biotehnologija.pdf

Физиологија растења и развића биљака Предавања: 



1. Предавање (02.03.2010): o Увод у биотехнологију биљака  Историјат развоја биотехнологије  Примене биотехнологије  Биотехнологија биљака o Генетско инжењерство  Основни кораци генетског инжењерства  Генске касете o Ензими као алати  Нуклеазе  Рестрикционо/модификациони системи  ДНК и РНК лигазе  Полимеразе  Остали ензими 2. Предавање (09.03.2010): o Вектори  Плазмиди  Бактериофази  Хибридни вектори великог капацитета и вештачки хромозоми o Трансформација  Agrobacterium tumefaciens и природна трансформација биљака1  Експлоатација A. tumefaciens: бинарни вектори  Трансформација помоћу Agrobacterium rhizogenes  Хемијска трансформација  Електропорација  Биолистичка трансформација o Селекција  Типови селектабилних маркера  Негативна селекција: резистенција на антибиотике и хербициде  Позитивна селекција  Визуелна селекција: лактозни оперон и α-комплементација  Репортер гени и генске фузије

Питања за испит: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Типови особина које се уводе у биљке генетским инжењерством Генске касете и конструкти Основне класе ензима које се користе у генетском инжењерству Главни типови вектора Биолошки, физички и хемијски методи трансформације биљака Селекција и типови селектабилних маркера

Консултације: Др Ана Симоновић [email protected], Институт „Синиша Стнковић“, III спрат, соба111, тел. 2078-431 Ово поглавље је дато знатно опширније и детаљније од онога што је потребно за испит. Прочитајте све, да би стекли целу слику, а научите само оно најбитније. 1

1

Увод у биотехнологију биљака Историјат развоја биотехнологије Термин биотехнологија је, до 1971., у главном био коришћен само у прехрамбеној индустрији и агрикултури. Од почетка 70-тих се, међутим, овај термин у научним круговима користи са знатно ширим значењем, обухватајући разне биолошке лабораторијске технике, као што су технологија рекомбинантне ДНК, процедуре засноване на култури ћелија и ткива, или хоризонтални трансфер гена међу разнородним биљкама помоћу бактерије Agrobacterium tumefaciens, односно њених плазмида. Термин „биотехнологија“ би, у ствари, требало користити у још ширем значењу, тако да опише цео спектар метода, како древних тако и модерних, који се користе за манипулацију органиских материјала како би се задовољили захтеви прехрамбене и дугих индустрија. Биотехнологија се дефинише као примена традиционалних и/или научних знања у манипулацији (делова) микроорганизама, или ћелија и ткива виших организама, тако да они обезбеђују добра и услуге корисне за прехрамбену и друге индустрије и њихове кориснике. Биотехнологија комбинује дисциплине попут генетике, молекуларне биологије, биохемије, ембриологије, цитологије, системске биологије и биоинформатике, као и практичне дисциплине као што су хемијско инжињерство, информационе технологије и роботика. Хронологија развоја биотехнологије је приказана у Таб. 1.1: Хронологија развоја биотехнологије 1700s 1860s

1900 1922 1953 1970s 1973 1983 1985 1986 1990 1992 1994 1995

Природњаци препознају и идентификују хибридне биљке Аустријски монах и ботаничар Грегор Мендел проучава грашак и схвата да се специфичне особине, касније дефинисане као гени, преносе са родитеља на потомке Европски ботаничари почињу да побољшавају биљну продуктивност користећи генетичке теорије засноване на Менделовом раду Фармери набављају хибридна семена кукуруза направљена укруштањем два варијетета Откриће структуре ДНК обележава почетак модерне генетике и молекуларне биологије Хибридна семена се уводе у земље у развоју, како би се повећала производња хране Прецизно манипулисање бактеријске ДНК помоћу техника генетичког инжињерства Креирана прва генетички модификована (ГМ) биљка – дуван отпоран на један антибиотик Тестирање у пољу ГМ биљака отпорних на вирусе, бактерије и инсекте Агенција за заштиту природе (EPA, U.S. Environmental Protection Agency) одобрава пуштање у промет прве ГМ биљке – дувана отпорног на хербициде Прво успешно тестирање у пољу ГМ памука отпорног на хербициде Администрација за храну и лекове (FDA, U. S. Food and Drug Administration) одлучује да ће ГМ храна бити регулисана исто као и конвенционална храна Парадајз са продуженом свежином (FlavrSavr Tomato) постаје прва ГМ биљка која је добила одобрење за продају Направљени ГМ канола и кукуруз отпорни на хербициде

2

2000

2001

У Америци је одобрен низ ГМ биљака отпорних на хербициде, инсекте или вирусе, попут памука, соје, шећерне репе, кукуруза, папаје, кромпира, спанаћа, тиквица и парадајза Континуирано тестирање и побољшавање „Златног пиринча“(Golden rice), модификованог да у зрнима акумулира β-каротен Табела 1.1.: Хронолошки преглед главних достигнућа у развоју биотехнологије

Примене биотехнологије Биотехнологија се примењује у више индустријских области, али и у основним истраживањима, као и у заштити животне средине (Таб. 1.2.). Црвена биотехнологија се односи на примену у медицини, ветерини и фармацији, и то у областима као што су фармакогеномика, производња лекова, генетска тестирања, генска терапија и др. Зелена биотехнологија је биотехнологија примењена на агрикултуру. Селекција и доместикација биљака путем микропропагације или дизајнирање трансгених биљака да успевају под специфичним условима средине или у присуству (или одсуству) агрономских хемикалија су само неки од примера зелене биотехнологије. Главна нада и идеја водиља развоја зелене биотехнологије је проналажење решења за повећање продукцје и квалитета хране која би била мање шетна по околину од класичних индустријских и хемијских решења. На пример, биљка која би сама производила пестицид, као што то чини БТ кукуруз, би елеминисала потребу за прскањем поља пестицидима. Да ли је овај приступ заиста безбеднији за околину је предмет многих дебата. У ову категорију спада и биоремедијација - примена биотехнологије у заштити животне средине и подразумева коришћење биолошких агенаса, првенствено бактерија и биљака, за уклањање или неутрализацију загађивача и хемикалија из воде или земљишта. Бела биотехнологија је индустријска биотехнологија. Примена биотехнологије у индустријским процесима обухвата дизајнирање организама да производе корисне хемикалије, дизајнирање ензима као индустријских катализатора да производе вредне хемикалије или разграђују токсине и загађиваче, индустријско коришћење усева за производњу биоразградљиве пластике, биљних уља, биогорива исл. Генерално, бела биотехнологија троши мање ресурса него одговарајући традиционални индустријски процес. Боја Црвена Жута Плава Зелена Браон Тамна Розе Бела Златна Сива

Области биотехнологије Здравље, медицина, дијагностика, фармација Прехрамбена биотехнологија и нутриционизам Биотехнологија морских, водених и обалских система; аквакултура Биотехнологија биљака, агрикултура и заштита живорне средине Биотехнологија сушних подручја и пустиња Биолошко оружје, биотероризам Патенти, проналасци, публикације, интелектуална својина Биоиндустрија Биоинформатика и нанобиотехнологија Класична технологија ферментације и процесовања Табела 1.2. Области биотехнологије, популарно класификоване према бојама

3

у основним истраживањима, биотехнологија се користи код различитих типова експеримената, од којих ће бити наведени само поједини примери.  Експерименати елиминације функције, као што је „нокаутирање гена“ (gene knockout) и утишавање гена (gene knockdown ili gene silencing) се користе код гена чија је секвенца позната, али је њихова функција недовољно позната или потпуно непозната. Код оваквих експеримената организам се генетски модификује тако да му недостаје активност једног или више гена, што подразумева креирање и манипулацију ДНК конструкта in vitro који се потом користи за трансформацију ћелија. Ово омогућава анализу фенотипских дефеката проузрокованих неактивношћу датог гена и стицање увида у функцију тог гена. Алтернативно, код мањих организама који се брзо размножавају, као што су нпр. бактерије, винске мушице и неке биљке, могућ је и класичан приступ мутагенезе у великим популацијама, међу чијим се потомством потом тражи одговарајућа мутација односно фенотип. За овакве експерименте није потребно познавати секвенцу гена, али је потребно имати увид у његову функцију.  Експерименати увођења функције се могу заснивати на увођењу више копија једног гена или једне цДНК копије гена под контролом одређеног промотора. Како је овај приступ супротан нокаут експериметима, често се означава као „gene knock-in” и обично се спроводи паралелно са нокаутима, да би се прецизније одредила функција гена студирањем фенотипа са појачаном експресијом (overexpression). У дати организам, наравно, могу бити уведени и страни гени.  Експерименти праћења генске експресије имају за циљ прикупљање информација о месту (како на нивоу ткива тако и на субћелијском новоу), времену и условима експресије датог протеина, али и о његовим интеракцијама са другим протеинима. Овакви експерименти често подразумевају конструкцију генских фузија испитиваног гена са репортер геном. Биотехнологија биљака У циљу повећања приноса и квалитета производа, у агрономији се традиционално користе два приступа: 1) укрштање и селекција биљака и 2) прскање пестицидима и хербицидима како би се спречило штетно деловање инсеката и корова. Користећи традиционалне генетичке манипулације, узгајивачи уводе жељене особине у стокове семена и потом укрштају различите варијетете како би њихове добре особине искомбиновали у потомству супериорног квалитета. Иако је овај приступ био веома успешан, проблем је у томе што су потребне године и године укрштања и повратног укрштања кроз велики број генерација да би се добила жељена особина. Уз пут се могу испољити и неке нежељене особине, јер је практично немогуће изоловати и одабрати једну особину без утицаја на друге. Додатно ограничење традиционалне селекције је њена применљивост само на биљке које се сексуално укрштају. Научни напредак и лабораторијске технике развијене током друге половине 20. века су омогућиле манипулацију ДНК, што је убзало процес унапређења биљака коришћењем биотехнологије. Главно достигнуће је, свакако, могућност латералног преноса гена из других организама у културне биљке, које потом почињу да производе нове протеине, што је било немогуће извести традиционалним методама укрштања. Биљке имају јединствене карактеристике које утичу на њихову подобност за трансгенезу. Поред сесилности, могућности самооплодње и производње бројног потомства, узгој трансгених биљака у великој мери олакшава чињеница да се целе биљке могу потпуно регенерисати из дедиференциране масе ћелија – калуса, уколико се у култури in vitro обезбеде нутриенти и одговарајући баланс биљних хормона. Нове уведене особине доприносе како повећаној продуктивности, тако и квалитету људске исхране и здравља, али и заштити околине. Према подацима из 2001, у Америци је више од половине укупних усева памука,

4

соје и каноле било генетички модификовано (Сл. 1.1.), док је 2003. око 6 милиона фармера из 18 земаља гајило ГМ усеве на површина од 67.6 милиона хектара.

Слика 1.1.: Проценат генитички модификованих усева у УСА 2001. године

Особине које се уводе у биљке коришћењем биотехнологије могу се класификовати у три опште категорије: улазне (произвођачке), излазне (потрошачке) и посебне особине. Улазне или произвођачке особине (input traits) су оне које побољшавају улаз тј. сам узгој култивара и помажу произвођачу да смањи трошкове производње, повећа принос и смањи коришћење хемикалија за контролу инсеката, корова и болести. Улазне особине се могу окарактерисати и као различити типови отпорности, јер обухватају:  Отпорност биљака на хербициде  Отпорност на инсекте  Отпорност на патогене (биотички стрес): бактерије, гљивице, вируси, нематоде  Отпорност на абиотички стрес: температурни екстреми, суша, поплаве, високе концентрације соли у земљишту и др.  Повећање приноса (на друге начине, осим увођења отпорности). Излазне или потрошачке особине (output traits) помажу потрошачима тако што поправљају квалитет хране односно биљних производа генерално. За разлику од ГМ биљака са улазним особинама које су увелико комерцијализоване, ГМ биљке са излазним особинама су већином у фази тестирања, неке су тек у идејној фази развоја, а мањи број оваквих пројеката је у потпуности остварен. Неки од главних примера потрошачких особина су:  Нутриционистички унапређене биљке  Биљке побољшаног укуса  Трајније воће и поврће са бољим карактеристикама сазревања  Дуван без никотина

5



Украсно цвеће нових боја, мириса и продужене свежине итд.

Посебне особине (value-added traits) су особине кодиране генима који убачени у биљке потпуно мењају начин коришћења биљака и практично их претварају у мини-фабрике које јефтино продукују велике количине материјала или хемикалија корисних у фармацији и индустрији. Генетичке модификације овог типа се у главном воде као метаболичко инжињерство, а сам начин експлоатације као молекуларна пољопривреда. Биљке које се користе на овај начин се могу гајити у пољу као и други усеви, али се често гаје и у биореакторима. Главни производи оваквих ГМ биљака су:  Терапеутски протеини који се користе у третирању болести или као вакцине  Секундарни метаболити  Текстилна влакна  Биоразградљива пластика  Уља која се користе за боје, детерџенте и лубриканте. Од свих трансгених биљака које су до данас комерцијализоване, код чак 71% биљака је реч о увођењу отпорности на хербициде, 28% су трансгене биљке отпорне на инсекте, док се само 1% се односи на све остале комерцијалне ГМ биљке.

Генетско инжењерство Основни кораци генетског инжењерства Генетско инжењерство, познато и као молекуларно клонирање, генетска манипулација, технологија рекомбинантне ДНК, па чак и нао „нова генетика“, представља област биотехнологије у којој се гени и природне ДНК секвенце користе као ресурси којима се на различите начине манипулише да би се постигли одређени циљеви како у фундаменталним истраживањима, тако и у примењеним областима. Развој генетичког инжињерства као посебне области траје већ четрдесетак година и сада је дошао у фазу када су опрема (центрифуге, аутоклави, инкубатори, спектрофотометри, системи за електрофорезу, PCR машине), алати (ензими), различити комерцијални китови (нпр. за конструкцију генских библиотека), сервиси (за секвенцирање, за синтезу олигонуклеотида), биоинформатички ресурси, па и инфраструктура за изолацију и гајење генетички модификованих организама, микроорганизама и вектора (стакларе, одгајивачнице експерименталних живориња, стерилни блокови, инкубатори) потребни за генетичке манипулације приступачни сваком појединачном истраживачу из осредње опремљене и финансиране лабораторије. Изузетак су пројекти из области геномике, транскриптомике и других омика, који се заснивају на високопроцесивним техникама и самим тим обично захтевају посебну опрему, а често и роботизоване системе, па у складу са тим и одговарајућу организацију и финансирање. Основни кораци у генетичком инжињерству су:  Изолација гена од интереса  Модификација гена од интереса и конструкција генске касете  Конструкција вектора и инсерција гена у вектор  Трансформација  Селекција сепарација генетички модификованих нетрансформисаних организама

организама

од

6

Генске касете Трансгени у биљкама морају имати правилну просторну и временску експресију, транскрипт мора бити исправно процесован, а протеин по потреби модификован и транспортован у одговарајућу органелу. Да би се ово постигло, трансген мора бити пажљиво исконструисан пре увођења у биљку. Сваки ген који се убацује у биљку, било то ген од интереса, селектабилни маркер или репортер ген се у ствари састоји од неколико елемената који се независно бирају и комбинују у целину која се колоквијално назива генска касета (gene cassette): промотор--(сигнал за транспорт у органелу)--ген--термиантор Избор промотора који ће бити фузионисан са трансгеном зависи од захтева - да ли експресија треба да буде конститутивна, индуцибилна или ткивно-специфична. Генерално, промотори могу бити хомологни (из исте врсте, истог рода или евентуално исте фамилије) или хетерологни (из удаљених врста). Коришћење хетерологних промотора може бити проблематично, јер подразумева препознавање cis-регулаторних секвенци једне биљке од стране транскрипционих фактора биљке домаћина. Упркос томе, хетерологни промотори често добро функционишу јер су многе фамилије транскрипционих фактора веома конзервативне. Највећи проблем представља експресије гена из монокотила у дикотилама или обрнуто. Промотори који се користе у генетичком инжињерству биљака се деле на:  Конститутивни промотори o Промотори биљних патогена o Конститутивни промотори монокотила  Индуцибилни промотори o Промотори индуковани абиотичким и биотичким стресом o Хемијски индуковани промотори  Ткивно-специфични промотори  Развојно-специфични промотори  Синтетички или рекомбинантни промотори Конститутивни промотори диктирају експресију у готово свим ткивима и практично су независни од развојних и спољашњих фактора. Како њихова експресија није условљена ендогеним факторима, овакви промотори су обично активни у различитим врстама и чак у различитим таксономским краљевствима. Конститутивни промотори се користе ако се жели висок ниво експресије протеина, ако није битно да експресија буде просторно или временски ограничена или управо ако је неопходно да продукт буде експримиран у свим деловима биљке током целог развића. Промотори овог типа се највише користе за биљне селектабилне маркере и репортер гене. Промотори биљних патогена су активни код практично свих дикотила, али понекад нису ефикасни код монокотила. У најширој употреби је CaMV 35S промотор мозаичког вируса карфиола (The Cauliflower Mosaic Virus, CaMV), dsDNA вируса који напада Brassicaceae. CaMV 35S (Сл. 7.1) је веома јак конститутивни промотор који даје високу експресију код дикотила, али је код монокотила мање ефикасан.

7

Слика 7.1.: Нуклеотидна секвенца CaMV 35S промотора (-343 +1). ТАТА box је уоквирен, а три секвенце налик СААТ box-у су истакнуте црвено. Позиција +1 (А) је почетак транскрипције. Секвенца -90 +1 је минимални промотор, а секвенца -343 -90 има својства енхенсера.

Транспорт у органеле. Поред захтева за одговарајућом експресијом, у неким случајевима је неопходно да се синтетисани протеин транспортује у неку органелу. Ово је чест случај код гена за резистенцију на хербициде, јер се циљни гени обично налазе у хлоропластима. У том случају се генским конструктима додају сигналне секвенце за транспорт у одговарајућу органелу. Терминатори су секвенце које сигнализирају крај транскрипције. На крај генских конструката или касета се скоро увек убацују терминатори од око пар стотина bp, који воде порекло од CaMV 35S транскрипта или, још чешће, од нопалин синтетазе из Ti плазмида (3' nos). Специфичне модификације хетерологних гена. Хетерологни гени, а посебно гени који не воде порекло од биљака, се често веома слабо експримирају у биљкама чак и кад су под контролом јаког промотора. Разлог лежи у самој структури тј. секвенци трансгнеа, која се разликује од нормалних биљних гена, због чега се ген неправилно процесује или транслира. Због тога су понекад неопходне специфичне модификације трансгена, као што су:  Промена GC састава. Гени различитих организама се разликују по свом GC саставу, при чему бактеријски гени имају знатно нижи % GC од других.  Уклањање криптичних интрона. Криптични или скривени интрони су секвенце трансгена које заправо нису интрони, али их биљни системи за обраду РНК погрешно препознају као интроне и исецају их. Ово доводи до делеција у транскрипту трансгена који се у том случају не експримира.  Уклањање АТТТА секвенци - код биљака поновци АТТТА односно AUUUA у транскриптима смањују стабилност mRNA, па се врло ретко јављају у биљним генима  Уклањање потенцијалних места за полиаденилацију – како код прокариота не долази до полиаденилације mRNA, тако бактеријски гени често имају секвенце које биљни системи препознају као сигнале за полиаденилацију у сред транскрипта. Ове секвенце, наравно, прекидају транскрипцију и неопходно их је све уклонити осим једне на крају транскрипта где је и потребна.  Оптимизација коришћења кодона - понекад је потребно изменити поједине нуклеотиде трансгена, да би за поједине аминокиселине изабрао оптималан кодон који се уобичајено користи код биљака, чиме се постиже ефикаснија транслација.  Консензусне секвенце у околини AUG кодона неопходне за иницијацију транслације су другачије код биљака него код других врста.

8

Ензими као алати Баш као и у сваком другом инжињерству и у генетичком инжињерству није довољан само материјал (ДНК ресурси), већ и специфични алати - ензими. Ензими који се користе у генетичком инжињерству и биотехнологиј су, логично, они који као супстрат имају ДНК (или РНК), и помоћу којих се ДНК сече, спаја, реплицира или модификује на различите начине. Познавање асортимана природних и модификованих/мутираних ензима који су комерцијално доступни, њиховог механизма катализе, специфичности, предности, мана и могућности примене је неопходно како би се направио правилан избор ензима за планирани експеримент. Нуклеазе Нуклеазе су ензими који спадају у групу хидролаза или, прецизније, естераза, a секу фосфодиестарске везе између нуклеотида у нуклеинским киселинама. Различите нуклеазе могу сећи фосфодиестарске везе са једне или друге стране (Сл. 4.1).  Неке нуклеазе секу 3’-O-P везу (ближе 3’C-атому пентозе, а према 5’-крају ланца): 5’-pNpN↓pNpNpNpN↓pNpN-OH3’  pNpN-OH + pNpNpNpN-OH + pNpN-OH 

Неке нуклеазе секу 5’-O-P везу (ближе 5’C-атому пентозе, а према 3’-крају ланца): 5’-pNpNp↓NpNpNpNp↓NpN-OH3’  pNpNp + HO-NpNpNpNp + HO-NpN-OH

Ако нуклеаза сече 3’-O-P везу, продукти хидролизе су (олиго)нуклеотиди који имају и 5’фосфатни и 3’-хидроксилни крај, што би било уобичајено. Ако, међутим, нуклеазе сече 5’-O-P везу, онда ће један од продуката имати фосфатне групе са обе стране, један неће имати ни једну, а остали ће имати 5’-хидроксилну и 3’-фосфатну групу.

G

A H

H O

5' -2

O3P

O P O

H(OH)

3'

H

OO

H

3'-O-P

5'

OP

H(OH)

H

O

O

H

H O

H

O

3' OH

O

5'-O-P

Слика 4.1: места деловања нуклеаза

Поред рестрикционих ендонуклеаза, многе друге врсте нуклеаза имају различите примене у молекуларној биологији. Нуклеазе се према типу супстрата и начину деловања класификују на следећи начин:  Егзонуклеазе (одвајају у главном по један по један нуклеотид са 3’ и/или са 5’ краја ланца) o Егзодезоксирибонуклеазе: λ егзонуклеаза, егзонуклеазе I, III и VII, BAL 31 o Егзорибонуклеазе  Ендонуклеазе (секу у средини ланца) o Ендодезоксирибонуклеазе: BAL 31 , DNAse I, рестрикционе ендонуклеазе, nicking ендонуклеазе o Ендорибонуклеазе: RNAse H, RNAse A, RNAse T1

9

o

Неспецифичне дезокси- или рибо- могу да секу и ДНК и РНК: нуклеаза S1, mung bean нуклеаза, микрококална нуклеаза

Рестрикционо/модификациони системи Рестрикционо/модификациони (Р/М) системи укључују рестрикциону ендонуклеазу (у даљем тексту РЕ, званична скраћеница REase) и модификујући ензим- ДНК метилазу одн. метилтрансферазу (MTase), а служе за одбрану ћелије од стране ДНК, тј. омогућавају разликовање домаће ДНК од стране ДНК (плазмидне, бактериофагне или ДНК унесене трансфекцијом). РЕ препознаје и сече специфичне ДНК секвенце, док метилаза метилује А или С на тим истим секвенцама, чиме штити ДНК домаћина од сопствене РЕ. Додате метил групе залазе у велики жљеб ДНК, чиме спречавају везивање РЕ. РЕ су изоловани пре више од 30 година током испитивања феномена рестрикције раста бактериофага на појединим бактеријским културама. Неки бактеријски сојеви су се једно време опирали фагној инфекцији, захваљујући својим рестрикционим ензимима. Међу првим изолованим РЕ су били EcoRI и EcoRII из Escherichia coli и HindII и HindIII из Haemophilus influenza. Показано је да ови ензими генеришу фрагменте ДНК дискретне величине који се могу спојити у лабораторији дејством лигаза (мада неки други РЕ не генеришу дискретне фрагменте). РЕ су нађени искључиво код прокариота (и код неких вируса), и то код свих испитиваних бактерија и архебактерија, што је потврђено и анализом секвенцираних прокариотских генома. На основу композиције субјединица, места сечења ДНК, специфичности за секвенце и захтева за кофакторима, РЕ се традиционално класификују у три групе (типа), мада је недавно класификацији додат и Тип IV, који се доста разликује од осталих. Секвенцирање гена за ензиме Р/М система је, међутим, показало велику разноврсност, много већу него што би одговарала подели на 4 типа. Без обзира на тип, рестрикционе ендонуклеазе по правилу катализују хидролизу оба ланца ДНК у исто време, при чему се хидролиза одвија паралелно, што је најчешће омогућено присуством два каталитичка места на ензиму. Р/М системи обухватају:  Тип I - метилаза и РЕ су један комплексан ензим  Тип II -метилаза и РЕ се независни једноставни ензими (дели се на 11 подтипова)  Тип III - метилаза и РЕ су један комплексан ензим  Тип IV - само РЕ који сече страну метиловану ДНК  Солитарне метилазе (без РЕ парњака) немају везе са Р/М системима, али њихова метилација може да интерферира са рестрикцијом У генетичком инжињерству се свакодневно користе само Р/М системи типа II, односно њихова рестрикциона компонента, али метилација и рестрикција другим системима може да утиче на исход експеримента, па је неопходно познавати генотип бактерије коју користимо за клонирање, као и тип метилације код организма чијом ДНК манипулишемо. Номенклатура Р/М ензима. Имена рестрикционих нуклеаза се означавају са 4 слова, од којих се прво (велико) односи на род, друга два (мала) на врсту, а последње (велико или мало) на сој, изолат или серотип бактерија. Ако иза слова има арапских бројева, они се такође односе на серотип или сој бактерија. Римски бројеви на крају се додељују како би се разликовали РЕ изоловани из истог соја. Тако је, на пример, EcoRI из Escherichia coli RY13 (аутор R. N. Yoshimori). Синоним за EcoRI је R.EcoRI, при чему “R” означава да је реч о рестрикционом ензиму (мада се префикс у случају рестрикционих ензима ретко користи). Овом рестрикционом ензиму по специфичности одговара метилаза М.EcoRI. За метиловане базе се користе следеће стандардне скраћенице:

10

   

m5C- 5-метилцитозин hm5C- 5-хидроксиметилцитозин m4C- N4- метилцитозин и m6A- N6-метиладенин

Р/М системи Типа II се по правилу састоје од индивидуалних РЕ и метилаза, енкодираних посебним генима, мада има изузетака (код подтипова IIB, IIG и IIH РЕ и М гени су фузионисани у један ген). РЕ Типа II препознају специфичне секвенце, а секу на константним позицијама које су или у овиру секвенце препознавања или близу ње, продукујући 5’-фосфатне и 3’-хидроксилне групе на крајевима. Обично захтевају само Mg2+ јоне као кофакторе, мада неки имају и егзотичне захтеве. РЕ Типа II могу бити мономери, хомо- и хетеро-димери, па чак и тетрамери. Метилтрансферазе најчешће препознају исту секвенцу као и одговарајући РЕ, али има и случајева када је метилаза мање специфична. Постоје три типа метилаза као део Р/М Типа II- оне које уводе m4C, m5C или m6A, при чему је S-аденозилметионин кофактор. Иако и РЕ и метилаза препознају исту секвенцу, међу њима постоји врло мало хомологије (код Типа I је заједничка субјединица одређивала специфичност за обе активности). Системи Типа II су веома заступљени, а због великог значаја у молекуларној биологији, окарактерисано их је преко 3500. РЕ Типа II су практично једини који се користе у лабораторији за анализу ДНК и за клонирање. Oва група обухвата најразличитије ензиме, од којих неки немају сличности ни са једним другим ензимом, па се сматра да су се појавили више пута независно током еволуције. Битне карактеристике ових ензима су:  Неки РЕ имају континуално место препознавања, као EcoRI (GAATTC), и много се више користе у пракси од ензима који имају дисконтинуално место препознавања, као BglI (GCCNNNNNGGC).  Већина ензима оставља кохезионе или лепљиве крајеве (sticky ends), који могу бити или 5’-кохезиони крајеви или 3’- кохезиони крајеви, док неки ензими секу равно, па генеришу равне крајеве (blunt ends). Ово је битно због лигације исечених фрагмената, јер се лепљиви крајеви много лакше повезују. Постоје парови РЕ који генеришу идентичне, одн. комплементарне кохезионе крајеве, иако имају различите секвенце препознавања, као BamHI и BglII, па се фрагменти исечени оваквим ензимима могу комбиновати при лигацији (Таб. 4.3).  Дужина места препознавања је такође од велике важности при избору РЕ, јер од дужине зависи фреквенција рестрикције, па тако и просечна дужина фрагмената који ће се добити. Највише се користе ензими који препознају секвенце од 6 bp.  Изошизомери (isoschizomers) су два или више РЕ који препознају и секу исту секвенцу. Први пример ензима који препознаје дату секвенцу је прототип, а они касније откривени су његови изошизомери. Ако неки РЕ препознаје исту секвенцу као прототип али је сече другачије, то је неошизомер. Тако су HpaII (C↓CGG) и MspI (C↓CGG) изошизомери, а AatII (GACGT↓C) и ZraI (GAC↓GTC) неошизомери. Важно је напоменути да се многи парови изошизомера разликују према својој осетљивости на метилацију циљне секвенце.

BamHI (5’ крајеви)

BglII (5’ крајеви)

KpnI (3’ крајеви)

5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'

5'---A GATCT---3' 3'---TCTAG A---5'

5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5'

SmaI (равни крајеви) 5'---CCC 3'---GGG

GGG---3' CCC---5'

Табела 4.3: Примери крајева генерисаних различитим РЕ

11

Примене рестрикционих ензима у генетском инжињерству и молекуларној биологији су бројне и обухватају фрагментисање ДНК ради даљих анализа, мапирање, клонирање, анализу генотипа и др.  Рестрикциона фрагментација (restriction digest) је једна од основних процедура у молекуларној биологији, која се користи да би се геномска или друга ДНК припремила за анализу или неку другу обраду. У зависности од наредних корака, фрагментација се може обављати једним или више РЕ, примењеним појединачно или симултано (ако се, нпр. два РЕ користе симултано, то је double digest). Ови фрагменти се потом могу амплификовати PCR-ом, анализирати електрофорезом идр. Рестрикциона фрагментација се примењује у склопу метода као што су анализа геномске ДНК Southern хибридизацијом, анализе молекуларних маркера типа RFLP, AFLP и VNTR и друге методе.  Рестрикционо мапирање представља одређивање места познатих РЕ у некој ДНК секвенци.  Молекуларно клонирање је централна метода генетичког инжињерства у којој се РЕ користе за инсерцију гена одн. генских конструката у плазмидне или друге векторе. Да би се генски конструкт убацио у циркуларни вектор, неопходно је и фрагмент и вектор исећи истим РЕ (или помоћу два РЕ који дају комплементарне кохезивне крајеве) и потом их повезати лигазама.  Анализа генотипа  Анализа метилације геномске ДНК ДНК и РНК лигазе ДНК лигазе катализују формирање фосфодиестарских веза на месту једноланчаних или дволанчаних прекида у дуплексу ДНК. Ако су у питању дволанчани прекиди, лигазе су много ефикасније у повезивању кохезивних крајева, док су за повезивање равних крајева потребне веће концентрације ензима, дуже време и/или посебни реакциони услови. Поједине лигазе могу деловати и на једноланчану ДНК. Како лигазе повезују 3'-ОН и 5'фосфатне крајеве, присуство фосфатне групе на 5' крају ланца је предуслов за реакцију. ДНК којој на 5' крају недостаје фосфат се може припремити за лигацију фосфорилацијом помоћу бактериофагне Т4 полинуклеотид киназе. Обрнуто, у колико желимо да заштитимо крајеве ДНК од дејства лигаза, то се једноставно постиже уклањањем 5'-фосфата алкалном фосфатазом. ДНК лигазе и код прокариота и код еукариота имају улогу у поправкама различитих типова оштећења на ДНК, као што су поправке после уклањања база или нуклеотида и поправке на месту погрешно спарених нуклеотида, а учествују и у процесима рекомбинације. Осим тога, ДНК лигазе су неопходне и у процесу репликације за повезивање Оказакијевих фрагмената. РНК лигазе имају улогу у животном циклусу појединих вируса и бактериофага. ДНК и РНК лигазе се у генетичком инжињерству првенствено користе за конструкцију рекомбинантних молекула, али и за неке специфичне потребе као што је повезивање једноланчаних прекида после синтезе другог ланца cDNA или детекција тачкастих мутација. Комерцијалне лигазе су или бактеријског порекла или су кодиране бактериофагним генима. Према типу супстрата и кофактора, лигазе нуклеинских киселина се деле на три групе:  АТР-зависне ДНК лигазе  NAD+-зависне ДНК лигазе и  АТР-зависне РНК лигазе Лигација инсерта у вектор је један од главних корака при молекуларном клонирању односно рекомбинантној технологији и представља најзначајнију употребу лигаза. При томе се најчешће и инсерт и вектор исеку истим рестрикционим ензимом, и то ензимом

12

који оставља кохезивне крајеве, а лигаза повезује инсерт и вектор и потом циркуларизује цео конструкт. Приликом оваквих реакција се могу добити различити продукти лигације:  Жељени продукт je фрагмент убачен у вектор, који се добија бимолекуларном конкатемеризацијом. Сви остали продукти су нежељени.  Циркуларизован вектор без инсерта се добија унимолекуларном циклизацијом, Повезани сами вектори  Повезани сами инсерти Полимеразе Полимеразе су ензими чија је улога полимеризација нуклеинских киселина уграђивањем нуклеотида које у форми rNTPa односно dNTPa узимају из раствора, при чему се ослобађа пирофосфат (PPi). Полимеразе се по функцији и типу матрице деле на:  ДНК полимеразе: полимеризација ДНК на основу ДНК мартице (репликација и поправка ДНК). Има много различитих комерцијалних ДНК полимераза које се широко користе у генетичком инжињерству за различите намене.  Реверзне транскриптазе (РТ или RNA-dependent DNA polymerase, RdDp) такође спадају у ДНК полимеразе, а катализују полимеризацију ДНК на основу РНК мартице тј. синтезу комплементарне ДНК (cDNA). Ови ензими су кодирани ретровирусима који имају РНК геном, па су неопходне да би превеле РНК у cDNA, која се потом уграђује у ћелију домаћина. Посебна врста реверзних транскриптаза је присутна и код еукариота, а то су теломеразе.  РНК полимеразе полимеризују РНК на основу ДНК мартице у процесу транскрипције. РНК полимеразе за функционисање увек захтевају одговарајући промотор, а еукариотске низ других протеина - транскрипционих фактора, па су као такве незахвалне за експериментално коришћење, осим у саставу посебних система одн. екстраката у китовима за in vitro транскрипцију. Најпрактичније за коришћење су РНК полимеразе кодиране бактериофазима. Постоје и РНКзависне РНК полимеразе које имају специфичне примене.  Терминална трансфераза: полимеризација ДНК продуживањем 3'-крајева. ДНК полимеразе учествују у репликацији, али и у поправци оштећења на ДНК, па се основна подела и своди на репликативне и „repair” полимеразе. Ова фамилија ензима је веома конзервативна, а на основу хомологије секвенци се деле на 7 подфамилија. У овом поглављу ће бити описане искључиво комерцијалне полимеразе (било природне или рекомбинантне и модификоване) које се користе у генетичком инжињерству. ДНК полимеразе имају многе заједничке карактеристике и захтеве:  Полимеризација се увек одвија у 5’3’ правцу, тј. нуклеотиди се додају на 3'-крај  За полимеризацију је неопходан слободан 3'-ОН терминус  За полимеризацију је неопходна матрица. Ни једна ДНК полимераза не може да започне de novo синтезу ДНК. Ни једна ДНК полимераза (осим терминалне трансферазе) као матрицу не може да користи интактну дволанчану ДНК, већ само: o једноланчану ДНК са хибридизованим олигонуклеотидом - прајмером. Прајмери за репликацију у ћелији се састоје од прва два РНК нуклеотида и неколико ДНК нуклеотида, које синтетише посебан тип полимеразе примаза. У експериментима се као прајмери користе различити типови синтетичких олигонклеотида. o дволанчану ДНК са краћим или дужим прекидима једног ланца (gaps) или o дволанчану ДНК којој штрчи 5' крај

13

дволанчану ДНК са једноланчаним прекидима (nicks)- само у случају неких полимераза као што је E. coli ДНК полимераза I и њен Klenow фрагмент Неопходни су dNTPs Mg2+ јони су неопходни за све полимеразе. o

 

Битне особине по којима се ДНК полимеразе разликују су:  Тачност (fidelity)  Брзина (бр уграђених нуклеотида/s)  Процесивност (бр уграђених нуклеотида пре дисоцијације од матрице)  Матрица - за већину ДНК полимераза је ДНК, а за реверзне транскриптазе је РНК  3’5’ егзонуклеазна активност (proofreading)  5’3’ егзонуклеазна активност (nick translation)  Замена ланца (strand displacement)  Термостабилност 3’5’ егзонуклеазна активност (proofreading, Сл. 4.2, б). Механизам провере спаривања нуклеотида и избацивања погрешно уграђеног нуклеотида на лицу места је својствен већини, али не свим полимеразама. Провера се обично заснива на својеврсном мерењу дијаметра дуплекса у делу ензима налик каналу који обухвата ДНК. Исецање погрешног нуклеотида се обавља у 3’5’ правцу, егзонуклеазном активношћу коју обично има посебна субјединица или домен полемеразе. Ензим при полимеризацији застане и врати се „корак уназад“ да би исекао пограшан нуклеотид пре него што угради исправан, и настави даље. При избору ензима за одређени експеримент веома је важно знати да ли полимераза има или нема ову активност. 3’5’ егзо активност је пожељна за PCR високе тачности (high-fidelity PCR), уклањање 3'-крајева који штрче (3´ overhang polishing) и синтезу другог ланца cDNA (после реверзне транскрипције). 3’5’ егзо активност је непожељна за обележавање ДНК нестандардним или модификованим нуклеотидима у циљу секвенцирања или нуклеотидима са флуоресцентним бојама у експериментима базираним на хибридизацији и за додатак нуклеотида на 3'-крај без матрице. 5’3’ егзонуклеазна активност представља способност неких полимераза да разграде један од ланаца ДНК нуклеотид по нуклеотид, у правцу полимеризације, у колико током полимеризације наиђу на дволанчани регион, као што је приказано на Сл. 4.2, в. Ова особина полимераза се користи за методу померања прекида (Nick translation), при чему се једноланчани прекиди намерно уводе дејством DNAseI или неке nicking ендонуклеазе. Померање прекида је метода обележавања ДНК радиоактивним нуклеотидима, нуклеотидним аналозима или нуклеотидима са прикаченим флуоресцентним бојама или антигенима. Замена ланца (strand displacement) је способност неких полимераза, и то искључиво оних којима недостаје 5’3’ егзо активност, да одлепе (раскидањем водоничних веза) један ланац ДНК од другог у колико током полимеризације наиђу на дволанчани регион, тако да новосинтетисани ланац замени стари, како је приказано на Сл. 4.2, г. Полимеразе са овом особином се могу користити за методу изотермалне амплификације одн. амплификацију заменом ланца (Strand Displacement Amplification, SDA), што представља алтернативу PCR амплификацији.

14

Слика 4.2: Активности ДНК полимераза. а - 5'3' полимеризациона активност, односно општа шема репликације ДНК. Водећи ланац (leading strand) се синтетише континуално у 5'3' правцу, док други ланац (lagging strand) заостаје, јер се синтетише из фрагмената. Са отварањем репликационе „виљушке“ се прво везују РНК прајмери које синтетише примаза, на које се надовезују нуклеотиди новог ланца у форми Оказакијевих фрагмената, који се касније повезују лигазом. Топоизомераза одвија навоје ДНК испред репликационе виљушке, док хеликаза раскида водоничне везе; Региони једноланчане ДНК код саме репликационе виљушке штите посебни протеини. б - 3’5’ егзонуклеазна активност; в - 5’3’ егзонуклеазна активност – померање једноланчаног прекида; г - замена ланца. Остала објашњења у тексту.

Термостабилност полимераза зависи од типа организма (бактерије и њених фага или вируса) из којих је ензим изолован:  Мезофилни организми полимеразе са Т оптимумом од 25-40оС, али добро функционишу и на нижим Т. Ове полимеразе се лако инактивирају топлотом, а добро функционишу у истом пуферима као и рестрикциони ензими и лигазе, тако да се ДНК не мора пречишћавати за различите реакције.  Термофилне бактерије полимеразе са Т оптимумом око 60-80оС,које су стабилне до 95оС, као Taq и Bst полимеразе

15



Хипертермофили - Archaea полимеразе са Т оптимумом око 75-85оС, а стабилне су и на 100оС, као VentR® и 9°N™.

E. coli ДНК полимераза I је ДНК-зависна ДНК полимераза са својственом 3’5’ и 5’3’ егзо активношћу. Користи за реакције радиоактивног обележавања ДНК nick транслацијом, али и за синтезу другог ланца cDNA. Није стабилна на повишеним Т, већ се комплетно инактивира загревањм на 75оС 20 min. Klenow фрагмент је продукт протеолизе E. coli ДНК полимеразе I (уклоњен је N-терминални домен) који поседује полимеразну и 3’5’ егзо активност, али нема 5’3’ егзо активност (Сл. 4.3). Користи се за секвенцирање ДНК, поравњавање крајева ДНК и у протоколима мутагенезе. Klenow фрагмент 3’5’ еxo- је варијанта ензима код кога су уведене и две мутације којима се елиминише и 3’5’ егзонуклеазна активност. Ова варијанта се такође користи за секвенцирање, за синтезу другог ланца, као и за обележавање ДНК насумичним прајмерима.

Слика 4.3: Структура и функција E. coli ДНК полимеразе I и њеног дела, Klenow фрагмента.

Taq полимераза је изолована из термофилне бактерије Thermus aqauticus YT-1 и користи се за обичан PCR, као и за високопроцесиван PCR. Најактивнија је на Т 75-80 оС, док је на 37оС 10 пута мање активна. Сматра се да се термална стабилност Taq заснива на повећаној хидрофобности језгра ензима, стабилизацији електростатичких веза у другим деловима ензиме и доброј интеракцији са молекулима воде због присуства доста пролина на самој површини. Како Taq нема 3´--> 5´ активност, није препоручљиво користити је ако је потребна велика тачност амплификације, али је зато погодна за уградњу неконвенционалних нуклеотида (dUTP, dITP) и нуклеотида са ковалентно закаченим флуоресцентним бојама, што је неопходно у неким есејима, попут анализе експресије ДНК чиповима (microarrays). Остали ензими Т4 полинуклеотид киназа катализује трансфер γ-фосфатне групе АТР-а на 5'-крај ДНК или РНК, па се користи за фосфорилацију 5'-крајева ако им недостаје фосфатна група, што је предуслов за лигацију. Ензим може да делује на дволанчану ДНК, једноланчану ДНК и РНК, на олигонклеотиде, као и на једноланчане прекиде у ДНК. Алкалне фосфатазе су Zn2+-металоензими који су најактивнији на рН 8-9, а катализују уклањање 5'-фосфтане групе са ДНК, РНК, rNTP-a и dNTP-a. Ова реакција се користи као припрема за радиоактивно обележавање 5'-крајева, као и за превенцију аутолигације вектора. Системи специфичне рекомбинације (site-specific recombination systems) су изоловани из вируса и бактериофага који могу да се интегрушу у геном домаћина у форми профага,

16

где катализују интеграцију виралног генома и његово извлачење (excision). Ови системи имају широку примену у биотехнологи, а се састоје од ензима рекомбиназе и специфичне секвенце коју дата рекомбиназа препознаје и на коју делује. Од оваквих система се највише користе Cre/Lox, Flp/FRT, R/RS и Int/att. Cre рекомбиназа (Cyclization recombination) је топоизомераза типа I кодирана бактериофагом Р1, која катализује место-специфичну рекомбинацију између LoxP места. LoxP су секвенце од 34 bp, које се састоје од два инвертована поновка (палиндрома) од по 13 bp између којих је 8 bp фрагмент који одређује оријентацију: ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT. За свако LoxP место се везује по један ензим, тако да су за све реакције потребна два ензима. Cre/LoxP систем се користи за модификацију гена и хромозома на различите начине, а продукти рекомбинације зависе од локације и оријентације LoxP места (Сл. 4.4):  Делеције ДНК сегмента у циркуларном облику између два LoxP места исте оријентације.  Фузија ДНК сегмената који имају по једно LoxP место.  Инверзија ДНК сегмента између два инвертована LoxP места

Слика 4.4: Примене Cre/LoxP система. а - исецање ДНК сегмента између два директна LoxP поновка; б - Фузија два ДНК молекула која имају по једно LoxP место; в - Инверзија сегмента ДНК између два инвертована LoxP.

Вектори Клонирање гена се заснива на коришћењу специфичних носача-вектора који омогућавају умножавање жељене секвенце у ћелији домаћину. Вектори за клонирање су ДНК молекули који се користе за транспорт клонираних секвенци између различитих домаћина (бактеријских и биљних ћелија) и епрувете и за конструкцију геномских и cDNA библиотека. Сви лабораторијски и комерцијални вектори морају да имају следеће особине:  Могућност аутономне репликације  Имају генетички маркер (или маркере) за селекцију  Поседују јединствена рестрикциона места за различите рестрикционе ензиме  Имају минималну количину неесенцијалне ДНК. Малим векторима се лакше манипулише in vitro и мање су подложни физичком цепању. Осим тога, краће секвенце имају мање рестрикционих места, па самим тим више јединствених рестрикционих места погодних за клонирање. Постоје природни вектори, као што су плазмиди и бактериофази, који су у мањој или већој мери модификовани, а постоје и потпуно вештачке конструкције попут хибрида између плазмида и фага (козмиди и фагемиди) или вештачких бактеријских (ВАС) или квашчевих хромозома (YAC). Различити вектори се у великој мери разликуку према свом капацитету - величини фрагмента стране ДНК који могу да приме (Таб. 8.1).

17

Вектор

Капацитет (Kb)

Домаћин

Ti плазмид/ бинарни вектор Ri плазмид/бинарни вектор Остали плазмиди λ фаг Козмиди Фозмиди Р1 PAC BAC YAC

5-10 (max 20)

A. tumefaciens A. rhizogenes E. coli

20 35-45 45 70-100 130-150 150-350 250-500 (max 1 Mb)

Квасац

Табела 8.1: Најважнији типова вектора

Плазмиди Плазмиди су екстрахромозомални дволанчани молекули ДНК (Сл. 8.1, а-б) величине 1-200 Kbp, који се налазе у бактеријама домаћинима у циркуларној, суперхеликалној форми (Сл. 8.1, в). Плазмиди су нађени код многих бактерија, а већина има узак избор домаћина. Репликација плазмида је независна од репликације бактеријског хромозома, али плазмиди у већој или мањој мери зависе од свог домаћина, јер домаћин кодира ензиме и протеине неопходне за репликацију. Плазмиди често садрже гене који користе бактерији домаћину, као што су гени за продукцију антибиотика или токсина, гени за резистенцију на антибиотике, за деградацију комплексних молекула, продукцију рестрикционих и модификационих ензима исл. Плазмиди одржавају сталан број копија посебним механизмима, а поседују и механизме за поделу одређеног броја плазмида ћеркама ћелијама, као и механизме зештите од инфекције другим плазмидима. Репликон је генетичка јединица која се која се састоји од места почетка репликације (Origin of Relication, ORI), који је код плазмида величие око пар стотина bp и контролних елемената. Репликон плазмида се дефинише и као сегмент плазмидне ДНК који може аутономно да се умножава и одржава сталан број копија. Број копија плазмида је просечан број плазмида по ћелији или по бактеријском хромозому под нормалним условима. До сада је окарактерисано преко 30 разних типова репликона одн. ORI-ја из различитих плазмида, од којих неки дозвољавају релаксирану репликацију односно већи број копија, док је код других репликација стриктно контролисана, а број копија мали. Типична стратегија клонирања плазмидима подразумева следеће кораке:  Изолација плазмида из бактерија  Рестрикционо сечење (отварање) плазмида изабраним рестрикционим ензимом  Рестрикционо сечење узорка ДНК (изолованог гена, неког ДНК фрагмента...)  Лигација ДНК фрагмената и плазмида  Трансформација бактерија (E. coli) продуктима лигације  Раст бактеријских ћелија на селектабилној подлози са антибиотиком  Опционално: визуелна селекција бактерија трансформисаних плазмидом са страним геном α-комплементацијом.

18

Слика 8.1: Електронске микрографије плазмида са мањим (а) и већим увећањем (б). в - суперхеликална структура плазмида и г - репликација плазмида, која подсећа на грчко слово „тета“.

Плазмид

Репликон

Број копија

Тип репликације

pBR322 серија pUC colE1 pMOB45 pACYC Ti pSC101 F

pMB1 модификован pMB1 colE1 pKN402 p15A repABC pSC101 oriS/repE

15-20 75-700 15-20 15-118 18-22 мали 5 1

Релаксирана

Индуцибилна Крута (stringent)

Табела 8.2: Типови репликације и репликони различитих плазмида

Типови плазмида. У генетичком инжињерству се користе три главна типа природних бактеријских плазмида (или њихови делови):  Вирулентни плазмиди кодирају за бактеријске токсине, као што је колицини плазмида ColE1. ORI ColE1 плазмида се често користи у векторима за клонирање.  Плазмиди који носе резистенцију на антибиотике (drug resistance plasmids; R plasmids) се користе као извор селектабилних маркера.  Коњугативни плазмиди, који поседују гене за трансфер ДНК између бактерија коњугацијом (Tra оперон). Гени Tra оперона кодирају за протеине трансмембранског система за трансфер ДНК. У ову групу спада неколико плазмида веома важних за генетско инжињерство: o F плазмид (fertility factor, F factor или EPISOM) је велики плазмид и налази се у једној копији, а омогућава бактерији да продукује секс пилус за коњугацију. Користи се за кострукцију фозмида и вештачких бактеријских хромозома. Бактеријски сојеви који имају F плазмид се означавају као F+, а они који га

19

o

немају као F-; F' бактерије имају F плазмид у који је убачен и део бактеријске ДНК, док се са Hfr означавају сојеви код којих је F интегрисан у геном. Ti и Ri плазмиди из A. tumefaciens односно A. rhizogenes такође спадају у коњугативне плазмиде, па се могу размењивати међу бактеријама, али имају и способност преноса генетског материјала у биљне ћелије. Ови плазмиди су основа за конструкцију бинарних, супербинарних и помоћних вектора за трансформацију биљака.

Комерцијални (вештачки, исконструисани) плазмиди имају следеће елементе:  Репликон и ORI  Полилинкер место за клонирање (Polylinker Cloning Sites or Multiple Cloning Sites – MCS). Ово је сегмент ДНК са нагомиланим јединственим рестрикционим местима за различите рестрикционе ензиме, тако да пружа могућност широког избора ензима.  Селектабилни маркер(и) – углавном гени за резистенцију на антибиотике  Репортер ген (опционално)  LacZa - 5'-крај гена за β-галактозидазу (опционално), који даје могућност плаво/беле селекције бактерија трансформисаних плазмидом са страним геном (αкомплементација, видети касније у пог. „Селекција“).  Експресиони вектори (за експресију протеина у бактеријама) имају и прокариотске промоторе (обично из бактериофага T3, T4 или SP6), који се налазе поред или са обе стране MCS-а, као и друге неопходне прокариотске 5'-регулаторне секвенце, као што је Shine-Dalgarno секвенца. Ово олакшава експресију страног гена, јер се не мора конструисати цела генска касета, већ је све унапред припремљено.  Елементи М13 фага који омогућавају репликацију једноланчане ДНК.

Слика 8.3: Mапe лабораторијксих плазмида pBR322 и pUC19. pBR322 је пример старије генерације плазмида са ORI-јем типа pMB1 и појединачним јединственим рестрикционим местима за клонирање. pUC19 је модеран мали плазмид за клонирање, великог броја копија, који су умножава у E. col, а такође садржи ORI типа pMB1, Код овог плазмида су јединствена рестрикциона места рганизована у MCS. pUC19 MCS је у оквиру читања LacZα гена, што омогућава сортирање колонија са инсертима путем α-комплементације.

20

Бактериофази Бактериофази су бактеријски вируси. Као и други вируси, бактериофази су облигатни паразити који се могу размножавати само у ћелијама домаћина. На хранљивим подглогама равномерно засејанима бактеријама, инфекција бактериофазима се уочава као плаке – провидна места где су ћелије убијене и где нема раста бактерија. Постоји више типова бактериофага, од којих се неки користе као вектори у генетском инжињерству, док се од других користе само поједини елементи, гени или ензими.

Слика 8.4: Различити типови бактериофага. а - Т бактериофаг прикачен на бактеријску мембрану, где се види како вирус ињектира своју ДНК у бактерију; б - бактериофаг λ; в - бактериофаг Р1; г - мали сферично бактериофаг φх174; д- филаментозни бактериофаг М13 и ђ - РНК бактериофаг Ms2.

Т серија бактериофага (Т4, Т7 итд) су велики фази комплексне структуре (Сл. 8.4, а) чији је геном у виду линеарне дволанчане ДНК. Деле се на парне и непарне Т фаге. Инфициране бактерије пролазе кроз литички циклус, што значи да на крају циклуса размножавања вирус доводи до лизе и смрти домаћина. Због своје величине и комплексности ови фази се не користе као вектори, али се зато ензими које кодирају, као што су лигазе и полимеразе, као и промотори неких њихових гена широко користе. Умерени бактериофази су добили име по томе што не доводе увек до лизе ћелије домаћина, већ осим литичког циклуса могу ући и у лизогени циклус. Њихов геном је такође у форми линеарне дволанчане ДНК. Главни представник ове групе и далеко најбоље проучен и највише коришћен фаг је λ фаг (Сл. 8.4, б, в), који се, уз одговарајуће модификације, користи као вектор за клонирање, његови делови се користе за конструкцију химерних, вештачких вектора (козмида и фагемида), а користе се и ензими кодирани овим фагом, као нпр λ егзонуклеаза. Осим λ фага, као основа за коснтрукцију вектора великог капацитета се користи и Р1 фаг.

21

Мали сферични бактериофази, као што су φх174 (Сл. 8.4, г) имају геном у форми циркуларне једноланчане ДНК. Иако се не користе као вектори, употребљавају се у генетичком инжињерству као извор ензима, нпр. φ29 полимеразе и φ6 RdRP. Филаментозни бактериофази, као М13 (Сл. 8.4, д), fd и f1 имају геном у форми циркуларне једноланчане ДНК и не доводе до лизе ћелије. РНК бактериофази као што је Ms2 (Сл. 8.4, ђ) имају једноланчани РНК геном и за сада немају специфичну примену у биотехнологији. Бактериофаг λ који инфицира E. coli је један од најбитнијих модел организама у биологији и један од најважнијих алата у генетском инжињерству. Вирусна честица се састоји од главе у коју је спакована ДНК и репа (Сл. 8.5, десно). Геном λ је дволанчана ДНК од 48.5 Kbp и тридесетак гена, која је линеарна док је спакована у главе фага, а домаћину се циркуларизује (Сл. 8.5, лево). Само су крајеви генома од по 12 нуклеотида једноланчани, и називају се cos места (cohesive ends), а служе за циркуларизацију генома и за паковање ДНК у вирусне партикуле. Животни циклус овог фага се може одвијати на два међусобно искључива начина - литичким и лизогеним циклусом.

Слика 8.5: Лево: геном λ, приказан у циркуларној форми, са назначеним најважнијим генима и промоторима. За сваки промотор је стрелицом назначен смер транскрипције, при чему пуне линије означавају оквир читања, а испрекидане стрелице проширени оквир читања. Линије управне на кружницу означавају терминаторе, али се неки од терминатора могу проћи уз помоћ антитерминатора N и Q. Места везивања N антитермиантора су означена зеленим звездицама (N utilisation site, Nut), а места везивања Q љубичастoм звездицoм (Qut). Поједини гени су представљени као групе гена (глава и реп). Место рекомбинације, attP, је приказано црвеним троуглићима. Око 30% генома није есенцијално за литички циклус, па могу да се избаце и замене фрагментом стране ДНК. Десно: структура λ фага.

Литички циклус λ фага почиње везивањем фага за површину бактерије и ињектирањем линеарне ДНК (Сл. 8.6). ДНК фага се одмах по уласку циркуларизује преко cos места, при

22

чему лигаза домаћина повезује једноланчане прекиде. Фаг се реплицира прво механизмом θ-структуре, а потом механизмом котрљајућег обруча, којим настају линеарни поновци генома или конкатемери (Сл. 8.7). Током репликације долази и до транскрипције вирусних протеина, од којих су неки регулаторни, неки су ензими потребни за репликацију, а остали су структурни протеини главе и репа фага, као и протеини потребни за лизу ћелије. На крају се ДНК пакује у формиране главе фага. Да би се ДНК спаковала, два cos места се приближе отвору главе, исеку се ензимом терминазом, а потом се лепљиви крајеви у комплексу са протеином закаче на одређено место у глави. Циклус траје око 40 мин, после чега ћелика прска, а из ње излази стотинак нових фага. Лизогени циклус. После циркуларизације, геном λ се интегрише у бактеријски геном и постаје профаг (Сл. 8.6). Вирус се овако размножава током више ћелијских деоба заједно са бактеријом, не убијајући домаћина и не продукујући нове вирусне честице, већ само мало успоравајући раст бактерија. У овом дормантном стању профаг експримира само један ген - λ репресор (cI), који репримира експресију свих других гена, одржавајући лизогено стање. Када се ћелија домаћин нађе под стресом (глад, отрови, антибиотици, УВ зрачење, оштећење ДНК или други фактори), активирају се механизми који у крајњој линији доводе до разградње λ репресора и активације гена који омогућавају извлачење профага из бактеријског хромозома и прелазак у литички циклус.

Слика 8.6: Шематски приказ литичког и лизогеног циклуса.

Регулација литичког и лизогеног циклуса је веома комплексна, али се у суштини све своди на то који ће од два главна регулаторна гена „преовладати“: cro  литички циклус или cI 

23

лизогени циклус, што зависи од услова раста бактерија, да ли је ћелија под стресом и да ли је дошло до оштећења ДНК. Ако ћелије живе у изобиљу хранљивих материја, инфекција доводи до литичког циклуса, да би се што више фага умножило док има ресурса. Исто тако, ако је ћелија у опасности, долази литичког циклуса или до индукције и исецања профага, да би се фази спасли и извукли из ћелије осуђене на смрт. Са друге стране, ако домаћин живи у „скромним условима“ и нема довољно ресурса за умножавање вируса, фаг ће ући у лизогено стање да сачека боља времена.

Слика 8.7: Механизам репликације и паковања λ генома током литичког циклуса. Убризгана линерана ДНК се циркуларизује спаривањем cos места и дејством домаћинове лигазе. Циркуларни геном се умножава θмеханизмом, а потом се конкатемерни линеарни геноми продукују механизмом котрљајућег обруча. Паковање линеарних генома се одвија паралелно са њиховим исецањем терминазом (иако то није тако представљено), тако да се само конкатемери, у ствари, могу паковати. Природни механизам паковања се може искористити и за паковање рекомбинантних молекула ограничених cos местима.

Зашто је λ фаг добар вектор?  λ може да прими велике инсерте ДНК. Око 15 Kbp, што је скоро трећина генома, може да се исече из централног дела, између гена J и N, и замени са 15-20 Kbp стране ДНК без утицаја на литички циклус. Међутим, величина ДНК која може да се спакује у главу фага је фиксна и износи 78 - 105 % WT генома. Ако је величина ДНК изван ових граница, паковање је неефикасно, или је виталност и инфективност вируса ниска.  Много је година и рада уложено у проучавање λ и његове модификације, па постоји цела палета исконструисаних верзија овог вируса, које, на пример, имају само по једно или два рестрикциона места за главне рестрикционе ензиме, или уведене неке погодне мутције. Комерцијални λ обично имају уграђено пуњење од ≈ 15 Kbp (stuffer fragment) које се замењује страном ДНК, па се називају и супституционим векторима.  λ је један од неколико организама који могу бити реконституисани у епрувети (in vitro packaging), тако да је могуће једноставно помешати рекомбинантну ДНК са протеинима за главу и реп и инфективне честице ће се саме оформити. Постоје и готови китови за паковање, као што су Gigapack® (Stratagene) i Packagene® (Promega).  Трансформација је знатно ефикаснија у поређењу са трансформацијом плазмидима, јер се заснива на природном процесу инфекције.  λ фаг се, осим као вектор, користи и као извор низа других елемената и алата за генетичко инжињерство. Сos места и протеини главе и репа се комбинују са другим векторима при конструкцији хибридних вектора. Механизам специфичне рекомбинације Int/att представља основу најмодернијих Gateway вектора. Посебно се користе и ензими кодирани λ фагом, као λ егзонуклеаза.

24

М13 бактериофаг спада у филаментозне фаге (Сл. 8.4, д) који не доводе до лизе ћелија, већ само успоравају њихов раст, што се на подлози са бактеријском културом уочава као мутне плаке. Вирусне честице су дугачке 930 nm, a се састоје од генома М13 енкапсулираног у око 2700 копија главног протеина омотача, pVIII. На оба краја се налазе по два типа других протеина, сваки у по 5 копија, и то са једне стране веома мали протеини pVII и pIX, а са друге pIII и pVI. Геном М13 је је мали (6407 nt), налази се у виду циркуларне једноланчане ДНК, а садржи 11 гена који кодирају за протеине означене као pI-pXI. На једном месту се између гена налази интергенски регион, који представља место где се може убацити страна ДНК, али такође садржи и секвенце неопходне за иницијацију и терминацију синтезе ДНК. Животни циклус М13 фага се одвија кроз следеће фазе (Сл. 8.10): 1) Везивање фага за површину бактерије се одвија интеракцијом F-пилуса (тј. TolA протеина) и pIII протеина фага, због чега овај фаг може да инфицира само „мушке“ или F+ E. coli ћелије, односно оне које садрже F плазмид. 2) Инфекција - омотач фага се одбацује и кроз F-пилус улази инфективна ssDNA, која се означава као „+“, јер по секвенци одговара РНК. 3) Репликација θ-структуром - ssDNA се преводи у dsDNA тако што се „-“ ланац цинтетише ензимима домаћина. Циркуларна dsDNA је репликативна форма фага и означава се као RF. Вирусни геном се неко време размножава преко θ-структуре. Протеин pX (који је идентичан С-терминалном делу pII) регулише број дволанчаних генома, тако да се без овог протеина не акумулирају једноланчани геноми. 4) Транскрипција и транслација- током репликације долази до синтезе виралне РНК и виралних протеина, при чему као матрица за транскрипцију служи „-“ ланац. 5) Репликација типа котрљајућег обруча - ензим pII прави једноланчани прекид у + ланцу RF-a, после чега репликација наставља да се обавља по rolling circle механизму, чиме настаје +ss потомство. Сваки новосинтетисани геном се исеца помоћу pII. 6) Циркуларизација новонасталих једноланчаних генома катализована pII ензимом. Током ране фазе инфекције, док је концентрација протеина pV ниска, циркуларна ДНК може поново ући у фазу репликације θ-структуром. 7) Интеракција са pV протеином (који је у форми димера) спречава конверзију ssDNA у RF форму и омогућава склапање виралних честица. По изласку готове вирусне честице, pV се рециклира. 8) Паковање фага - синтетисани делови капсида, протеини pIII, pVI, pVII, pVIII и pIX, се прво убацују у мембрану, као трансмембрански протеини, да би одатле били покупљени и организовани приликом изласка из бактерије. Протеини pI, pIV и pXI помажу при паковању и матурацији формирајући протеински комплекс - канал кроз мембрану кроз који вирус излази, али не улазе у састав фага. Осим ових виралних протеина, за паковање су неопходни и АТР, протонски градијент кроз мембрану и бактеријски тиоредоксин. Иако животни циклус М13 изгледа прилично компликовано, интересантно је да је довољно само 10 min од инфекције нове ћелије до ослобађања готових вируса, а сваког сата се ослободи око 1000 вируса. Како ћелија не умире, овај процес може да траје неограничено. М13 се користи за:  Прављење једноланчаних копија ДНК фрагмената који су предходно клонирани у другим векторима, a које имају следеће намене: o као матрице за место-специфичну (site-directed) мутагенезу o за секвенцирање (код старих метода секвенцирања је било неопходно радити са једноланчаном матрицом, што код модерних метода није случај) o за синтезу радиоактивних или флуоресцентних проба специфичних за један ланац

25

 



o за конструкцију посебних типова cDNA библиотека (subtractive cDNA libraries) Као основа за конструкцију фагемида За технику phage display, у којој се различити протеини и пептиди експримирају као фузије са протеинима омотача фага и тако бивају изложени на површини вирусних честица. Техника омогућава проучавање рецептор/лиганд и протеин-протеин интеракција. М13 се користи и као модел у нанотехнологији.

Слика 8.10: Животни циклус фага М13. 1 - Везивање фага за F-пилус; 2 - инфекција; 3 - репликација θ-структуром; 4 - транскрипција виралних гена; 5 - репликација типа котрљајућег обруча и исецање нових једноланчаних генома; 6 - циркуларизација; 7 - ssDNA/pV комплекс; 8 - паковање и излазак из ћелије. Знаком „?“је означен канал односно протеински комплекс који се састоји од протеина pI, pIV и pXI, али тачна структура комплекса није позната.

Хибридни вектори великог капацитета и вештачки хромозоми Козмиди (cosmids) су конвенционални плазмиди са cos местима λ фага. Као и плазмиди, имају ORI, MCS и селектабилни маркер. Козмиди се у бактерији размножавају као велики плазмиди, јер немају гене за литички циклус, али се због cos места могу спаковати in vitro у вирусне честице, што знатно олакшава трансформацију. Величина козмида је до 50 Kbp, колико стаје у главу λ фага, а капацитет за страну ДНК је 35-45 Kbp, јер је сама окосница плазмида мала. Фозмиди (fosmids) су слични козмидима и имају cos места, али су базирани на Fплазмиду. Капацитет фозмида је као и код козмида око 45 Kbp, а величине су до 50 Kbp. Разликују се од козмида по томе што, као и F-плазмид, одржавају само једну копију по ћелији, што је у неким случајевима предност. Фагемиди или фазмиди (phagemids, phasmids) такође представљају комбинацију између филаментозног фага (М13 или f1) и плазмида. Ови вектори имају један плазмидни ORI,

26

обично типа ColE1, да би могли да се разможавају у виду дволанчане ДНК као плазмиди, али и репликон одн. интергенски регион из фага f1 или М13 (f1 ORI), који омогућава умножавање у форми једноланчане ДНК и потом паковање у вирусне честице. Вештачки бактеријски хромозоми (Bacterial artificial chromosome, BAC, сл. 8.11) су вектори базирани на F-плазмиду и по томе су слични фозмидима. Иако, као и фозмиди, обично садрже cos места, главна намена ових вектора је клонирање великих инсерата. Величина самих ВАС вектора је око 7 Kbp, али је њихов капацитет око 150-350 kbp, мада могу да приме и инсерте до 700 kbp. ВАС се највише користе за клонирање великих геномских фрагмената током секвенцирања комплексних генома стратегијом „клон по клон“.

Слика 8.11: Пример ВАС вектора. oriS, repE, incC - компоненте репликона F-плазмидa за репликацију и регулацију броја копија (1 копија по ћелији). RepE је хеликаза која олакшава репликацију; parA, parB и parС – гени за партицију F-плазмидa који обезбеђују равномерну дистрибуцију плазмида одн. ВАС после деобе и самим тим стабилност ВАС библиотека; индуцибилни ORI (oriV) служи да се, по потреби, повећа број копија; CAT селектабилни маркер (резистенција на хлорамфеникол); MCS (или lacZа/MCS) – место за клонирање; прокариотски промотори, обичено из фага T7 или Sp6, за транскрипцију клонираних гена у домаћину или за in vitro транскрипцију; loxP место из Р1 фага – олакшава вађење клониране секвенце; cos место из λ фага, које може да служи за паковање само ако су инсерти релативно мали, а иначе служи за вађење клониране секвенце исецањем терминазом; Т- терминатори.

Вештачки хромозоми квасца (Yeast artificial chromosomes, YAC) су линеарни ДНК конструкти који имитирају природне хромозоме квасца, где се и размножавају (домаћин је Saccharomomyces cerevesiae). Ови вектори имају највећи капацитет од свих поменутих типова вектора, али могу бити нестабилни. Да би се неки фрагмент клонирао у YAC, вектор се прво обради рестрикционим ензимима BamHI, који сече одмах уз крајеве теломера, и EcoRI, који сече у SUP4 гену, чиме се добијају две линеарне „руке“ вектора – будући краци хромозома (Сл. 8.12). Потом се инсерти са компатибилним EcoRI крајевима лигирају у вектор. Продукти лигације се трансформацијом убаце у квасац одређеног генотипа, а потом се врши селекција помоћу маркера за оба крака хромозома, како би се потврдило да рекомбинанти имају обе „руке“.

27

Слика 8.12: Мапа вештачког хромозома квасца pYAC4 и процес клонирања геномских фрагмената у ове векторе. Селектабилни маркери за леву и десну руку хромозома и за праћење процеса конирања су означени зеленим стрелицама (TRP1, URA3, SUP4, HIS3), а теломере (TEL) црвеним. Жути кружић означава центромеру (CEN4). ARS1 (Autonomously replicating sequence) из квасца – секвенца која омогућава репликацију хромозома (аналогно ORI-ју код плазмида).

Трансформација Трансформација у ширем смислу подразумева сваки процес уноса стране ДНК у ћелије домаћина, било у форми линеарног (рекомбинантног) фрагмента или фрагмена убаченог у вектор, при чему долази до инкорпорације стране ДНК у геном и експресије страног генетичког материјала. У ужем смислу трансформација не укључује унос стране ДНК путем вируса или бактериофага, већ се овај процес назива трансдукција. Трансформација еукариотских ћелија у култури in vitro се понекад означава и као трансфекција. Код бактерија је уобичајен и латерални преноса гена коњугацијом, која се остварује директним ћелијским контактом и својствена је бактеријама са коњугативним плазмидима. У биотехнологији биљака су битна још два појма: котрансформација, којом се паралелно уводе два или више страних гена и ретрансформација, када се нови страни ген уводи у већ трансформисану биљку.

28

Нуклеинске киселине не могу да уђу у бактеријске или еукариотске ћелије саме од себе, већ им је за пролазак кроз спољашњу мембрану или ћелијски зид и плазмамембрану потребна одговарајућа помоћ. Методи уноса страних гена су:  Биолошки или природни механизми: o Унос гена у бактерије помоћу бактериофагних вектора или вектора базираних на фазима (трансдукција). За овај метод нема посебних протокола, довољно је помешати бактерије са бактериофагом и засејати на подлогу. o Унос гена у еукариотске ћелије вирусима (трансдукција) o Унос гена у биљне ћелије посредством A. tumefaciens и A. rhizogenes  Хемијски методи o Трансформација бактерија плазмидима (CaCl2/топлотни шок метод) o Трансформација протопласта огољеном ДНК (CaCl2/PEG метод)  Физички методи o Електропорација - примењује се на бактеријске ћелије и биљне протопласте, ћелије и ткива, као и на једноћелијске алге o Биолостичка трансформација може да се примени на целе биљке или експланте o Трансформација силикон-карбидним влакнима се углавном користи за трансформацију калуса монокотила o Микроињектирање је применљиво само на огољене протопласте o Трансформација залеђивањем и одлеђивањем (за Agrobacterium). Трансформација биљака подразумева стабилну инкорпорацију страних гена у биљни геном. Најпопуларнији метод за трансформацију дикотила је експлоатација природног механизма за унос страних гена индиректно, посредством A. tumefaciens или А. rhizogenes. Тешкоће са трансформацијом монокотила на овај начин су довеле до развоја различитих метода директног трансфера гена, првенствено физичких приступа као што су биолистички метод и електропорација, који су применљиви и на моно- и на дикотиле. Већина метода за директан унос гена може да се примени и за експерименте привремене или пролазне експресије страних гена у биљним ћелијама (transient expression assays). Метод подразумева само унос и експресију страних гена, без њихове интеграције у геном. Agrobacterium tumefaciens и природна трансформација биљака Агробактерије су земљишне, грам-негативне штапићасте бактерије. Agrobacterium tumefuciens и A. rhizogenes су биљни патогени који изазивају туморе типа crown-gall односно hairy root респективно, до чега долази због трансфера гена са плазмида које садрже у биљни геном. Врсте и сојеви Agrobacterium-а се разликују по свом спектру домаћина. A. tumefaciens је мобилна земљишна бактерија, која напада дикотиле изазивајући туморе на биљкама (crown-gall disease, Сл. 9.1). Познавање интеракције између A. tumefaciens и биљне ћелије, механизама инфекције и трансформације је од огромног значаја за како за агрономију, тако и за фундаментална истраживања интеракција патоген-домаћин и веома ретког примера природног латералног трансфера гена међу царствима. A. tumefaciens има широк избор домаћина и познато да је да може да инфицира 643 врсте из 331 рода. У домаћине спадају и многе културне биљке, првенствено грожђе, ораси, јабуке и руже. Монокотиле нису подложне инфекцији, са пар изузетака. Могућност експлоатације природног механизма трансформације биљака сврстава A. tumefaciens и њој сродну бактерију A. rhizogenes у најомиљеније алате генетских инжињера биљака.

29

Слика 9.1: Тумор изазван инфекцијом A. tumefaciens

Животни циклус A. tumefaciens:  А. tumefaciens живи у земљишту, у ризосфери, где нормално живи хранећи се материјама које биљке испуштају из корена.  Ако је биљка у близини бактерије повређена, бактерија долази до места повреде хемотаксијом, привучена хемоатрактантима (амино киселинама, шећерима, органским киселинама и фенолима) које луче повређене биљне ћелије.  Приликом инфекције до 200 бактерија може да се прикачи на једну биљну ћелију.  Бактерија инфицира биљку и улази у корен или стабло на месту повреде.  Долази до интерћелијског размножавања и ширења бактерија у биљном ткиву.  Ћелије у околини бактерија почињу рапидно да се умножавају и да расту, формирајући туморе. Вирулентност и способност стварања тумора зависи од присуства Ti плазмида (Tumor inducing) у бактерији. Део Ti плазмида познат као ТДНК се пребацује у биљну ћелију и интегрише у геном.  Туморске одн. трансформисане биљне ћелије ослобађају посебна једињења опине које бактерија користи за исхрану.  Бактерије са површине тумора могу поново доспети у земљиште. Геноми неколико сојева А. tumefaciens су секвенцирани. На пример, сој А. tumefaciens С58 је иницијално изолован из тумора трешања, а индукује производњу опина нопалина и агропина Bo542. Геном овог соја се састоји од једног циркуларног хромозома од 2.84 Mbp, једног линеарног хромозома од 2.07 Mbp и два плазмида. Већи плазмид, означен као pAtC58, има 542.8 Kbp и не учествује у процесу трансформације. Мањи плазмид од 214.2 Kbp је Ti плазмид, означен као pTiC58 и он је одговоран за вирулентност. pTiC58 има 199 гена, од тога 197 гена који кодирају за протеине и 2 псеудогена; ни један плазмидни ген не кодира за РНК. Опини су веома стабилна једињења која продукују трансформисане биљне ћелије, а A. tumefaciens их користи као главни извор азота и енергије. Синтеза опина је катализована ензимима кодираним Т-ДНК генима. Различити сојеви бактерија имају различите Ti

30

плазмиде који диктирају синтезу различитих опина. Сваки сој A. tumefaciens код домаћина индукује синтезу специфичних опина, при чему Ti плазмид у бактерији кодира синтезу одговарајућих ензима за катаболизам опина. На овај начин A. tumefaciens себи стварају посебну еколошку нишу „терајући“ биљку да производи оне опине које само дати сој бактерија може да користи и нико други. Највећи број опина су деривати амино киселина који настају кондензацијом амино киселине и кето киселине или шећера. Иако је структура ових једињења необична, саставни делови су уобичајени метаболити, па је и за синтезу кондензацијом и за разградњу хидролизом потребан само по један ензим (одн. ген), а не цео метаболички пут. Најпознатији опини су нопалин, октопин и манопин (Сл. 9.2). До сада је описано преко 30 врста опина, који се по хемијској структури сврставају у неколико фамилија:  Нопалинска фамилија опина (нопалин, нопалинска киселина, леуцинопин, глутаминопин и др.) настаје кондензацијом: амино киселина + α-кетоглутарат.  Октопинаска фамилија (октопин, октопинска киселина, лизопин, хистопин и др.) настаје кондензацијом: амино киселина + пируват.  Манопинска или манитил фамилија (манопин, манопинска киселина, агропин, агропинска киселина) настаје кондензацијом: амино киселина + маноза.  Агроцинопини су мала, посебна класа опина која не настаје кондензацијом, већ су по структури фосфодиестри шећера. Нпр. агроцинопин А је фосфодиестар сахарозе и арабинозе.

Слика 9.2: Структуре најпознатијих опина

Ti плазмид (tumor-inducing plasmid) je велики плазмид од око 200 Kbp или више, са око 200 гена, што зависи од типа одн. специфичности за опине (Сл 9.3 и Таб 9.1). Способност A. tumefaciens да доведе до трансформације биљних ћелија и да проузрокује појаву тумора зависи од присуства Ti плазмида. Ово је коњугативни плазмид који је способан за два типа латералног трансфера гена: коњугацијом између различитих сојева бактерија, при чему се преноси копија целог плазмида и за трансфер дела плазмида означеног као Т-ДНК из бактеријске у биљну ћелију. Иако се Ti плазмиди из различитих сојева разликују, сви имају неке заједничке карактеристике:

31

    

један или више региона Т-ДНК са онкогенима vir регион са генима за вируленцију ORI (origin of replication) tra регион, чији гени омогућавају коњугативни трансфер гене за катаболизам опина

Слика 9.3: Шематски приказ Ti плазмида (нопалинског типа) са назначеним главним елементима, генима и регионима. Делови Т-ДНК су обележени зеленим нијансама, док су гени који се експримирају и бактерији браон или црвени (vir region). Гени нису нацртани у сразмери у односу на величину плазмида (јер је од око 200 гена приказано само десетак кључних). Распоред гена донекле варира од типа до типа. Скраћенице за гене и њихове функције су дате у табели 9.1.

Т-ДНК (transferred DNA) је део Ti плазмида који се физички интегрише у биљни геном, а дефинисан је левим и десним граничником (LB и RB), који представљају неправилне поновке од 24 bp. Било која секвенца која је оивичена граничницима може бити пренета у биљну ћелију, при чему је десни граничник есенцијалан за Т-ДНК трансфер. Т-ДНК носи гене који кодирају за ензиме укључене у синтезу хормона ауксина и цитокинина и синтезу опина. Прекомерна продукција ових хормона у биљним ћелијама доводи до неконтролисане пролиферације ћелија - тумора, па су ови гени у ствари онкогени. Нопалински плазмиди имају једну Т-ДНК од око 20 Kb у којој је идентификовано 13 ORF-ова, док октопински имају два Т-ДНК региона, TL и TR, од 14 и 7 Kb, респективно. Само је TL регион онкоген, тј. носи гене за синтезу хормона, као и ген за синтезу октопина (укупно 8 ORF-ова), док TR има гене за синтезу других опина - манопина, агропина и фруктопина. Гени на Т-ДНК су по својим карактеристикама сличнији еукариотским генима него прокариотским. Функције појединих гена су приказане у Таб. 9.1. Вирулентни регион (Vir) садржи гене који омогућавају трансфер Т-ДНК. Ови гени су организовани у најмање 9 оперона (А-Ј), а функције већине гена су дефинисане. Сви вирулентни оперони су индуцибилни, с тим што се virA и virG експримирају на ниском нивоу и без индукције тј. имају базалну експресију и једини су моноцистронски. Већина Vir протеина су цитосолни протеини осим VirA и VirB1-11, који су мембрански. Неки Vir протеини функционишу у бактерији, док други, као нпр. virE2 и virF функционишу у биљној ћелији.

32

Гени и елементи Ti T-DNA

LB

auxA или iaaM или tms1 auxB или iaaH или tms2 cyt или ipt или tmr tml nos ocs RB O tra

VIR

noc occ inc ORI virA virB1-11 virC1 virD1 virD2

virD4 virE1 virE2 virE3 virF virG virH

virJ

Функција Леви граничник (Left Border) нопалински тип: TGRCAGGATATATGKSGKGTAAAC октопински тип: YGGCAGGATATAWCMRTTGTAAWT Триптофан монооксигеназа (синтеза ауксина IAA) Индол-3-ацетамид хидролаза (синтеза ауксина IAA) Изопентил трансфераза (синтеза цитокинина) ген који детерминише величину тумора код неких врста Нопалин синтаза (само код нопалинског типа) Октопин синтаза (само код октопинског типа) Десни граничник (Right Border) - иста секвенца као и за леви Енхенсер или „overdirive“: TAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTG Налази се уз RB; повећава ефикасност трансфера. Гени за транспорт ДНК приликом коњугације. Продукти ових гена чине канал кроз мембрану, врло слично као и VirB протеини. Катаболизам нопалина (само код нопалинског типа) Катаболизам октопина (само код октопинског типа) Гени за инкопатибилност (имунитет на друге плазмиде) Место за почетак репликације (Origin of replication) Рецептор за фенолна једињења; киназа која фосфорилише VirG Компоненте секреционог система типа IV, одн. Т-пилуса Оverdrive-везујући протеин; повећава ефикасност трансфера Протеин који се везује за граничнике и модулише активност VirD2 Nicking ендонуклеаза; штити 5'-крај Т-ДНК; неопходан за трансфер кроз секрециони систем и кроз једарне поре; има NLS сигнал; интерагује са биљним кариоферин-а протеином Компонента секреционог система типа IV, одн. Т-пилуса Протеин потребан за експорт virE2; има чаперонску активност Протеин који се везује за ssDNA, штити Т-ДНК од нуклеаза, неопходан за улазак Т-ДНК кроз једарне поре Помаже интеракцију virE2 са кариоферином-а и улазак у једро Диктира разградњу протеина који облажу Т-Днк; ( само код октопинских плазмида) Транскрипциони фактор одговоран за индукцију VIR региона Сматра се да учестује у детоксификацији околине бактеријске ћелије, јер су неки продукти повређених биљних ћелија инхибиторни за бактерију ( само код октопинских плазмида) Учествује у експорту Т-ДНК Табела 9.1: Функције најважнијих гена и секвенци Ti плазмида

Процес трансформације помоћу A. tumefaciens се одвија у следећим корацима, као што је шематски приказано на Сл. 9.4:

33

1а- Ослобађање сигналних молекула из повређене биљне ћелије. На месту повреде се ослобаају шећери и фенолна једињења, као што су ацетосирингон, αхидроксиацетосирингон и др. Ова једињења су обично део одбрамбеног система биљке, укључена у синтезу фитоалексина и лигнина, док за бактерију представљају сигнал присуства биљних ћелија компетентних за трансформацију. 1б- Експресија бактеријских хромозомалних гена укључених у ране кораке вируленције:  attR је ген који учествује у синтези специфичног полисахарида који је одговоран за иницијално закачињање бактерије за биљну ћелију. Бактерија потом производи мрежу целулозних влакана који учествују у причвршћивању.  chv гени (chromosomal virulence genes)су такође укључени у прве кораке инфекције и причвршћивање бактерије за биљну ћелију. chvА и chvВ су одговорни за продукцију и секрецију цикличних 1,2-гликана, док је продукт chvЕ заједно са продуктом плазмидног virA гена образује трансмембрански рецепторски комплекс.  pscA је укључен у секрецију још једног екстрацелуларног полисахарида за причвршћивање – сукциногликана. 1в- Експресија првих вирулентних гена Ti плазмида, virA и virG. 2- Препознавање сигналних молекула. VirA је трансмембранска рецепторна киназа која се активира везивањем фенолних једињења, а посебно ацетосирингона. Везивање лиганда доводи до аутофосфорилације VirA, која потом фосфорилише цитоплазматични протеин VirG. Разлике између WHR и LHR сојева се у главном заснивају на разликама њихових VirA протеина, а посебно његовог N-терминалног дела, тј. домена који препознаје сигналне молекуле. Сматра се да сојеви са широким спектром домаћина имају VirA који је сензитиван на више различитих једињења. 3- Индукција vir гена. Фосфорилисани VirG је транскрипциони активатор који се везује за регулаторне секвенце vir оперона, тзв. vir box (TNCAATTGAAAY), индукујући експресију свих vir гена (virB, virC, virD, virE, virF, virH, virJ, укључујући и virA и virG). Многи шећери, а посебно глукоза, галактоза и ксилоза појачавају индукцију vir гена. За овај ефекат је неопходан транспортер за глукозу и галактозу ChvЕ, који функционише у комплексу са VirA. 4- Формирање једноланчане Т-ДНК. Комплекс VirD1/VirD2 препознаје леви и десни граничник Т-ДНК, при чему VirD1 има топоизомеразну активност, док VirD2 има функцију nicking ендонуклеазе која прави једноланчане прекиде између треће и четврте базе са леве стране оба граничника, чиме се ослобађа једноланчана Т-ДНК. У одвајању ланаца вероватно учествује и хеликаза кодирана бактеријским генима. VirD2 се ковалентно везује за ослобођену фосфатну групу 5'-краја Т-ДНК, где и остаје током транспорта у биљну ћелију. Јеноланчани регион у самом плазмиду се попуњава одговарајућом полимеразом. VirC1 се везује за енхенсер (overdive, O) код десног граничника, доприносећи ефикасности Т-ДНК трансфера. 5- Транспорт Т-ДНК/VirD2 комплекса из бактеријске ћелије се обавља кроз специјализовани мембрански секреторни систем типа IV или Т-пилус (инсерт на Сл. 9.4). Т-пилус се састоји од VirB1-B11 протеина кодираних virB опероном и од VirD4. Трансмембрански канал овог система се се наставља у пилус чија је главна субјединица VirB2. Т-пилус служи за активан транспорт Т-ДНК из бактерије у биљну ћелију, али кроз њега се такође транспортују и VirE2 протеини, као и VirF и VirE3. Т-пилус је по структури готово

34

идентичан F-пилусу који имају бактерије E. Coli инфициране F плазмидом. Већина субјединица Т и F пилуса су хомологе, само се пар субјединица разликује. У оба случаја систем служи за транспорт ssDNA, али са различитом сврхом. Т-пилус служи за транспорт ДНК између два царства, из бактерије у биљку, дакле за вирулентност, па се гени који га кодирају називају vir генима. F-пилус служи за транспорт ДНК између две бактерије исте или сродних врста у процесу коњугације, а кодиран је tra генима. Како Ti плазмид спада у коњугативне плазмиде, осим vir гена такође има и tra гене, баш као и F плазмид, па се може преносити и у друге бактерије.

Слика 9.4: Процес трансформације биљних ћелија помоћу A. tumefaciens. Процес је приказан у корацима 1-9, који су објашњени у тексту

6- Транспорт Т-ДНК у једро биљне ћелије. Када Т-ДНК/VirD2 комплекс и VirE2 протеини уђу у цитоплазму биљне ћелије, VirE2 облажу Т-ДНК, чиме настаје зрео Т-комплекс2. Улога VirE2 је да заштите једноланчану Т-ДНК од дејства нуклеаза и да успостве правилну конформацију Т-комплекса за улазак у једро кроз једарне поре (NPC, nuclear pore complex). Показано је да и VirD2 и VirE2 интерагују са различитим биљним цитоплазматичним протеинима, који обезбеђују нуклеарну локализацију Т-комплекса. VirD2 има један сигнал за нуклеарну локализацију (NLS, nuclear localization signal), путем кога интерагује са биљним протеином из фамилије кариоферин-α, чија је функција Према алтернативном моделу, VirE2 облаже Т-ДНК у бактеријској ћелији и цео комплекс се транспортује кроз пилус. 2

35

препознавање протеина који треба да се упуте у једро. VirE2 има две NLS секвенце, али се транспорт у једро обавља посредством биљног VIP1 протеина (VirE2-interacting protein 1) и његовог функционалног аналога, бактеријског VirE3. Сматра се да VIP1 и VirE3 олакшавају интеракцију између VirE2 и кариоферина-α и тако омогућавају улазак Т-комплекса у једро. У интеракцијама са VirD2 и VirE2 и транспорту у једро учествују и други биљни протеини, као импортин-α, протеин фосфатаза типа 2С, циклофилини и VIP2. 7- Интеграција Т-ДНК у биљни геном. Када Т-ДНК у комплексу са протеинима уђе у једро, долази до интеракција са једарним протеинима који омогућавају интеграцију. Показано је, на пример, да VIP1 интерагује са хистонима Н2А, што је од значаја за позиционирање Т-комплекса на место интеграције. Пре интеграције, међутим, сви протеини везани за ТДНК морају бити уклоњени, за шта је одговоран VirF. VirF је бактеријски F-box протеин који диктира деградацију VirE2 и VIP1 у протеозомима. Т-ДНК се интегрише у биљни геном процесом нелегитимне одн. нехомологе рекомбинације (illegitimate recombination). За разлику од хомологе рекомбинације, нелегитимна рекомбинација не зависи од присуства региона хомологије, већ се може догодити на било ком делу генома, али до инсерције већином долази у регионима са већим %АТ. За овај процес су неопходни биљни једарни протеини иначе задужени за поправку оштећења на ДНК и/или процесе рекомбинације. У геном се независно може уградити и више копија Т-ДНК (код Aabidopsisa у просеку по 3), а ове копије су најчешће оивичене граничницима, као и у самом плазмиду. 8- Експресија Т-ДНК гена aux, cyt и nos или ocs, доводи до синтезе ензима који катализују синтезу ауксина, цитокинина и опина. Настали хормонски дисбаланс доводи до формирања тумора. Трансформисана ћелија производи опине, који се транспортују у бактеријску ћелију. 9- Катаболизам опина се одвоја у бактерији, ензимима кодираним Ti-плазмидом (noc или occ ген), што представља главни извор енергије и угљеника за бактерију. Експлоатација A. tumefaciens: бинарни вектори Убрзо по открићу да A. tumefaciens са својим плазмидима поседује механизам за природно убацивање гена у биљке, овај систем је почеао да се експлоатише у биотехнологији. Откривено је да се Т-ДНК може активно транспортовати и ако се Vir функције и Т-ДНК налазе на различитим плазмидима, из чега су проистекли модерни методи трансформације системом бинарних вектора. Овај систем се заснива на природном механизму, али су многе компоненте измењене у циљу олакшане манипулације конструктима и повећања ефикасности трансформације. Кључна измена се састоји у подели функција оригиналног Ti плазмида на два вектора(Сл. 9.5): 1. Вештачки (рекомбинантни) Ti плазмид или бинарни вектор3, који носи страни ген и 2. Помоћни (helper) плазмид, који кодира за Vir функције.

3

Термин „бинарни“ се односи на систем од два вектора тј два плазмида, али се главни од та два плазмида, онај који носи страни ген, колоквијално назива „бинарним вектором“.

36

Слика 9.5: Систем бинарних вектора за трансформацију биљака. а - Модификовани Ti плазмид који између левог и десног граничника има убачен страни ген уместо онкогена. Страни ген је убачен у MCS место, које се код многих комерцијалних плазмида налази у овиру LacZ. PSM је биљни селектабилни маркер, нпр. резистентност на канамицин (KanR), док је BSM бактеријски селектабилни маркер, нпр. ген за резистенцију на тетрациклин (TetR). Плазмид има два ORI-ja да би могао да се умножава у две врсте бактерија - E. coli и A. tumefaciens. б - Модификовани Ti плазмид који има избачене готово све гене осим Vir региона, а служи као помоћни плазмид. Иако је овај плазмид приказан као да је мањи од бинарног вектора, он је у ствари око 20 пута већи од њега, због величине Vir региона. в - Плазмид за трансформацију се конструише и размножава у E. coli. г - Плазмид се пребацује из E. coli у A. tumefaciens коњугацијом или електропорацијом. д - трансформација биљне ћелије помоћу A. tumefaciens која има два плазмида који заједно имају све неопходне функције потребне за трансформацију - граничнике и Vir протеине.

Бинарни вектор (рекомбинантни Ti плазмид) се конструише у E. coli, а онда се убацује у разоружани сој A. tumefaciens (обично LBA4404) који има помоћни плазмид. Бинарни вектори садрже:  Т-ДНК граничнике (LB и RB), између којих се убацују страни ген, биљни селектабилни маркер и репортер.  Полилинкер тј. MCS место (које је код неких плазмида уграђено у 5' део LacZ гена, што омогућава плаво-белу селекцију одн. а-комплементацију).  Биљни селектабилни маркер(и) – ген(и) за резистенцију на антибиотике или хербициде.  Репортер ген је опционални али уобичајен елемент бинарних вектора, који се уграђује поред страног гена, уместо њега или у фузији са страним геном, између граничника. Највише се користе GUS, веријанте GFP-a и луцифераза.  Страни ген се убацује у форми касете са одговарајућим промотором и другим регулаторним секвенцама, између граничника, обично у MCS.  Репликативне функције. Бинарни вектор мора да може да се реплицира и у E. coli и у A. tumefaciens, па зато има ORI-је за оба домаћина, који се налазе изван граничника.

37

 

Мобилизационе функције су опционална компонента бинарног вектора. То су секвенце које омогућавају трансфер бинарног вектора из E. coli у A. tumefaciens путем коњугације. Бактеријски селекрабилни маркер (резистенција на антибиотикле) се налази изван граничника.

Житарице и друге монокотиле нису природни домаћини за Agrobacterium, али се ипак могу трансформисати коришћењем супер-бинарних вектора или супервирулентних сојева Agrobacterium-a. Избор експланта. Како је сврха највећег броја експеримената трансформације добијање целих трансгених биљака, експлант који се користи за трансформацију мора бити изабран тако да може да се регенерише у целу биљку. Као експланти се могу користити листови, котиледони, хипокотили идр. Кокултивација или инокулација подразмева инкубацију биљних експланата са културом A. tumefaciens. Експлант се исецка и стави у културу A. tumefaciens на око 10-30 минута, током чега се бактерије прикаче на биљне ћелије. Потом се екпланти изваде из културе и ставе на чврсту подлогу без антибиотика. Кокултивација траје око два дана, да би се омогућио трансфер рекомбинантне Т-ДНК. На крају се експланти исперу раствором антибиотика који убија бактерије, а не штети биљним ћелијама, обично цефотаксимом. Селекција и регенерација. Експланти се потом пребацују на свежу чврсту подлогу која садржи селективни антибиотик или хербицид који спречава раст нетрансформисаних биљних ћелија. Овај медијум осим тога треба да садржи и антибиотик који убија преостале бактерије (цефотаксим), као и одговарајући ауксин и цитокинин у односу који је потребан за регенерацију дате врсте. Потврда трансформације. Експресија страног гена се проверава најчешће RT-PCR-ом са специфични прајмерима за страни ген или алтернативно Northern Blotting-ом. Трансформација помоћу Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes је земљишна бактерија сродна A. tumefaciens-у, која се такође користи за трансформацију биљака. A. rhizogenes код инфицираних дикотила доводи до формирања посебног типа тумора у виду разгранатих и длакавих коренова познатих као hairy roots (Сл. 9, в, г, е). Овај фенотип је проузрокован трансфером гена са Ri плазмида (root-inducing), њиховом интеграцијом у геном и експресијом. Ri плазмид је сличан Ti плазмиду и такође поседује Т-ДНК, као и Vir регион. На основу типа опина, сојеви A. rhizogenes се деле на aгропинскe, манопинске, микимопинске и кукумопинске сојеве. На Т-ДНК Ri плазмида се налазе онкогени - rol гени A, B, C и D, који се интегришу у биљни геном. Иако је одавно показано да су rol гени одговорни за индукцију hairy roots, као и за карактеристичан фенотип регенереисаних биљака, њихове биохемијске функције нису у потпуности разјашњене. Трансформација са A. rhizogenes. Инокулација се може постићи кокултивацијом експланата са бактеријсксом културом, а ко експланти се могу користити листови, хипокотили, котиледони и сл. Алтернативно, инокулација се обавља убадањем биљака у стабло или лисну петељку, иглом предходно умоченом у бактеријску културу. Трансформација се веома лако уочава у виду коренова који се појављују на месту убода после десетак дана (Сл. 2.6, в). Трансформисани коренови брзо расту на медијуму без хормона, густо се гранају и имају много коренских длака, а могу се одвојити од

38

оригиналног експланта или биљке и гајити као независна култура (клон), која се повременим пасажирањем може одржавати практично неограничено дуго (Сл. 2.6, г, е). За разлику од crown gall тумора, који се не могу регенерисати у целе биљке (због чега се онкогени из Т-ДНК и избацују), hairy roots се могу регенераисати у култури, у неким случајевима и спонтано.

Сл. 9 - Hairy roots: в) Појава трансформисаних коренова на биљци Cistus creticus 10 дана од убода одн. инфекције са A. rhisogenes; е) култура трансформисаних коренова (hairy roots) кестена са г) –увећан детаљ.

Примене A. rhizogenes, култура трансформисаних коренова и регенераната су бројне:  Продукција секундарних метаболита у културама трансформисаних коренов  Продукција терапеутских протеина у култури коренова  Проучавање метаболичких путева и одговора биљака на хемикалије  Трансформисани коренови се користе као експериментални систем за проучавање интеракција са другим организмима, као што су нематоде, микоризалне гљивице и патогени коренова.  Фиторемедијација (акумулација тешких метала)  Добијање трансгених биљака регенерацијом из културе коренова Хемијска трансформација Хемијска трансформација се у главном примењује на трансформацију бактерија плазмидима, али може да се примени и на биљне протопласте. Хемијска трансформација бактерија плазмидима. Бактерије (E. coli) се за унос страних гена (у главном у форми плазмида) могу припремити релативно једноставном хемијском обрадом - испирањем у растворима соли. Ћелије спремне да приме страну ДНК се означавају као компетентне ћелије. Већина протокола за припрему компетентних ћелија подразумева испирање у леденом раствору који садржи CaCl2, после чега се ћелијама дода раствор рекомбинантних плазмида и смеша се на кратко загреје на 42 оС. Током

39

топлотног шока страна ДНК улази у ћелије, којима је потом потребно неко време да се опораве на оптималној температури (37 оС). Током опоравка селектабилни маркер унет са плазмидом, најчешће ген за резистенцију на неки антибиотик, почиње да се експримира у трансформисаним ћелијама, које се тада могу засејати на подлогу са антибиотиком ради селекције трансформаната. Основни кораци ове методе су приказани на Сл. 9.7.

Слика 9.7: Хемијска трансформација бактерија плазмидима. Објашњења у тексту.

Механизам успостављања компетенције. Током логаритамске фазе раста, на мембранама E.coli постоје многобројне поре које се називају и адхезивне зоне. Иако су ове поре физички довољно велике да би кроз њих могла да прође петља плазмидне ДНК, до тога не долази јер негативно наелектрисане групе фосфолипида мембране одбијају негативо наелектрисану ДНК. Улога Ca²+ јона је у неутрализацији негативних наелектрисања, како би ДНК могла да приђе мембрани. Када се смеша инкубира на леду, долази до уређења фосфолипидног билејера, тако да је неутрализација негативних наелектрисања ефикаснија. Нагли пораст температуре, тј. топлотни шок, доводи до брзе мембранске транзиције, што повећава пермеабилност мембране, тако да плазмиди успевају да прођу кроз поре. Хемијска трансформација биљних протопласта. Протопласти се могу учинити компетентним за трансформацију огољеном ДНК третманом полиетилен гликолом (PEG) у присуству двовалентних катјона - обично Ca²+. При томе Ca²+ има сличну улогу као и код бактеријских ћелија, док PEG дестабилизује мембрану и чини је пермеабилном за ДНК. Електропорација Електропорација је физичка метода трансформације која се примењује како на бактеријске тако и на биљне ћелије. Ћелије се излажу електрошоку, што доводи до отварања привремених пора на мембрани. Кроз ове поре у ћелију могу дифундовати

40

различити макромолекули а не само ДНК за трансформацију, као нпр. боје, антитела, РНК, вирусне честице идр. Електропорација бактерија. Излагање ћелија оштром пулсу електрицитета дестабилизује мембране E.coli и индукује формирање привремених пора кроз које могу да прођу молекули ДНК. Дијаметар ових пора је од 2 до неколико nm. Сматра се да су ове поре у почетку хидрофобне, а веће хидрофобне поре се потом могу претворити у хидрофилне (Сл. 9.8). Електропорација је најлакши, најбржи, најефикаснији и најрепродуцибилнији метод за трансформацију бактеријских ћелија.

1

3

2

4

Слика 9.8: Хипотетичке промене плазмамембране током електропорације. 1 - интактна мембрана; 2 хидрофобне примарне поре кроз које могу да прођу јони и мањи молекули; 3 - хидрофилна пора и 4 - улазак ДНК кроз хидрофилну пору. Осим приказаних постоје и прелазне форме пора између стања 1 и 2, као и поре које су делимично хидрофобне (са једне стране) а делимично хидрофилне (са друге стране). Ни за једну од ових пора не постоје директни докази, већ се њихова структура претпоставља на основу интерпретације резултата различитих типова експеримената. Измењено према Sambrook & Russell (2001).

Слика 9.9: Основни кораци електропорације бактерија. Објашњења у тексту.

Електропорација биљних ћелија. Електропорација се може применити на протопласте, суспензије биљних ћелија, културе калуса, неке типове експланата (незреле ембрионе, делове цвета итд.), као и на културе Chlamydomonas-a. Електропорација се успешно користи за трансформацију главних житарица - кукуруза, пшенице и пирича.

41

Биолистичка трансформација Биолистичка трансформација (biolistic = biological + ballistics, gene gun или particle bombarment method) је најефикаснија и највише коришћена физичка метода трансформације, која се првенствено користи за монокотиле, али и за дикотиле и друге организме. Највећи број комерцијалних трансгених житарица су добијене на овај начин. Милиони металних честица обложених са ДНК се великом брзином испааљују у целе биљке, експланте или ћелијске културе. По уласку у ћелију ДНК се спира са пројектила, и ако уђе у једро може доћи до привремене експресије и/или до стабилне уградње у хромозоме домаћина. Методу је 1987. године увео John Sanford са колегама са Cornell Универзитета, који је успео да трансформише житарице помоћу металних пројектила обложених са ДНК, пуцајући у меристеме целих биљака из 22-калибарског пиштоља.

Слика 9.10: а - Шематски приказ апарата за биолистичку трансформацију (Bio-Rad Biolistic PDS-1000/HE transformation system). б - генски пиштољ за трансформацију in planta.

Највише коришћен систем за биолистичку трансформацију биљака је Biolistic® PDS1000/HE Particle Delivery System, Bio-Rad Laboratories (Сл. 9.10, а). Овај систем ради са хелијумом под великим притиском, који се у тренутку опаљивања пропушта кроз диск да би потиснуо макроносач (мембрану) напуњен милионима микроносача - честица злата или волфрама обложених са ДНК. При томе зауставни екран задржава макроносач, док честице настављају у правцу циљног ткива брзином од преко 1700 km/h и улазе у ћелије. Узорак ткива се налази у вакуумираној комори. Постоје и ручне варијанте уређаја, познате као генски пиштољи (Сл. 9.10,б), који се могу користити на експерименталним пољима, при чему се циља у меристемске регионе биљака.

42

Селекција Трансформацијом се нови гени уносе у само мали број ћелија, па је следећи корак у генетичком инжињерству, без обзира на конкретан циљ и дизајн експеримента, селекција трансформисаних ћелија међу нетрансформисаним. Селекција трансформисаних бактеријских колонија или биљних клонова се најчешће обавља увођењем селектабилног маркера паралелно са геном од интереса. Типови селектабилних маркера Селектабилни маркери су гени који се уводе у бактеријске или биљне ћелије паралелно са геном од интереса, на истом вектору, а се користе за селекцију трансформисаних организама и/или за праћење генске експресије (Tаб. 10.1). Заједничка карактеристика селектабилних маркера и репортер гена је да се њихова експресија може лако пратити, без екстранкције ДНК, електрофорезе или ауторадиографије.  Селектабилни маркери за негативну селекцију су гени који успостављају резистенцију на антибиотике или хербициде. Ово је традиционални тип вештачке селекције који се означава као негативна селекција јер селектабилни агенс убија нетрансформисане ћелије.  Селектабилни маркери за позитивну селекцију су гени који трансформантима омогућавају раст користећи супстанцу која је селектабилни агенс (нпр. алтернативни извор угљеника), али селектабилни агенс не убија нетрансформисане ћелије.  Маркери за визуелну селекцију омогућавају визуелно разликовање трансформисаних и нетрансформисаних колонија или клонова, нпр. према боји или морфологији, при чему селективни притисак не постоји. Ови гени и нису селектабилни макери у стриктном смислу те речи, па их је правилније означавати прегледним маркерима или маркерима за сортирање (screenable markers).  Репортер гени су посебан тип маркера за визуелну селекцију чија се експресија може квантификовати (scoreable markers). Селектабилни маркер или репортер Аминогликозид фосфотрансферза I Аминогликозид (3') фосфотрансферза II (Неомицин фосфотрансфераза II) Аминогликозид фосфотрансферза III (Неомицин фосфотрансфераза III или канамицин киназа Аминогликозид фосфотрансферза IV (Хигромицин фосфотрансфераза)

Аминогликозид фосфотрансферза VI Аминогликозид-3-Nацетилтрансфераза (Гентамицин

NptI Kan NptII Kan neor Aph3'II NptIII Kan

Hpt Hph Hphs Hyg hygr AphIV AphA-6 AAC(3) Gen

Извор гена

Тип

За:

Селективни агенс

А

Бактерије

Канамицин

E. coli Tn5

А

Бактерије Биљке Хлоропл.

Strepto-coccus faecalis

А

Бактерије

Канамицин Генетицин Паромицин Неомицин Канамицин

S. hygroscopius, E. coli

А

Бактерије Биљке Хлоропл.

Хигромицин В

Acinetobacter sp.

А

Бактерије Хлоропл. Бактерије Биљке

Амикацин

А

Гентамицин

43

ацетилтрансфераза) Аминогликозид-3'-аденил трансфераза (Аминогликозид нуклео-тидил трансфераза) Стрептомицин фосфотрансфераза Хлорамфеникол ацетилтрансфераза

AadA Spec

Shigella flexneri

SPT

E. coli Tn5 E. coli Tn9

Стрептомицин Спектиномицин

Стрептомицин Спектиномицин Хлорамфеникол

E. coli Tn3

А

E. coli pSC101 Tn10

А

Бактерије

Тетрациклин

E. coli

А

Aspergillus terreus S. viridochromogenes, S. hygro-scopius СР4 сој Agrobacterium sp. S. typhimurium, Petunia Achromobacter E. coli квасац биљке E. coli плазмид R46

А

Бактерије Биљке Биљке

Блеомицин Флеомицин Бластицидин

Х

Биљке

Фосфинотрицин (Bialophos)

Х

Биљке

Глифозат (Roundup)

Х

Биљке

Глифозат

Х

Биљке

Сулфонилуреа имидазолинони

Х

Биљке

Сулфонамид

Х

Биљке

Хлорсулфурон

HemL GSA-AT

Х

Биљке

Габакулин

PPO

Х

Биљке

Бутафенацил

X

Биљке

Цијанамид

Х

Биљке

2,4-D

Х

Биљке

Бромоксинил

T

Биљке

Метотрексат

Т

Биљке Хлоропл.

Бетаин алдехид

Блеомицин-везујући протеин Бластицидин деаминаза

BSD

Фосфинотрицин ацетилтрансфераза

Bar Pat

Мутантна 5-Енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза

EPSP aroА

Глифозат оксидоредуктаза

gox

Мутантна ацетолактат синтаза

Als

Мутантна дихидроптероат синтаза Мутантна синтаза ацетохидрокси киселине Мутантна глутамат-1семиалдехид аминотрансфераза Мутантна протопорфириноген оксидаза Цијанамид хидратаза

Sul dhps AHAS

2,4- Дихлорофенокси-ацетат монооксигеназа Бромоксинил нитрилаза

TfdA DPAM Bxn

Дихидрофолат редуктаза неосетљива на метотрексат Бетаин алдехид дехидрогеназа

DHFR

Klebsiella ozaenae Миш

badh

Спанаћ

Тетрациклин ефлукс протеин

Бактерије Биљке Хлоропл. Бактерије Биљке Бактерије Биљке Хлоропл. Бактерије

CAT CM CmR Bla Amp ampr Carb Tet TetA tetr TC Ble

β-Лактамаза

А

Cah

Myrothecium verrucaria

А, Р

Ампицилин Карбеницилин

44

Триптофан декарбоксилаза

Tdc

2-деоксиглукозо-6-фосфат фосфатаза D-серин амониујум лијаза Фосфоманозо изомераза

DOGR

Catha-ranthus roseus квасац

T

Биљке

4-метил триптофан

T

Биљке

2-деоксиглукоза

E. coli E. coli

T П

Биљке Биљке

T. thermosulfurogenes, S. rubiginosus E. coli

П

Биљке

D-серин Маноза као једини извор С Ксилоза као једини извор С

П

Биљке

П

Биљке

П П В

Бактерије Бактерије Биљке

В

Биљке Биљке Бактерије Биљке Бактерије Биљке Хлоропл.

Ксилозо изомераза

dsdA PMI manA XylA

Арабитол дехидрогеназа

atlD

Изопентил трансфераза

Ipt

Левансахараза Инхибитор жиразе Коренски локуси (Rol гени) Транскрипциони фактор Leafy cotyledon 1 Knotted1 β-Галактозидаза

sacB ccdB Rol A, B, C Lec1

A. tumefaciens (Ti) Bacillus subtilis F плазмид A. rhizo-genes (Ri) кукуруз

Kn1 LacZ

кукуруз E. coli

В В, Р

β-Глукуронидаза

Gus UidA

E. coli

В, Р, П

Луцифераза

Luc

Photinus pyralis Vibrio harveyi

В, Р

Aequorea victoria

В, Р

A. tumefaciens (Ti) A. tumefaciens (Ti) пшеница

Р

Бактерије Биљке Хлоропл. Биљке

Р

Биљке

присуство октопина

Р

Биљке

/

Зелени флуоресцентни протеин

LuxA, LuxB GFP

Нопалин синтаза

Nos

Октопин синтаза

Ocs

Оксалат оксидаза

OxO

Арабитол као једини извор С Раст без цитокинина сахароза смртоносан ген морфологија морфологија морфологија бојена реакција цитокинин глукуронид као извор цитокинина; бојена реакција

Биљке луминисценција

флуорсценција присуство нопалина

Табела 10.1: Преглед селектабилних маркера и репортер гена који се користе у биотехнологији биљака. За сваки маркер је дато пуно име езима одн. протеина, скраћеница гена (којих обично има више у употреби), организам из кога ген потиче и тип маркера. Маркери су сортирани као следећи типови: А- резистенција на антибиотике; Х- резистенција на хербициде; Т– резистенција на токсине или анлоге метаболита; П– маркери за позитивну селекцију; В– маркери за визуелну селекцију; Р– репортер гени. За сваки маркер је назначено да ли се користи при селекцији бактерија или биљака, као и да ли се може користити при трансформацији хлоропласта.

Негативна селекција: резистенција на антибиотике и хербициде Као селектабилни маркери се највише користе гени који успостављајају резистенцију на неки антибиотик, хербицид, антиметаболит, аналог метаболита или токсин (Tаб. 10.1). Како се и маркер и ГОИ налазе на истом вектору, велика је вероватноћа да ћелије које преживе третман антибиотиком или хербицидом, такође имају и ГОИ. Овај тип вештачке селекције се означава као негативна, јер селектабилни агенс (тоскин, антибиотик или хербицид) убија нетрансформисане ћелије или спречава њихов раст.

45

Резистенција на антибиотике. Природни извор гена за резистенцију на антибиотике су бактеријски плазмиди и транспозони. У зависности од механизма деловања, поједини антибиотици су специфични само за прокариоте или, рецимо, само за Грам-негативне бактерије, док су други токсични и за прокариоте и за еукариоте. Разлог зашто су и еукариоти, а посебно биљке, сензитивни на одређене типове антибиотика лежи у чињеници да већина антибиотика инхибира синтезу протеина, а механизми транслације у органелама су слични прокариотским. Гени за резистенцију већином кодирају за ензиме који модификују антибиотике нпр. фосфорилацијом или ацетилацијом и тако их детоксификују, али има и случајева када се резистенција заснива на избацивању антибиотика из ћелије. Примери:  Хлорамфеникол је антибиотик широког спектра изолован из земљишне актиномицете, који инхибира синтезу протеина у бактеријама, смањујући брзину катализе пептидил трансферазе лоциране на 70S рибозомима. Резистенција се заснива на активности хлорамфеникол ацетилтрансферазе (CAT), која катализује трансфер ацетил групе са acetil-CoA на С3-хидроксилну групу антибиотика. Овај ген се обично налази на плазмидима или на транспозонима као што је Tn9.  Канамицини, неомицин, гентамицин, генетицин (G418) и хигромицин В су сродни антибиотици из групе аминогликозидних антибиотика. Ови антибиотици интерагују са најмање три рибозомална протеина, као и са специфичним базама rRNA мале субјединице, што инхибира синтезу протеина. Како су сличне структуре, многи аминогликозидни антибиотици се инактивирају сличним или истим ензимима, аминофосфотрансферазама одн. аминогликозид фосфотрансферазама (APHs). Како су биљке сензитивне на канамицин и хигромицин, одговарајуће APHs, неомицин фосфотрансфераза II (NptII) и хигромицин фосфотрансфераза се много користе као биљни селектабилни маркери.  Ампицилин (аминопеницилин) и карбеницилин (карбоксипеницилин) су деривати пеницилина. Ови антибиотици инхибирају синтезу ћелијског зида неких Грамнегативних бактерија тако што онемогућавају унакрсно повезивање пептидогликана катализовано транспептидазом. Ензим β-лактамаза, кодирана Bla геном, хидролизује цикличну амидну везу β-лактамског пристена ампицилина, чиме доводи до резистенције.  Тетрациклин и сродни антибиотици имају карактеристичан четвороциклични скелет. Тетрациклин инхибира везивање аминоацил tRNA за акцепторско место на 30S рибозомалној субјединици, чиме спречава синтезу протеина код Грам-негативних и позитивник бактерија, као и код протозоа. Резистенција на тетрациклин се успоставља експресијом гена tetr. Продукт је хидрофобни мембрански Tet протеин, који се уграђује у унутрашњу бактеријску мембрану и спречава акумулацију тетрациклина у ћелијама тао што доводи до ефлукса антибиотика. Резистенција на хербициде се у највећем броју случајева постиже увођењем мутираног циљног ензима, биљног или бактеријског порекла, који није сензитиван на хербицид, или ређе ензима који модификује и детоксификује хербицид. Као селектабилни маркери се највише користе фосфинотрицин ацетилтрансферза (bar ген) који детоксификује фосфинотрицин и мутантни ензим EPSP резистентнан на хербицид глифозат (Roundup). Резистенција на токсине, аналоге метаболита и антиметаболите се такође користи за селекцију. Аналози метаболита попут 4-метил триптофана и 2-деоксиглукоза интерферирају са општим метаболизмом, па се ензими који детоксификују оваква једињења могу користити као селектабилни маркери. Метотрексат је антиметаболит који инхибира ензим дихидрофолат редуктазу и тако интерферира са синтезом тимидина, пуруна, ДНК и РНК. Мутантна варијанта дихидрофолат редуктазе неосетљива на метотрексат се користи као биљни селектабилни маркер.

46

Слика 10-1: Примери антибиотика са назначеним местима деловања детоксификујућих ензима одн, протеина.

Позитивна селекција Коришћење антибиотика и хербицида има негативне ефекте чак и на резистентне, трансгене, ћелије и умањује њихову способност пролиферације и регенерације у биљке. Осим тога, у јавности постоји одбојност према коришћењу маркера за резистенцију, због страха од њиховог случајног преношења на корове или микробе. Позитивна селекција је алтернативни селекциони систем у коме супстанца која се користи као селекциони агенс није токсична за биљне ћелије. Као селектабилни маркери за позитивну селекцију се користе ензими који трансформисаним ћелијама омогућавају коришћење селектабилног агенса за раст. Нетрансформисане ћелије не могу да расту или расту веома споро, јер је композиција медијума таква да је селектабилни агенс неопходан за раст. Највише се користе са алтернативним изворима угљеника или азота. Биљне ћелије у култури in vitro захтевају присуство угљених хидрата у медијуму као извор угљеника и енергије. У медијум се обично додају сахароза или глукоза. Ако се, међутим, у медијум дода неки неуобичајен шећер као нпр. маноза, ћелије овај шећер неће моћи да користе. Маноза се у ћелијама брзо конвертује у манозо-6-фосфат дејством хексокиназе, али се даље не метаболише. Увођењем гена за фосфоманозо изомеразу (PMI) пореклом из E. coli, се омогућава коришћење манозе и преживљавање трансформаната. PMI катализује интерконверзију манозе-6-Р у фруктозу-6-Р, која се лако разграђује гликолизом. Осим манозе/PMI, за селекцију се користе ксилоза/ксилозо изомераза, као и шећерни алкохоли (рибитол) и др. Осим високе ефикасности, предност оваквих система је и цена, јер су шећери далеко јефтинији од хербицида и антибиотика.

47

Визуелна селекција: лактозни оперон и α-комплементација Маркери за визуелну селекцију (прегледни маркери, screenable markers) омогућавају разликовање трансформисаних и нетрансформисаних колонија или конова, при чему нема селективног притиска, тако да све ћелије преживљавају. Ови маркери су најчешће ензими који могу да продукују обојено или флуоресцентно једињење конверзијом неког вештачког супстрата, као β-галактозидаза и β-глукуронидаза, или гени који трансформантима дају специфичне морфолошке карактеристике, као лиснате котиледоне (транскрипциони фактор Lec1) или длакаве коренове (Rol гени). Највише коришћен систем за визуелну селекцију бактеријских колонија је тзв. плаво/бели систем базиран на лактозном оперону.

Слика 10.2: Различити β-галактозиди као природни и вештачки супстрати β-галактозидазе и као индуктори лактозног оперона. Детаљна објашњења у тексту.

Лактозни оперон E. coli је веома користан систем у молекуларној генетици и генетском инжињерству из два разлога: прво, транскрипција лактозног оперона је тесно регулисана а механизам регулације је проучен у детаље и њиме се лако може манипулисати и друго, главни продукт оперона, ензим β-галактозидаза, може да катализује бојене реакције, па

48

је у том смислу веома погодан као визуелни маркер и репортер. Lac оперон се састоји од три структурна гена задужена за катаболизам лактозе који су под контролом заједничког промотора и оператора и једног регулаторног гена са посебним промотором (Сл. 10.3, горе). Структурни гени су:  lacZ, који кодира за β-галактозидазу, ензим који хидролизује дисахарид лактозу до галактозе и глукозе (Сл. 10.2). Алтернативно, овај ензим може да катализује и изомераизацију лактозе у алолактозу, али је удео ове реакције мали.  lacY, који кодира за β-галактозид пермеазу, мембрански протеин задужен за транспорт лактозе у ћелију и  lacA, који кодира за β-галактозид трансацетилазу, која преноси ацетил групу са ацетил-CoA на β-галактозиде, мада сврха ове реакције није позната. Индукција оперона зависи од приступачности лактозе, јер би за ћелију било неекономично да производи три ензима у одсуству супстрата. Транскрипција структурних гена оперона почиње везивањем РНК полимеразе за промотор/оператор, под условом да је секвенца оператора слободна. Регулаторни протеин, lac репресор, се конститутивно експримира кодиран геном lacI (inducibility). Када у медијуму нема лактозе, репресор се везује за регулаторну секвенцу у саставу промотора, lac оператор, што онемогућава везивање полимеразе. У присуству лактозе се за репресор везује лактозни метаболит, алолактоза, доводећи до промене конформације репресора и његове дисоцијације од оператора. Тако се за слободан промотор/оператор може везати полимераза доводећи до акумулације ензима за метаболизам лактозе. Постоји, међутим, и други ниво регулације лактозног оперона, који зависи од присуства глукозе у медијуму. Наиме, ако су у медијуму присутни и глукоза и лактоза, ћелије радије користе глукозу као основни метаболит, а лактозни оперон ће се експримирати веома слабо (базална експресија). Ово се објашњава тиме да је за високу експресију потребан други регулаторни протеин, CAP (cAMP Activator Protein). CAP се активира cAMP-ом, а потом се везује за специфичну секвенцу поред промотора, чиме стимулише везивање полимеразе и олакшава њено позиционирање. Како су количине глукозе и cAMP-а у бактеријским ћелијама обрнуто сразмерне, када је глукоза приступачна, биће мало cAMP-а и мало активног CAP-а, а експресија гена оперона ће бити ниска. Ниво cAMP-а не зависи директно од концентрације глукозе, већ од брзине уласка глукозе у ћелију, јер је функција аденилат циклазе, која продукује cAMP, путем посебног механизма регулисана функцијом глукозног транспортера. Лактозни аналози. До сада је описано мноштво лактозних аналога и деривата и различитих сусптитуисаних β-галактозида који су се показали корисним у манипулацијама лактозним опероном, било као алтернативни супстрати β-галактозидазе, било као вештачки индуктори оперона (Сл. 10.2). У експериментима се као индуктор најчешће користи изопропил-β-D-тиогалактозид (IPTG), који инактивира репресор на исти начин као и алолактоза, али није супстрат за β-галактозидазу. Предност IPTG-a је у томе што га ћелије не метаболишу, тако да његова концентрација у ћелијама остаје константна током експеримента, што доводи до стабилне експресије оперона. Као супстрати за бојене реакције се користе X-gal и ONPG. β-Галактозидаза хидролизује X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил--D-галактопиранозид) на галактозу и 5-бромо-4-хлоро-3хидроксииндол, који се потом оксидује и димеризује у нерастворно плаво једињење индиго. Ако се IPTG и X-gal додају у агарозни медијум, бактеријске колоније које имају функционалан lacZ ген ће бити плаве. ONPG (орто-нитрофенил---D-галактозид) је колориметријски и спектрофотометријски супстрат за детекцију и квантификацију активности β-галактозидазе, посебно ако желимо да β-галактозидазу користимо као репортер ген. ONPG је безбојан, али је продукт хидролизе, о-нитрофенол, жут.

49

Слика 10.3. Горе: структура лактозног оперона са основним регулаторним елементима и 3D структура једне субјединице β-галактозидазе, која је иначе тетрамер, где је -фрагмент означен плаво, а ω-фрагмент бледо зелено. Доле: нетрансформисане и трансформисане бактерије са одговарајућим елементима лактозног оперона и шематским приказом -комплементације. Инсерт: изглед плавих и белих бактеријских колонија на агарној подлози. Детаљна објашњења у тексту.

-Комплементација (blue/white screening) је систем за визуелну селекцију који се заснива на чињеници да ензимска функција β-галактозидазе остаје очувана чак и ако се ензим реконституише од два полипептидна фрагнемта независно кодирана деловима lacZ гена. 5'-крај lacZ гена кодира за N-терминални део протеина, тзв. -фрагмент, док 3'-крај кодира за C-терминални део ензима, односно ω-фрагмент (Сл. 10.3), који у бактеријама дивљег типа, нормално, чине јединствен полипептид. Сваки понаособ, ови фрагменти су нефункционални, али ако се експримирају у истој ћелији, сами се комбинују у функционалну β-галактозидазу, што се назива -комплементацијом. Плаво/бела селекција је техника за разликовање две врсте трансформисаних ћелија: оних код којих је инсерција страног гена у вектор била успешна и оних које су трансформисане „празним“ вектором, тј, у случају када је лигација била неуспешна. Кораци су следећи:  Лигација ГОИ у вектор (плазмид), који има 5'-крај lacZ гена, као pUC19 или pBluescript. Ови вектори су конструисани тако да се у средини lacZ (у оквиру читања, без ремећења кода), налази MCS место за клонирање, где се убацује страни ген. Ако се страни ген успешно лигира у вектор, он ће пресећи 5' lacZ, и он више неће бити функсионалан. Вектор обавезно има и неки селектабилни маркер (нпр. ampr).  Компетентне бактерије посебног генотипа се потом трансформишу вектором. Код ових бактерија је комплетан Lac оперон је избачен из хромозома делецијом, а уместо

50



тога је, на посебном F’-плазмиду, део оперона који се састоји од регулаторних секвенци и 3'-краја lacZ гена. Ћелије се потом гаје на подлози која садржи антибиотик (ампицилин), X-gal и IPTG. Ако је лигација била успешна, страна секвенца ће пореметити 5' lacZ, неће бити фрагмента, па ће овакве колоније остати беле. Ако је лигација била неуспешна, тако да је вектор затворен без инсерта, бактерије ће експримирати -фрагмент и у ћелијама ће се накупити плави продукт деградације X-gal-а. Беле колоније се изолују са подлоге (Сл. 10.3,инсерт) и користе за даље експерименте.

Репортер гени и генске фузије Репортер гени (scoreable или screenable markers) су гени за тестирање, чија експресија резултира фенотипом који се може квантификовати. Мора да постоји есеј за квантитативно одређивање активности (експресије) репортера, а детекција експресије репортера (ензимске активности или флуоресценције) треба да је сензитивна, поуздана, ефикасна, једноставна и јефтина. Експресија репортера се обично прати на нивоу квантификације протеина или ензимске активности и то било in situ, хистохемијским реакцијама или у in vitro есејима, из биљних екстраката. Као и остали селектабилни маркери, репортер гени се уводе у ћелије заједно са ГОИ, на истом вектору. Репортер гени имају следеће намене:  Трансформација биљака самим репортер геном, без ГОИ, служи за одређивање ефикасности система за трансформацију, нпр. за проверу функционалности нових вектора, ефикасности нових метода трансформације, могућности трансформације неиспитаних биљних врста исл. У овом случају се репортери користе у комбинацији са јаким конститутивним промотором.  Репортер гени се могу користити као маркери за визуелну селекцију за потврду трансформације, да би се установило да ли је ГОИ убачен у ћелије и да ли је трансформација стабилна. У овом случају се репортер експримира са својим засебним промотором, који се разликује од промотора ГОИ (Сл. 10.4, а).  Транскрипциони репортери или промоторске фузије представљају фузије промотора ГОИ са репортером (Сл. 10.4, б). Промоторске фузије се користе да се установи начин експресије ГОИ, да се прати хистолошка и интраћелијска локализација ГОИ, време експресије током развића, утицај спољних фактора на индукцију исл.  Транслациони репортери представљају праве фузије два гена, репортера и ГОИ, којих има више типова (Сл. 10.4, в-д). Транслациони репортери се користите за праћење експресије ГОИ и сматра се да пружају прави увид у начин експресије испитиваног гена, укључујући и субћелијску локализацију, јер садрже све његове секвенце, укључујући и све регулаторне секвенце. Транслациони репортери се могу конструисати повезивањем репортера и ГОИ, при чему су оба гена под контролом истог промотора, транскрибују се као једна mRNA, а потом синтетишу као један полипептид (Сл. 10.4, в). Важно да оба протеина поприме финкционалну конформацију и да могу да нормално интерагују са својим супстратима и поред тога што су повезани, па се између гена умеће ДНК сегмент који кодира за флексибилни полипептидни линкер, да би протеини били физички размакнути и минимално сметали један другом. Конструкти у којима је репортер убачен у ГОИ интрагенски (али тако да се не поремети оквир читања, Сл. 10.4, г) су стабилнији, али инсерција репортера може да омета функцију ГОИ. На крају, постоје и конструкти који садрже ГОИ и све његове регулаторне елементе и који се комплетно транскрибују, али се транслира само репортер, јер је на крају секвенце репортера СТОП кодон (Сл. 10.4, д).

51

Слика 10.4: Типови генских фузија. а - Репортер ген и ген од интереса (ГОИ) се налазе на истом ДНК сегменту, али имају независне промоторе (Р) и остале регулаторне елементе. б - Транскрипциони репортер или промоторска фузија. в - Транслациони репортер у коме су репортер и ГОИ под контролом истог промотора, а раздвојени су линкером; г - Транслациона фузија са интрагенским репортером; д - Транслациони репортер са СТОП кодоном после репортера.

-Глукуронидаза (GUS) је хидролаза из E. coli, која је посебно погодна за коришћење у биљној молекуларној биологији. Како код кичмењака и многих инвертебрата постоји ендогена GUS активност, овај репортер је неприменљив у анималним системима. Међутим, код виших биљака, папрати, маховина, гљива и многих бактерија нема ендогене GUS активности, па GUS репортер представља највише коришћен репортер систем. Глукуронидаза хидролизује разне -глукурониде, а есеји за детекцију активности су веома сензитивни и једноставни. Принцип у свим есејима је сличан: безбојно једињење типа супституисаног глукуронида се хидролизом преводи у обојени или флуоресцентни продукт. Највише се користи хистохемијски есеј, познат као GUS бојење (Сл. 10.5).

52

Слика 10.5: а - Реакција добијања индиго плаве боје, која се одвија током хистохемијског GUS бојења. Ова реакција је у суштини иста као раније поменута реакција β-галактозидазе са X-gal супстратом, само што је у овом случају супстрат X-gluc, а хидролизом се одваја глукуронична киселина. Продукт реакције се оксидује и димеризује у индиго, који се таложи у ћелијама које експримирају β-глукуронидазу. Експресија β-глукуронидазе се тако може пратити, када је, на пример, GUS ген фузионисан са неким специфичним промотором, као што је приказано на примеру фузије промотора GS1-2 изоформе глутамин сиснтетазе са GUS геном. Експресија овог конструкта се види у на попречном пресеку корена (б) и колеоптила (в) клијанаца кукуруза.

Зелени флуоресцентни протеин (Green Fluorescent Protein, GFP) је један од најпопуларнијих репортер гена, који је првобитно изолован из медузе Aequorea Victoria (Сл. 10.6, а), мада је потом откривен и код неких других Cnidaria. Захваљујући GFP-у ова медуза флуоресцира зелено када се осветли плавом светлошћу (exc = 395 & 475 nm; em = 508 nm). In vivo, до флуоресценције долази због нерадијативног трансфера енергије са биолуминисцентног протеина аквеорина на GFP, без физичке интеракције. GFP је мали протеин од 238 амино киселина и масе од 26.9 kDa. Флуорофора се састоји од 3 аминоксиелине, Ser65 - дехидро Tyr66 - Gly67, а локализована је у централном αхеликсном хептапептиду, заштићена структуром „буренцета“ (β-barrel) од 11 трака (Сл. 10.6, б). Ова структура штити флуорофору од хемијских утицаја из околине и не дозвољава да флуорофора преноси енергију ексцитације на околне молекуле (quenching). После транслације, флуорофора се спонтано формира циклизацијом и оксидацијом, што траје око 4 сата (Сл. 10.7).

Слика 10.6: а - Aequorea victoria; б - 3D структура GFP-а; в - Уљана репица трансформисана GFP-ом (лево) и нетрансформисана биљка (десно) под УВ светлом; г - Плажа Сан Диега нацртана на агарозној плочи живим бактеријама које експримирају 8 различитих варијанти флуоресцентних протеина.

53

Слика 10.7: Спонтано формирање флуорофоре GFP-a циклизацијом и оксидацијом.

GFP је најприближнији појму „идеалног“ репортера, из више разлога:  Састоји се од једног полипептида  Флуорофора се формира спонтано, од аминокиселина, и никакви други гени тј. ензими нису потребни за њено формирање  За флуоресценцију нису потребни никакви кофактори или коензими  Веома је стабилан и отпоран на варијације рН и температуре и присуство хемикалија  Није токсичан и може се експримирати у бактеријама, биљкама и животињама  Може се визуелизовати in vivo, простим осветљавањем плавом или УВ светлошћу GFP се користи за:  Идентификацију трансформисаних ћелија  Мерење генске експресије in vivo. Код трансгених биљака се флуоресценција GFP-а може детектовати и мерити и у пољу  Обележавање и локализацију протеинских фузија  Проучавање интраћелијског транспорта протеина  Проучавање протеин-протеин интеракција ФРЕТ методом (FRET - Fluorescenceresonance energy transfer)  Обележавање једноћелијских организама када је потребно пратити ћелијске линије и клонове  Идентификацију организама пуштених у спољашњу средину  Идентификацију лабораторијских организама који не смеју бити пуштени у спољашњу средину. Луцифераза (Luc) је ензим изолован из северноамиричке врсте свитаца Photinus pyralis. Ензим катализује оксидативну декарбоксилацију супстрата луциферина (6-хидроксибензотиазола) до оксилуциферина у присуству АТР-а, Mg2+ јона и кисеоника. Луминисценција се може пратити визуелно (мада је интензитет ослобођене светлости генерално веома низак), фотографисати, или електронски квантификовати помоћу луминометра или фотомултипликатора. Реакција катализована луциферазом се одвија у 3 корака: 1) Luc + LH2 + ATP-Mg ↔ Luc∙LH2-AMP + PPi 2) Luc∙LH2-AMP + О2 → Luc∙Oxyluciferin* + AMP + CO2 3) Luc∙Oxyluciferin* → Luc∙Oxyluciferin + h

54