158 PENENTUAN KREATININ DALAM URIN SECARA KOLORIMETRI DENGAN SEQUENTIAL INJECTION-FLOW REVERSAL MIXING (SI-FRM) MIXING (SI-FRM) Colorimetric Determination of Creatinine in Urin with Sequential Injection-Flow Reversal Mixing (SI-FRM) 1
1
1
Hermin Sulistyarti , Akhmad Sabarudin , Yudha Ikoma Istanti , Eka Ratri Noor Wulandari 1 Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
[email protected]
1
ABSTRAK Sequential injection analysis (SIA), generasi kedua dari sistem injeksi alir telah dikembangkan untuk penentuan kreatinin sebagai indeks medis kegagalan ginjal kronis. Pendeteksian kreatinin didasarkan pada reaksi Jaffe yang terjadi antara kreatinin dan asam pikrat dalam medium basa untuk membentuk senyawa berwarna merah-oranye. Absorbansi dari senyawa yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 530 nm. Dalam penelitian ini, suatu konsep baru dari SIA yang disebut “lab-at-valve” dikembangkan dengan menambahkan suatu Valve Mixing sebagai tempat untuk memaksimalkan pembentukan senyawa antara kreatinin dan alkali-pikrat. Parameter-parameter yang mempengaruhi metode ini antara lain laju alir produk, waktu delay , volume sampel, volume reagen, konsentrasi reagen dan senyawa pengganggu telah dipelajari secara rinci. Dari hasil penelitian diperoleh bahwa kondisi optimum akan tercapai pada laju alir 20 µL/detik, waktu delay 5 detik, komposisi penggunaan 100 µL sampel dengan 300 µL reagen (asam pikrat 0,03 M dan NaOH 3 %) sehingga limit deteksi pada penentuan kreatinin yang dihasilkan sebesar 3,01 µg/g. Aplikasi dari metode ini ditujukan untuk penentuan kreatinin dalam sampel urin. Kata kunci : Kreatinin, reaksi Jaffe, SI-VM, RGB kolorimetri, urin ABSTRACT Sequential injection analysis (SIA), a second-generation of Flow Injection system has been developed for the determination of creatinine as an index of chronic renal failure. Creatinine detection was measured by Jaffe’s reaction between creatinine and picrate in alkaline medium to form a colored product (red-orange). The absorbance was measured at wavelength of 530 nm. In this system, a new concept of SIA, called “lab-at-valve (LAV)”, has been developed by designing of a valve mixing to maximize formation of creatinine-alkaline picrate compound. The influence of variables such as effect of rate flow of product, delay time, sample volume, reagent volume, reagent concentration, and interference was investigated. The results showed that optimum conditions was obtained at flow rate of 20 µL/s, delay time of 5 s, the composition of 100 µL sample volume with 300 µL reagent volume (0.03 M picrate acid and 3 % NaOH) and detection limit of creatinine is 3.01 µg/g. Application of the proposed method was successfully applied to the determination of creatinine in urine samples. Keywords : Creatinine, : Creatinine, Jaffe’s reaction, SI-VM, RGB colorimetry, urine
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
159 PENDAHULUAN Dewasa ini,
antara tingginya
tingkat
kematian merupakan masalah utama bagi kesehatan memang
manusia. belum
Penyakit
mencapai
ginjal sepuluh
penyebab utama kematian di Indonesia, akan tetapi kelompok penyakit ini semakin banyak ditemukan pada berbagai jenis pelayanan kesehatan. Pola penyakit ini sering cepat berubah, sejalan dengan perubahan budaya.
kondisi
Dikemudian
sosial-ekonomihari,
diduga
di
Indonesia penyakit ginjal akan meningkat dalam jumlah dan kepentingan.
darah, terdapat pada seseorang yang ginjalnya sudah tidak berfungsi dengan normal. Senyawa ini dihasilkan ketika terjadi kontraksi pada otot. Dalam darah,
filtrasi
dihilangkan
melalui
dengan
glomerulus
proses
ginjal
dan
disekresikan dalam bentuk urin. Ginjal yang sehat menghilangkan kreatinin dari darah dan memasukkannya pada urin untuk dikeluarkan dari tubuh (Anonim, 2009). Analisis kadar kreatinin dalam tubuh merupakan indeks medis yang penting untuk mengetahui kondisi laju filtrasi glomerulus, keadaan ginjal, dan berfungsinya kerja otot (Spiritia, 2009) Metode yang sering digunakan untuk penentuan
kreatinin
adalah
metode
analisis secara kolorimetri melalui reaksi Jaffe. Reaksi Jaffe merupakan reaksi yang sederhana dan mudah. Metode ini didasarkan pada pembentukan senyawa berwarna
merah–oranye
yang
terjadi
pikrat
dengan
kreatinin
dalam suasana basa (Siangproh et al ., 2009). Dalam aplikasinya, reaksi Jaffe umumnya
dilakukan
menggunakan
batch
cara
dengan
asam
penangas
Metode
digunakan
menyempurnakan dengan
dengan
batch .
metode
sering
reaksi
untuk
Jaffe
mereaksikan pikrat
listrik,
kreatinin
dalam
namun
yaitu
suatu
dikarenakan
jumlah sampel yang dibutuhkan besar maka dibutuhkan jumlah reagen yang banyak dengan konsentrasi yang tinggi sehingga
Kreatinin adalah zat racun dalam
kreatinin
asam
mengakibatkan
dibutuhkan
waktu
untuk
yang
mencapai
kesempurnaan reaksi memerlukan waktu yang lama yaitu sekitar 30 menit (Faria & Pasquini,
1992).
Untuk
mengatasi
kelemahan pada metode batch
maka
diperkenalkan metode analisis berbasis teknik alir dengan menggunakan sistem
sequential
injection
Penggunaan
SIA
mempercepat
analysis ditujukan
proses
mengefisienkan
(SIA). untuk analisis,
penggunaan
reagen,
analisis secara otomatis dan memperkecil larutan
yang
menghemat harganya
dibuang
pemakaian mahal
sehingga
reagen
dan
yang
berbahaya
(Christian, 2005). Siangproh et al. (2009), melakukan
penentuan
kreatinin
yang
didasarkan pada reaksi Jaffe dengan menggunakan metode SIA. Parameter yang diteliti yaitu konsentrasi Na-pikrat dan NaOH, volume sampel serta reagen, dan jumlah flow reversal .
Akan tetapi
dalam aplikasinya kurang efektif karena
Sains dan Terapan Kimia , Vol.5, No. 2 (Juli 2011), 70-79
160 proses analisis menggunakan laju alir
dan sensitifitas tinggi (limit deteksi 5,69
yang lambat yaitu 50 µL/menit selain itu
µg/g).
tidak adanya tempat untuk bercampurnya sampel
dan
reagen
dimungkinkan
reaksi
sehingga pembentukan
Berdasarkan pada
penelitian
uraian ini
diatas,
maka
digunakan
suatu
metode pengaplikasian dari metode SIA-
senyawa kreatinin-pikrat tidak berjalan
LAV yang disebut dengan Sequential
dengan sempurna.
Injection-Valve Mixing (SI-VM). Metode ini
Untuk
itulah
dikembangkan
suatu
merupakan metode alternatif dari metode
konsep terbaru dari SIA yaitu Lab-at-Valve
SI-FRM
(LAV)
tehnik
Wulandari (2010) [7]. Sebagai tempat untuk
on-line yang sederhana dan
terjadinya reaksi antara asam pikrat dan
yang
analisis
ekonomis.
merupakan
Komponen
suatu
pada
SIA-LAV
yang
telah
dilakukan
oleh
kreatinin dibuat suatu valve mixing dimana
disusun hampir sama dengan tehnik SIA
untuk
sebelumnya, hanya saja ditambahkan
pembentukan
suatu separating chamber yang diletakkan
dilakukan dengan pendiaman sampel dan
di port 1 pada selection valve sebagai
reagen dalam valve mixing selama jangka
tempat terjadinya reaksi antara reagen
waktu
dan
akan
sederhana
pada
(2010)
sampel.
mendeteksi
separating
Spektrofotometer secara
langsung
chamber sehingga
proses
penyempurnaan senyawa
tertentu. dari
ini
kreatinin-pikrat
Proses
yang
penelitian
diharapkan
mempercepat
reaksi
proses
lebih
Wulandari akan
lebih
analisis
yang
yang terjadi di dalamya dapat langsung
dilakukan tetapi tetap mempertahankan
diketahui (Burakham et al ., 2005)
sensitifitas
Pengembangan metode SIA-LAV ini
yang
tinggi.
Untuk
meningkatkan absorbansi dari kreatinin
telah dilakukan pada penelitian yang
dilakukan
dilakukan oleh Wulandari (2010), hanya
meliputi laju alir produk, volume sampel
saja sebagai tempat terjadinya reaksi
dan reagen yang dipakai, waktu delay dan
antara reagen dan sampel dibuat suatu
konsentrasi asam pikrat serta NaOH yang
mixing coil dan pada prosesnya untuk
digunakan. Sebelum dilakukan aplikasi
menyempurnakan
penentuan kreatinin dalam sampel urin,
senyawa
reaksi
pembentukan
kreatinin-pikrat
dilakukan
dilakukan
optimasi
terlebih
parameter
dahulu
yang
penelitian
pembentukan segmen antara sampel dan
mengenai pengaruh senyawa-senyawa
reagen di holding coil yang selanjutnya
yang terdapat pada sampel urin yang
reversal pada
dapat mengganggu terhadap pengukuran
pengaplikasiannya
kadar kreatinin. Senyawa pengganggu
metode ini cukup efektif dimana proses
yang diuji dalam penelitian ini yaitu
analisis
kreatin.
dilakukan
mixing
proses
coil .
flow
Pada
berlangsung
cepat
yaitu
12
sampel/jam, penggunaan sedikit reagen
Kemudian
dilakukan
aplikasi
metode SI-VM untuk penentuan kadar
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
1 1
kreatinin pada sa pel urin. Hasil dari
hidro sida (SAP Kemika), a am nitrat
reaksi antara asam pikrat da
% (Merck KGaA, Jerman), ecuali etanol
dalam
suasana
asa
dideteksi secara
kreatinin
tersebut
5
akan
techn ical grade (SAP Ke ika), sampel
n-line me ggunakan
urin dan akuade yang bukan merupak n
RGB kol rimeter.
baha kimia pro nalisis.
Pene tuan Parameter Optimum seca a
METOD PENELITIAN
on li e
Alat
Penentuan l ju alir optiimum prod k
Alat-alat
yang
digunakan
dalam
penelitia ini antara lain:, peral tan gelas, oven,
eraca
analitis
Mettler,
botol
semprot, pipet mik o 1 mL dan 5 mL,
dilakukan
Hamilton,
Reno,
Nevada, USA) den an kapasit s volume 2,5 mL, delapan selection
alve (SL;
Hamilton, Reno, N vada, US ), pompa dan det ektor beru a RGB
olorimeter
yang dik ntrol melal i komputer .
alat t rsebut ditu jukkan pada Gambar 1.
penelitia analisis
Penentuan laju alir optimum prod k dilakukan melalui 4 tahap be ikut ini:
Taha 1: Pencuc an line dan detektor Pada tahap ini dilakukan pengkondisi n alat
engan car a: switchin valve (S )
berada pada po isi mengisi dan syrin e
untuk dialirkan
Bah n-bahan y ng diguna an dalam ini merup kan bahan kimia pro (p.a)
(Sigma- ldrich,
yait
padatan
kreatinin
Co.,Jerman),
kreatin
port
d n
μL/detik.
ini dilakukan seban ak tiga k li
(Sigma- ldrich,
benar
.
Gambar 1
μL/detik,
μL/detik
melal i port 4 de gan laju ali r 50 Taha
Akuad s
enuju hold ing coil (H )
dengan l ju alir 50
agar dihasilkan
natrium
μL
melal i port 2 de gan laju ali r 30
(Sigma- ldrich, Co.,Jerman), asam pikrat Co.,Jerman),
on-lin e ,
deng n komputer. Adapun gambar d ri
pump (SP) men ambil 2100
Bahan
ara
yaitu dengan al t SI-VM y ng dirangkai
seperan kat alat SI-VM yang erdiri dari
syringe pump (S ;
menggunakan
Rangkaiian Alat SI- M
bersih
ondisi alat yang benarsaat
digunak n
162 Tahap 2: Pengisian Line dengan larutan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada tahap ini dilakukan pengisian line-
Optimasi Parameter
line yang akan digunakan dengan cara:
Parameter Fisik
SV berada pada posisi “ OUT ” dan SP mengambil
500
kreatinin dan 500
μL μL
larutan
standar
reagen dari port 3
Penentuan laju alir optimum produk dilakukan
dengan
cara
memvariasi
kecepatan laju alir menuju ke detektor
dan 4 yang akan dikeluarkan melalui port
sehingga akan dihasilkan nilai absorbansi
7 dengan laju 50 μL/detik.
kreatinin yang berbeda pada berbagai
Tahap 3: Pendeteksian kreatinin
tingkatan laju alir. Besarnya laju alir
Pada
produk
tahap
ini
dilakukan
absorbansi
yang
melalui
detektor
dapat
larutan standar kreatinin dideteksi dengan
mempengaruhi absorbansi kreatinin yang
cara: SV berada pada posisi “ OUT ” dan
diperoleh,
SP mengambil masing-masing 150
mempengaruhi
μL
dikarenakan
laju
proses
alir
akan
pembentukan
larutan standar kreatinin dan larutan asam
senyawa kreatinin-pikrat, cepat lambatnya
pikrat-NaOH untuk dialirkan menuju port 1
analisis serapan senyawa kreatinin-pikrat
dengan laju alir 5
yang mampu dibaca oleh detektor dan
μL/detik,
kemudian
dilakukan delay yang dilanjutkan dengan
proses
mengalirkan larutan campuran ini menuju
senyawa kreatinin-pikrat dengan carrier
detektor.
yaitu
(akuades). Sesuai dengan Gambar 2
mengalirkan akuades kedalam detektor
maka laju alir 20 µl/s dipilih sebagai laju
untuk membawa sisa-sisa larutan yang
alir optimum ke detektor karena diperoleh
masih tertinggal. Nilai Absorbansi yang
sensitivitas yang paling tinggi. Waktu
diperoleh akan terbaca oleh komputer.
delay
Langkah
berikutnya
Penetuan Kreatinin dalam Urin secara on line Pada penentuan kadar kreatinin dalam urin dilakukan prosedur seperti pada penentuan optimasi parameter dengan menggunakan seluruh kondisi optimum dari parameter yang digunakan. Sebelum digunakan urin diencerkan 30 kali dengan akuades. kemudian dilakukan prosedur seperti di atas. Nilai absorbansi diplotkan
dispersi
dapat
pembentukan
yang
terjadi
mempengaruhi senyawa
antara
proses
kreatinin-pikrat
yang terjadi karena berpengaruh terhadap lamanya waktu kontak antara sampel dan reagen. Semakin lama waktu kontak antara sampel dan reagen maka senyawa kreatinin-pikrat
yang
terbentuk
akan
semakin stabil, sehingga absorbansi yang diperoleh akan semakin tinggi. Namun waktu kontak yang terlalu lamapun dapat menurunkan absorbansi.
ke dalam kurva baku untuk mengetahui kadar kreatinin dalam sampel urin. .
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
1 3
Hal
ini
kreatinin pikrat
Ga bar 2
rafik Penentuan Laju
dikarenakan
senyawa
jumlah y ang sedikit maka tid k
akan mampu unt uk membe tuk senya a
dalam
kreatinin-pikrat dengan seluruh kreatinin
terjadi
yang ada. Sed ngkan ap bila volu e
penurun n absorb nsi yang diperoleh.
reagen yang di unakan terlalu bany k
Waktu d lay optimu
maka selain p mborosan pengguna n
carrier
tadin a
Produk
telah
terbentu
yang
dala
lir Optimu
dapat t rdispersi (akuades)
Volume reage
e
sehingg
yaitu 5 detik. (larutan Na-pikrat)
reagen konsentr si larutan sampel ju a
yang digunakan dal am peneliti n ini juga
akan
perlu dit liti karena erpengaru terhadap
besar nya pengenceran yang terjadi har s
jumlah volume samp el yang ma mpu untuk
diper itungkan kembali. Variasi volu e
memben tuk senya a dengan sejumlah
reagen yang digu nakan yaitu 150, 300,
volume reagen tertentu. Perlunya untuk
450, 600, dan
menentukan
optimum yaitu 30 0 µL.
volume
reagen
optimum,
mengala i
penge ceran
50 µL. Volume reag n
karena apabila reag n yang dig nakan
Gambar 3
d n
Grafik Penentuan Konse trasi NaOH Optimum
164
Gambar 4
Grafik Penentuan Konsentrasi Asam Pikrat Optimu
Optimasi volume sampel ditentukan untuk
meminimu kan
sampel
tetapi
tet p
p nggunaan
memp rtahankan
mem engaruhi
pembentuk n
kreatinin-pikrat (Siangproh et al., 2009). Sesu i
Gambar 3
maka
sensitifit s yang tinggi deng n tingkat
NaO
ketelitian yang besar (Siangpr oh et al.,
kons ntrasi
2009).
peng kuran lebih tinggi.
Abs rbansi
yang
diperoleh
senya a
konsentrasi
optimum yaitu 3% karena pa a tersebut
sensitifit s
Peng ruh konsentrasi asa
pikrat yaitu
berbanding lurus d ngan volu e sampel
seba ai
pembent k
yang di unakan, a sorbansi akan terus
senyawa denga
meningkat sejalan dengan bertambahnya
Gam ar 4 maka dapat dik tahui bah a
volume sampel ya g digunak n hingga
absor bansi sem kin meningkat deng n
keadaan steady sta e tercapai (Ruzicka &
semakin bertambahnya kon entrasi asam
Hansen, 1988).
pikrat,
Volume sampel optimum yang dipilih adalah
100
penggunaan
µL
dikarenakan
volu e
sampel
pada
100
µL
reagen
dan
untuk
kreatinin. Berdasark n
a sorbansi
akan
mulai
berkurang pada onsentrasi 0,035 M d n seter snya. Kon entrasi asam pikrat 0, 3 M di ilih sebagai konsent asi optimu m
seluruh reatinin ya g ada tepa berikatan
dikar nakan asa
dengan
lebih tinggi dari konsentrasi ersebut tid k
sejumlah
reagen
y ng
telah
pikrat pada konsentrasi
disediak n.
meni gkatkan
Parame ter Kimia
asam pikrat ya g tinggi
Peng ruh konsentrasi NaO reagen
sebagai
ntuk pem entuk sua ana basa
dalam pembentuka
senyawa kreatinin-
jumla
asam
ensitifitas.
ikrat
Konsentrasi enyebabk n
semakin
bany k
sehin ga kelebi an asam pikrat ya g tidak bereaksi dengan
kr eatinin ak n
pikrat perlu diteliti karena konsentrasi
bereaksi dengan ion Na+ dari NaOH d n
NaOH y ng digunakan akan
dihasilkan
ndapan
Na-pikr t.
165 Tabel 1.
Penentuan kadar kreatinin dalam sampel urin
No
Sampel
Konsentrasi Sampel (µg/g)
1
Urin 1
759,37 ± 3,213
2
Urin 2
853,12 ± 0,643
3
Urin 3
1415,6 ± 1,928
Aplikasi SI-VM untuk Pengukuran Kreatinin dalam Urin Aplikasi SI-VM pada penentuan kreatinin dalam sampel urin dilakukan pada beberapa sampel urin yang telah diperoleh.
Seluruh
sampel
diperoleh
terlebih
dahulu
urin
yang
dilakukan
berbagai individu tergantung dari berbagai faktor seperti jenis kelamin, berat badan, kebiasaan
hidup
banyaknya macam
sehari-hari
konsumsi
makanan
air
yang
misalnya
putih
serta
berbeda-beda
yang dikonsumsi pada setiap individu.
pengenceran sebanyak 30 kali dengan
KESIMPULAN
menggunakan akuades. Dari hasil uji analisa kadar kreatinin dalam urin diperoleh nilai absorbansi yang kemudian diplotkan dengan menggunakan kurva baku kreatinin dengan persamaan garis lurus yang diperoleh yaitu y = 0,00016x
+
0,00670,
sehingga
akan
diperoleh besarnya konsentrasi kreatinin yang terdapat dalam masing-masing urin. Berdasarkan hasil uji sampel urin pada kondisi optimumnya diperoleh hasil analisa yang ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel
1
menunjukkan
bahwa
konsentrasi kreatinin yang terdapat pada masing-masing urin berbeda-beda pada
Metode
SI-VM
dapat
direkomendasikan
sebagai
metode
penentukan
kadar
kreatinin,
hal
dikarenakan
metode
yang
ini
digunakan
memiliki sensitifitas yang tinggi dengan limit deteksi sebesar 3,01 µg/g dan waktu analisis
selama
±2
optimum
penentuan
menit.
Kondisi
kreatinin
dengan
menggunakan metode SI-VM berlangsung pada kondisi laju alir produk 20 µL/detik, waktu
delay
sampel/larutan
5 standar
detik, 100
volume µL
dan
volume reagen (asam pikrat 0,03 M dan NaOH 3%) 300 µL.
Sains dan Terapan Kimia , Vol.5, No. 2 (Juli 2011), 70-79
166 DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2009, Urin Test , http://kidshealth.org/parent/general/ body_basics/kidneys_urinary.html
Ruzicka, J., and E.H. Hansen,1988, Flow Injection Analysis 2 nd Edition , John Willey & Sons, Inc, New York, USA ISBN 0-47181355-9
Burakham, R., J. Jakmunee, and K. Grudpan, 2005, Development of Sequential Injection Lab at Valve (SI-LAV) Micro Extraction Instrumentation for the Spectrophotometric Determination of an Anionic Surfactant , Thailand
Siangproh,W., N. Teshima, T. Sakai, S. Katoh, O. Chailapakul, 2009, Alternative Method for Measurement of Albumin/Creatinine Ratio Using Spectrophotometric Sequential Injection Analysis, Talanta , 79:1111-1117
Christian, S., 2005, FIA/SIA Principles , http://www.flowinjection. com/method2.aspx
Wulandari, E.R.N, 2010, Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri dengan Sequential Injection-Flow Skripsi Reversal Mixing (SI-FRM), Jurusan Kimia Universitas Brawijaya, Malang
Faria, L.C. and C. Pasquini, 1992, Spectrophotometric Determination Of Creatinine by Monosegmented Continuous-Flow Analysis, Journal of Automatic Chemistry , 14(3): 97-100
Yayasan Spiritia, (2009), HIV Penyakit Ginjal , http://spiritia.or.id/
Penentuan Kreatinin dalam Urin Secara Kolorimetri… (Hermin Sulistyarti dkk)
dan
