UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR Facultad de Ciencias Químicas Carrera de Química Laboratorio de Electrouímica Nombre! Carla Nombre! Carla Coba "ro#ecto de Laboratorio $% Tema! Elaboración Tema! Elaboración de un biosensor de dopamina &% Ob'eti(o! •
Elaborar un biosensor para dopamina a partir de la cáscara de plátano
)% Fundamento te*rico! Biosensor Un biose biosenso nsorr se pued puede e defin definir ir como como un dispo disposit sitivo ivo compu compuest esto o por por dos dos elemen elementos tos fundamen fundamentale tales: s: un recepto receptorr biológic biológico o preparad preparado o para detectar detectar específi específicame camente nte una sustancia aprovechando la exquisita especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sensor, capa de interpretar interpretar la reacción de reconocimiento biológico que produce el receptor y !traducirla! en una se"al cuantificable# $os dos constituyentes del biosensor están integrados con%untamente y es precisamente esta íntima unión de dos mundos opuestos &el !vivo! y el !inerte!' la que le confiere a los dispositivos biosensores sus especiales características de sensibilidad y selectividad# (rente (rente a ellas ellas los biosen biosensor sores es ofrec ofrecen en la posib posibili ilida dad d de obten obtener er medida medidas s direc directa tas, s, continuas, de forma rápida y con alta sensibilidad# )uchos biosensores ofrecen tambi*n las venta%a venta%as s del peque" peque"o o tama"o tama"o y la portabil portabilidad idad,, por lo que se podrían podrían utiliar utiliar en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del m*dico# Esto además significa que la cantidad de muestra para hacer el análisis es relativamente ba%a &de micro a micro a nanolitros', nanolitros ', lo que es muy importante si se trata de análisis de sangre o de +- o si la muestra es cara o difícil de conseguir# &.nstituto de )icroelectrónica de )adrid' Determinación de dopamina $a dopamina o + &/0&10aminoetil' benceno02, 10diol' es una catecolamina biog*nica de origen origen natural natural,, formada formada por la descarbo descarboxila xilación ción de 3, /0dihid /0dihidroxif roxifenil enilalan alanina ina # Es un precursor a la epinefrina y la norepinefrina norepinefrina en una ruta biosint*tica, biosint*tica, que funciona como un neuro neurotra trans nsmis misor or en los los siste sistemas mas nervi nervioso osos s centra centrall y perif perif*ri *rico co # $a concen concentra tració ción n insuficie insuficiente nte debido debido a la p*rdida p*rdida de c*lulas c*lulas productor productoras as de + puede puede dar lugar a una enfermedad llamada enfermedad de 4ar5inson en el que una persona pierde la capacidad de e%ecutar movimientos suaves y controlados # + se puede suministrar como una medicina, sin embargo su exceso de dosificación puede actuar sobre el sistema nervioso simpático, que causa una tasa de incremento de enfermedades del coraón y aumento de la presión arterial#
4ocos m*todos basados en la modificación química de materiales de los electrodos tradicionales han sido reportados para la determinación de + &por e%emplo , la determinación electroquímica de + en presencia de ácido ascórbico usando micelas de dodecil sulfato de sodio como agente de enmascaramiento , 16 poli0cromotropo modificado electrodo de 7C, -afion &película de material compuesto de hierro revestida de carbono en un electrodo modificado con nano partículas de quitosano', electrodo modificado con una película híbrida 4t8+u, electrodo modificado con películas de nano partículas de oro auto0ensambladas y pasta de carbono con películas de polipirrol8ferrocianuro # 9in embargo, la mayoría de estos m*todos se enfrentan a la oxidación de las biomol*culas en el electrodo, el ensuciamiento del electrodo &debido a la adsorción de los productos de oxidación', la se"al analítica inestable, requiere alta sobre potencial, límite de detección alta, una respuesta lenta y sobre todo son comple%os# &6a5hsh aoof ;
Polifenol oxidasa $a 4olifenol oxidasa, 44>, es una de las enimas mas estudiadas en la industria de los alimentos ya que es la responsable de las reacciones de pardeamiento enimático en frutas y verduras# Una de las raones por las cuales es importante su estudio es porque comercialmente es indeseable, ya que modifica las propiedades sensoriales, nutricionales y en general de calidad que per%udica la comercialiación de un producto# El banano que pertenece al g*nero )usa, con sus innumerables variedades, es una fruta tropical de importancia comercial que sufre cambios en su textura, color a trav*s del proceso de maduración# $os cambios asociados a la maduración como bioquímicas, fisiológicos y de composición y el ablandamiento de los plátanos se han estudiado y reportado ampliamente durante las distintas fases de desarrollo en las cuales la polifenol oxidasa cumple un papel importante# &7uerrero Eraso, 1==?'
El primer plano del sitio activo de la polifenol oxidasa muestra que utilia seis aminoácidos para quelar dos iones de cobre# Estos son histidinas, que tienen un grupo cíclico polar con átomos de nitrógeno con electrones no compartidos para proporcionar el poder quelante# Una de ellas se caracteria porque está conectada por un enlace sulfuro a una cisteína en otra parte de la proteína# El diagrama muestra tambi*n el átomo de oxígeno de una mol*cula de agua a los asociados con los iones de cobre en el sitio activo# >tra característica a tener en cuenta es la forma en que los iones de cobre en el sitio activo son en un bolsillo con dos lados que tienen los quelantes de histidina a partir de dos lugares distantes de la secuencia primaria# &4lant 4hysiology .nformation @ebsite, 2??A' +% ,etodolo-ía e./erimental Materiales y reactivos ,ateriales 4untas de micropipetas +lambre de cobre rígido B/ +lambre de cobre delgado $agartos +daptadores 4istola de silicona
Reacti(os opamina &hidroclorato' 1== mg Cáscara de plátano 9oluciones buffer de p conocido +gua destilada
Equipo )ultímetro marca Druper Procedimiento 4reparación de los microelectrodos • • •
Cortar dos pedaos de alambre de cobre rígido B/ de aproximadamente 2 cm $i%ar los alambres y limpiarlos con un algodón empapado ligeramente de alcohol En cada una de las puntas de micropipeta, colocar uno de los alambres hasta que atraviese la punta de la micropipeta e inmoviliar con silicona
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4ara el electrodo de referencia, colocar una peque"a cantidad de algodón en el extremo más peque"o de la punta de micropipeta y llenarla con agua destilada, colocar uno de los alambres preparados anteriormente dentro de esta punta y cerciorarse de que no exista fuga de líquido# .nmoviliar el electrodo con silicona y colocarlo en un soporte# 4ara el electrodo de traba%o, colocar una peque"a cantidad de la parte interna de la cáscara de plátano en el extremo más peque"o de la punta de micropipeta, colocar uno de los alambres preparados anteriormente dentro de esta punta y cerciorarse de que la punta del alambre y el interior de la cáscara de plátano hagan contacto# .nmoviliar el electrodo con silicona y colocarlo en un soporte#
Calibración del electrodo de referencia •
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Domar el electrodo de referencia y colocarlo %unto a otro pedao de alambre de cobre li%ado dentro de un tubo eppendorf que contenga una solución buffer de p / epetir el proceso con las soluciones buffer de p F y p 2= ealiar una curva y determinar la correlación del microelectrodo
4reparación de la curva de calibración de dopamina •
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4reparar estándares de concentración conocida a partir de la dopamina de 1== mg aforada a 1 m$ eterminar el potencial de cada solución Draar la curva respectiva
eterminación de una muestra de concentración desconocida
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eterminar el potencial de la muestra .nterpolar el dato de potencial en la curva de calibración +notar los resultados obtenidos
0% Re-istro de datos e./erimentales Calibración del electrodo /1 /,== F,=2 2=
V =,=/ = 0=,=F
C 2m-3 1== 2== = 1 2 = ,uestra
V 2mV3 A,/3 1,A? =,FF =,1? 0=,2 0=,=A =,2F
Curva de calibración de dopamina
G# Cálculos y resultados Gráfico de la curva de calibración del microelectrodo de referencia
Calibración del microelectrodo de referencia 0.05 f(x) = - 0.02x + 0.12 R² = 0.98
0 3
Potencial (V)
4
5
6
7
8
9
10
-0.05 -0.1
pH Calibración dl !icr"lc#r"d" d rfrncia $inar (Calibración dl !icr"lc#r"d" d rfrncia)
11
Gráfico de la determinación de dopamina
Determinación de dopamina 10 f(x) = 0.04x - 0.63 R² = 0.97
5 Potencial (mV) 0 -5
0
50
100
150
200
250
Concentración dopamina (mg) %#r!inación d d"&a!ina $inar (%#r!inación d d"&a!ina) '#ra
Cálculo aproximado de la concentración de dopamina en la muestra "otencial4=#=/1C0=#G1?3
C =
0.17 mV + 0.6293 mV 0.0425
mV mg C42A#A2 mg
5% Obser(aciones •
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$a parte blanca de la cáscara, ubicada dentro del microelectrodo, se tornaba marrón claro al cabo de dos determinaciones 9e reemplaó la cáscara de plátano, una ve que esta se tornaba marrón $a punta de cobre del electrodo de referencia se tornó ligeramente oscura luego de las determinaciones
6% Conclusiones • •
9e elaboró un biosensor de dopamina a partir de la cáscara de plátano 9e determinó la concentración de una muestra de dopamina desconocida, correspondiente a 2A#A2 mg
7% Discusiones •
$a polifenol oxidasa traba%a de manera apropiada a un p de F por lo que se debe controlar este factor si se quiere que el biosensor traba%e apropiadamente
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4uede existir interferencia de iones cobre con el centro reactivo del biosensor, por lo que se recomienda elaborar este tipo de microelectrodos con grafito &@ang ; 9hang $in, 2?AA' El índice de correlación del biosensor no es apropiado debido a que estos equipos deben tener una alta sensibilidad a lo largo de las determinaciones El reemplaar la cáscara de plátano a medida que se realiaron las determinaciones ayudó a que el biosensor no se saturase y las determinaciones no se vieran afectadas 4ara elaborar este tipo de biosensores se debe inhibir las enimas de inter*s para evitar su rápida degradación y prolongar el uso del biosensor + pesar del índice de correlación aceptable, este biosensor no es de gran utilidad debido a que se debe reemplaar la cáscara de plátano con demasiada frecuencia y eso supone molestias para el analista y aumento del error
$8% 9iblio-ra:ía •
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6a5hsh aoof, H#, ;
