biorremediação de btex

Alessandra Abrão Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAÇÃO BACTERIANA DOS COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMÁTICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Belo Horizonte 2007

Alessandra Abrão Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAÇÃO BACTERIANA DOS COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMÁTICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Monografia apresentada ao Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como  parte dos requisitos para obtenção do título de Especialista em Microbiologia Ambiental e Industrial.

ORIENTADORA: Profª. Vera Lúcia dos Santos

Belo Horizonte 2007

Alessandra Abrão Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAÇÃO BACTERIANA DOS COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMÁTICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Monografia apresentada ao Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como  parte dos requisitos para obtenção do título de Especialista em Microbiologia Ambiental e Industrial.

ORIENTADORA: Profª. Vera Lúcia dos Santos

Belo Horizonte 2007

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por sempre iluminar meus caminhos e pela proteção nos momentos difíceis. A minha mãe Neuza, meu pai Welington e irmãzinha Dani, por todo apoio, carinho e amor de uma vida. Sem eles, nada disso teria sido possível. Aos avós, padrinhos, tios e primos, por  sempre terem acreditado em mim e por todo o amor e mimo de sempre. Ao Lorenzo e às amigas queridas, Taty, Carolinas (Little e Degol´s), Fabi, Nana, Bia, pelo amor e compreensão, principalmente nos momentos de ausência, pela força, nos momentos mais difíceis. Obrigada por fazerem minha vida mais rep leta de alegria. A minha orientadora, Profa. Vera Lúcia dos Santos, agradeço pela orientação e incentivo a  percorrer novos caminhos, e aos demais professores do curso de Especialização, Especialização, pela contribuição para minha formação, pela paciência e dedicação. A todos os colegas do curso de Especialização, em especial, Lúcia, Cléber, Vivi e Léo, por  terem tornado as sextas e sábados de estudo momentos menos árduos. Obrigado pela ótima convivência, amizade e cooperação. Aos colegas do Laboratório de Saúde Pública / Água e do FAS, pela alegria do dia-a-dia e  pela compreensão e apoio nos nos momentos de sufoco. A Universidade Federal de Minas Gerais pela bolsa de estudo, tornando possível a concretização de mais uma etapa da minha vida profissional. A todos que de alguma forma contribuíram para que este momento fosse possível, meu muito obrigado.

RESUMO RESENDE, A.A. (2007)  Mecanismos gerais de degradação bacteriana dos compostos hidrocarbonetos monoaromáticos: benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX). Belo

Horizonte, 2007. Monografia (Especialização), Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.

Os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) são hidrocarbonetos monoaromáticos, cuja origem no meio ambiente, em geral, está relacionada às atividades de extração e refino de petróleo e derivados. Tais compostos são contaminantes comuns de solos e águas, entretanto, devido à elevada toxicidade e caráter mutagênico e carcinogênico a seres humanos, fauna e flora locais, vários esforços têm sido feitos para desenvolver estratégias de sua remoção do meio. A biorremediação, como método de remoção destes hidrocarbonetos aromáticos, tem sido alvo de muitas pesquisas há mais de meio século. Consequentemente, o entendimento dos mecanismos de biodegradação desses compostos orgânicos tem sido aprimorado desde então. É de conhecimento que os BTEX podem ser biodegradados, servindo como fonte de carbono e energia para os microrganismos, sob condições aeróbias e anaeróbias, incluindo neste último caso condições nitrificantes, ferro e sulfato-redutoras. Na degradação bacteriana desses compostos, sob ambas as condições, podem ser observadas duas vias distintas: uma inicial, que leva à formação de intermediários centrais comuns, entre eles o catecol e o benzoil-CoA; e uma segunda, que promove a transformação dessas moléculas em metabólitos centrais que possam ser utilizados pela célula. Os genes que codificam as enzimas relacionadas às vias de degradação dos BTEX estão sob constante regulação por proteínas específicas moduladas por substratos e intermediários das vias e por mecanismos de regulação globais, permitindo uma resposta coordenada ao estado fisiológico e metabólico da célula. O entendimento das vias de degradação dos BTEX, de sua genética e seus mecanismos de regulação gerais é de grande relevância para o avanço das técnicas de biorremediação. Sendo assim, este trabalho se propõe a fazer uma revisão das principais vias de degradação  bacteriana dos hidrocarbonetos monoaromáticos do grupo BTEX descritas na literatura, bem como dos aspectos relacionados citados anteriormente, e sumarizar brevemente algumas de suas aplicações biotecnológicas em processos de biorremediação e potenciais implicações ambientais.

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 01 2 DESENVOLVIMENTO ............................................................................................. 03 2.1 Os BTEX e suas principais fontes .................................................................................. 03 2.2 Tratamento de sítios contaminados ............................................................................... 06 2.2 A BIODEGRADAÇÃO DOS COMPOSTOS BTEX ................................................................... 08 2.2.1 As bactérias como agentes da degradação dos compostos BTEX ..................... 08 2.2.2 As vias de degradação bacteriana dos BTEX ...................................................... 12 2.2.2.1 Vias aeróbias de biodegradação do BTEX ..................................................... 13 2.2.2.1.1 Etapas iniciais de degradação aeróbia dos BTEX ..................................... 14 2.2.2.1.2 Oxidação dos intermediários centrais da degradação aeróbia dos BTEX ..19 2.2.2.2 Vias anaeróbias de biodegradação do BTEX .................................................. 21 2.2.2.2.1 Etapas iniciais de degradação anaeróbia dos BTEX ................................. 23 2.2.2.2.2 Oxidação dos intermediários centrais da degradação anaeróbia dos BTEX ................................................................................................................................... 28

2.2.3 Mecanismos de regulação enzimática das vias catabólicas relacionadas à degradação bacteriana dos BTEX ................................................................................ 29 2.3 A BIORREMEDIAÇÃO COMO ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE ÁREAS CONTAMINADAS POR BTEX ................................................................................................... 36 2.3.1 Técnicas de estudo de microrganismos com potencial aplicação em processos de biorremediação ................................................................................................................ 37 2.3.2 Exemplos de processos de biorremediação em diferentes ambientes contaminados por BTEX ................................................................................................ 40 2.4 PERSPECTIVAS QUANTO AO USO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA CONSTRUÇÃO DE LINHAGENS COM AMPLA CAPACIDADE DE DEGRADAÇÃO ...................................................... 42

3 CONCLUSÃO ............................................................................................................... 44 4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 46

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estruturas químicas das moléculas dos compostos BTEX. ................................... 03 Figura 2 – Ataque inicial do benzeno por oxigenases ............................................................ 14 Figura 3 - Reações envolvidas na primeira etapa das vias de degradação aeróbia de tolueno.16 Figura 4 – Primeira etapa da via de degradação aeróbia do etilbenzeno..................................18 Figura 5 – Primeira etapa da via de degradação aeróbia do meta-xileno .................................18 Figura 6 – Degradação do catecol, intermediário comum das vias de degradação dos BTEX,  pelas vias de orto e meta clivagem............................................................................................20 Figura 7 – Desenho esquemático da utilização microbiana dos hidrocarbonetos aromáticos, evidenciando o rendimento energético do metabolismo aeróbio ou anaeróbio da molécula, em função do aceptor de elétrons utilizado.....................................................................................22 Figura 8 – Potenciais reações iniciais da via de degradação anaeróbica do benzeno: carboxilação, metilação ou hidroxilação, com seus respectivos produtos, benzoato, tolueno e fenol ........................................................................................................................................ 24 Figura 9 - Primeira etapa da via de degradação anaeróbia do tolueno .................................... 25 Figura 10 – Etapas iniciais da via de degradação anaeróbia do etilbenzeno .......................... 26 Figura 11 – Etapas iniciais das vias de degradação das moléculas m-xileno e o-xileno ........ 27 Figura 12 – Esquema da via de degradação anaeróbia do intermediário central comum das vias: benzoil-CoA ................................................................................................................... 28 Figura 13 – Esquema ilustrativo da rede de processos e sinais que regulam a capacidade metabólica de degradação bacteriana dos compostos aromáticos, evidenciando os três tipos de regulação gênica: mecanismos de resposta específica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais ..................... 30

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos de importância para a mobilidade de hidrocarbonetos........................................................................................................................ 06 Tabela 2 – Principais grupos de bactérias envolvidas na degradação dos hidrocarbonetos monoaromáticos do grupo BTEX ........................................................................................... 10 Tabela 3 – Proteínas regulatórias representativas envolvidas no metabolismo dos BTEX....................................................................................................................................... 31

1 INTRODUÇÃO

Os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) são hidrocarbonetos monoaromáticos, cuja origem está relacionada, em geral, às atividades de extração e refino de  petróleo e derivados. Além de participarem em boa parte da composição de combustíveis fósseis, esses compostos são utilizados em vários setores industriais, como a produção têxtil e  produção de pesticidas, entre outros. Os BTEX são contaminantes contaminantes comuns de solos e água. Esses compostos podem chegar ao meio ambiente através de descarga dos efluentes industriais, acidentes durante o processo de produção, transporte e estocagem de produtos químicos e de produtos derivados d erivados do refino refino do petróleo, p etróleo, em especial a gasolina. A poluição causada pelos compostos BTEX é um tópico de grande relevância para a saúde humana, da flora e da fauna ambientais. Esses compostos apresentam elevada toxicidade, em geral, relacionada às suas propriedades mutagênicas e carcinogênicas. Além disso, tais compostos aromáticos podem causar distúrbios neurológicos, alterações nas funções do sistema endócrino e lesões em órgãos como os rins e o fígado. Considerando as grandes quantidades de hidrocarbonetos contaminantes no ambiente e sua elevada toxicidade, existe uma grande preocupação em remover tais compostos do meio. Os métodos químicos e físicos disponíveis, muitas vezes, não são capazes de promover a remoção efetiva dos poluentes. Uma alternativa promissora a esses processos, devido ao seu custo relativamente baixo e alta eficiência, é a degradação biológica dos contaminantes, chamada de biorremediação. A biorremediação fundamenta-se na utilização de microrganismos capazes de degradar os compostos orgânicos, decompondo os mesmos em moléculas mais simples como CO 2, CH4 e H2O. Após os carboidratos, os compostos aromáticos são uma das classes de compostos orgânicos mais largamente distribuídos, que constituem uma fonte importante de carbono e energia para os microrganismos. As bactérias, em especial, são um grupo de microrganismos muito versáteis, capazes de transformar uma grande variedade de compostos hidrocarbonetos, o que as torna uma poderosa ferramenta para a biorremediação b iorremediação de sítios contaminados por BTEX. A degradação bacteriana dos compostos BTEX pode ocorrer sob condições aeróbias, em que o aceptor de elétrons é o oxigênio, e em condições anaeróbias, em que o ferro (III), o nitrato e

o sulfato constituem os principais aceptores de elétrons. Em ambas as condições, as primeiras reações de modificação do substrato apresentam certas particularidades, com relação aos mecanismos e enzimas participantes. Entretanto, tais reações levam à formação de um u m número restrito de intermediários centrais, como por exemplo, o catecol e o protocatecuato, nas vias de degradação em condições aeróbias, e o benzoil-CoA, nas vias de degradação em condições anaeróbias. Os intermediários centrais das vias são, então, catabolizados por vias de degradação comuns, que levam à formação dos metabólitos centrais, como acetil-CoA, acetato e piruvato, que participam de processos pro cessos importantes na célula, como o ciclo de Krebs. O aprimoramento dos conhecimentos relativos aos microrganismos potencialmente degradadores de compostos BTEX e das vias envolvidas neste tipo de metabolismo é de grande relevância para o avanço das técnicas de biorremediação de sítios contaminados por  BTEX. Primeiramente, porque permite a obtenção de inoculantes promissores, capazes de  promover a degradação dos poluentes com rapidez e eficiência. Segundo, porque permite a utilização de técnicas moleculares para manipulação dos componentes genéticos relacionados às vias, como genes que codificam enzimas e proteínas regulatórias e promotores ligados aos operons catabólicos. Além disso, as técnicas moleculares possibilitam a obtenção de microrganismos geneticamente modificados que reúnam características que os tornem capacitados para promover a degradação de substratos diferentes em condições ambientais diversas. A proposta deste trabalho é fazer uma revisão das principais vias de degradação bacteriana dos hidrocarbonetos monoaromáticos do grupo grupo BTEX descritas na literatura, sua genética genética e os mecanismos de regulação gerais, e sumarizar brevemente algumas de suas aplicações  biotecnológicas em processos processos de biorremediação e potenciais potenciais implicações ambientais.

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 OS BTEX E SUAS PRINCIPAIS FONTES

Os hidrocarbonetos são uma classe de substâncias orgânicas, cujas moléculas são compostas exclusivamente por átomos de hidrogênio e carbono. Entre os hidrocarbonetos, podemos distinguir duas classes distintas: hidrocarbonetos alifáticos e hidrocarbonetos aromáticos. Os compostos alifáticos podem ser divididos em aqueles de cadeia linear, cadeia ramificada e cicloalcanos. Já os compostos aromáticos são aqueles que possuem em sua estrutura um ou vários anéis aromáticos, caracterizados pelas duplas ligações alternadas originando um fenômeno chamado de ressonância. O benzeno e outros alquilbenzenos são compostos aromáticos que possuem apenas um anel aromático. Entre esses hidrocarbonetos monoaromáticos, encontra-se uma classe particular de compostos denominados BTEX:  benzeno, tolueno, etilbenzeno etilbenzeno e xilenos (Figura 1). (a)

(b)

(c)

CH3

CH2 CH3

Benzen o

T o luen o

Etilb enzen o

(d)

(e)

(f)

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3 orto-xileno

meta-xileno

para-xileno

Figura 1 – Estruturas químicas das moléculas dos compostos co mpostos BTEX. (a) Benzeno, (b) tolueno, (c) etilbenzeno (d) orto-xileno, (e) meta-xileno e (f)  para-xileno.

Os compostos BTEX são contaminantes comuns de solos e águas. Os BTEX são comumente utilizados em uma série de atividades industriais, possuindo aplicações nas mais diversas áreas: extração de metais, pintura, têxtil, processamento de madeira, produtos químicos,  pesticidas, detergentes e produtos do tabaco (CHAKRABORTY & COATES, 2004). Esses hidrocarbonetos podem chegar ao meio ambiente através da descarga dos efluentes industriais e também através de acidentes durante o processo de produção, transporte e estocagem. Entretanto, a grande parcela do processo de contaminação pode ser atribuída às atividades de refinarias de petróleo e seus derivados, em especial, a gasolina, cuja composição pode variar  de 10 a 60% de compostos BTEX (GÜLENSOY & ALVAREZ, 1999).  No período de 1975 a 2001, foram relatados pela comissão mista que analisa acidentes da Petrobrás/ Repar (CREA-PR) trinta e três acidentes envolvendo derramamento de petróleo e seus derivados no Brasil, somando milhões de litros que contaminaram solos, rios e mares. Em julho de 2000, um acidente ocorrido durante a transferência de petróleo entre terminais no litoral de Santa Catarina foi o responsável pela contaminação dos rios Barigüi e Iguaçu, por  cerca de 4 milhões de litros de petróleo, provocando danos significativos à flora e fauna aquáticas e sério risco à saúde dos moradores locais (revisado por TIBURTIUS et al., 2004). Talvez, mais importante do que os grandes acidentes sejam os pequenos acidentes, na maioria das vezes, não notificados, e que quando somados, apresentam um dano muito superior aos outros de maior porte. Entre esses pequenos acidentes, encontram-se principalmente a contaminação de lençóis subterrâneos de água por vazamentos de derivados de petróleo em solos de garagens de caminhões e ônibus e em postos de combustível. A Agência de Proteção Ambiental Norte Americana (EPA) estima que existam mais de 1,5 milhões de tanques subterrâneos de armazenamento de gasolina nos Estados Unidos, entre os quais pelo menos 30% estão com problemas de vazamento (SILVA et al., 2002). No Brasil, existe cerca de 30 mil postos de combustíveis, muitos sob risco de ocorrerem vazamentos devido ao longo tempo de vida (alguns têm mais de 25 anos), o que aumenta a probabilidade de apresentarem rachaduras ou corrosão (SILVA et al., 2002). Quando ocorre uma contaminação de um curso de água ou de um solo por petróleo ou alguns de seus derivados, eles se espalham pelo ambiente, ficando sujeitos a várias modificações,  principalmente, em relação à sua composição. Entre os fenômenos envolvidos nesse processo encontram-se a evaporação de frações de baixo peso molecular, dissolução de alguns

componentes hidrofílicos, adsorção às partículas presentes em sedimentos ou solos, oxidação fotoquímica e biodegradação (HARAYAMA et al., 2004). Tais compostos relacionados ao petróleo e seus derivados também apresentam uma cinética específica quando presentes no meio. Durante migração através de solos e sedimentos em cursos d´água, a fração mais polar (compostos nitrogenados, sulforados e oxigenados, nalcanos de pequena cadeia e pequenos hidrocarbonetos aromáticos) é capaz de maior  espalhamento em superfície e em profundidade, enquanto a fração menos polar permanece adsorvida às partículas do solo (JOVANCICEVIC et al., 2005). Em um derramamento e/ou vazamento de combustível, uma das principais preocupações é a contaminação dos aqüíferos que são usados como fonte de abastecimento de água para o consumo humano. Os maiores problemas de contaminação são atribuídos aos hidrocarbonetos monoaromáticos, que são os constituintes mais solúveis e móveis da fração da gasolina. Esses compostos têm maior mobilidade em sistema solo-água devido ao menor coeficiente de  partição entre octanol-água (Tabela 1), o que leva a uma lenta adsorção no solo e um transporte preferencial pela água, provocando a contaminação de mananciais de abastecimento. Essa mobilidade é aumentada pela adição de álcool na gasolina comercializada no Brasil, devido ao efeito de cossolvente do álcool (SILVA et al., 2002, TIBURTIUS et al., 2004). A contaminação de mananciais de abastecimento é particularmente problemática devido à alta toxicidade dos compostos BTEX e outros alquilbenzenos. Tal toxicidade está relacionada ao  potencial carcinogênico e mutagênico desses compostos (SILVA et al., 2002). Os valores máximos permitidos para os diferentes hidrocarbonetos monoaromáticos em águas destinadas para consumo humano, de acordo com o estabelecido pela Portaria 518/2004 do Ministério da Saúde (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004), são 5 g.L-1 para o  benzeno, 170g.L-1 para o tolueno, 200 g.L-1 para o etilbenzeno e 300 g.L-1 para o xileno.  No Brasil, o benzeno é reconhecido oficialmente como um agente cancerígeno pela Portaria da Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho nº 14 de dezembro de 1995 (BRASIL, SECRETARIA DE SEGURANÇA E SAÚDE NO TRABALHO, 1995). Entre os casos de câncer relatados, as leucemias são as mais freqüentes, resultado dos danos cromossômicos  provocados pelo benzeno, principalmente em linfócitos e células da medula óssea de humanos e outros seres vivos. Além do potencial carcinogênico e mutagênico, os BTEX são poderosos

Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos de importância para a mobilidade de hidrocarbonetos (modificada de WATTS et al., 2000).

Composto Benzeno Tolueno Xileno  Nonano Decano Dodecano

Solubilidade em água (mg/L)a 1760 532 163-185 0,122 0,021 0,005

K aow: Coeficiente de partição octanol-água

Log Kaow 2,12 2,73 2,95-3,26 4,67 6,69 7,24

depressores do sistema nervoso central, podendo levar a alterações nas capacidades motoras e neurológicas, bem como alterações nos sistemas endócrinos e enzimáticos (revisado por  TIBURTIUS et al., 2004).  Não apenas o contato direto com os hidrocarbonetos monoaromáticos é prejudicial à saúde do homem. Organismos aquáticos (flora e fauna) são capazes de absorver ou ingerir tais compostos, armazenando os mesmos em suas moléculas protéicas e reservas lipídicas. No tecido adiposo, os hidrocarbonetos encontram-se inalterados, levando a um processo de transferência na cadeia alimentar, até atingir o homem. A ingestão e acúmulo de hidrocarbonetos em doses muitas vezes pequenas podem acarretar em processos de intoxicação crônica, trazendo sérias implicações para a pesca, saúde pública e meio ambiente (SILVA et al., 2002).

2.1.1 TRATAMENTO DE SÍTIOS CONTAMINADOS

O tratamento dos sítios contaminados por BTEX é de grande relevância considerando os  problemas ambientais e de saúde pública que tais compostos podem ocasionar e o tempo que os mesmos permanecem no ambiente quando nenhum procedimento a mais é realizado para auxiliar a degradação natural destes compostos.

O tratamento desses poluentes pode ser realizado através de processos físicos, químicos e  biológicos. Às vezes, o tratamento exige a remoção do solo ou água contaminados, podendo ser realizado, em outras circunstâncias, no próprio local. O carvão ativado é muito utilizado para remoção de contaminantes orgânicos, por meio do  processo de adsorção. Outro processo utilizado para remoção de compostos orgânicos pouco  polares, chamado air striping, consiste na injeção de ar dentro do aqüífero contaminado, a transferência dos contaminantes voláteis para a fase gasosa e sua separação por um sistema de extração de vapor. Esses processos são eficientes, entretanto, não são destrutivos. O carvão ativado gera fases sólidas saturadas com contaminantes, enquanto o “air striping” libera gases tóxicos (TIBURTIUS et al., 2004). Um processo químico muito usado é a oxidação catalítica, em que o ar é aquecido a 300500ºC por um tempo curto. Esse processo é dispendioso pelo alto gasto de energia e uso de catalisadores de elevado custo, como a platina (KIM, 2002). Entre outros processos físicos e químicos existentes, podemos citar: a utilização de radiação, como microondas (CHIH-JU & TAI, 1998); e o emprego de radicais livres hidroxilas ( OH) em processos oxidativos •

avançados, utilizando ozônio, peróxido de hidrogênio, semicondutores, reagente de Fenton e radiação ultravioleta (FREIRE et al., 2000; WATTS et al., 2000). Devido às limitações dos diferentes métodos citados anteriormente, para que a remoção seja efetiva, vários processos devem ser usados em conjunto, o que acaba elevando o custo e tempo do tratamento. Uma alternativa promissora aos processos citados anteriormente é a degradação biológica dos contaminantes, chamada de biorremediação. Segundo Tiburtius et al. (2004), a biorremediação é um dos processos mais utilizados para a remoção dos BTEX e fundamenta-se na utilização de microrganismos capazes de degradar os compostos orgânicos, decompondo os mesmos em moléculas mais simples como CO 2, CH4 e H 2O (mineralização). É um processo de custo relativamente baixo e alta eficiência. A biorremediação só é possível graças à versatilidade microbiana, no que diz respeito às vias catabólicas, enzimas envolvidas e capacidade de adaptação. As principais vias catabólicas de degradação dos compostos BTEX por bactérias serão abordadas nos capítulos posteriores. No capítulo 3 também será abordado o tema da biorremediação com maior atenção.

2.2 A BIODEGRADAÇÃO DOS COMPOSTOS BTEX

2.2.1 AS BACTÉRIAS COMO AGENTES DA DEGRADAÇÃO DOS COMPOSTOS BTEX

Durante a primeira metade do século XX, um extenso número de vias bioquímicas, tanto de  biossíntese quanto de degradação, foi elucidado, e os microrganismos se tornaram exemplos  primos da versatilidade da vida. Apenas entre estes seres vivos podem ser observados exemplos de tolerância a ambientes extremos, cujas temperaturas beiram as de congelamento e ebulição da água, ou cujos valores de pH são capazes de ir de um ponto extremo a outro na escala.  Não apenas a capacidade de sobreviver em ambientes extremos ilustra a versatilidade microbiana, mas também a rapidez com a qual os microrganismos são capazes de se adaptar e modificar seu aparato enzimático face às novas mudanças ambientais, produzindo uma larga variedade de tipos fisiológicos conhecidos hoje (PALLERONI, 1995). Somente entre os microrganismos, é possível encontrar atividades catabólicas de grande interesse, que  permitam, por exemplo, atividades como a biorremediação de ambientes altamente contaminados por compostos orgânicos recalcitrantes que são tóxicos para outras formas de vida superiores. Desde 1945, Claude Zobell já afirmava que os múltiplos efeitos das bactérias na formação e transformação dos hidrocarbonetos do petróleo seriam uma nova fronteira de conhecimento (revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004). Hoje, é de conhecimento que grande  parte das modificações na composição dos compostos orgânicos presentes no ambiente, incluindo componentes do petróleo e produtos de seu processamento, acontece devido à atividade microbiana. Em geral, os hidrocarbonetos do petróleo são degradados na seguinte ordem: n- alcanos > alcanos monocíclicos > alquil benzenos > alcanos isoprenóides > alquil naftalenos > alcanos bicíclicos > esteranos > hopanos (SUN et al. , 2005). Essa alteração pode dar-se em espaços de tempo relativamente curtos, desde alguns meses até alguns anos (JOVANCICEVIC et al. , 2005). Diversos estudos têm relatado os processos de biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos e os microrganismos envolvidos na degradação desses compostos sob condições ambientais

diversas, tais como: ambientes marinhos (HARAYAMA et al. , 2004; COHEN, 2002; HEAD & SWANNELL, 1999) e continentais, águas de superfície (ANTIC et al.  , 2006) e subterrâneas, solos e sedimentos (CAVALCA et al., 2000; PHELPS & YOUNG, 1999), condições aeróbias e anaeróbias (ZHANG & BENNETT, 2005; CHAKRABORTY & COATES, 2004; HOLLIGER & ZEHNDER, 1996), ambientes extremos (MARGESIN & SCHINNER a,b, 2001). As bactérias possuem uma ampla capacidade de degradar os hidrocarbonetos aromáticos do grupo BTEX. Muitos outros microrganismos apresentam a capacidade de degradação desses compostos, entre eles organismos eucariotos como fungos, algas, entre outros, que também têm um papel importante nos processos de detoxificação de ambientes contaminados. Devido às facilidades de estudo sob condições laboratoriais das propriedades bioquímicas e genéticas nas bactérias, grande parte das vias foram elucidadas através de investigações utilizando esse grupo de microrganismo. Além disso, as alterações genéticas são rapidamente expressas nos  procariotos, devido à natureza haplóide de seus genomas. Essa característica favorece a realização de testes genéticos, com a finalidade de elucidar a função de genes e proteínas envolvidas nas vias de degradação bacteriana (PALLERONI, 1995).  Na literatura, encontram-se descritos vários processos de degradação utilizando bactérias em culturas puras ou em consórcios. Os consórcios bacterianos têm especial importância na degradação de compostos aromáticos considerados recalcitrantes, na detoxificação de sítios contaminados por vários compostos diferentes (misturas) e na degradação de contaminantes em ambientes adversos (ZHANG & BENNETT, 2005). Isso porque, muitas vezes, uma única espécie não possui todo o aparato enzimático capaz de promover a degradação completa do composto orgânico, gerando intermediários que são metabolizados por outras espécies. A Tabela 2 traz alguns exemplos de bactérias que, em cultura pura, foram capazes de metabolizar alguns dos compostos BTEX. Algumas delas apresentaram a capacidade de metabolizar até mais de um composto. Como será observado posteriormente, grande parte das vias de degradação aeróbia dos compostos BTEX foram elucidadas através de investigações utilizando as bactérias do gênero Pseudomonas, que acabaram se tornando modelos de estudo. As bactérias desse gênero

apresentam grande versatilidade metabólica relatada na literatura desde o início do século,  podendo utilizar até 100 diferentes fontes de carbono, incluindo hidrocarbonetos alifáticos,

Tabela 2 – Principais grupos de bactérias envolvidas na degradação dos hidrocarbonetos monoaromáticos do grupo BTEX. Bactéria (linhagem) Benzeno  Dechloromonas spp. Linhagens RCB e JJ  Arthrobacter sp. HCB  Burkholderia pickettii pK01 Planococcus sp. ZD22 Tolueno Pseudomonas putida F1  Burkholderia pickettii pK01

Condições

Referência

Anaeróbia – Nitrato redutoras Aeróbia Aeróbia Aeróbia

Coates et al (2001)

Aeróbia Aeróbia

Gibson et al. (1968) Kukor & Olsen (1996)

Pseudomonas mendoncina

Aeróbia

Whited & Gibson (1991)

Pseudomonas stutzeri OX1  Arthrobacter sp. HCB Pseudomonas putida mt-2 Cycloclasticus pugetti PS-1

Aeróbia Aeróbia Aeróbia Aeróbia Anaeróbia – Fe(III) redutora Anaeróbia – Fe(III) e nitrato redutoras

Arenghi, et al. (1999) Alvarez & Vogel (1991) Williams & Murray (1974) Dyksterhouse et al. (1995)

KR1

Geobacter grbicium Thauera aromática linhagens

K172 e T1  Azoarcus spp.  Desulfobacula toluolica  Desulfobacterium cetonicum Geobacter metallireducens

linhagem GS-15

Etilbenzeno Linhagens EbN1 e EB1, relacionadas ao gênero Thauera

Proteobacteria marinha, linhagem EbS7 Pseudomonas sp. NBM21

Alvarez & Vogel (1991) Kukor & Olsen (1996) Li et al. (2006)

Anders et al. (1995) Evans et al. (1991) Chakraborty & Coates (2004)

Anaeróbia – Fe(III) e sulfato redutoras

Rabus et al. (1993) Harms et al. (1999)

Anaeróbia – Fe(III) redutora

Chakraborty & Coates (2004) Lovley et al (1989)

Anaeróbia – Nitrato redutoras

Rabus & Widdel (1995) Ball et al. (1996)

Anaeróbia – Sulfato redutoras Aeróbia

Kniemeyer et al. (2003) Jeong et al. (2006)

Xilenos Linhagem oXyS1, relacionadas às espécies Desulfobacterium Anaeróbia – Sulfato redutoras acetonicum e

Harms et al. (1999)

 Desulfosarcina variabilis

Linhagem mXyS1, do grupo Proteobacteria Thauera spp. e Azoarcus spp. Pseudomonas sp. NBM21

Anaeróbia – Nitrato redutoras

Hess et al. (1997), Rabus & Widdel, (1995).

Aeróbia

Jeonq et al. (2006)

mono e poliaromáticos, além dos compostos substituídos, contendo na molécula átomos de cloro, fósforo, entre outros. Algumas das moléculas podem ser degradadas utilizando mais de uma via catabólica (PALLERONI, 1995). Os genomas das bactérias Pseudomonas estão entre os maiores genomas bacterianos já seqüenciados e contêm uma grande proporção de genes regulatórios descritos na literatura. Boa parte dos genes está relacionada ao metabolismo, transporte e efluxo de compostos orgânicos, o que explica a grande capacidade de adaptação dessas bactérias em ambientes diversos (PALLERONI, 1995). Os plasmídeos associados às vias catabólicas das pseudomonas também estão entre os mais estudados. Esses componentes genéticos muito comuns nas bactérias contribuem bastante  para a grande versatilidade deste grupo de organismos. Grande parte dos genes relacionados às vias catabólicas de degradação descritos na literatura encontra-se presente em plasmídeos, como pWW0 de P. putida e pWW53 de P. putida MT53 (ASSINDER & WILLIAMS, 1990). Os plasmídeos catabólicos, em geral, somente são mantidos em células bacterianas que se encontram sob pressão seletiva. Esta é uma importante justificativa de se trabalhar com a microbiota indígena na biorremediação de locais contaminados. Muito pouco é conhecido sobre como as comunidades microbianas se tornam adaptadas à  presença de compostos xenobióticos. Análises comparativas de sequências de DNA e estudos em microcosmos experimentais têm demonstrado que a transferência gênica entre espécies  possa ter um grande impacto na evolução bacteriana. Os efeitos da transferência gênica são dependentes da expressão do novo material genético nos organismos receptores e das conseqüentes mudanças nas suas características fenotípicas frente aos processos de seleção natural. Uma estratégia para investigar o impacto da transferência gênica é rastrear a distribuição de genes para a biodegradação de contaminantes ambientais sob várias condições seletivas (FULTHORPE & WYNDHAM, 1991; WYNDHAM et al., 1997). Como os genes catabólicos estão frequentemente associados com plasmídeos conjugativos e, em alguns casos, com transposons, eles são ideais para investigar a influência da mobilidade genética no metabolismo microbiano (WYNDHAM et al., 1997; ELSAS & SMIT, 1997).

2.2.2 AS VIAS DE DEGRADAÇÃO BACTERIANA DOS BTEX

A biodegradação é a capacidade metabólica de organismos transformarem ou mineralizarem contaminantes orgânicos em substâncias simples, que possam então se integrar aos ciclos  biogeoquímicos. A intensidade da biodegradação depende de uma série de fatores como disponibilidade de nutrientes, oxigênio, valores de pH, concentração e características dos contaminantes. Este processo, juntamente com outros processos físicos e químicos, é responsável pela descontaminação de ambientes contaminados por compostos orgânicos tóxicos como os BTEX (MARGESIN & SCHINNER, 2001).  Nem sempre é possível combinar em único microrganismo todas as características requeridas  para promover a descontaminação de um ambiente. Nesse caso, a sintropia do consórcio  bacteriano é muito importante, pois cada membro do grupo é especializado em determinada etapa da via de degradação de certo poluente (DÍAZ, 2004). Muitas vezes, um substrato orgânico só é metabolizado na presença de outros substratos capazes de serem metabolizados pelo microrganismo. Esse tipo de processo, chamado cometabolismo, degrada parcialmente o composto orgânico, que, por sua vez, não serve como fonte de carbono para o microrganismo. O co-metabolismo é comum em consórcios  bacterianos que degradam hidrocarbonetos aromáticos, como o benzeno (BOSSERT & COMPEAU, 1995). A biodegradação aeróbia e anaeróbia de hidrocarbonetos monoaromáticos têm características comuns. Para a biodegradação dos compostos é essencial uma reação redox, em que o hidrocarboneto é oxidado (doador de elétron) e um aceptor de elétron é reduzido. Existem diferentes compostos que podem agir como aceptores de elétron, entre eles o oxigênio (O 2), utilizado pelas bactérias aeróbias, e o nitrato (NO 3-), os óxidos de Fe (III), o sulfato (SO 42-), entre outros, utilizados pelas bactérias anaeróbias (BORDEN et al., 1995). Em geral, a degradação dos hidrocarbonetos aromáticos é mais eficiente e rápida em condições aeróbias. O oxigênio é o aceptor de elétrons mais comum na respiração microbiana, e o processo aeróbio fornece uma grande quantidade de energia para as células. Em condições anaeróbias, a estabilidade desses compostos é grande, basta pensar no tempo de vida dos reservatórios de petróleo cru. Na degradação dos hidrocarbonetos aromáticos, o oxigênio

molecular atua não apenas como um aceptor de elétrons na cadeia respiratória, mas também como um agente reativo na oxidação da molécula (BOSSERT & COMPEAU, 1995). Por  outro lado, os processos de degradação de hidrocarbonetos em condições anaeróbias têm grande importância, principalmente em ambientes contaminados, com depleção de oxigênio.  Nos itens a seguir, serão descritas as principais vias de degradação dos hidrocarbonetos aromáticos BTEX, em ambas as condições: aeróbia e anaeróbia.

2.2.2.1 VIAS AERÓBIAS DE BIODEGRADAÇÃO DO BTEX

As enzimas envolvidas nos processos de transformação de compostos aromáticos, em geral, não são distribuídas em muitas classes diferentes de enzimas; as hidrolases e oxidoredutases são as mais utilizadas nas vias. As oxidoredutases são enzimas complexas, usualmente, compostas por multicomponentes protéicos, que requerem cofatores como o NADH, e são, na maioria das vezes, utilizadas em várias etapas da biocatálise (DÍAZ et al., 2001). Os hidrocarbonetos monoaromáticos do grupo BTEX são degradados aerobicamente por  microrganismos através de um processo oxidativo em que a primeira etapa da via dá-se através de reações catalizadas por enzimas oxigenases do anel aromático que introduzem átomos de oxigênio no anel aromático ou em seus substituintes alquil (CAVALCA et al., 2000, CHAKRABORTY & COATES, 2004). As primeiras etapas das vias de degradação possuem suas particularidades para cada substrato BTEX diferente. Após essa etapa, os hidrocarbonetos monoaromáticos são transformados em intermediários centrais comuns: os catecóis e os protocatecuatos. Tais compostos intermediários são substratos de enzimas oxigenases responsáveis pela clivagem do anel aromático, que atuam diferentemente, gerando produtos que serão metabolizados por vias centrais distintas: orto e meta clivagem. As vias centrais envolvem uma série de reações que  produzem metabólitos que participam do ciclo de Krebs, acetato e succinato, ou substratos que podem ser facilmente convertidos a intermediários do ciclo, como o piruvato e acetaldeído (DIAZ, 2004).

2.2.2.1.1 ETAPAS INICIAIS DE DEGRADAÇÃO AERÓBIA DOS BTEX

Todos os compostos monoaromáticos do grupo BTEX são derivados do benzeno. Sendo assim, a quebra do anel aromático é uma etapa comum a todas as vias de degradação desses compostos. Para ocorrência da clivagem do anel aromático é necessário diminuir a sua estabilidade termodinâmica, que dificulta o ataque enzimático, o que pode ser realizado adicionando grupos eletrofílicos à estrutura do anel (DIAZ, 2004).  Na oxidação do benzeno pelas bactérias aeróbias, essa barreira química foi superada por me io da utilização do oxigênio molecular, não apenas como aceptor de elétrons, mas também como um co-substrato na reação mediada pelas oxigenases. O ataque da molécula pode ser  catalisado pelas monooxigenases, enzimas que incorporam um átomo de oxigênio ao anel (Figura 2a), ou pelas dioxigenases, que incorporam dois átomos de oxigênio (Figura 2b). O  produto dessa reação inicial é um benzeno dihidrodiol (1,2-dihidroxiciclohexa-3,5-dieno), cuja isomeria espacial (cis ou trans) depende de qual enzima catalisará a reação (RIBBONS & EATON, 1982). O benzeno dihidrodiol, por sua vez, é convertido a catecol por uma desidrogenase (Figura 2). (a)

O2

H

H2O

H

H2O

OH H

O NADH

NAD +

Benzeno

OH

H

Óxido Areno

O2

(b)

Benzeno

NAD +

NAD

+

NADH

OH

H

H Cis-dihidrodiol

OH Catecol

Trans-dihidrodiol

OH OH NADH

OH

NAD

+

NADH

OH Catecol

Figura 2 – Ataque inicial do benzeno por oxigenases. (a) A reação é catalisada por uma monooxigenase, que introduz um átomo de oxigênio no anel aromático, produzindo um óxido areno, que, através de uma hidratação, forma um trans-dihidrodiol, convertido posteriormente a catecol. (b) A reação é catalisada por uma dioxigenase, que introduz dois átomos de oxigênio no anel, formando diretamente o cis-dihidrodiol, convertido por uma desidrogenação a catecol. As moléculas de catecol produzidas são degradadas pelas vias de orto e meta clivagem.

As oxigenases que catalisam a hidroxilação do anel do benzeno requerem co-substratos doadores de elétrons, como o NADH (Figura 2). Entre os multicomponentes dessas enzimas, há um flavoproteína que recebe os elétrons do NADH e os transfere através da ferredoxina  para a oxigenase. A oxigenase reduzida reage com o oxigênio molecular e o substrato aromático (revisado por WRENN, 1998). Como relatado anteriormente, reações de orto ou meta clivagem dão continuidade ao processo de degradação, através do metabolismo da molécula de catecol, produzindo intermediários que participam do ciclo de Krebs. A degradação de compostos alquil benzenos, tais como o tolueno, etilbenzeno e xilenos, pode ocorrer inicialmente através da oxidação direta do anel ou, muito comumente, através da oxidação dos grupos laterais. Esses compostos têm sido utilizados como fonte de carbono e energia para uma grande variedade de bactérias, incluindo as pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Achromobacter e Nocardia (WRENN, 1998).

Diferentes vias catabólicas do tolueno encontram-se descritas na literatura, como as vias TOL, TOD, TOM, T4MO e TBU (Figura 3). Tais vias foram estudadas primeiramente em bactérias  pseudomonas, mas não são exclusivas dessas bactérias. A via catabólica TOL foi elucidada a partir do estudo de um plasmídeo isolado de Pseudomonas putida mt-2, que inicia o metabolismo do tolueno oxidando o seu grupo metil.

Pela ação de uma monooxigenase, o tolueno é convertido a benzil álcool, oxidado em seguida a benzaldeído e, conseguinte, a ácido benzóico, por uma desidrogenação. A hidroxilação do anel dá-se a partir do ácido benzóico, formando um cis-benzoato dihidrodiol, convertido em seguida a catecol (WILLIAMS & MURRAY, 1974). A clivagem do catecol é obtida pela meta-clivagem (Figura 3a). Bactérias contendo o plasmídeo TOL são capazes de degradar, além do tolueno, as moléculas de p-xileno e m-xileno. Comparando as habilidades de biodegradação dos compostos BTEX e naftaleno de diversas linhagens bacterianas, Gülensoy & Alvarez (1999) observaram que esses três compostos foram os mais frequentemente degradados (75% das linhagens) e sugeriram que possivelmente o plasmídeo TOL apresenta um papel muito importante na degradação dos BTEX e naftaleno.

CHO

CH2OH

COO

-

COO OH

OH H

OH

(a) Benzilálcool

TOL

Benzaldeído

Benzoato

Cis-benzoato dihidrodiol

Catecol

Metaclivagem

OH

CH3

CH3

H OH (b) OH TOD Cis-tolueno H

OH

Metaclivagem

OH 3-M etilcatecol

dihidrodiol

CH3

CH3 TOM

CH3 OH

OH

(c) OH

o-cresol

Tolueno

3-Metilcatecol

CH3

TBU

CH3 OH

(d) m-cresol

T4MO

CH3

Metaclivage

OH

Metaclivagem

OH

3-M etilcatecol

CH2OH

CHO

COO

-

COOH Ortoclivagem

(e) OH OH  p-cres ol

OH

OH

OH

 p -Hidroxi  benzil álcool

 p-Hidroxi  benzaldeído

 p-H idroxi  benzoat o

OH Protocatecuato

Figura 3 – Reações envolvidas na primeira etapa das vias de degradação aeróbia de tolueno. (a) A via TOL tem como produto inicial um benzil álcool, que após oxidação a ácido  benzóico, é convertido a dihidrodiol e consecutivamente, a catecol. As via TOD (b), TOM (c) e TBU (c) são iniciadas pela oxidação direta do anel, formando produtos convertidos  posteriormente a 3-metilcatecol. Também a via T4MO (e) é iniciada por hidroxilação do anel, formando, no entanto, uma molécula de protocatecuato. As moléculas de catecol, 3metilcatecol e protocatecuato são metabolizadas por meta ou orto clivagem, produzindo intermediários centrais do ciclo de Krebs (Modificada de GÜLENSOY & ALVAREZ, 1999).

 Nas vias descritas a seguir, a degradação do tolueno é iniciada pela hidroxilação do anel aromático, levando à formação dos intermediários centrais 3-metilcatecol (vias TOD, TOM e TBU), degradado posteriormente pela via de meta clivagem, e protocatecuato (via T4MO) degradado pela via de orto clivagem. A via catabólica TOD, descoberta na bactéria P. putida F1, inclui a enzima tolueno dioxigenase, que adiciona dois átomos de oxigênio ao anel benzênico. Essa reação leva à formação do cis-tolueno dihidrodiol, que é convertido a 3-metilcatecol por uma reação de desidrogenação (GIBSON et al., 1968) (Figura 3b). A via catabólica TOM foi elucidada em  Burkholdderia cepacia G4 (inicialmente denominada P. cepacia G4), que utiliza a enzima tolueno orto-monooxigenase no ataque inicial da

molécula, originando um o- cresol (SHIELDS et al., 1989) (Figura 3c). De forma similar, na via catabólica TBU, descrita em  B. pickettii PK01 (inicialmente denominada P. pickettii PK01), esta etapa é catalisada pela enzima tolueno meta-monooxigenase para formar um mcresol (KUKOR & OLSEN, 1996) (Figura 3d). Finalmente, a via catabólica T4MO ocorre em P. mendocina KR1, que utiliza a enzima tolueno  para-monoxigenase para formar um  p-cresol (WHITED & GIBSON, 1991) (Figura 3e). O p-cresol é convertido a  p-hidroxibenzil álcool, que, assim como na via TOL, é oxidado a p-hidroxi benzoato. Essa molécula é convertida posteriormente a protocatecuato. Alquil benzenos maiores como o etilbenzeno, isopropil, n-butil, entre outros, são degradados  por  Pseudomonas putida através da oxidação do anel benzênico. Em geral, esse processo é lento, e os produtos formados inicialmente são cis-dihidrodióis, como descrito na via TOD de degradação de tolueno. No caso do etilbenzeno, o produto da primeira etapa da via é o etilcatecol, metabolizado pela via de meta clivagem (WRENN, 1998) (Figura 4). Quanto aos benzenos dialquil substituídos, como os xilenos, existem algumas diferenças quanto à degradação de seus isômeros orto, meta e para. As moléculas de m-xileno e p- xileno são convertidas a dimetilcatecóis, que não são clivados pela catecol 2,3 dioxigenase de P.  putida, e, portanto, não são metabolizados pela via de meta clivagem. Já a  Nocardia corallina

é capaz de metabolizar pela via de orto clivagem o produto inicial da degradação do  p-xileno, o 3,6-dimetilcatecol. Entretanto, apresenta como produto final da via o 2,5-dimetil- cis,cisácido mucônico, não atingindo a mineralização do composto aromático (JAMISON et al, 1969).

CH2CH3

CH2CH3

CH2CH3 H

OH

OH

Metaclivage

OH

OH

H Cis-etilbenzeno dihidrodiol

Etilbenzeno

3-etilcatecol

Figura 4 – Primeira etapa da via de degradação aeróbia do etilbenzeno. A via de degradação do etilbenzeno, assim como a via TOD do tolueno, é iniciada pela oxidação direta do anel, formando como produto intermediário o 3-etilcatecol, posteriormente metabolizado pela via de meta clivagem.

 Nocardia sp. é capaz de crescer em o-xileno, degradando inicialmente esse composto através

da hidroxilação do anel, produzindo 3,4-dimetilcatecol. Essa bactéria é capaz de oxidar o 3,4dimetilcatecol pela via de meta-clivagem, formando ácido acético, propionaldeído e piruvato. Entretanto, esta bactéria é uma exceção tanto em relação à sua capacidade de oxidação de dimetilcatecóis pela via de meta-clivagem, quanto à capacidade de crescer em o-xilenos (WRENN, 1998). Quanto à degradação dos meta e  para xilenos, a primeira etapa da via de degradação compreende a oxidação do grupo metil, produzindo 3-metil benzoato, e a conseguinte oxidação do anel aromático, mecanismo semelhante ao observado na via TOL de degradação do tolueno. A inserção do oxigênio ocorre no átomo de carbono ligado ao grupo carboxila. As reações de descarboxilação e desidrogenação que se seguem, transformam o diol em metilcatecol (RIBBONS & EATON, 1982) (Figura 5). CH2OH

CH3

CH3 m-xileno

CHO

CH3

CH3 3-metil benzil álcool

COO

3-metil  benzaldeído

COO OH

-

CH3 3-metil  benzoato

OH H

OH

CH3

OH

3-metil cis-benzoato dihidrodiol

Metaclivage

CH3 3-metilcatecol

Figura 5 – Primeira etapa da via de degradação aeróbia do meta-xileno. Após a oxidação do grupo metil, o anel aromático é oxidado, através de um mecanismo semelhante ao observado na via TOL de degradação do tolueno. O produto intermediário dessa via é o 3-metilcatecol.

2.2.2.1.2 OXIDAÇÃO DOS INTERMEDIÁRIOS CENTRAIS DA DEGRADAÇÃO AERÓBIA DOS BTEX

Os compostos monoaromáticos estruturalmente diferentes são degradados aerobicamente através de vias iniciais diversas. No entanto, os produtos intermediários formados são comuns às vias, limitando-se a algumas moléculas dihidroxi aromáticas: catecóis e protocatecuatos. Esses intermediários são oxidados por vias centrais específicas que produzem intermediários centrais do metabolismo da célula: vias de orto ou meta clivagem.  Na via de meta clivagem, a quebra do anel se dá próximo às duas hidroxilas do anel aromático, sendo as reações subsequentes ditadas pela natureza do produto da fissão do anel.  Na via de orto-clivagem, a quebra do catecol se dá entre as hidroxilas do catecol, sendo que um grupo inteiramente diferente de enzimas é requerido para o metabolismo dos distintos  produtos do anel clivado.  Na via de orto-clivagem (Figura 6a), a enzima catecol 1,2-dioxigenase catalisa a incorporação de um dioxigênio entre os dois grupos hidroxilas da molécula de catecol. O produto formado é o ácido cis,cis-mucônico (GIBSON, 1968), que é convertido em mucolonato pela ação da enzima de lactonização de cis,cis-muconato (4-carboximetil-4-hidroxi-isocrotolactona liase). Este produto, pela ação de uma isomerase, é convertido a -cetoadipato enol lactona, que por  sua vez constitue-se num substrato para a oxoadipato enol-lactona hidrolase formando 3oxoadipato. Finalmente, o 3-oxoadipato é convertido a succinato e acetil-CoA pela ação de uma transferase (4-carboximetil-4-hidroxi-isocrotolactona liase) (ORNSTON & STANIER, 1966; KEMP & HEGEMAN, 1968). Em Pseudomonas putida, através da via de meta-clivagem, o catecol é convertido a ácido 2hidroximucônico semialdeído (DAGLEY et al., 1960) que pela ação da enzima semialdeído desidrogenase dependente de NAD+ origina 4-oxalocrotonato (NISHIZUKA et al., 1962). Na segunda via (Figura 6b), o ácido 2-hidroximucônico semialdeído é metabolisado pelo sistema hidrolase a 2-oxi-penta-4-enoato (SALA-TREPAT et al., 1971), o qual é descarboxilado a 4hidroxi-2-oxi-valerato, pela ação de outra hidrolase. Este produto é clivado pela ação de uma aldolase originando acetaldeído e piruvato.

OH (a)

Catecol 1,2dioxigenase

ORTOCLIVAGEM

COOH

Catecol

O2

OH

Catecol 2,3dioxigenase

METACLIVAGEM

(b)

CHO COOH

O2

COOH

OH

Cis,cis-muconato

2-hidroximucônico semialdeído

H2O O

COOH C O

HCOOH COOH

Muconolactona

O 2-oxipenta-4-enoato

COOH

O

H2O

C O

3-oxoadipato enol-lactona

COOH O

O

HO

COOH

4-hidroxi-2-oxi-valerato

COOH 3-oxoadipato

COOH

CH2 COOH

Succinato

Acetaldeído

+

CH3

O

CO

SCoA

+

COOH O Piruvato

Acetil-CoA

Figura 6 – Degradação do catecol, intermediário comum das vias de degradação dos BTEX,  pelas vias de orto e meta clivagem. (a) Na via de orto-clivagem, a quebra do catecol se dá entre as hidroxilas do catecol, enquanto na via de meta clivagem (b), a quebra do anel se dá  próximo às duas hidroxilas do anel aromático, sendo as reações subsequentes ditadas pela natureza do produto da fissão do anel.

2.2.2.2 VIAS ANAERÓBIAS DE BIODEGRADAÇÃO DO BTEX

A biodegradação anaeróbia dos hidrocarbonetos aromáticos BTEX foi negligenciada até a década de 80, particularmente por ser considerada pouco favorável energeticamente, quando comparada à degradação aeróbia. Entretanto, esses compostos são utilizados como fonte de carbono por diversas bactérias anaeróbias, sob condições nitrato redutoras, ferro redutoras, sulfato redutoras e condições metanogênicas. O uso de outros aceptores de elétrons diferentes do oxigênio é baseado na disponibilidade dos compostos aceptores e na competição de diferentes tipos de microrganismos pelos doadores de elétrons. Por exemplo, a redução de Fe (III) é o mecanismo de oxidação de matéria orgânica mais frequentemente observado em ambientes subsuperficiais. O nitrato é um dos íons mais encontrados em águas naturais, ocorrendo geralmente em baixos teores nas águas superficiais, mas podendo atingir altas concentrações em águas subterrâneas. Já o sulfato é o  principal aceptor de elétrons para degradação anaeróbia em ambientes marinhos, devido a su a alta concentração em água do ar (DIAZ, 2004, BORDEN et al., 1995). Em termos de energia, enquanto a degradação de compostos aromáticos utilizando o nitrato e o Fe (III) como aceptores de elétrons é quase tão eficiente quanto a degradação aeróbia, em condições sulfato redutoras e metanogênicas, a quantidade de energia gerada é comparativamente muito menor (DIAZ, 2004) (Figura 7). A biodegradação anaeróbia é o processo que prevalece em situações onde a atividade da microbiota indígena aeróbia resulta em uma rápida depleção do oxigênio dissolvido, como em águas subterrâneas contaminadas, solos, sedimentos e biorreatores, entre outros (CHAKRABORTY & COATES, 2004). A biodegradação anaeróbia encontra-se extensivamente revisada por vários autores (CHAKRABORTY & COATES, 2004; SPERMAN & WIDDEL, 2000; PHELPS & YOUNG, 1998; HOLLIGER & ZEHNDER, 1996; COLBERG & YOUNG, 1995). Esse  processo apresenta algumas vantagens sobre a biodegradação aeróbia, tornando-se uma boa alternativa para processos de biorremediação. Os processos aeróbios têm um custo elevado,  pois requerem sistemas de injeção de oxigênio caros e a manutenção e o gasto de energia acabam por onerar mais o processo (ZHANG & BENNETT, 2005).

Respiração Processo aeróbio

O2

Potencial redox (mV)

Energia G0 (kJ)

H2O CO2

 Aer óbi a (Pseudomonas)

+ 800

- 3174,4

+ 430

- 2977,3

+ 100

- 3043,3

- 270

- 185,4

- 400

- 124,3

Massa celular

Processo anaeróbio -

NO3

-

NO2 (N2) CO2

Massa celular

Hidrocarbonetos aromáticos

3+

Fe

2+

CO2

2-

Massa celular

Fermentação

SO4

Redução Fe (III) (Geobacter)

H2S CO2

Massa celular

H+, CO2

(Azoarcus)

Fe

Massa celular

Compostos orgânicos

Desnitrificação

Redução Sulfato (Dessulfobacterium)

H2, CH4

 Ác idos org âni co s (ex. acetato)

CO2

Metanogênese (Methanospirillium)

Massa celular

Figura 7 – Desenho esquemático da utilização microbiana dos hidrocarbonetos aromáticos, evidenciando o rendimento energético do metabolismo aeróbio ou anaeróbio da molécula, em função do aceptor de elétrons utilizado. Gêneros de bactérias representativos de cada tipo de metabolismo são mostrados em parênteses.

Com relação aos principais mecanismos de biodegradação anaeróbia de hidrocarbonetos monoaromáticos, uma importante diferença em relação aos mecanismos aeróbios é a introdução do oxigênio através da água, ao invés do uso do oxigênio molecular, para formação de compostos monoaromáticos oxigenados, susceptíveis à posterior clivagem do anel. Algumas variações existentes entre as vias catabólicas, como, por exemplo a adição do fumarato na etapa de ativação da molécula, ocorrem devido aos diferentes aceptores de elétrons utilizados (CHAKRABORTY & COATES, 2004). Assim como ocorre nas vias de degradação aeróbias dos BTEX, as primeiras etapas da degradação são diferentes para cada hidrocarboneto monoaromático com cadeias laterais

distintas. Da mesma forma, as vias de degradação apresentam um produto intermediário comum, o benzoil-CoA. O benzoil-CoA é degradado, formando intermediários do metabolismo central como o acetil-CoA (ZHANG & BERNNETT, 2005).

2.2.2.2.1 ETAPAS INICIAIS DE DEGRADAÇÃO ANAERÓBIA DOS BTEX

O benzeno é um dos hidrocarbonetos aromáticos mais resistentes à degradação sob condições anóxicas. O deslocamento da nuvem de elétrons estabiliza as ligações carbono-carbono, tornando o benzeno altamente resistente ao ataque químico. Embora um grande número de artigos relate a degradação anaeróbia de outros hidrocarbonetos aromáticos, entre eles tolueno e xilenos, algumas investigações anteriores descreveram o benzeno como recalcitrante (PHELPS et al., 1996). A degradação anaeróbia do benzeno já foi demonstrada sob condições nitrato redutoras, Fe(III) redutoras, sulfato redutoras e metanogênicas, mas, até pouco tempo atrás, nenhum organismo específico ou gênero tinha sido associado com tal habilidade. Também, tal metabolismo tinha sido observado apenas em estudos envolvendo sedimentos ou consórcios microbianos (revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004, HOLLIGER & ZEHNDER, 1996). Em 2001, Coates et al. isolaram e descreveram duas linhagens bacterianas, RCB e JJ, intrinsecamente relacionadas com membros do gênero  Dechloromonas. Essas linhagens de Proteobacterias foram capazes de degradar rapidamente o benzeno a CO 2 na ausência de oxigênio, acoplando a oxidação do benzeno à redução do nitrato. A via bioquímica da degradação anaeróbia do benzeno ainda não está elucidada, mas algumas  possibilidades têm sido sugeridas (Figura 8). Entre elas estão carboxilação inicial, hidroxilação, metilação ou redução do anel aromático com subseqüente formação do produto intermediário, benzoil-CoA, e posterior clivagem do anel (COATES et al., 2002). Alguns estudos utilizando consórcios bacterianos degradadores de benzeno, tem apontado fenol e  benzoato como possíveis produtos de uma etapa inicial de degradação do benzeno (CALDWELL & SUFLITA, 2000, PHELPS et al., 2001, WEINER & LOVLEY, 1998).

Figura 8 – Potenciais reações iniciais da via de degradação anaeróbica do benzeno: carboxilação, metilação ou hidroxilação, com seus respectivos produtos, benzoato, tolueno e fenol. As reações subseqüentes levam a formação do intermediário central benzoil-CoA, clivagem do anel e oxidação a dióxido de carbono. Entre os compostos BTEX, o tolueno é o hidrocarboneto cujo processo de biodegradação anaeróbia é provavelmente o mais conhecido. Esse composto pode ser biodegradado utilizando um grande número de aceptores de elétrons: nitrato, Mn(IV), Fe(III), sulfato, CO

2,

acoplado à redução de substâncias húmicas e oxi-ânions clorinados (revisado por  CHAKRABORTY & COATES, 2004). A primeira etapa da via de degradação anaeróbia do tolueno é a ativação dessa molécula pela adição do fumarato ao grupo metil, formando o produto benzilsuccinato. Esta reação é catalisada pela benzilsuccinato sintase – BSS - (Figura 9). Esta etapa foi descrita inicialmente  por Biegert et al. (1996), que demonstraram a presença de benzilsuccinato livre como um  produto intermediário transiente nas culturas de T. aromatica contendo tolueno. Após a formação do benzilsuccinato, este é convertido ao seu derivado CoA, benzilsuccinil-CoA por  uma enzima transferase, para ser então oxidado a benzoil-CoA e succinil-CoA (LEUTWEIN & HEIDER, 1999).

COO

-

COO

2[H]

-

Succinato

COOH Fumarato

CH3

COO

COO

-

Tolueno

CoA

-

2[H]

COOH

Belzilsuccinato

S

CO

COOH Fenilitaconato

CO

S

CoA H2O

COO

-

Succinil-CoA

CoA

S

CO

HS

CoA

CO

HO

S

CoA

COO -

CO2 Benzoil-CoA

2[H]

2-carboximetil3-hidroxifenilpropionil-CoA

Figura 9 - Primeira etapa da via de degradação anaeróbia do tolueno. A primeira etapa envolve a ativação do tolueno pela adição do fumarato ao grupo metil. O produto formado, o  benzilsuccinato, é convertido ao seu derivado CoA, benzilsuccinil-CoA por uma enzima transferase, para ser então oxidado a benzoil-CoA e succinil-CoA.

O etilbenzeno é degradado por bactérias sob condições desnitrificantes e sulfato-redutoras. Em condições desnitrificantes, o etilbenzeno é inicialmente ativado para a degradação através de uma reação de desidrogenação do carbono ligado ao anel pertencente ao grupo etil da cadeia lateral, pela etilbenzeno desidrogenase, produzindo ( S )-1-feniletanol, cujo grupo hidroxila é proveniente de uma molécula de água. O ( S )-1-feniletanol sofre uma segunda oxidação, formando uma acetofenona que, em seguida, é metabolizada a 3-fenil-3oxopropionato (benzoil acetato), tioesterificada com CoA e, tioliticamente clivada em acetilCoA e benzoil-CoA (Figura 10a), (RABUS et al., 2002).

O (a)

O OH

2[H]

H2O

-

COO

HSCoA COO COO

Benzoil-CoA

-

COO

SCoA

-

O 1-(feniletil) O succinil-CoA

1-(feniletil) succinato

-

Rearranjo

SCoA

2-(fenilpropil) malonil-CoA

CO 2

fumarato

COO

O

Acetil-CoA  benzoil acetil-CoA

benzoil acetato

acetofenona

COO

-

O

CO 2

2[H]

(b)

etilbenzeno

SCoA

CO 2

(S)-(-)-1-feniletanol

etilbenzeno

O

O

OH

SCoA

-

SCoA degradação  pos terio r 

O 2-fenilpropionil-CoA

Ciclo de Krebs

HSCoA

SCoA O 3-oxo-4-fenil pentan oil-CoA

H2O

O

SCoA O

2[H]

2[H]

4-fenilpentanoil-CoA

SCoA

acetil-CoA

Figura 10 – Etapas iniciais da via de degradação anaeróbia do etilbenzeno. (a) Via proposta  para degradação anaeróbia sob condições denitrificantes. (b) Via proposta para degradação anaeróbia sob condições sulfato redutoras. Figura modificada de Harayama et al. (2004).

 Na via de degradação anaeróbia, em condições sulfato redutoras, as modificações das cadeias laterais assemelham-se às sugeridas para a degradação anaeróbia de n-alcanos. O etilbenzeno é ativado pela adição de uma molécula de fumarato, formando (1-fenil-etil) succinato. Esse  produto é tioesterificado sob condições energéticas, transformado em 1-(fenil-etil)-succinilCoA, cujo esqueleto de carbono do tioester é rearranjado para permitir uma

-

descarboxilação, formando então 4-fenilpentanoil-CoA (Figura 10b). A rota metabólica para degradação desta última molécula ainda não está completamente elucidada. Essa via regenera o fumarato que pode ser reutilizado na ativação de outras moléculas de etilbenzeno. A etapa de ativação da molécula nessa via metabólica alternativa, similar àquela do tolueno descrita

anteriormente, pode ser justificada pela diferença entre os potenciais de redox dos respectivos aceptores de elétrons nitrato e sulfato (Figura 7) (KNIEMEYER et al., 2003). A degradação anaeróbia dos três isômeros estruturais do dimetilbenzeno ( meta, orto e para xilenos) tem sido predominantemente estudada sob condições nitrato e sulfato redutoras. A completa mineralização por culturas microbianas tem sido relatada para todos os xilenos, com exceção do  p-xileno, cujos estudos de biodegradação na ausência de oxigênio estão relacionados a consórcios bacterianos (ZHANG & BENNETT, 2005). As reações iniciais envolvidas na oxidação anaeróbia do m-xileno são similares às de degradação do tolueno e envolvem a adição inicial de uma molécula de fumarato em um dos grupos metil para formar 3-metilbenzilsuccinato, que é posteriormente oxidado a 3metilbenzoato (Figura 11). A adição do fumarato é catalisada pela enzima 3metilbenzilsuccinato sintase, que, assim como a benzilsuccinato sintase (degradação do tolueno), retém um átomo de hidrogênio do grupo metil durante a reação. De forma semelhante o o-xileno é oxidado (Figura 11) (KRIEGER, 1999).

-

OOC

CH

CH

COO-

CH2

OOC

fumarato CH3

-

CH

CH3

CH2

COO

-

CH3 3-metilbenzilsuccinato

m-xileno -

OOC

CH

CH2

COO

-

fumarato CH3

-

OOC

CH

CH

CH3

o-xileno

COO-

CH2 CH3

2-metilbenzilsuccinato

Figura 11 – Etapas iniciais das vias de degradação das moléculas m-xileno e o-xileno. A degradação dos xilenos ocorre inicialmente através da reação de adição do fumarato a um dos grupos metil, produzindo o metilbenzilsuccinato correspondente. A formação do intermediário benzoil-CoA, a partir dessa molécula, é semelhante ao ocorrido na via de degradação anaeróbia do tolueno (Figura 9).

O processamento do metilbenzilsuccinato formado é semelhante ao descrito para o  benzilsuccinato, formado durante a degradação anaeróbia do tolueno (Figura 9). Os produtos formados são metabólitos centrais da célula (LEUTWEIN & HEIDER, 1999).

2.2.2.2.2 OXIDAÇÃO DOS INTERMEDIÁRIOS CENTRAIS DA DEGRADAÇÃO ANAERÓBIA DOS BTEX

O produto intermediário comum das vias de degradação anaeróbia dos BTEX é o benzoilCoA. O anel aromático do benzoil-CoA é reduzido pela benzoil-CoA redutase e,  posteriormente, é clivado por hidrólise (HARAYAMA et al., 2004). A molécula formada é degradada por  -oxidação, produzindo três moles de acetil-CoA, um metabólito central do ciclo de Krebs, e um mol de CO 2 para cada mol de hidrocarboneto, como mostrado na Figura 12 (HOLLIGER & ZEHNDER, 1996).

O C

SCoA

O C

SCoA

O C

SCoA

O

O -

Benzoil-CoA 4 e

REDUÇÃO

C

SCoA COOH

3 Acetil-CoA + CO 2

H2O

HIDRÓLISE

-OXIDAÇÃO

Figura 12 – Esquema da via de degradação anaeróbia do intermediário central comum das vias: benzoil-CoA. O benzoil-CoA sofre redução, produzindo produtos alicíclicos, para  posteriormente, ser clivado por hidrólise. Os produtos lineares formados são transformados no metabólito central, acetil-CoA, por meio da -oxidação.

2.2.3 MECANISMOS DE REGULAÇÃO ENZIMÁTICA DAS VIAS CATABÓLICAS RELACIONADAS À DEGRADAÇÃO BACTERIANA DOS BTEX

As bactérias regulam o metabolismo em resposta a uma ampla variedade de flutuações ambientais, incluindo alterações de temperatura, pH, nível de oxigênio, nutrientes e até variações na densidade populacional. Existem dois mecanismos básicos de regulação em uma célula. Um destes controla a atividade de uma enzima pré-existente, denominado regulação  pós-traducional. O outro tipo de regulação controla os níveis da proteína, ou mesmo sua  presença e ausência, sendo o controle, portanto, ao nível transcricional ou traducional. A inibição da atividade enzimática pode ser obtida através de vários processos, entre eles:  processamento de enzimas sintetizadas na forma inativa, inibição por retroalimentação (feedback) e modificação enzimática pela adição covalente de grupos específicos, como o adenosina monofosfato (AMP) e o desoxiadenosina monofosfato (DMP). A inibição por  retroalimentação é um dos principais mecanismos de regulação da atividade enzimática.  Nesse caso, o produto final de uma via pode vir a inibir a atividade de uma enzima do início da via, regulando sua própria biossíntese. A ligação desse produto em um sítio diferente do sítio ativo da enzima, chamado sítio alostérico, modifica a estrutura da proteína, reduzindo sua eficiência de ligação ao substrato. Esse processo é revertido, quando o nível do produto final cai, alterando o equilíbrio da reação (MADIGAN et al., 2004). A inibição da atividade enzimática é um mecanismo de regulação bastante refinado, muito comum para enzimas constitutivas, essenciais no metabolismo da célula, sendo sintetizadas continuamente, mantendo concentrações semelhantes em todas as condições de crescimento. Por outro lado, as enzimas induzidas, são necessárias apenas em determinadas reações enzimáticas. Sendo assim, a síntese dessas enzimas ocorre somente sob condições específicas, sofrendo uma grande influência dos mecanismos de controle da expressão gênica (MADIGAN et al., 2004). As bactérias apresentam um extensivo repertório de genes metabólicos e regulatórios, responsáveis pela grande capacidade de adaptação desses microrganismos a diferentes ambientes aeróbios e anaeróbios. Os genes relacionados às vias de degradação de hidrocarbonetos monoaromáticos e outros xenobióticos expressam, em geral, enzimas induzidas, e estão sujeitos a pelo menos três tipos de regulação da síntese enzimática:

mecanismos de resposta específica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais (Figura 13) (SHINGLER, 2003).

Figura 13 – Esquema ilustrativo da rede de processos e sinais que regulam a capacidade metabólica de degradação bacteriana dos compostos aromáticos, evidenciando os três tipos de regulação gênica: mecanismos de resposta específica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais (modificado de SHINGLER, 2003). Primeiramente, diversos reguladores transcricionais têm as atividade controlada por sinais ambientais, entre eles, os compostos aromáticos. As proteínas regulatórias específicas e  promotores permitem que os operons catabólicos sejam transcritos apenas e em nível suficiente para garantir uma adequada resposta metabólica ao substrato particular presente em abundância no meio, que possa servir como fonte de carbono e energia. São várias as proteínas regulatórias de transcrição envolvidas no metabolismo dos BTEX (Tabela 3). Estas proteínas são capazes de responder a uma gama de compostos, em geral, substratos específicos ou intermediários das vias de degradação, denominadas moléculas efetoras. A ativação de sinal para os membros da família LysR, por exemplo, é relativamente específica, estando relacionada a algum intermediário produzido no início da via. No caso do CatR, proteína regulatória da via de orto-clivagem de degradação do catecol, a síntese de

Tabela 3 – Proteínas regulatórias representativas envolvidas no metabolismo dos BTEX (adaptada de SHINGLER, 2003).

Proteína Família

54

Via de degradação

Bactéria/Plasmídeo

Referência

-dependente

TbuT TouR

Tolueno Tolueno

XylR

Tolueno/xileno

 R. pickettii PKO1 P. stutzeri OX1 P. putida mt-2 (TOL

 pWW0)

Byrne & Olsen (1996) Arenghi et al. (1999) Inouye et al. (1988)

Sistema de dois componentes

TodS/ TodT

Tolueno

P. putida F1

Lau et al. (1997)

P. putida WCS358 P. putida mt-2 (TOL

Bertani et al. (2001) Spooner et al. (1986)

Família AraC / XylS

PobC XylS BenR

4-Hidroxibenzoato Tolueno

 pWW0)

Benzoato

P. putida

Cowles et al. (2000)

Catecol

P. putida

Rothmel et al. (1990)

Família LysR

CatR

 R. Ralstonia e P. Pseudomonas

catecol 1,2-dioxigenase é induzida pelo produto de sua ação, o cis,cis-muconato (SHINGLER, 2003). Já as proteínas regulatórias que respondem a substratos primários podem ser menos específicas, respondendo a vários compostos estruturalmente análogos, não susceptíveis à metabolização, como, por exemplo, o XylR. A proteína XylR, codificado por gene do operon TOL presente no plasmídeo pWWO do catabolismo de tolueno e xileno, pertence a uma extensa família de ativadores transcricionais, a família 54-dependente. Ela atua se ligando a elementos “enhancer” e regulando a transcrição a partir de um grupo distinto de promotores reconhecidos pela holoenzima RNA polimerase - 54 (Tabela 3). Os fatores correspondem a subunidades da RNA polimerase responsáveis pelo reconhecimento do promotor. A proteína XylR ativa o promotor Pu do operon do plasmídeo pWW0 para conversão do tolueno e m/pxilenos a benzoato e alquilbenzoatos correspondentes, mas também responde a compostos análogos estruturalmente, como benzil álcoois e benzil aldeídos cloro e alquil substituídos (SHINGLER, 2003). Os mecanismos de resposta específica respondem não apenas a sinais específicos p resentes no meio, mas também aos mecanismos de resposta global, que constituem um segundo nível de

regulação da expressão gênica. Os circuitos de regulação global podem sobrepor os mecanismos regulatórios específicos, acoplando os níveis de transcrição gênica ao estado fisiológico e metabólico da bactéria (Figura 13) (PRIETO et al., 2004). Os mecanismos de resposta global são mecanismos regulatórios que respondem aos sinais ambientais regulando a expressão de muitos genes. Um dos mecanismos de resposta global mais estudado é a repressão catabólica. Na repressão catabólica, a síntese de várias enzimas não relacionadas, principalmente as catabólicas, é inibida quando as células encontram-se em um meio contendo uma fonte de carbono mais prontamente utilizável, tal como a glicose. A repressão catabólica foi inicialmente denominada efeito glicose, porque a glicose foi a  primeira substância descrita com capacidade de iniciar a repressão enzimática. O exemplo deste sistema mais bem caracterizado está relacionado ao catabolismo da lactose em  Escherichia coli, em que a glicose atua desde o controle da entrada da lactose na célula até a

inibição da transcrição das enzimas catabólicas (MADIGAN et al., 2004).  No caso das bactérias pseudomonas, os substratos preferenciais que exercem a repressão catabólica são o acetato e os intermediários do ciclo de Krebs, como o succinato, piruvato, succinil e acetil-CoA (COLLIER et al., 1996). O succinato tem sido usado como o componente modelo para estudar a repressão catabólica de compostos aromáticos (DUETZ et al., 1994). Em Pseudomonas putida mt-2, succinato reprime a expressão da via para o catabolismo de tolueno e xileno ao nível transcricional e, numa menor extensão, a via de meta-clivagem (DUETZ et al., 1994). Müller et al. (1996) demonstrou que succinato também reprime a transcrição da via de meta clivagem codificada por genes cromossômicos de P.  putida linhagem H.

A glicose reprime a transcrição de genes da via de degradação do tolueno (operon TOL)  presentes no plasmídeo pWW0. Esse mecanismo de repressão catabólica está relacionado à ação de genes  pts, que codificam componentes de um sistema PTS (sistema fosfotransferase) alternativo não ligado geneticamente ao operon da via, provavelmente interceptando o circuito de regulação XylR por uma rota diferente. Apesar de serem mecanismos frequentemente observados na regulação das vias catabólicas de pseudomonas, pouco se conhece sobre seus mediadores ou detalhes do processo (revisado por SHINGLER, 2003). Poucas proteínas já foram relatadas como participantes da repressão catabólica em  pseudomonas, mas sabe-se que o controle desse mecanismo é independente de cAMP

(MAcGREGOR et al., 1991). Morales et al. (2004) demonstrou que a proteína Crc (“catabolite repression control”), a primeira descrita, está envolvida não apenas no controle da expressão de genes implicados no metabolismo de alguns açúcares e compostos nitrogenados, mas também na expressão de genes pertencentes a vias centrais relacionadas com o metabolismo de compostos aromáticos. Entre os genes modulados negativamente pelo Crc estão alguns requeridos para assimilação do benzoato, pela via do catecol, e do 4-OH benzoato, pela via do protocatecuato. Além dos mecanismos de resposta específica e global, Shingler (2003) relata um terceiro nível de regulação em que os compostos aromáticos podem impactar o desempenho do catabolismo provocando respostas comportamentais. Respostas quimiotáticas à presença de compostos aromáticos têm sido descritas sendo induzidas coordenadamente com os genes relacionados ao seu catabolismo, sugerindo uma estratégia bacteriana integrada para se locomover em direção aos compostos aromáticos e degradá-los (Figura 13) (PANDEY & JAIN, 2002, PARALES & HARWOOD, 2002). O mecanismo da quimiotaxia é complexo e envolve muitas proteínas. As bactérias empregam um tipo de sistema de dois componentes para detectar as alterações na concentração de um agente químico, regulando assim, a movimentação flagelar. No sistema de dois componentes, o sinal externo não é diretamente transmitido à proteína regulatória, sendo detectado  primeiramente por uma proteína sensora específica e, então, transmitido de forma alterada a uma proteína reguladora de resposta (MADIGAN et al., 2004). As proteínas sensoras envolvidas no mecanismo da quimiotaxia são denominadas proteínas quimiotáticas aceptoras de metil (PQM), sendo todas proteínas transmembranas. A maquinaria quimiotática de algumas bactérias envolve várias proteínas: em P. putida já foram relatadas 25 ou mais PQMs, em comparação com as cinco enzimas relatadas em  E. coli (PARALES & HARWOOD, 2002). As enzimas PQMs estão em contato com as proteínas citoplasmáticas, CheA e CheW. Ao se ligar a um agente qu ímico, as PQMs transmitem o sinal detectado, juntamente com CheW, através de mudanças conformacionais para a proteína citoplasmática CheA, uma enzima histidina autoquinase que atua como doadora do grupo fosforil para outras proteínas reguladoras de resposta, que através de uma cascata de fosforilação, afetam o movimento de rotação flagelar (MADIGAN et al., 2004).

Em alguns casos, os componentes sensoriais de resposta a compostos aromáticos são cotranscritos com os genes requeridos para o seu catabolismo. Esse é o caso do componente sensorial NahY PQM-similar, relacionado ao sistema de quimiotaxia de P. putida direcionada ao naftaleno. Em P. putida F1, o tolueno foi capaz de induzir respostas quimiotáticas a uma larga variedade de compostos, inclusive alguns não metabolizados pela via TOD. Nesse sistema, mutantes defeituosos quanto ao catabolismo do tolueno retiveram a resposta quimiotática, enquanto a inativação de sistema regulatório TodS/TodT abolia a resposta quimiotática (revisado por PARALES & HARWOOD, 2002, SHINGLER, 2003). Existem vários trabalhos e revisões que tratam dos mecanismos de regulação das vias de degradação de compostos aromáticos (TROPEL & VAN DER MEYER, 2004, MORALES et al., 2004, PRIETO et al., 2004, SHINGLER, 2003) . Trabalhos experimentais de investigação da capacidade catabólica de microrganismos específicos ou grupos de microrganismos relatam interações entre substratos aromáticos, capazes de aumentar ou diminuir a capacidade metabólica de uma linhagem. Gülensoy & Alvarez (1999) relataram a ocorrência de interações benéficas ao testar a capacidade de degradação de BTEX de 55 linhagens de bactérias. Esses autores observaram que muitas linhagens apresentavam-se incapazes de degradar alguns desses compostos quando eles estavam isolados no meio, apresentando tal capacidade apenas quando os mesmos encontravam-se concomitantes, indicando a interação benéfica entre os substratos. As interações benéficas entre substratos podem aumentar a capacidade catabólica de diversas linhagens, possivelmente induzindo enzimas das vias de degradação ou por mecanismos de co-oxidação. A molécula de tolueno é, em geral, um bom indutor de enzimas, sendo capaz de  promover a degradação de outros BTEXs em condições aeróbias e desnitrificantes. Entretanto, já foi reportado que o tolueno, em alguns casos pode ser um inibidor competitivo da degradação do benzeno (revisado por GÜLENSOY & ALVAREZ, 1999). O conhecimento dos mecanismos regulatórios que controlam a expressão das vias catabólicas relacionadas à degradação bacteriana dos BTEX é de grande importância para aplicação desses microrganismos em processos de biorremediação. O entendimento desses mecanismos  permite a obtenção de mutantes que perderam a capacidade de inibir a síntese de determinadas proteínas reguladoras e, portanto, que sejam capazes de produzir as enzimas das

vias de degradação de hidrocarbonetos aromáticos, até então enzimas induzidas, de forma constitutiva. Além disso, algumas proteínas regulatórias do catabolismo de compostos aromáticos são capazes de detectar no ambiente os níveis de substratos aromáticos cujas vias de catabolismo fazem parte do maquinário celular ao qual pertencem. Por essa propriedade, essas proteínas reguladoras sensoriais podem ser incorporadas a biossensores celulares para o monitoramento de poluentes biodegradáveis em ambientes contaminados (KEANE et al., 2002, HAY et al., 2000). Em geral, essas células utilizadas como biossensores acoplam promotores relacionados a genes das proteínas regulatórias com um gene repórter, cuja expressão é detectada através de fluorescência ou bioluminescência. Tais microrganismos constituem potenciais sistemas  para mensurar a qualidade de águas, solos e atmosferas (TROPEL & VAN DER MEER, 2004, SHINGLER, 2003).

2.3 A BIORREMEDIAÇÃO COMO ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE ÁREAS CONTAMINADAS POR BTEX

As atividades antropogênicas têm sido as principais responsáveis pelo lançamento de quantidades consideráveis de hidrocarbonetos no ambiente. Muitos desses compostos são altamente tóxicos aos seres humanos, fauna e flora locais e, por isso, a necessidade de remoção desses hidrocarbonetos dos meios contaminados. Métodos físicos e químicos comumente usados, alguns deles já descritos neste trabalho, não são sempre efetivos na remoção dos compostos e, muitas vezes, podem acabar gerando compostos poluentes adicionais. Sendo assim, a remoção desses compostos através da atividade microbiana tem sido estudada como uma alternativa bastante interessante, quando comparada aos tratamentos convencionais, visto que é economicamente viável e, em geral, não deixa resíduos secundários. Um eficiente processo de biodegradação envolve fatores relacionados às condições ambientais e à microbiota disponível. Entre as condições ambientais, além dos fatores requeridos para o crescimento microbiano (atividade de água, temperatura, pH, pressão, fontes de C e N, entre outros), algumas características relacionadas aos compostos contaminantes podem limitar o processo de biodegradação: biodisponibilidade, toxicidade e concentração (BOSSERT & COMPEAU, 1995). A biodisponibilidade dos compostos é de extrema relevância, pois, para que ocorra a degradação, o composto deve estar livre no meio, de forma que possa ser transportado para o interior da célula. Entre os contaminantes orgânicos é muito comum a adsorção dos compostos em partículas do solo, ficando parcialmente indisponíveis para o microrganismo. Esse fenômeno é comum entre compostos apolares, cuja solubilidade em água é muito baixa (ex. n-alcanos de cadeia longa). No caso dos BTEX, a adsorção não é tão preocupante, visto que tais compostos, como tratado na introdução deste trabalho, apresentam solubilidade relativamente alta em água (Tabela1). A concentração e a toxicidade do contaminante também devem ser estimadas, de forma a não inibir o crescimento bacteriano. Além disso, a presença de compostos bioquimicamente incompatíveis com o catabolismo efetivo do composto alvo, isto é, misturas inibitórias,  podem inibir o processo.

Por fim, a microbiota disponível deve apresentar resistência aos compostos contaminantes e  possuir as vias metabólicas para degradação dos mesmos. Todos os fatores citados anteriormente devem ser analisados em conjunto a fim de decidir se o tratamento dos resíduos deve ocorrer  in situ ou ex situ (ex. biorreator), além de auxiliar na escolha do tipo de estratégia adotada para o processo de biorremediação (bioestimulação, bioaumentação, condições aeróbias ou anaeróbias etc). A pesquisa de microrganismos com potencial de degradação dos BTEX e das vias metabólicas envolvidas é de alta relevância não apenas para a compreensão dos processos de  biorremediação, mas também para a obtenção de microrganismos, que podem ser utilizados como inoculantes, com alto potencial de degradação e características de adaptabilidade. Além disso, o estudo de interferentes dos processos é de alta relevância, visto que o uso dessa microbiota potencialmente degradadora de hidrocarbonetos requer o entendimento de todos os aspectos fisiológicos, microbiológicos, ecológicos e bioquímicos envolvidos na transformação dos poluentes. Assim, é possível desenvolver técnicas que permitam o uso eficiente desses microrganismos no campo.

2.3.1 TÉCNICAS DE ESTUDO DE MICRORGANISMOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM PROCESSOS DE BIORREMEDIAÇÃO

Entre as técnicas de estudo dos microrganismos com potencial uso em processos de  biorremediação encontram-se as técnicas tradicionais de cultivo, isolamento e caracterização fisiológica, morfológica e bioquímica, e as técnicas de Biologia Molecular. As técnicas tradicionais de cultivo apresentam uma grande limitação: apenas uma pequena porcentagem de microrganismos presentes no ambiente é capaz de crescer sob condições laboratoriais. A necessidade de desenvolver novas técnicas de cultivo com a finalidade de isolar algumas  bactérias que não são cultiváveis em meios tradicionais é eminente. Alguns pesquisadores têm utilizado preferencialmente meios de cultura oligotróficos para crescimento de microrganismos isolados de ambientes naturais, em detrimento dos meios ricos em fontes de carbono. Button et al . (1993), utilizando como meio de cultura a água do mar, foram capazes de obter uma recuperação de 2-60% das bactérias presentes no ambiente marinho, taxa superior à encontrada normalmente utilizando métodos de cultivo tradicionais (menor do que

0,1%). Wang et al . (1996) isolou a bactéria oligotrófica Cycloclasticus oligotrophus capaz de degradar hidrocarbonetos aromáticos, utilizando a mesma técnica. Uma segunda explicação da incapacidade de serem cultivados poderia estar relacionada com o fato de tais microrganismos não serem capazes de crescer em culturas puras, considerando que requerem para seu crescimento substâncias produzidas por outros microrganismos. Além desses dois fatores, muitos outros têm sido apontados como interferentes, entre eles a ausência de fatores de crescimento, danos por estresses oxidativos e indução da ação de fagos lisogênicos durante períodos de inanição (revisado por HARAYAMA et al., 2004). Uma variedade de metodologias foi desenvolvida nos últimos anos para o estudo da estrutura da comunidade microbiana, dentre outras, a análise de atividade enzimática; a análise de perfil de proteínas celulares, de componentes da parede celular ou da cadeia respiratória, como a análise de ácidos graxos metil-ester e ácidos graxos fosfolipídicos (RAJENDRAN et al., 1992); e análise de ácidos nucléicos, DNA total ou RNA ribossomal da comunidade (ANDERSON & CAIRNEY, 2004). As técnicas de Biologia Molecular têm permitido uma melhor estimativa da diversidade microbiana nos ambientes, o que não foi possível durante muito tempo utilizando apenas as técnicas tradicionais de cultivo. Várias técnicas moleculares que têm como alvo o estudo do gene da subunidade 16S do RNA ribossomal (rDNA) de bactérias vêm sendo utilizadas. Os métodos para a análise comparativa de seqüências de rDNA incluem, geralmente, etapas de extração de DNA da amostra e amplificação das seqüências de interesse pela reação em cadeia polimerase (PCR), utilizando iniciadores com a especificidade desejada. As seqüências amplificadas podem ser clonadas e seqüenciadas ou analisadas com base em seus perfis eletroforéticos. Por sua vez, os principais métodos usados para a obtenção de perfis eletroforéticos relacionados com a filogenia são a ARDRA ("Amplified rDNA restriction analysis"), que se baseia no princípio de que os sítios de restrição no operon do rRNA são conservados; a DGGE/TGGE ("Denaturing or temperature gradient gel electrophoresis"), que fornece informações sobre a variação na seqüência em uma mistura de fragmentos de PCR de comprimento idêntico com base na mobilidade diferencial em um gel de acrilamida com gradiente de desnaturante crescente ou de temperatura crescente (EICHNER et al., 1999); a análise de polimorfismo de conformação das fitas simples do DNA amplificado (SSCP), que se baseia na mobilidade eletroforética diferenciada das estruturas dobradas do ssDNA

(STACH et al., 2001); análises de restrição do DNA ribossomal marcado terminalmente (TRFLP); e a técnica de hibridização local – FISH (fluorescence in situ hybridization), cujas sondas têm como alvo moléculas de rRNA. Essas técnicas representam grandes avanços nesta área e têm sido introduzidas no estudo da ecologia microbiana, revelando uma enorme diversidade antes inesperada, principalmente, em relação a ambientes pouco explorados como o ambiente marinho (HARAYAMA et al., 2004). Técnicas moleculares que têm como alvo de estudo genes relacionados com metabolismo específico dos microrganismos têm sido muito utilizadas, juntamente com os testes de  biodegradação laboratoriais, para determinação do potencial catabólico microbiano. Cavalca, et al. (2000) estudaram populações de microrganismos potencialmente degradadores de BTEX em subsolos contaminados por esses compostos. Esses autores isolaram quinze linhagens de bactérias dos gêneros Pseudomonas e  Alcaligenes, cujo DNA extraído foi submetido à PCR visando a amplificação de genes-chave no processo de biodegradação por  diferentes vias catabólicas: catecol 2,3 dioxigenase ( xylE ), tolueno dioxigenase (subunidade maior da enzima) ( todC1) e ( xylA,M ). A amplificação desses genes é conseguida através da utilização de iniciadores consenso, determinados através da análise de seqüências gênicas alvo de bactérias modelo. Os resultados dos testes moleculares, tanto de identificação de microrganismos, quanto de detecção da atividade biodegradadora devem ser sempre acompanhados de testes tradicionais. Em um trabalho com linhagens isoladas de reservatório de Petróleo, Cunha, et al. (2006) obtiveram alguns resultados divergentes entre os testes moleculares e ensaios tradicionais de cultivo e degradação, indicando que mais estudos devem ser realizados a fim de determinar  seqüências de oligonucleotídeos iniciadores para grupos de microrganismos potencialmente degradadores, mas pouco explorados, e também, para novos genes (e, consequentemente, novas enzimas) que podem estar envolvidos no catabolismo dessas espécies. Para os testes tradicionais de biodegradação, as culturas isoladas são crescidas em meios contendo indutores de enzimas das vias catabólicas as quais se deseja explorar, e também crescidas em meios contendo hidrocarbonetos como fonte exclusiva de carbono. Os testes de  biodegradação podem ser realizados através de métodos qualitativos, que consistem na observação a olho nu de alteração no meio pelo crescimento microbiano, como, por exemplo, a alteração de uma película de óleo sobre a superfície do meio de cultura, muito usado como teste de triagem, e métodos quantitativos, como a detecção inicial e final das concentrações

dos hidrocarbonetos adicionados ao meio através de técnicas de cromatografia (ex. cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta performance), detecção de produtos intermediários comuns a várias vias catabólicas, testes de cinética utilizando extratos enzimáticos das culturas induzidas, entre outros. O monitoramento da ocorrência de biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos pode ser  feito através de biomarcadores: intermediários específicos de vias metabólicas. Uma vez detectados no ambiente, podem ser indicativos da presença de uma população microbiana ativa utilizando o composto contaminante. Para ser utilizado como biomarcador, a substância deve ser detectável em amostras de solo, água e sedimentos, deve ser específica para uma via catabólica particular e não deve ser gerada, em geral, por atividade antropogênica. Exemplos de biomarcadores comumente utilizados são o benzilsuccinato, para oxidação de tolueno e metilbenzilsuccinato, para xilenos (CHAKRABORTY & COATES, 2004).

2.3.2 EXEMPLOS DE PROCESSOS DE BIORREMEDIAÇÃO EM DIFERENTES AMBIENTES CONTAMINADOS POR BTEX

Existem vários relatos na literatura de processos de biorremediação bem suscedidos em diversos tipos de ambientes. Bradley & Chapelle (1995) demonstraram a aplicabilidade de técnicas de biorremediação em um aquífero no Alaska. Esses autores conseguiram observar  uma rápida mineralização de tolueno, a 5ºC e sob condições aeróbias, no sedimento do aqüífero contaminado por petróleo. As taxas de mineralização conseguidas por estes autores foram comparáveis às descritas para aqüíferos temperados (~20ºC), indicando que o processo de biorremediação in situ não é prejudicado pela temperatura, nessa situação. Em um trabalho de investigação da biodegradação de BTEX em solos alpinos a 10ºC, foi observada uma redução de contaminantes significativamente mais baixa (76%) do que a observada em solos temperados (20ºC), ao contrário do observado por Bradley & Chapelle (1995) (revisado por MARGESIN & SCHINNER, 2001). Trabalhos envolvendo bactérias termófilas demonstraram que, predominantemente, os  bacilos, possuem um grande potencial para a conversão de poluentes ambientais, incluindo todas as grandes classes (MÜLLER et al., 1998). Taylor et al. (1998) patentearam um

 processo de descontaminação onde há o acoplamento da técnica de “stripping” à técnica de  biorremediação utilizando microrganismos termófilos, para rápido tratamento de solos a grandes profundidades. Uma descontaminação primária é realizada submetendo uma parcela do solo a aquecimento (através da injeção de vapor e resistência elétrica) para vaporização de  parte dos contaminantes, removidos por extração a vácuo. A parcela residual, não extraída com a vaporização, é então metabolizada por microrganismos termófilos, visto que o ambiente ficaria aquecido por um tempo longo após a primeira etapa de remoção dos contaminantes. Processos de biorremediação intrínseca em solos áridos de desertos têm sido estudadas,  principalmente em áreas onde ocorrem comumente guerras e onde existe grande atividade de extração de petróleo. Um grande problema nesses locais é a necessidade de irrigação constante do meio. O uso de água do mar para o processo de irrigação é prejudicial por  aumentar a salinidade, inibindo o processo de biodegradação, enquanto o uso de água continental nos solos desérticos leva a um processo de lixiviação, reduzindo a salinidade do solo. O uso de água salina diluída (0,5%m/v) e reflorestamento têm sido testados como alternativas aprazíveis na biodegradação dos hidrocarbonetos contaminantes de solos desérticos (revisado por MARGESIN & SCHINNER, 2001). Alguns trabalhos na literatura relatam a eficiência dos processos de biorremediação, em condições anaeróbias, em aquíferos cuja concentração de oxigênio é muito baixa (BAKER et al., 1987, BATTERMAN, 1983). Os processos anaeróbios são muito utilizados para depuração de águas residuárias municipais e industriais, principalmente em biorreatores, devido ao seu menor custo e eficiência comprovada. Entretanto, eles têm recebido menor  atenção em relação aos aeróbios, quanto a detoxificação de sítios contaminados por petróleo e derivados (ZHANG & BERNETT, 2005). Os exemplos anteriores justificam a necessidade de mais pesquisas relacionadas às técnicas d e  biorremediação, não apenas em áreas cujas características do meio são adversas ao crescimento microbiano, mas em todos os tipos de ambientes, em condições aeróbias e anaeróbias, visto que cada situação é única, e generalizações nem sempre são satisfatórias. Demonstrações da biodegradação dos BTEX no campo, em ambientes continentais e marinhos, são necessárias para aumentar nossos conhecimentos sobre a eficiência desse  processo.

2.4 PERSPECTIVAS QUANTO AO USO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA CONSTRUÇÃO DE LINHAGENS COM AMPLA CAPACIDADE DE DEGRADAÇÃO

A utilização de microrganismos como alternativa para o tratamento de ambientes contaminados tem sido bem vista por boa parte dos estudiosos, levando em consideração a grande capacidade microbiana de adaptação e utilização de vários tipos de compostos como fonte de carbono. As várias evidências de detoxificação natural de ambientes contaminados nos levam a reconhecer o papel da microbiota indígena na degradação dos compostos contaminantes. Entretanto, cada vez mais, a quantidade de resíduos lançados no ambiente tem sido maior, bem como o número de compostos recalcitrantes que acompanham essa contaminação, o que dificulta a ação microbiana. A utilização da tecnologia do DNA recombinante para obtenção de microrganismos geneticamente modificados (MGMs) com múltiplas capacidades de degradação tem sido vista como uma alternativa para biorremediação de ambientes contaminados por xenobióticos recalcitrantes, a maioria associada às áreas de despejo de resíduos industriais. Linhagens recombinantes, apesar de alguns resultados de sua aplicação ainda serem discutíveis, têm sido exploradas e apresentaram algum sucesso no aumento do desempenho de bactérias da microbiota indígena. Como discutido na seção anterior, a presença de poluentes no ambiente altera a estrutura das comunidades microbianas indígenas estimulando, principalmente, o aumento de classes de microrganismos resistentes aos contaminantes. Essa resistência, especialmente em relação aos compostos orgânicos aromáticos, dá-se, por exemplo, por alterações na composição das membranas lipídicas bacterianas (citoplasmática e membranas externas). Equipar bactérias solvente-tolerantes com maquinarias catabólicas apropriadas pode ser um avanço promissor   para os propósitos da biorremediação (PIEPER & REINEKE, 2000). A obtenção de recombinantes utilizando bactérias adaptadas a ambientes específicos foi realizada por Lange et al. (1998). Estes autores construíram uma bactéria recombinante  Deinococcus radiodurans, um dos organismos mais resistentes à radiação que se conhece,

através da clonagem dos genes tod  em seu cromossomo. Essa bactéria recombinante é capaz de expressar a enzima tolueno dioxigenase (TOD) e apresenta a habilidade de degradar  tolueno, clorobenzeno, 3,4-dicloro-1-buteno e indol.

Outro exemplo de tentativas de obtenção de bactérias recombinantes capazes de promover a  biorremediação em ambientes extremos poluídos foi a clonagem de genes relacionados às vias de degradação de hidrocarbonetos aromáticos em bactérias acidófilas  Acidophilium cryptum (QUENTMEIER & FRIEDRICH, 1994), A clonagem de genes de tolerância em bactérias com potencial de degradação de hidrocarbonetos aromáticos também é uma alternativa. Esta estratégia já foi realizada através da transferência do operon de  E. coli pro U  (um importante locus relacionado à osmorregulação) para linhagens de Pseudomonas capazes de degradar petróleo cru. O uso desses microrganismos na remediação de ambientes salinos reduz os custos com diluições e outros processos de purificação antes necessários para redução da salinidade (MARGESIN & SCHINNER, 2001). Uma outra estratégia para obtenção de recombinantes com capacidade superior de  biodegradação é a combinação de segmentos catabólicos de diferentes organismos em uma única linhagem, levando à obtenção de vias metabólicas completas em bactérias, antes incapazes de degradar completamente um composto xenobiótico, que produziam metabólitos intermediários ou até mesmo tóxicos. Outras formas de otimizar a biodegradação consiste no uso de mutações sitio-dirigidas que aumentam a atividade de enzimas das vias catabólicas, alteração de promotores, tornando-os mais fortes, e a alteração de mecanismos de regulação a favor dos processos de degradação dos contaminantes (PIEPER & REINEKE, 2000). Talvez uma das dificuldades do uso das linhagens recombinantes seja a instabilidade dos genes clonados quando os mesmos se encontram em plasmídeos. Uma solução para esse  problema tem sido a utilização de mini-transposons para integrar os genes nos cromossomos e estabilizá-los nas linhagens (PIEPER & REINEKE, 2000). Os avanços das técnicas moleculares permitirão obter mais informações sobre os mecanismos de degradação dos compostos aromáticos, estrutura e função de genes, promotores, moléculas reguladoras e enzimas, bem como novas rotas metabólicas, oferecendo maiores possibilidades à otimização dos processos catabólicos, através dos MGMs. Entretanto, apesar das linhagens recombinantes constituírem uma boa alternativa para uso nos processos biorremediadores, são necessários mais estudos para aplicação dessa microbiota no campo, a fim de evitar a geração de outros impactos ambientais, além da contaminação pelos xenobióticos pré-existentes.

3 CONCLUSÃO

A elevada taxa de mortalidade (cerca de 6,5 milhões de pessoas morrem de câncer  anualmente) e o fato de que os tratamentos para estas doenças serem dispendiosos, demorados e normalmente trazerem muito sofrimento aos doentes, expõem claramente os benefícios  potenciais do desenvolvimento de técnicas eficientes para a remoção de agentes tóxicos como os compostos BTEX do meio ambiente. Tendo em vista que a grande maioria dos compostos orgânicos derivados do petróleo  presentes no meio ambiente sofre modificações devido à ação dos microrganismos, a alternativa da biorremediação como processo de remoção desses resíduos tem sido amplamente aceita e estudada, considerando sua eficiência e custo relativamente baixo. Ainda existe uma grande necessidade de estudos a fim de determinar quais são os microrganismos biodegradadores, suas principais vias catabólicas e as condições ótimas para uma eficiente biodegradação desses poluentes (temperatura, nutrientes, pressão de oxigênio etc). Tais estudos possibilitam o desenvolvimento de técnicas que permitam o uso eficiente de microrganismos com alta capacidade de degradação no campo. Uma área ignorada pelos pesquisadores é a caracterização de culturas enriquecidas. Os consórcios bacterianos são particularmente importantes para a degradação de compostos considerados recalcitrantes. Por esse motivo, a elucidação da ecologia desses grupos de organismos é crítica. Também é necessário expandir as áreas de conhecimento quanto às diversas condições ambientais nas quais esses organismos podem estar presentes e que, eventualmente, podem estar sujeitas à contaminação por BTEX, entre elas encontram-se as condições extremófilas, apontadas anteriormente neste trabalho: áreas desérticas e áreas polares, altas profundidades no oceano, condições altamente salinas e de pHs variados. Além disso, também é importante delegar maior atenção aos processos de degradação em meios exauridos de oxigênio. Apesar dos processos de degradação de BTEX sob condições anaeróbias serem mais lentos do que aqueles que ocorrem em condições aeróbias, eles constituem um componente significante na remoção de poluentes devido à grande abundância

de outros aceptores de elétrons em relação ao oxigênio dissolvido e, em sistemas de  biorremediação, requerem menor intervenção humana. O crescente interesse pelos processos anaeróbios, somado aos recentes avanços na tecnologia molecular e bioquímica e na instrumentação analítica, permitirão que novas linhagens continuem sendo isoladas e novas enzimas e vias metabólicas, elucidadas. O isolamento e caracterização das enzimas e genes envolvidos no catabolismo de degradação dos compostos BTEX possibilitam, através da engenharia genética, a obtenção de microrganismos com potencial elevado de biodegradação, capazes de resistir bem às condições do meio e à competição com a microbiota natural do solo (SINGH & WALKER, 2006). Uma melhor compreensão dos mecanismos que controlam a expressão desses genes também é necessária por contribuir na descoberta de novos genes e proteínas envolvidas na regulação, podendo contribuir bastante na construção de MGMs com grandes habilidades para degradação dos compostos BTEX, que possam ser utilizados para otimização dos processos de biorremediação. Além disso, a maquinaria regulatória pode ser usada no desenvolvimento de técnicas de biomonitoramento, biosensores e dispositivos de biossegurança para controle ambiental.

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