UIVERSIDAD DE SOORA
Bioseparaciones Segunda Edición Armando Tejeda Mansir Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas Universidad de Sonora Hermosillo, Sonora México
Rosa María Montesinos Cisneros Departamento de Matematicas Universidad de Sonora Hermosillo, Sonora México
Roberto Guzmán Zamudio Department of Chemical and Environmental Engineering University of Arizona Tucson, Arizona USA
Datos de catalogación bibliográfica Tejeda Mansir, Armando; Montesinos Cisneros, Rosa María; Guzmán Zamudio, Roberto.
Bioseparaciones. Segunda edición.
PEARSON EDUCACIÓN, México, 2011 ISBN: 978-607-32-0945-8 Formato: 18.5 x 23.5 cm
Páginas: 704
Todos los derechos reservados Editores: Editor de desarrollo:
Carlos Mario Ramírez Torres
[email protected] Marianna Lyubarets (Universidad de Sonora) Claudia Silva Morales
SEGUNDA EDICIÓN, 2011 D.R. © 2011 por Universidad de Sonora Av. Rosales y Blvd. Encinas S/N Col. Centro 83000, Hermosillo, Sonora www.uson.mx D.R. © 2011 por Pearson Educación de México, S.A. de C.V. C.V. Atlacomulco 500- 5o Piso Industrial Atoto 53519, Naucalpan de Juárez, Estado de México Cámara Nacional de la Industria Editorial Mexicana. Reg. Núm. 1031 Reservados todos los derechos. Ni la totalidad ni parte de esta publicación pueden reproducirse, registrarse o transmitirse, por un sistema de recuperación de información, en ninguna forma ni por ningún medio, sea electrónico, mecánico, fotoquímico, magnético o electroóptico, por fotocopia, grabación o cualquier otro, sin permiso previo por escrito de los coeditores. El préstamo, alquiler o cualquier otra forma de cesión de uso de este ejemplar requerirá también la autorización de los coeditores o de sus representantes. “Este libro se publicó con el apoyo del Programa de Mejoramiento del Profesorado PROMEP/103.5/11/1535”
ISBN: 978-607-32-0945-8 ISBN e-book: 978-607-32-0946-5 ISBN e-chapter: 978-607-32-0947-2 ISBN: 978-607-8158-28-7 (UNISON) Impreso en México. Printed in Mexico. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 – 14 13 12 11
ISBN: 978-607-32-0945-8
Contenido
Prefacio
I
XI
El Proceso de Bioseparación
1
1 Una Perspectiva de las Bioseparaciones 1.1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1 Productos Biotecnológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.2 Bioproce ocesos y Bioseparaciones . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Tipos pos de Bioproce ocesos y Biop ioprodu oductos . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 Propiedades de los Bioprodu oductos . . . . . . . . . . . . . 1.3 Oper peraciones de Bioseparación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1 Esquema RIPP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2 Bioproceso Típico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.3 1.3.3 Co Compo mporta rtamie mien nto del Biopr Bioproce oceso so y Cali Calida dad d del del Produ Product cto o 1.4 1.4 Impo Import rta ancia ncia Econ Econó ómica mica de las las Bio Biosepa separa raci cion ones es . . . . . . . . . 1.5 Comercializa ización del Bioprodu oducto . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.1 Desarrollo del Bioproceso . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.2 Diseño Interior . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6 Tendencias en Bioseparaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7 Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8 Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.9 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Síntesis del Bioproceso 2.1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Enfoque de Diseño . . . . . . . . . . 2.2. .2.2 Conside siderracione ioness Técnic nicas de Dise iseño 2.3 Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Recuperación . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Concentración . . . . . . . . . . . . 2.3.3 Purificación . . . . . . . . . . . . . . 2.3.4 Acabado . . . . . . . . . . . . . . . .
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5 5 5 6 7 8 9 9 9 15 20 21 22 22 23 25 26 28
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31 31 31 32 32 35 35 36 36 36
2.4. Diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1. Síntesis del Bioproce oceso . . . . . . . . 2.4. 2.4.2. 2. Anál Anális isis is y Eval Evalua uaci ción ón del del Biop Biopro roce ceso so 2.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . .
II
CONTENIDO
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Recuperación del Producto
63
3. Filtración 3.1. Introdu oducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. 3.2.1. 1. La Filt Filtra raci ción ón com comoo Par Parte te de los los Sis Siste tema mass de de BSL BSL 3.2. 3.2.2. 2. Pret Pretra rata tami mien ento to de Cald Caldos os para para BSL BSL . . . . . . . 3.2. 3.2.3. 3. Teorí eoríaa de la Filt Filtra raci ción ón Con Convencio nciona nall . . . . . . . 3.2. 3.2.4. 4. Teorí eoríaa de Filt Filtra raci ción ón de Lec Lecho Prof Profun undo do . . . . . 3.3. Equipo de Filtración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1. Filtros por por Lotes a Presión . . . . . . . . . . . . 3.3 3.3.2. .2. Filt iltros ros Continu inuos al Vacío . . . . . . . . . . . . . 3.3.3. Filtros de Lecho Profundo . . . . . . . . . . . . . 3.4. Diseño de Equipo de Filtración . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1. Filtración por por Lotes . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2. Filtración Continua . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 3.4.3. .3. Filt iltrac ración ión de Lech echo Prof Profun undo do . . . . . . . . . . . 3.4. 3.4.4. 4. Sist Sistem emas as Expe Expert rtos os en Filt Filtra racción ión . . . . . . . . . . 3.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4. Centrifugación 4.1. Introdu oducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 4.2. Funda undame menntos tos de la Cent entrif rifugac gación ión . . . . . . . . 4.2.1. Ley de Stokes . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. 4.2.2. 2. Sedi Sedime ment ntac ació iónn por por Acc Acció iónn de de la la Gra Gravvedad edad 4.2 4.2.3. .3. Sed Sedime imentació aciónn Cent entrífu ífuga . . . . . . . . . 4.2.4. Factor G . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Equipo de Centrifu ifugación . . . . . . . . . . . . . 4.3. 4.3.1. 1. Equi Equipo poss de de Sedi Sedime menntaci tación ón Cen Centríf trífug ugaa . . 4.3. 4.3.2. 2. Equi Equipo poss de Filt Filtra raci ción ón Cen Centríf trífug ugaa . . . . . 4.4 4.4. Diseño seño de Equi Equipo po de Cent entrifu ifugac gación ión . . . . . . . 4.4. 4.4.1. 1. Diseñ iseñoo de Cen Centríf trífug ugas as Tubul ubular ares es . . . . . 4.4.2. Centrífuga de Discos . . . . . . . . . . . . 4.4.3. Escalamiento . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 4.4.4. .4. Filt iltrac ración ión Centrí trífug fuga . . . . . . . . . . . . 4.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36 36 43 56 57 62
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67 67 67 68 70 73 74 75 76 76 77 78 79 92 98 100 100 100 101 108
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111 . 111 . 112 112 . 112 . 114 114 . 115 . 119 . 120 . 120 120 . 126 126 . 126 . 127 127 . 135 . 140 . 144 144 . 147
CONTENIDO
4.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 4.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154
5. Rompimiento de Células 5.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. 5.2.1. 1. Estru strucctura ura de la Par Pareed Celula lularr . . . 5.2. 5.2.2. 2. Sist Sistem emas as Celu Celula lare ress de Secr Secrec eció iónn . . . 5.2. 5.2.3. 3. Métod étodos os de Romp Rompim imie iennto Celul elular ar . . 5.2. 5.2.4. 4. Métodos odos de Perme rmeabil abiliizac zación ión . . . . 5.3. 5.3. Equip quipoo de Rompim pimient ento Celula lularr . . . . . . 5.3. 5.3.1. 1. Molin olinoo de de Perla erlass de de Alta Alta Veloc elocid idad ad . 5.3. 5.3.2. 2. Homo Homoge gene neiz izad ador or de Alta Alta Pres Presió iónn . . 5.3.3. Microfluidizador . . . . . . . . . . . 5.4. 5.4. Dise iseño de Equ Equipo ipo de Rompim mpimie iennto . . . . . 5.4. 5.4.1. 1. Molin olinoo de de Perla erlass de de Alta Alta Veloc elocid idad ad . 5.4. 5.4.2. 2. Homo Homoge gene neiz izad ador or de Alta Alta Pres Presió iónn . . 5.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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III Concentración del Producto 6. Extracción 6.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. 6.2. Funda ndamen mentos de la Extr Extrac accción ión . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.1. 6.2.1. Tipos Tipos de de Siste Sistema mass de Extrac Extracció ciónn Líqui Líquidodo-Líq Líquid uidoo . 6.2. 6.2.2. 2. Quím Químic icaa de de la la Ext Extra racc cció iónn Líq Líqui uido do-L -Líq íqui uido do . . . . . 6.2.3. Selección del Solvente . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.4. 6.2.4. Extra Extracci cción ón en Dos Dos Fases ases Acuos Acuosas as Inmisc Inmiscibl ibles es . . . 6.3. Equipo de Extracción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3. 6.3.1. 1. Equi Equipo po de Extr Extrac acci ción ón por por Lote Lotess . . . . . . . . . . . 6.3. 6.3.2. 2. Equi Equipo po de Extr Extrac acci ción ón Con Contin tinua . . . . . . . . . . . 6.4. 6.4. Dise iseño de Equ Equipo ipo de Extrac racción ión . . . . . . . . . . . . . . 6.4.1. Extracción por por Lotes . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.2. Extracción Continua . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. 6.4.3. 3. Extracc racció iónn Dife iferenc rencia iall . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. 6.4.4. 4. Extr Extrac acci ción ón por por Eta Etapa pass no no en en Equ Equil ilib ibri rioo . . . . . . 6.4. 6.4.5. 5. Extracc racció iónn Fracci accion onar aria ia . . . . . . . . . . . . . . . 6.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
157 . 157 . 158 . 158 158 . 160 160 . 160 160 . 164 164 . 167 167 . 168 168 . 175 175 . 178 . 180 180 . 180 180 . 192 192 . 196 . 197 . 201
205 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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209 . 209 . 210 210 . 210 . 211 211 . 220 . 221 . 230 . 230 230 . 231 231 . 233 233 . 234 . 241 . 253 253 . 259 259 . 262 262 . 266 . 267 . 272
CONTENIDO
7. Adsorción 7.1. Introdu oducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.1. 7.2.1. Tipos de Adsorción: Adsorción: Interac Interacción ción Soluto-Ads Soluto-Adsorben orbente te . 7.2.2. Tipos pos de Adsor sorben bentes . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2 7.2.3. .3. Relac lacion iones de Equil quilib ibrrio . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2 7.2.4. .4. Ciné inética ica de la Adsor dsorcción ión . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3. Equipos pos de Adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4. Diseño de Adsorbe orbeddores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4.1. 7.4.1. Adsorbe Adsorbedor dores es Tipo Tipo Tanq Tanque ue Agitad Agitadoo por por Lote Lotess . . . . 7.4.2. 7.4.2. Adsorbe Adsorbedor dores es Tipo Tipo Tanq Tanque ue Agitad Agitadoo Con Contin tinuo uo . . . . 7.4 7.4.3. .3. Adsor dsorcción ión en Lec Lecho Fijo ijo . . . . . . . . . . . . . . . . 7.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV Purificación del Producto
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275 . 275 . 276 . 277 . 277 . 281 . 286 . 294 . 295 . 295 . 310 . 318 318 . 349 . 350 . 356
359
8. Cromatografía por Elución 363 8.1. Introdu oducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 8.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365 8.2.1. 8.2.1. Tipos de Cromatogr Cromatografía afía Líquida: Líquida: Principi Principioo de Separaci Separación ón 365 8.2.2. Matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 366 8.2.3. 8.2.3. Tipo Tipo de Cromat Cromatogr ograf afía ía por por Pres Presión ión de Operac Operación ión . . . . . 370 8.2 8.2.4. .4. Relac lacion iones de Equil quilib ibrrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 8.2 8.2.5. .5. Ciné inética ica de la Adsor dsorcción ión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 8.3. Equipos pos Cromato atográficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 8.4. 8.4. Dise Diseño ño de Colu Column mnas as Crom Cromat atog ográ ráfic ficas as . . . . . . . . . . . . . . . . 372 372 8.4. 8.4.1. 1. Teorí eoríaa de Crom Cromat atog ogra raffía Line Lineal al . . . . . . . . . . . . . . . 373 373 8.4.2. Mode odelos lineales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373 8.4.3. Evaluación Evaluación del Comportamiento de las Columnas: Columnas: Resolución, Pureza y Rendimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . 396 8.4 8.4.4. .4. Escal scalam amiient ento y Optim ptimiz izac aciión . . . . . . . . . . . . . . . . 402 402 8.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411 8.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412 8.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419 9. Precipitación 421 9.1. Introdu oducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421 9.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422 9.2.1. 9.2.1. Precip Precipita itaci ción ón por por Dism Dismin inuci ución ón de la Solu Solubil bilida idadd . . . . . . 423 9.2.2. Precipitación Precipitación de Proteínas por Desnaturalización Desnaturalización Selectiv Selectivaa 437 9.2 9.2.3. .3. Prec recipit ipitac aciión por por Afinida nidadd . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441 9.3. Equipo de Precipitaci ación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443 9.4. Diseño de Precipitadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
CONTENIDO
9.4. 9.4.1. 1. Cinét nética ica de la Prec recipita pitacción ión 9.4.2. Método odos de Diseño . . . . . 9.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . 9.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . 9.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . .
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444 444 449 456 458 459
10.Ultrafiltración 461 10.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 461 10.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462 10.2 10.2.1 .1.. Pro Proccesos sos con Membran branas as . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462 462 10.2.2. Flujo Cruzado o Tangencial . . . . . . . . . . . . . . . . . 465 10.2 10.2.3 .3.. Te Teoría ría de la Ul Ultrafi rafiltr ltració aciónn . . . . . . . . . . . . . . . . . 466 466 10.3. Equipos de Ultrafiltración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479 10.3.1. Membranas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 480 10.3.2. Módulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481 10. 10.4. Diseño de Equipos pos de UF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485 10.4.1. Obj Objeetivo de la UF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486 10.4.2. Mecánica de Fluidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487 10.4.3. Métodos de Operación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489 10.4 10.4.4 .4.. Dis Diseeño de la Unidad idad de UF . . . . . . . . . . . . . . . . . 490 490 10.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506 10.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507 10.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 511 11.Electroforesis 513 11.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 11.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513 11.2.1 11.2.1.. Carga Carga y Pun Punto to Isoelé Isoeléctr ctrico ico de las Prote Proteína ínass . . . . . . . . 514 11.2 11.2.2 .2.. Te Teoría ría Elec lectroci rociné néttica ica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 515 515 11.2 11.2.3 .3.. Fen Fenóómeno menoss de Dispe ispers rsiión . . . . . . . . . . . . . . . . . . 523 523 11.2 11.2.4 .4.. Med Medio ioss y Modos Modos de la Elec Electr trof ofor ores esis is . . . . . . . . . . . . 528 528 11.3 11.3.. Equip quipos os de Ele Electrof rofore oresis sis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532 532 11.3.1. Equipos de Flujo Libre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532 11.3 11.3.2 .2.. Equi Equipos pos de Fluj Flujoo Lib Libre re con con Rec Recir ircu cula laci ción ón . . . . . . . . . 534 534 11.3.3. Equipos Electrocromatográficos . . . . . . . . . . . . . . . 536 11.4 11.4.. Diseñ iseñoo de Equi Equipo po de Elec Electr trof ofor ores esis is . . . . . . . . . . . . . . . . . 537 537 11.4.1. Te Teoría de Platos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 537 11.4.2. Teoría Cinética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542 11.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543 11.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544 11.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 545
V Operaciones de Acabado
CONTENIDO
547
12.Cristalización 551 12.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551 12.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553 12.2.1. Tipos pos de Cristales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553 12.2.2. Pureza de los Cristales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 554 12.2 12.2.3 .3.. Equi Equili libr brio io:: Sol Solub ubil ilid idad ad y Sob Sobre resa satu tura raci ción ón . . . . . . . . . 554 554 12.2.4. Selección del Modo de Operación . . . . . . . . . . . . . . 559 12.2.5. Cinética de la Cristalización . . . . . . . . . . . . . . . . . 560 12.2.6. 12.2.6. Distribuc Distribución ión de Tamaño amaño en Poblac Poblaciones iones de Crista Cristales les . . . 565 12.3 12.3.. Equ Equipos ipos de Crist istaliz alizaación ción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 568 12.3 12.3.1 .1.. Cr Crist istaliz alizaadore doress por por Lote Lotess . . . . . . . . . . . . . . . . . . 568 12.3 12.3.2 .2.. Cri Crist stal aliz izad ador orees Con Contin tinuos uos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 568 568 12.4 12.4.. Diseño seño de Crist ristaaliza lizaddore ores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 570 12.4 12.4.1 .1.. Cr Crist istaliz alizaadore doress por por Lote Lotess . . . . . . . . . . . . . . . . . . 571 12.4.2. Cristalizador Continuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 582 12.4.3. 12.4.3. Cristal Cristalizado izadores res Contin Continuos uos con Remoción Remoción Selectiv Selectivaa . . . . 595 12.4.4. 12.4.4. Balances Balances de Masa y Energía Energía en Cristalizad Cristalizadores ores Contin Continuos uos 597 12.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 611 12.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 612 12.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 615 13.Secado 617 13.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617 13.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617 13.2 13.2.1 .1.. Equ Equil ilibr ibrio io y Pro Propi pied edad ades es Térm Térmic icas as . . . . . . . . . . . . . 618 618 13.2.2. Métodos de Secado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 627 13.2.3. 13.2.3. Velocid Velocidad ad de Secad Secado: o: transfe transferenc rencia ia de calor y masa . . . . 628 13.2 13.2.4 .4.. Efe Efect ctos os Colat olater eral ales es del del Seca Secado do . . . . . . . . . . . . . . . 628 628 13.3. Equipos pos de Secado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630 13.3 13.3.1 .1.. Se Secador dores Adiab diabáátic ticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630 630 13.3 13.3.2 .2.. Se Secador dores no Adiabá iabáttico icos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632 632 13.4. Diseño de Secadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 634 13.4.1. 13.4.1. Diseño Diseño de Seca Secadore doress Adiabátic Adiabáticos: os: Calor Calor conv convect ectivo ivo . . . . 635 13.4.2. 13.4.2. Diseño de de Secadore Secadoress no Adiabático Adiabáticos: s: Calor conduc conductiv tivoo . . 651 13.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653 13.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 655 13.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 657
VI Diseño del Bioproceso
659
14.Análisis del Bioproceso 663 14.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663 14.2. Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663
CONTENIDO
14.2 14.2.1 .1.. Esc Escaala y Modo odo de Oper peraci ación . . . . . . . . . . . . . . . . 664 664 14.2.2. Modelo del Bioproceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 665 14.2.3. Balances de Masa y Energía . . . . . . . . . . . . . . . . . 666 14.2.4. Evaluación Económica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 666 14.3. Caso de Diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 667 14.3.1. Plásmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 667 14.3.2. Diagrama de Bloques del Bioproceso . . . . . . . . . . . . 667 14.4. Desarrollo del Diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 668 14.4 14.4.1 .1.. Des Descr cripc ipció iónn gene genera rall del del biop bioproc roces esoo . . . . . . . . . . . . . 669 669 14.4.2. Bases de Diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 669 14.4.3. Preparación del Diagrama de Flujo . . . . . . . . . . . . . 670 14.4 14.4.4 .4.. Inco Incorpo rpora raci ción ón de los los Proc Proces esos os Unit Unitar ario ioss . . . . . . . . . . 673 673 14.4.5. Especificaciones de Equipos y Corrientes . . . . . . . . . . 674 14.4.6. Bases del Análisis Económico . . . . . . . . . . . . . . . . 674 14.4.7. Simulación del Bioproceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . 675 14.4.8. Análisis de Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 677 14.5. Sumario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 679 14.6. Problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 680 14.7. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 681
Índice alfabético
682
Prefacio Actualmente, es impresionante el impacto que tiene la biotecnología en diversas áreas, particularmente en la diversificación y optimización de los bioprocesos biopro cesos para la producción de alimentos y medicamentos, lo cual permite incrementar nuestra capacidad para cubrir dos de las necesidades humanas básicas. Una parte importante de los bioprocesos, tanto desde el punto de vista económico como del técnico, la constituye constituye las operaciones de bioseparación necesarias para procesar los caldos biológicos y obtener los productos de acuerdo con las especificaciones requeridas. La motivación para realizar este trabajo traba jo se deriva deriva de nuestro nuestro convencimiento convencimiento de la importancia de la enseñanza e investigación de los principios básicos y las aplicaciones de las operaciones de bioseparación, para poder complementar los esfuerzos que se realizan en otros campos de estudio de los bioprocesos. En este sentido, es nuestra intención aportar un documento que contribuya a sistematizar y ampliar la enseñanza de las bioseparaciones. Este libro está escrito para servir de introducción al estudio de las bioseparaciones, puede ser utilizado por alumnos de los últimos semestres de carreras de biotecnología, química de alimentos, ingeniería bioquímica, ingeniería sanitaria, ingeniería en alimentos, ingeniería química o bien en los primeros cursos de programas de posgrado en el área de biotecnología o áreas afines. Este trabajo se divide en seis partes y 14 capítulos. La primera parte es una introducción a los procesos de bioseparación y a los aspectos principales de la selección de las operaciones que los integran. En las siguientes cuatro partes: Recuperación del producto, Concentración, Purificación y Acabado se abordan las principales operaciones de bioseparación siguiendo una secuencia típica de un bioproceso, tratando con ello de conservar conservar un enfoque unitario más que describir procesos particulares. La última parte del libro se relaciona con el Diseño del Bioproceso e integra los aspectos que se revisan en las partes previas. En cada capítulo dedicado a una operación determinada, se presentan los fundamentos fundamentos de la operación, los equipos comúnmente comúnmente empleados para realizarla y los principales métodos de diseño. En cada sección se incorporan ejemplos ilustrativos que se complementan con problemas de final de capítulo. En esta segunda edición que aparece 15 años después de la primera, hemos realizado un esfuerzo por mejorar y actualizar el contenido del libro. También hemos renovado la presentación de las ecuaciones y figuras del texto.
PREFACIO
Un aspecto distintivo de esta nueva nueva edición es el uso de más apoyo de programas de computación. Se han incluido en los capítulos del libro varios ejemplos resueltos y problemas propuestos utilizando Matlab. Así mismo, se introduce el uso de paquetes computacionales para el diseño de bioprocesos. Varios factores se combinaron combinaron para la publicación del presente presente trabajo. traba jo. Nuestros estudiantes han contribuido a la discusión del contenido del material de este libro y estimularo estimularonn su publicación publicación.. Sin duda un apoyo apoyo determinan determinante te para lograr este objetivo fue el que se nos brindó por parte de la Universidad de Sonora y de la Universidad de Arizona, a través de nuestros respectivos departamentos. Nuestro intercambio académico con el Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV-IPN, el Departamento de Biotecnología de la UAM-Iztapalapa y el Instituto de Biotecnología de la UNAM, motivaron y contribuyeron tribuyeron significativamente significativamente a la realización del trabajo. traba jo. Deseamos expresar un sincero agradecimiento por todos estos apoyos recibidos. Dr. Armando Tejeda Mansir Dra. Rosa Ma. Montesinos Cisneros Dr. Roberto Guzmán Zamudio
Parte I
El Proceso de Bioseparación
3 Esta primera parte del libro destaca la importancia de las bioseparaciones en los procesos para la obtención de productos biotecnológicos o bioprocesos. En el Capítulo 1 se presenta una perspectiva de las operaciones de bioseparación y sus principales características. El Capítulo 2 trata sobre los factores y metodologías que deben tomarse en cuenta para la correcta selección de un bioproceso.
Capítulo 1
Una Perspectiva de las Bioseparaciones 1.1. Introducción El cultivo de células con el objeto de obtener productos útiles, es una actividad que ha realizado el hombre prácticamente durante toda su historia. Recientemente este tipo de bioprocesos se enmarcan dentro de lo que ahora se conoce como Biotecnología. Ésta ha evolucionado a partir de los conocimientos generados en diversas disciplinas, tanto del área de las ciencias básicas como de las ingenierías. Hoy, la biotecnología puede ser definida como la aplicación de la ciencia y la tecnología en organismos vivos, así como a sus partes, productos y modelos, para modificar materiales vivos o no vivos para la producción de conocimiento, bienes y servicios (OECD, 2005).
1.1.1. Productos Biotecnológicos El mercado actual de productos biotecnológicos es del orden de miles de millones de dólares (Demain, 2007). Los bioprocesos correspondientes presentan una enorme versatilidad que involucra desarrollos basados en microorganismos, enzimas, células de mamífero, plantas y animales. Comprenden la producción de metabolitos primarios como aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, solventes y ácidos orgánicos; metabolitos secundarios como antibióticos y glicopéptidos; bioprocesos de biotransformación para producción de agentes hipocolesterolémicos, inmunosupresores, compuestos anticancerígenos y biopesticidas; y biofarmaceuticos como proteínas recombinantes (hormonas, factores sanguíneos, agentes trombolíticos, factores hematopoyéticos), vacunas, interferones, interleucinas y anticuerpos monoclonales.
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
1.1.2. Bioprocesos y Bioseparaciones Las operaciones que comprenden los bioprocesos reactivos a escala comercial (Fig. 1.1), se han dividido tradicionalmente en operaciones previas (procesos “upstream”) y operaciones posteriores o bioseparaciones (procesos “downstream”).
Figura 1.1: Operaciones de un bioproceso. a) Operaciones previas y b) Operaciones posteriores o bioseparaciones. Adaptada de: Bujurstrom, 1985. c 1985. Todos los derechos reserReproducida con el permiso de McGraw-Hill. Copyright vados.
Las operaciones previas comprenden la preparación del medio, la esterilización y el funcionamiento del biorreactor (Cooney, 1990). Los procesos de bioseparación involucran la recuperación, concentración, purificación y acabado de los productos provenientes del biorreactor. Comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para la obtención del producto en las condiciones de pureza, y actividad deseadas. Cuando el producto de interés es in-
1.2. TIPOS DE BIOPROCESOS Y BIOPRODUCTOS
7
tracelular es necesario romper las células y separar los restos celulares. En el caso de que el producto sea extracelular (o cuando las células son el producto), se requiere separar las células del caldo. Una vez obtenido el caldo de interés éste se somete a las operaciones de recuperación, concentración, purificación y acabado necesarias para obtener el producto en las condiciones necesarias. Las bioseparaciones también son muy empleadas en los bioprocesos extractivos, donde el producto de interés se obtiene directamente de sus fuentes naturales como la obtención de proteínas del plasma sanguíneo, enzimas de tejidos animales y taninos de plantas. Otro campo de aplicación de las bioseparaciones es en los bioprocesos enzimáticos para el procesamiento de los productos obtenidos, como en la obtención de jarabes fructosados. La aplicación de las bioseparaciones es muy amplia, pero los principios en que están basadas son utilizados de manera similar en los diferentes bioprocesos.
1.2. Tipos de Bioprocesos y Bioproductos Actualmente se pueden distinguir de manera general tres generaciones de bioprocesos, en relación al tipo de bioseparaciones que éstos involucran (Tabla 1.1). La primera generación comprende el conjunto de bioprocesos desarrollados mediante cultivos de organismos no recombinantes, cuyos productos se obtienen en forma activa tanto si son intracelulares o si son secretados al medio de cultivo. En esta generación se encuentran los bioprocesos de la biotecnología tradicional como los de la producción de etanol, enzimas, ácido cítrico y antibióticos. Los productos de estos bioprocesos se presentan en concentraciones altas al inicio de la etapa de separación y no requieren de una extremada pureza para su venta. Los descubrimientos asociados con la biología molecular y la ingeniería genética logrados en las últimas décadas, han ampliado las capacidades biotecnológicas del hombre. En esta etapa podemos situar una segunda generación de productos de la biotecnología como la insulina humana, la hormona de crecimiento y el alfa interferón, entre otros. Estos son producidos intracelularmente utilizando células recombinantes de Escherichia coli . Se caracterizan por encontrarse en bajas concentraciones dentro de la célula, son de elevado peso molecular, tienen propiedades similares a los contaminantes y requieren un alto grado de pureza. Además, generalmente al producirse en la célula no poseen actividad biológica por tratarse de cadenas peptídicas sin la conformación o estructura apropiada; lo que se traduce en la necesidad de aplicarles tratamientos fisicoquímicos adicionales para lograr obtener el producto en su estado activo. Los desarrollos recientes en investigaciones terapéuticas tales como el uso de DNA plasmídico (pDNA) en terapia génica y vacunas han fomentado el desarrollo de bioprocesos novedosos para la producción de pDNA a gran escala utilizando también E. coli como célula hospedera (Tejeda y Montesinos, 2008). La tercera generación de la biotecnología, la podemos caracterizar por bioprocesos mediante los cuales se obtienen productos extracelulares en células recombinantes, la mayoría de las cuales son eucarióticas. En estos sistemas se ha observado la capacidad no sólo de producir exógenamente el producto
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Tabla 1.1: Características de los Bioprocesos y los Bioproductos. Característica Período T ip o d e cé lu la s Fortaleza de las células Crecimiento Mantenimiento Conocimiento de propiedades básicas Conocimiento Tecnológico Tipo Localización Tamaño Actividad al secretarse Pureza deseada Similitud con contaminantes Valor
Primera
Generación Segunda
Tercera
- 1975 N o re co mb ina nte s Alta
1975 R ec omb ina nte s Alta
1985 R ec om bin antes Ba ja
Rápido Bajo Alto
Rápido Bajo Alto
Lento Alto Medio
Alto
Alto
Medio
Productos Antibióticos Insulina humana Aminoácidos HC Extracelular Intracelular e intracelular Intermedio Macromoléculas Sí No
Factor VIII, tPA EPO, mAb Extracelular Macromoléculas Sí
Alta Baja
Muy alta Alta
Muy alta Alta
Bajo
Alto
Alto
deseado, sino que éste se obtiene en forma activa. El factor VIII de la sangre, la eritropoyetina (EPO) estimuladora de la formación de eritrocitos, el agente trombolítico activador del plasminógeno tisular (t-PA), los anticuerpos monoclonales (mAb) para el tratamiento del cáncer y las citoquinas como los interferones α y β con actividad antiviral, son productos característicos de esta generación. Debido a su empleo con fines terapéuticos, estos productos deben ser obtenidos con un alto grado de pureza (Datar et al ., 1993). Actualmente, de 151 productos recombinantes aprobados por la FDA y la EMEA, 59 (39 %) son obtenidos en células de mamífero, 45 (29.8 %) en E. coli , 28 (18.5%) en S. cerevisiae , 17 (11.2 %) en células de hibridomas, 1 (0.67 %) en leche de cabra y 1 (0.67 %) en células de insecto (Ferrer-Miralles et al ., 2009). Varios bioprocesos tanto de la segunda como de la tercera generación pueden considerarse bien establecidos y muy eficientes. Otros se encuentran en una etapa de desarrollo que requiere ampliar el conocimiento de los aspectos fundamentales del comportamiento de las operaciones principales, para contribuir a su optimización y facilitar su validación (Asenjo y Andrews, 2008).
1.2.1. Propiedades de los Bioproductos El diseño del esquema de bioseparación de un producto dado debe tomar en cuenta la naturaleza del material inicial, la localización del producto (si el producto es intracelular o extracelular), el volumen a procesar y la concentración inicial del producto. El diseño también debe tomar en cuenta la sensibilidad del
1.3. OPERACIONES DE BIOSEPARACIÓN
9
producto a factores como la temperatura, pH, fuerza iónica, enzimas degradativas o sustancias químicas. La forma física, la pureza y los requerimientos de calidad del producto también son factores que deben ser considerados en el diseño. El conocimiento tecnológico de los procesos biotecnológicos de segunda y tercera generación es limitado. Actualmente es necesario profundizar en los métodos de escalamiento de algunas operaciones, ya que generalmente se han adaptado a escala comercial a partir del laboratorio. En el proceso de escalamiento es necesario considerar los volúmenes y normas del mercado para el producto (Null, 1987). La biotecnología ha adoptado con éxito operaciones de la ingeniería química para la purificación de productos biotecnológicos tradicionales. Sin embargo, existen limitantes para lograr ésto cuando se trata de obtener productos característicos de la segunda y tercera generación. Existe una necesidad real de desarrollar procesos de bioseparación apropiados, con la participación de ingenieros, bioquímicos y biólogos con el propósito de lograr, tanto la pureza deseada del producto, como la eficiencia y rentabilidad del mismo (Wang, 1988).
1.3. Operaciones de Bioseparación Las operaciones de bioseparación se basan en las diferencias que existen entre las propiedades fisicoquímicas de los componentes presentes en el caldo de cultivo. El objetivo del diseño de un proceso de bioseparación es explotar esta diferencia en las propiedades en la forma más económica. Generalmente existe una propiedad específica que es la base primaria para la separación. Los métodos de bioseparación usados con más frecuencia, así como la propiedad en la que se basan, se muestran en la Tabla 1.2.
1.3.1. Esquema RIPP Las bioseparaciones generalmente comprenden varias operaciones que se agrupan de acuerdo con un esquema típico en operaciones de: recuperación (remoción de sólidos y ruptura celular), concentración, purificación y acabado (RIPP de sus siglas en inglés). Esta estrategia involucra el uso de operaciones de baja resolución en la recuperación y concentración ( e.g. filtración, extracción) y operaciones de alta resolución para la purificación y el acabado (e.g. cromatografía, cristalización, electroforesis).
1.3.2. Bioproceso Típico Los bioprocesos para la producción de insulina humana están bien documentados en la literatura y permiten presentar la gran diversidad de operaciones unitarias que deben ser consideradas en las bioseparaciones (Ladish y Kolmann, 1992). La insulina es una hormona pancreática que ha sido utilizada en el tratamiento de la diabetes tipo I desde principios del siglo pasado. La
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Tabla 1.2: Operaciones de bioseparación y su propiedad básica. Tipo Recuperación Concentración Purificación
Acabado
Método (Operación) Filtración Centrifugación Rompimiento celular Extracción Adsorción Destilación Cromatografía Precipitación Ultrafiltración Ósmosis inversa Electroforesis Diálisis Electrodiálisis Cristalización Secado
Propiedad Tamaño Tamaño, densidad Estructura celular Distribución entre fases Sorción superficial Presión de vapor Depende de fase estacionaria Solubilidad Tamaño molecular Difusividad y solubilidad Carga eléctrica y movilidad Difusividad Carga eléctrica y movilidad Punto de fusión o solubilidad Temperatura, humedad
insulina está formada por las cadena pepítidicas A y B unidas por puentes disulfuro. La cadena A consta de 21 residuos de aminoácidos y la cadena B de 30. La demanda mundial de insulina en el 2006 osciló entre 7,000 y 10,000 kg/año y se proyecta que alcanzará entre 15,000 y 20,000 kg/año para el año 2012. El mercado mundial de la insulina se estima en $4,000 millones de dólares y las principales compañías productoras son Novo Nordisk, Eli Lilly y Sanofi Aventis. (Ainsworth, 2005). Al menos tres tecnologías han sido desarrolladas para producir insulina basadas en bioprocesos con células recombinantes. El Método de las dos cadenas fue desarrollado por la compañia Genetech y escalado por Eli Lilly. En este método las cadenas A y B de la insulina se producen en E. coli por separado y posteriormente se fusionan para formar la insulina recombinante. El Método de la proinsulina intracelular ha sido comercializado por Eli Lilly y se basa en la producción en E. coli de las cadenas A y B fusionadas formando un complejo llamado proinsulina que una vez procesado da lugar a la insulina recombinante. El Método de la proinsulina extracelular fue desarrollado por Novo Nordisk y se basa en la producción en S. cerevisiae de las cadenas A y B fusionadas formando un precursor que es excretado por la célula y posteriormente procesado para obtener insulina recombinante.
Método de la proinsulina intracelular En la Figura 1.2 se presentan los principales pasos para la producción de insulina por el Método de la proinsulina intracelular . Las células de E. coli sobreproducen cuerpos de inclusión (CI) formados por el complejo Trp-LE’-Metproinsulina (preproinsulina). Trp-LE’-Met es una señal peptídica de 121 residuos
1.3. OPERACIONES DE BIOSEPARACIÓN
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de aminoácidos unida a la proinsulina de 82 residuos. La proinsulina se obtiene mediante la recuperación de los CI, la solubilización de éstos y la ruptura del enlace de la señal peptídica utilizando bromuro de cianógeno (CNBr) que corta por el lado carboxílico el residuo de metionina. Dado que las cadenas peptídicas A, B y C no contienen residuos de metionina o triptófano, estas permanecen intactas. La molécula de proinsulina obtenida, se somete a replegamiento para permitir que se formen los enlaces disulfuro entre las cadenas. La proinsulina es luego sometida a sulfitolisis oxidativa para su plegamiento apropiado. Finalmente, se elimina la cadena peptídica C que une las cadenas A y B para obtener la insuluna sintética (Datar y Rosén, 1990).
Figura 1.2: Los principales pasos para la producción de insulina por el "Método de la proinsulina intracelular"se basan en la obtención de: 1) E. coli por cosecha, 2) CI por rompimiento celular, 3) preproinsulina por solubilización de los CI, 4) proinsulina por rompimiento con CNBr, 5) proinsulina-SSO3 por sulfitolisis oxidativa y 6) insulina por acción enzimática. En la Figura 1.3 se presenta el diagrama de flujo del bioproceso para obtención de insulina mediante el “Método de la proinsulina intracelular”. El diagrama completo consta de las operaciones previas y las operaciones posteriores o bioseparaciones.
Operaciones previas: Sección de fermentación Las operaciones previas del bioproceso son la preparación y esterilización del medio, la compresión y esterilización del aire, así como la fermentación (Fig. 1.3). El medio de cultivo se prepara en el tanque V-101 y se esteriliza continuamente en el equipo ST-101. El aire es provisto por el compresor G-101 y se mezcla
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Figura 1.3: Diagrama de flujo de un proceso para la producción de insulina recombinante humana (biosintética). Adaptada de Heinzle et al ., 2006. c 2006. Todos los derechos reservaReproducida con el permiso de Wiley-VCH. Copyright dos.
1.3. OPERACIONES DE BIOSEPARACIÓN
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con amoníaco, para posteriormente esterilizarse por filtración en el equipo AF101.Tanto el medio como la mezcla aire amoníaco se alimentan al fermentador V-102. Este fermentador es inoculado mediante un tren de preparación de inóculo de dos pasos (no se muestra). Al final de la fermentación se obtiene en el biorreactor un caldo celular de E. coli conteniendo los CI formados por TrpLE’-Met-proinsulina, que es bombeado a un tanque de almacenamiento donde se mezcla con una solución del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
Bioseparaciones Las bioseparaciones para la producción de insulina por el método de la proinsulina intracelular, constan de las etapas de recuperación, concentración, purificación y acabado.
Recuperación Cosecha celular El primer paso de la ruta de bioseparación consiste en la recuperación de las células por centrifugación. El caldo concentrado se envía a un tanque de almacenamiento V-106 que es la interfase entre las operaciones previas y las bioseparaciones. Este paso se realiza por medio de 3 centrífugas de disco operando en paralelo DS-101 (sólo se muestra una en el diagrama), bajo el procedimiento 9 (P-9). El lodo recuperado se diluye con una solución de EDTA en buffer TRIS en el tanque de mezclado V-109 para facilitar la separación de los CI de los restos celulares. Rompimiento celular y recuperación de CI En este caso, el producto es intracelular y se requiere el rompimiento de las células por medio de homogeneizadores de alta presión HG-101 para liberar los CI. El homogeneizado obtenido es centrifugado para recuperar los CI, utilizando las mismas centrífugas DS-101 bajo el procedimiento 13 (P-13). Los CI se recuperan en la fase pesada y la mayoría de los restos celulares quedan en la fase ligera, debido a la mayor densidad y tamaño de los CI. La fase pesada es mezclada con una solución del detergente Triton-X100 y recentrifugada en las centrífugas DS-101. Este lavado facilita la separación de los CI de proteínas solubles y restos celulares. Solubilización de CI La suspensión que contiene los CI se transfiere a un reactor recubierto de vidrio V-103, donde se hace reaccionar con urea y 2-mercaptoetanol. La urea es un agente caotrópico que disuelve las proteínas desnaturalizadas de los CI y el 2-mercaptoetanol es un agente que reduce los enlaces disulfuro. Al final de la reacción de solubilización, se reemplaza la urea y el 2-mercaptoetanol por agua para inyección (API) y se concentra la solución en la unidad de diafiltración DF-101. Las partículas finas remanentes se eliminan en el filtro DE-101 para evitar problemas en los equipos de cromatografía. Reacciones
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Rompimiento con CNBr La proteína quimérica Trp-LE’-Met-proinsulina es fragmentada utilizando bromuro de cianógeno (CNBr) en una solución de ácido fórmico en el reactor V-103, obteniéndose la proinsulina desnaturalizada y la secuencia Trp-LE’-Met. La proinsulina se obtiene intacta ya que no contiene residuos de metionina ni triptófano que son los sitios donde hidroliza el CNBr. Al final de esta reacción, el ácido fórmico, el CNBr que no reaccionó y el gas cianuro producido se eliminan en un evaporador rotatorio al vacío CSP-101. El gas cianuro es tóxico y es necesario eliminarlo en un adsorbedor con una solución de hipoclorito. Sulfitolisis La sulfitolisis de la proinsulina desnaturalizada se efectúa en el reactor V-105, adicionando hidrocloruro de guanidina (GuHCl), bicarbonato de amonio (NH4 HCO3 ), sulfito de sodio (Na2 SO3 ) y tetrationato de sodio (Na2 S4 O6 ). Esta operación se utiliza para desdoblar la proinsulina, romper los 2 enlaces disulfuros y adicionar grupos sulfito (SO− 3 ) a los residuos de azufre de las cisteínas. Este paso es necesario debido a que la proinsulina puede no estar correctamente plegada desde su síntesis o porque el tratamiento con CNBr rompe enlaces disulfuro existentes. El GuHCl previene el replegamiento de la molécula y el entreplegamiento entre distintas moléculas. Al final de la sulfitolisis la solución es diafiltrada con API en la unidad DF-101. Concentración Cromatografía de intercambio iónico La proinsulina (S-SO3 ) obtenida en el paso anterior, se hace pasar por tres columnas de intercambio catiónico de S-sefarosa (sulfopropil) C-101operando en paralelo. En la elución de la columna se utiliza una solución de urea para prevenir el replegamiento. La operación permite concentrar la solución y eliminar proteínas contaminantes. Replegamiento Esta operación permite la remoción de los grupos sulfito 2 (SO− 3 ), la formación de los enlaces disulfuro y el plegamiento correcto de la proinsulina en su forma nativa. Se realiza en el reactor V-107 e involucra una reducción con una solución diluida mercaptoetanol (MrEtOH) que facilita la formación de los enlaces disulfuro y evita entre-plegamiento. Al final del paso de replegamiento el MrEtOH se sustituye por API y se concentra la solución en la unidad de diafiltración DF-102. La solución de proinsulina obtenida se hace pasar por una columna de cromatografía de interacción hidrofófica C-102 (HIC de sus siglas en inglés), para eliminar gran parte de las proteínas contaminantes. Conversión enzimática La remoción de la cadena C de la proinsulina que conecta las cadenas A y B, se realiza enzimáticamente utilizando tripsina y carboxipeptidasa B en el reactor V-108. La tripsina rompe en el extremo carboxi entre residuos lisina y arginina. La carboxipeptidasa B remueve grupos aminoácidos terminales. La solución obtenida se lava con API y se concentra 4 veces en la unidad de diafiltración DF-102.
1.3. OPERACIONES DE BIOSEPARACIÓN
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Purificación Cromatografía de intercambio iónico La insulina se purifica mediante una secuencia cromatográfica multimodal basada en diferencias de carga, hidrofobicidad y tamaño entre la insulina y sus contaminantes. El primer paso de purificación de la solución que contiene la insulina se realiza en una columnas de intercambio catiónico de S-sefarosa C-103. En este paso se elimina gran parte de la proinsulina no convertida y de las proteínas contaminantes. Al final de la operación se lava la solución para eliminar el buffer de elución con API y se concentra la solución dos veces en la unidad de diafiltración DF-103. Cromatografía de fase reversa La purificación continúa utilizando la columna C-104 de cromatografía de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC) de ácido fenil borónico (PBA). Mediante la operación se logra eliminar las diversas proinsulinas y el resto de las proteínas contaminantes. La solución obtenida se lava con API y se concentra 2 veces en la unidad de diafiltración DF-103. Cromatografía de filtración en gel La purificación se completa en una columna de filtración en gel C-105 en donde la insulina se obtiene prácticamente pura. Al final de la operación la solución se lava con API y se concentra 10 veces en la unidad de diafiltración DF-104. Acabado Cristalización La solución obtenida se alimenta a un cristalizador enchaquetado V-111, donde se mezcla con acetato de amonio (CH3 -COO-NH4 ) y cloruro de cinc (ZnCl 2 ) . La insulina cristaliza como Zn2 -Insulina6 . Al final de la cristalización, los cristales son recuperados en una centrífuga de canasta BCF-101. Secado Finalmente, los cristales se secan en el liofilizador FDR-101. El rendimiento global del bioproceso es del 32% y la pureza de la insulina obtenida varía entre 99.5 a 99.9 %.
1.3.3. Comportamiento del Bioproceso y Calidad del Producto Las especificaciones son los estándares técnicos, regulatorios y legales que el producto debe cubrir de acuerdo a su uso. Los aspectos de rendimiento, pureza y actividad del producto son básicos para determinar la viabilidad de un bioproceso, debido a que para lograr el grado de purificación requerido en los productos biotecnológicos, generalmente el bioproceso debe realizarse en varios pasos.
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Rendimiento Las operaciones de bioseparación para un proceso deben seleccionarse cuidadosamente con el fin de que el costo sea mínimo. Es decir, si el rendimiento por paso es bajo y se requieren varias pasos, puede tenerse un bioproceso no viable económicamente debido a su aún más bajo rendimiento global. El rendimiento está dado por: Rendimiento =
cantidad de producto obtenido cantidad de producto alimentado
(1.1)
Para un bioproceso de n pasos, con un rendimiento por paso RP % , se puede establecer que el rendimiento global RG % está dado por: RG % = (RP )n
× 100
(1.2)
Ejemplo 1.1. Cálculo del rendimiento global de un esquema de bioseparación. Calcular el rendimiento global (RG %) de un esquema de bioseparación de n = 10 pasos. Cuando el rendimiento por paso (RP % ) es de: a). 60% y b). 30 % Solución: Utilizando la ecuación (1.2) se tiene: a) RG % = (0.6)10
× 100 = 0.006 × 100 = 0.6 %
b) RG % = (0.3)10
× 100 = 0.000006 × 100 = 0.0006 %
Esto significa que se requiere 1000 veces más cantidad de materia prima para lograr la misma masa de producto purificado, cuando el RP desciende de 60 a 30%. Por otra parte si el rendimiento promedio por paso fuese de 95%, el rendimiento total alcanzado sería del 60 % (Hearn y Anspach, 1990).
Ejemplo 1.2. Gráfica del rendimiento global Graficar el efecto del rendimiento por paso (RP % ) y el número de pasos (n) sobre el rendimiento global (RG %) de un bioproceso, considerando rendimientos por paso de 60%, 70%, 80%, 90%, y 95%. Solución: El programa MATLAB para la solución del ejemplo se presenta en la Figura 1.4. La Figura 1.5 muestra como varía el rendimiento global en función del número de pasos y el rendimiento por paso. El rendimiento global aumenta conforme se disminuye el número de pasos de procesamiento y se aumenta el rendimiento por paso.
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1.3. OPERACIONES DE BIOSEPARACIÓN
Figura 1.4: Programa MATLAB para la solución del Ejemplo 1.2.
Pureza La pureza necesaria y actividad generalmente están definidos por agencias reguladoras como la FDA de acuerdo al uso que se le va a dar al producto. En el caso de productos para uso parental en humanos la pureza requerida es mayor al 99.5% generalmente. La pureza está dada por: Pureza =
cantidad de producto cantidad total
(1.3)
Actividad específica Una medida de la pureza de un producto es la actividad específica que está dada por: unidades de actividad biológica (1.4) masa Ejemplo 1.3. Estimación del rendimiento y la pureza y de una enzima en un proceso de purificación. En el desarrollo de un bioproceso para la obtención de una enzima a partir de E. coli , se sabe que la bacteria tiene un 80 % de humedad y que el 60 % de su peso seco es proteína. El proceso de purificación de la enzima consta de 4 pasos (Fig. 1.6). Actividad específica =
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Figura 1.5: Representación gráfica del rendimiento global de un proceso de purificación de un producto biotecnológico en función del rendimiento por paso y el número de pasos. Fuente: Hearn y Anspach, 1990. Reproducida reservados.
con el permiso
c 1985. Todos los derechos de Marcel Dekker Inc. Copyright
En la tabla siguiente se presenta la cantidad de enzima y de proteína total al final de cada paso.
Paso Romp. celular Precipitación Inter. iónico Cromat. gel
Proteína Enzima Fracción total (g) total (g) enzima ×103 12.000 0.080 6.667 1.800 0.060 33.333 0.240 0.048 200.000 0.036 0.036 1000.000
Se pide: Obtener el factor de purificación de la enzima en cada paso, el rendimiento por paso y el rendimiento global. Solución: El factor de purificación, el rendimiento por paso y el rendimiento global del proceso se presentan junto con los datos del problema en la tabla siguiente:
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1.3. OPERACIONES DE BIOSEPARACIÓN
Figura 1.6: Proceso hipotético de cuatro pasos para la purificación de una enzima.
Paso Romp. celular Precipitación Inter. iónico Cromat. gel
Prot. tot. (g) 12.000 1.800 0.240 0.036
Enzima tot. (g) 0.080 0.060 0.048 0.036
Fracción enz. 103 6.667 33.333 200.000 1000.000
×
Factor de purific. 1 5 30 150
% Rendimiento Por etapa Global 100 100 75 75 80 60 75 45
a) El factor de purificación se obtiene mediante el cociente de la fracción de enzima en cada paso, entre la fracción de enzima inicial. b) El rendimiento en cada paso está dado por el cociente de la cantidad de enzima total obtenida en cada paso, entre la cantidad total de enzima al inicio del paso. c) El rendimiento global al final de cada paso está dado por el cociente de la cantidad de enzima total obtenida en ese paso entre la cantidad total de enzima inicial.
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
GMP La obtención de un producto biotecnológico debe realizarse conforme a las prácticas de buena manufactura para la industria (GMP de sus siglas en inglés), para los métodos, instalaciones y controles utilizados para la fabricación, procesamiento, empaque o manejo de una sustancia, para asegurar que ésta cumpla con los requerimientos de acción segura, y que presente la identidad y fuerza, y cumpla con las características de calidad y pureza que pretende o represente tener (L K Biosciences, 2009). Todos los procedimientos deben mantenerse dentro de los límites especificados en los reportes de validación de la empresa, para poder demostrar la reproducibilidad de la operación y la calidad del producto final. En el contexto de la bioseparaciones, los procesos de validación comprenden todos los pasos críticos del proceso, especialmente las operaciones con membranas y las operaciones cromatográficas, particularmente las empleadas para remover bacterias y virus contaminantes (Kalyanpur, 2002).
Instalaciones Debido a que la mayoría de los bioprocesos requieren control microbiológico, las instalaciones deben ser diseñadas bajo las normas apropiadas (HVAC), con gradientes positivos de presión de aire y entradas seguras para el personal. Las operaciones secuenciales deben estar próximas una a la otra (proximidades de proceso) para minimizar tiempos y costos. Es recomendable la segregación de las etapas del bioproceso para prevenir la contaminación. El grado de segregación depende del número de productos de la planta.
1.4. Importancia Económica de las Bioseparaciones La obtención de productos a partir de materiales biológicos generalmente requiere operaciones de bioseparación apropiadas que son costosas y pueden ser el factor limitante en el desarrollo del bioproceso (Rito-Palomares, 2008). Esto es debido principalmente a la baja concentración de producto en los caldos que entran al proceso de bioseparación y a la alta pureza requerida por la mayoría de los productos finales (Woodley et al ., 2008). Frecuentemente, la parte correspondiente a las bioseparaciones puede representar hasta un 60 % del costo total de producción sin considerar las materias primas (Kalk, 1986). Debido a lo anterior, existe una relación inversa entre el precio de venta de un producto biotecnológico y la concentración de éste en el caldo del biorreactor (Fig. 1.7). Es obvio que no sólo la concentración del producto en el fermentador determina el precio, también deben ser consideradas la escala, la productividad y el rendimiento global de la recuperación. Puede decirse entonces que el éxito comercial de un proceso biotecnológico depende en gran medida de la adecuada
1.5. COMERCIALIZACIÓN DEL BIOPRODUCTO
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selección del esquema de bioseparación, particularmente conforme el margen de utilidad (precio-costo) disminuye.
Figura 1.7: Relación entre la concentración inicial del producto en el caldo y el precio final de venta del producto. Fuente: Dwyer, 1984. c 1984. Todos los derechos Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright reservados.
1.5. Comercialización del Bioproducto El desarrollo sustentable de un proceso biotecnológico para la obtención de un producto de interés comprende varios aspectos, principalmente los ambientales y sociales relacionados con su impacto en la población, los económicos relacionados con el mercado y los técnicos que involucran el diseño del bioproceso. El estudio de mercado permite evaluar el potencial económico o social del proceso y es requisito indispensable para la formulación del proyecto a desarrollar. Por ejemplo, aún cuando la factibilidad técnica de un proceso dado pueda ser atractiva, el valor esperado del producto pudiera no justificarlo (Knight, 1990). El tiempo de desarrollo de un producto biotecnológico es largo y puede comprender varios años en condiciones normales. Desde el punto de vista técnico el escalamiento del proceso pasa de la escala de laboratorio de mg, a la escala piloto de g y finalmente a la escala productiva de kg. Cuando es necesario, las pruebas del producto pasan por las fases clínicas I, II y III, paralelamente.
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
1.5.1. Desarrollo del Bioproceso El diseño del bioproceso comprende todo el trabajo conceptual necesario que debe realizarse antes de la construcción o modificación de una planta de proceso. Este trabajo debe ser completo y cuidadoso, de tal manera que permita desarrollar y evaluar varios esquemas de operación con el propósito de aproximarse al diseño óptimo, bajo las restricciones presupuestales establecidas (Kelly, 1987). El diseño del bioproceso se realiza utilizando metodologías ingenieriles básicas como la síntesis y el análisis del proceso. La síntesis del proceso es la selección del esquema del proceso o diagrama de flujo que permita producir el producto de interés a un costo y calidad aceptables. El análisis del proceso consiste en evaluar y comparar diferentes esquemas obtenidos mediante la síntesis.
1.5.2. Diseño Interior El concepto de diseño interior (design in ) ha sido recomendado para ahorrar costos y tiempo en el escalamiento de un bioproceso (L K Biosciences, 2009). En este enfoque se propone considerar los aspectos relacionados con la seguridad, robustez, GMP, adaptabilidad, restricciones y acceso al mercado, desde los trabajos a escala de laboratorio. Partiendo de que la normatividad del proceso define al producto, en este enfoque se recomienda la integración de un paquete de transferencia tecnológica que comprenda la documentación de la justificación del proceso, el diagrama de flujo, la lista de materias primas, la descripción de las operaciones unitarias, las especificaciones y criterios de aceptación, los datos de lotes, el protocolo del proceso, la descripción de los métodos analíticos, el reporte de la caracterización del proceso y el reporte del desarrollo (Tabla 1.3). Tabla 1.3: Conceptos para la integración de un paquete biotecnológico. CONCEPTO Diseño del proceso Línea celular Materias primas Diagrama de flujo Operaciones unitarias Sustancia Producto Control del proceso Control de calidad Métodos analíticos Carac. proceso Pruebas del proceso
DESCRIPCIÓN Análisis ingenieril: escalabilidad, costos, rendimiento, facilidad de implementación, robustez Descripción y status del banco de células Lista y justificación Diagrama y plan de muestreo Documentación de corridas y protocolo Pureza, composición, justificación y almacenamiento Formulación, justificación y almacenamiento. Lista de análisis de control Especificaciones, criterios de aceptación y manual Demostración de la aplicabilidad de los métodos Rangos aceptables probados y parámetros críticos Datos de varios lotes de laboratorio
1.6. TENDENCIAS EN BIOSEPARACIONES
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1.6. Tendencias en Bioseparaciones En la era de la genómica funcional y la biología de sistemas, la obtención de bioproductos ha evolucionado cada vez más hacia el uso de estrategias más sistemáticas que las usadas previamente. El análisis integral del fenómeno celular está siendo utilizado para reprogramar células a nivel molecular para mejorar los bioprocesos. La manipulación genética y su análisis subsecuente, se ha combinado con estrategias ingenieriles para el diseño de estos bioprocesos (Fig. 1.8). El enfoque comprende una primera etapa para la obtención de la cepa modificada base, una segunda etapa de ingeniería de la cepa modificada base utilizando HTA (High throughput analysis) y simulación in silico, además de una tercera etapa de diseño del proceso fermentativo y las bioseparaciones (Park et al ., 2008). El enfoque HTA también está siendo utilizado en esta última etapa para la optimización de operaciones como la cromatografía (Wiendahl et al ., 2008). La tecnología de análisis de proceso (PAT) ha sido recomendada por la FDA como un sistema para diseñar, analizar, y controlar el bioproceso mediante mediciones de atributos críticos de calidad y comportamiento de materias primas, materiales en proceso, y procesos; con el objetivo de asegurar la calidad final del producto (Känsäkoski et al ., 2006). Es importante hacer notar que el término análisis es general e incluye los análisis químicos, físicos, microbiológicos, matemáticos y de riesgo de manera integrada. El objetivo de la PAT es mejorar el entendimiento y control del proceso de fabricación, que es consistente con el objetivo de los actuales sistemas de control de calidad: la calidad no se prueba en los productos, ésta debe ser inherente al producto o debe estar presente por diseño (FDA, 2004).
En varios casos, este enfoque biológico combinado con estrategias ingenieriles de optimización ya ha producido un mejoramiento considerable de varios bioprocesos. Uno de los ejemplos más promisorios es la producción de anticuerpos terapéuticos en células de mamíferos donde se han alcanzado concentraciones de más de 10 g/L en el proceso fermentativo. Esta tendencia plantea nuevos retos en el diseño de las bioseparaciones para aprovechar las altas concentraciones obtenidas, ya que las operaciones convencionales como la cromatografía que se caracterizan por su baja capacidad volumétrica, es muy probable que se conviertan en cuello de botella de las bioseparaciones (Flaschel, 2008). En este sentido, algunas operaciones tradicionales como la extracción y las operaciones híbridas como la cromatografía en columnas de membranas están siendo consideradas para cubrir este tipo de procesos (Gottschalk, 2008). En el caso de productos intracelulares, éstos demandan técnicas novedosas de liberación selectiva como una forma posible de mejorar la eficiencia de las bioseparaciones involucradas (Balasundaram et al ., 2009). Las aplicaciones clínicas de los desarrollos biotecnológicos también impactarán los procesos de bioseparación. La tecnología de las células troncales requerirá métodos de cosecha apropiados para el procesamiento de este tipo de biomasa. Las vacunas de DNA y la terapia génica ya estimulan el desarrollo de bioseparaciones apropiadas, que presentan particularidades que las hacen diferentes a los esquemas de las proteínas (Haynes, 2004). En cuanto al proceso, los equipos
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
Figura 1.8: Desarrollo de nuevos bioprocesos. a) Obtención de la cepa modificada base, b) Ingeniería de la cepa modificada base utilizando HTA y simulación in silico y c) Diseño de la etapa fermentativa y de bioseparaciones. Adaptada de Park et al., 2008. c 2009. Todos los derechos reservados. Reproducida con el permiso de Elsevier. Copyright
1.7. SUMARIO
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y accesorios desechables representan una alternativa cada vez más económica en las bioseparaciones debido al ahorro en costos de limpieza y de validación de los procesos (Rao et al ., 2009). Hoy, los bioprocesos bien establecidos pueden utilizar modelos matemáticos en la optimización y simplificación de la validación de operaciones de bioseparación como la cromatografía. Este enfoque será extendido a más procesos y procedimientos experimentales (Asenjo y Andrews, 2008). La simulación será cada vez más utilizada en el desarrollo inicial de un concepto, en el diseño del proceso o en la operación de una planta. Esto involucra la elaboración de diagramas de flujo, balances de masa y energía, dimensionamiento de equipo y costos de capital y operación. Varios paquetes computacionales comerciales están disponibles para realizar estas tareas como SuperPro Designer y ASPEN. Algunos desarrollos recientes sobre el uso de modelos en bioprocesos son del área de dinámica computacional de fluidos (CFD), principalmente para el estudio de tiempos de residencia y mezclado en equipo de proceso. El comportamiento de algunos esquemas de bioseparación frecuentemente es muy dependiente de algunas operaciones unitarias claves como la extracción y la cromatografía. La modelación y simulación de estas operaciones puede ayudar a reducir tiempos y costos en el desarrollo y operación de los bioprocesos. Para realizar este tipo de simulaciones es frecuente utilizar paquetes y programas como Matlab, Mathcad y Fortran (Gosling, 2005).
1.7. Sumario Los procesos de bioseparación involucran operaciones de recuperación, concentración, purificación y acabado de productos provenientes del biorreactor. Las bioseparaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para obtener un producto biotecnológico en las condiciones de pureza y actividad requeridas. La sustentabilidad de los procesos biotecnológicos depende en gran medida de las operaciones de bioseparación que involucran, de tal manera que la correcta selección y diseño de estas operaciones tiene un fuerte impacto en el éxito del proceso.
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CAPÍTULO 1. UNA PERSPECTIVA DE LAS BIOSEPARACIONES
1.8. Problemas 1.1. Análisis comparativo de esquemas de bioseparación. Efectuar un análisis comparativo, en relación a las operaciones de separación que utilizan, de los procesos para la producción de ácido cítrico, penicilina e insulina. 1.2. Cálculo de párametros del comportamiento de un bioproceso. Un proceso para la recuperación de hidroxibutirato deshidrogenasa consta de tres pasos: Un rompimiento de las células para liberar la enzima intracelular, seguido de dos pasos de adsorción/desorción por afinidad. En la tabla siguiente se presentan los datos obtenidos de actividad de enzima y proteína total al final de cada paso. Se pide: Calcular la actividad específica, el factor de purificación y el % de rendimiento. Paso Rompimiento Ads/Des (1) Ads/Des (2)
Actividad Total (Unidades) 6,860 6,800 5,380
Proteína Total (mg) 76,200 2,200 267
A Esp.
F Purif.
Rend.
1.3. Análisis de purificación. Completar la siguiente tabla relacionada con la purificación de una enzima: Vol. Material
ml
Conc. prot. mg/ml
P rot. total mg
Act. enzim. U/ml
Act. total U
Extracto
1500
12.0
20,000
1er. paso
550
11.0
16,940
2do paso
125
4.5
14,387
Act. esp. U/mg
Rend. Etapa Total
Fac. purif.
1.4. Precio y costo. En un proceso biotecnológico que se encuentra en desarrollo para producir una enzima, se obtiene una concentración de 0.1 mg/ml de la enzima en el caldo inicial. A los proyectos de la empresa se les exige un margen sobre ventas del 50 % (MSV = Precio - Costo). Se pide: Estimar el costo de producción máximo del producto utilizando la Figura 1.7. 1.5. Esquema de bioseparación de pDNA. Se requiere diseñar un proceso para producir plásmidos de DNA (pDNA) purificados, a partir de cultivos de E. coli . Los pDNA se producen dentro de las células, en forma de DNA circular cerrado superenrollado, son de tamaño mucho menor al genoma bacteriano,
1.8. PROBLEMAS
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pero mucho más grandes que las proteínas. Su peso molecular es de 3,000 kDa y a un pH = 8.0 su carga externa es muy negativa debido a los grupos fosfatos. Para la producción del plásmido se cuenta con los siguientes equipos: a) Una columna de inercambio catiónico. b) Una columna de intercambio aniónico. c) Una centrífuga para cosechar células. d) Una columna cromatográfica de SEC que retiene moléculas de peso molecular menor a 100 kDa. e) Un equipo de choque osmótico para romper células. f) Una unidad de ultrafiltración. Se pide: Diseñar un esquema de bioseparación del plásmido.
1.6 Rendimiento. En una operación de ultrafiltración/diafiltración se procesan 120 L de una solución eluída de una columna de Q Sefarosa, que tiene una concentración de proteína de 1.9 mg/mL. La solución concentrada (retenido) ocupa un volumen de 30 L y tiene una concentración de 7.4 mg/mL. Se pide: Calcular el rendimiento de la etapa. Resp. 97 %