30 dakika devamlı karıştırılarak tutulur. Sıcaklığın 40 °C’nin üzerine çıkmamasına dikkat edilir. Isıtma sonunda çözeltinin rengi turuncuya döner. Reaksiyona girmemiş olan DNFB bir pipet yardımıyla uzaklaştırılır. Daha sonra 1.5 mL derişik HCl dikkatle ilave edilir. Türev bu aşamada çöker. Eğer çökelme olmazsa erlen buz banyosunda soğumaya bırakılır. Çökelti bir test tüpüne alınarak az miktarda aseton içinde çözülür. Mobil faz olarak (kloroform: benzil alkol: glasiyel asetik asit) ; (45:20:1) karışımı kullanılır. Mobil faz 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde kromatografi tankına konulur. Bir TLC (thin layer chromatography; ince tabaka kromatografisi) plakasına kurşun kalemle plakayı zedelememeye dikkat ederek alttan 3 cm yükseklikte bir çizgi çekilir. 2 cm aralıkla bu çizgi üzerinde tatbik noktaları işaretlenir. Hazırlanmış olan amino asit türevleri bu noktalara tatbik edilir. Bütün örnekler tatbik ed ildikten sonra TLC plakasının kuruması beklenir ve kromatografi tankına yerleştirilir. Mobil fazın plaka üzerinde üstten 2 cm kalıncaya kadar yürümesi beklenir. Plaka tanktan çıkarılır, mobil fazın yürüme sınırı kurşun kalem ile işaretlenir. Çeker ocakta kurutulur. Her bir aminoasidin ve türevinin Rf değerleri hesaplanır.

ÇALIŞMA SORULARI 1- Proteinlerin 3 boyutlu yapı aydınlatılması nasıl yapılır? Araştırınız.


59


DENEY X MEMEL DOKULARINDAN DNA ZOLASYONU VE BAZI ÖZELLKLERNN NCELENMES DNA ve RNA nükleik asitler olarak adlandırılırlar ve nesilden nesile kalıtımsal bilginin aktarılmasını sağlayan uzun zincirli polimerlerdir. Bu makromoleküllerin yapı taşları nükleotidlerdir. Her nükleotid bir şeker , bir fosfat ve bir bazdan oluşur.

Şekil 10.1- DNA ve RNA yapısında yer alan azotlu bazların yapıları

Şekil 10.2- Deaoksinükleotid yap ısı

Nükleik asitler nükleotidlerin 3 , 5 -fosfodiester köprüleri ile bir araya gelmesinden oluşmuştur. Bu zincirlerde fosfodiester köprüleri ile bağlanmış şeker molekülleri nükleik asitlerin iskeletini oluşturur. Biyokimya Laboratuvarı I – Güz

60


Şekil 10.3- Nükleik asit yapısı

Şekil 10.4- DNA yapısında yer alan baz çiftleri


61


DNA ikili sarmalında adenin-timin (A-T) ve guanin-sitozin (G-C) bağları kurulur. DNA ikili sarmalını bir arada tutan kuvvetler, nükleotid zincirleri arasındaki A-T ve G-C çiftleri arasındaki hidrojen köprüleri (yatay interaksiyon) ve nükleotid zincirleri üzerindeki bazlar arasındaki etkileşimlerdir (dikey interaksiyon).

Şekil 10.5- DNA çift sarmal yapısı

Protein molekülünde olduğu gibi DNA molekülünün yapısındaki herhangi bir bozulmaya da denatürasyon denir. DNA denatürasyonu yatay ve dikey çekici güçlerden herhangi birindeki azalma veya kopma sonucu olur. Yatay güçlerdeki azalma ya da kopma sonucu olan denatürasyon DNA’nın 260 nm’deki absorbansının artması ile belirlenebilir. Dikey güçlerdeki azalma ya da kopma sonucu olan denatürasyon (hipokromisite) tek başına 260 nm’de absorbans değişikliğine sebep olmaz. Ancak DNA’nın 210 nm civarındaki 2. pikinin absorbansında azalma hatta tamamen yok olma ve pikin dalga boyunun daha yüksek dalga boylarına kayması meydana gelir.

DNA sarmalını oluşturan zincirlerin birindeki veya her ikisindeki bazlardan bir veya bir kaçının kopması sonucu nükleotid zincirde kısalma meydana geliyorsa bu olaya DNA’nın d egradasyonu denir. Degradasyon gerçekleştiğinde 260 nm’deki absorbansta azalma meydana gelir. 42°C’ın üzerindeki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı arasındaki hidrojen köprüleri öncelikle A-T zengin bölgelerde olmak üzere gevşeyip açılmaya başlar. Kullanılan tampon çözeltiye bağlı olarak 56-80°C arasındaki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı kendisini oluşturan nükleotid zincirlerine ayrılır. Buna DNA’nın erimesi denir. DNA heliksinin %50’sinin denatüre olduğu sıcaklığa DNA’nın erime sıcaklığı (T m) adı verilir. T m değeri o DNA’nın A-T/G-C oranına bağlı olduğundan, DNA’nın tanımlanmasını sağlayan spesifik bir değerdir (yani bir fareden alınan DNA’nın Tm değeri, bir insandan alınan DNA’nın T m değerinden farklı olacaktır veya aynı bakterinin iki farklı suşunun Şekil 10.6- DNA‘nın erimesi DNA’larının Tm değerleri farklı olacaktır). Ayrıca T m değeri kullanılan tampon çözeltinin iyonik şiddetine ve pH’sına da bağlıdır. Bu nedenle Tm değeri verilirken mutlaka deneyin hangi, şartlarda yapıldığı da belirtilmelidir.


62


DNA erimesi sıcaklık 90-100 °C’nin üzerine çıkılmadığı sürece geri dönüşümlüdür. Eğer 80°C’ye ısıtılmış bir DNA çözeltisi, oda sıcaklığında yavaş yavaş soğumaya bırakılırsa iki sarmal tekrar birleşerek DNA ikili sarmalını oluştururlar (hibridizasyon). Ancak aynı DNA oda sıcaklığında değil de bir buz banyosunda ani soğutmaya bırakılacak olursa DNA sarmalarında hibridizasyon gerçekleşmez ve nükleotid zincirleri birleşmezler. Ayrıca DNA boyunda kısalmalar, yani DNA degradasyonu meydana gelebilir. Eğer degradasyon meydana gelmediyse bu çözeltiler yeniden ısıtılıp yavaş yavaş soğumaya bırakılırlarsa DNA ikili sarmalını yeniden oluşturabilirler.

Şekil 10.7- DNA’nın erimesine G-C içeriğinin etkisi

Yukarıda anlatıldığı gibi nükleik asitler 260 nm dalga boyunda absorbans piki verirler. Bu absorbans değeri kullanılarak nükleik asidin konsantrasyonu tayin edilebilir. 260 nm dalga boyunda, 1 cm’lik kuartz küvetlerde 1’lik bir absorbans 50µg/mL DNA konsantrasyonuna karşılık gelir. Tek zincirli DNA veya RNA içinse bu değer 40 µg/mL’dir. Nükleik asitlerin saflığını tayin etmek için nükleik asit çözeltilerinin absorbanslarının 240-300 nm arasında ölçülmesi gerekir. Proteinler 280 nm’de pik verdiklerinden A 260 nm / A280 nm oranından yararlanılarak saflık tayini yapılabilir. DNA için bu oran 1.8, RNA içinse 2.0 olmalıdır. Eğer bu verilen değerlerden daha düşük değerler elde ediliyorsa, bu örneğin proteinlerle kontamine olduğunu gösterir. Kontaminasyon bir kimyasal karışım içinde düşük miktarlarda (genellikle istenmeyen) başka maddelerin var olmasıdır. Hücreler (hücre tiplerine göre farklılık göstermekle birlikte) büyük ölçüde su içerdiklerinden, hücre organellerinin yapısal özellikleri su ile reaksiyonları sonucu ortaya çıkar. Hücreler ve hücre organelleri yapısal özellik ve bütünlüklerini izotonik çözeltiler içinde koruyabilirler. Hücrelerle aynı osmatik basınca sahip çözeltilere izotonik çözeltiler denir. zotonik çözeltilerde hücre ile etrafındaki çözelti arasındaki su alış verişi dengededir. %0.876’lık NaCl (serum fizyolojik), %5 dekstroz (serumda kullanılır) gibi çözeltiler yaygın olarak kullanılan izotonik çözeltilere örnek olarak verilebilirler.


63


Her ne kadar hemen hemen tüm hücreler DNA içerseler de bazı dokularda bu miktar çok az olduğundan bu tip dokular DNA izole etmek için iyi bir kaynak değildirler. Bazı dokular ise yüksek deoksiribonükleaz aktivitesine sahip olduklarından DNA izolasyon esnasında küçük parçalara ayrılır. Bu nedenle DNA elde etmek için yüksek DNA ve düşük nükleaz aktivitesine sahip dokular tercih edilmelidir. Bu amaçla en iyi kaynaklar timus ve lenf en iyi dokulardır. Dalak, testis ve yumurtalıklarda DNA elde etmek için kullanılabilirler.

KMYASALLAR NaCl, EDTA, SDS, etanol.

YÖNTEM Çözeltilerin hazır lanma sı: Ekstraksiyon çözeltisi: 0.15 M NaCl ve 0.1 M EDTA çözeltisinden oluşur. 0,925 g EDTA ve 2,19 g NaCl 250 mL destile su içinde çözülerek hazırlanır. Deneyde soğuk olarak kullanılır. 2M NaCl çözeltisi: 11.7 g NaCl 100 mL destile suda çözülerek hazırlanır.

DNA’nın zolasyonu: DNA izolasyonunun yapılacağı dokudan yaklaşık 10 g alınır ve 100 mL ekstraksiyon çözeltisi ilave edilir. Daha sonra kısa sürelerle ve DNA içeren çözeltinin ısınmamasına dikkat edilerek homojenizatörde homojenize edilir. DNA’nın bozulmaması için bu işlemler soğukta yapılmalı ve kullanılan çözeltiler önceden soğutulmuş olmalıdır. Homojenize hale getirilmiş olan çözeltiye 1 mL %10 SDS ilave edilir. Hafifçe alt üst edilerek çözelti karıştırılır (SDS deterjan olduğundan köpürmemesine dikkat edilir). Daha sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Üstteki çözelti (süpernatant) dikkatle alınır ve temiz bir santrifüj tüpüne hacim 4 mL olacak şekilde aktarılır. Süpernatant çözeltisine 8 mL soğuk 2M NaCl çözeltisi ilave edilir ve dikkatle karıştırılır. Daha sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant yaklaşık 4 mL hacimde olacak şekilde dikkatle temiz bir santrifüj tüpüne alınır. Süpernatanta yaklaşık 8 mL soğuk etanol yavaş yavaş ilave edilir ve tüpteki değişim gözlenir. Daha sonra 4000 rpm’de 1-2 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonunda üstteki süpernatant dekante edilir ve beyaz renkli DNA presipitatı alınır. Etanol kalıntısını uzaklaştırmak için 1-2 mL 0.1 M EDTA çözeltisi ile, karıştırılmadan kalıntılar yıkanır, yıkama çözeltisi dekante edilerek uzaklaştırılır ve daha sonra yeterli miktarda ekstraksiyon çözeltisinde çözülür. Çözünmeyen kısımlar santrifüj ile uzaklaştırılır. Elde edilen DNA çözeltisi derin dondurucuda uzun süre saklanabilir.


64

Biyokimya_Laboratuvari_I

Recommend Documents