INFORME DE LABORATORIO LABORATORIO Nº 4 “INMOVILIZACION “INMOVILIZACION DE CELULAS”
I. OBJETIVOS - Conocer un procedimiento para la inmovilización de células o enzimas enzimas - Evaluar la capacidad capacidad fermentativa de las levaduras levaduras inmovilizadas
II. FUNDAMENTO Inmovilizar células (o enzimas) es la incorporación de estas en un sistema de fase sólida que no afecta el intercambio con el medio (sustratos). Por ello, aunque la biomasa no está libre en el medio sus capacidades catalíticas permanecen para actuar sobre los sustratos para la producción de los productos Se han descrito diversos métodos y matrices inertes para realizar la inmovilización celular. La inmovilización más empleada se hace en geles poliméricos hidrofílicos de alto peso molecular, tales como, agarosa, alginato y carragenano.
Métodos de Inmovilización Para
obtener
biocatalizadores
inmovilizados
que
retengan
actividad y sean estables es necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que dependerá del tipo de actividad catalítica de interés. Existen diversos métodos para inmovilizar células, los cuales pueden dividirse en:
- Entrecruzamiento físico (floculación). - Entrecruzamiento covalente. - Adsorción sobre matrices insolubles - Enlace covalente con matrices insolubles. - Entrampamiento físico en materiales porosos. - Encapsulamiento.
Según la ruta seguida para su preparación los sistemas pueden clasificarse en cuatro:
Inmovilización sin Carrier Es el caso de células unidas con otras células, tanto por adsorción o por uniones covalentes. La floculación de células, durante su fermentación o por procesos secundarios mediante variación en parámetros fisicoquímicos (pH, fuerza iónica) es un proceso de unión por adsorción. Este proceso puede ayudarse por el agregado de pequeñas cantidades de agentes de floculación (polímeros). Es también común el uso de agentes químicos bifuncionales, tal como el glutaraldheído para unir células mediante entrecruzamiento químico. El caso típico es la floculación de algunas cepas de Zymomonas mobilis, empleadas en la producción de etanol. El método de
inmovilización es sencillo, pues espontáneamente se producen flocs cuando se crecen células en un medio adecuado sin agitación. Los flocs así formados se utilizan como inóculo de medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la producción de etanol a partir de glucosa
en
reactores
especialmente
diseñados.
Las
células
inmovilizadas son retenidas dentro del reactor. Este método permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva a cabo en condiciones de reacción suaves, que no perjudican la estabilidad del biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia mecánica frente a la agitación y a la compresión, hay limitaciones difuncionales al transporte de nutrientes, y está limitado a pocas clases de microorganismos.
Inmovilización del Biocatalizador en Carriers Preformados Es la estrategia típica en la inmovilización de enzimas, especialmente por medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones en condiciones físicas y químicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las características de estabilidad mecánica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el
caso de células, el problema estriba en cómo favorecer la adhesión de las células (relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la estabilidad y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor diámetro que la célula para permitir la penetración a las superficies internas. Se emplean carriers porosos, que son embebidos por inmersión en suspensiones celulares. En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la generación de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o carboxilo libres presentes en la enzima.
Inmovilización durante la preparación del Carrier Es la estrategia más común en la inmovilización de células enteras Si bien hay dos métodos, entrampamiento y encapsulamiento, este último es de limitada importancia. Debido al tamaño de las células enteras, es relativamente sencillo preparar redes de porosidad tal que garanticen la completa retención de las células, y que los procesos de transporte de sustratos y productos sean suficientemente rápidos para obtener alta eficiencia en la actividad catalítica. La dificultad se encuentra en la búsqueda de condiciones de preparación de carriers que cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad del biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el método de inmovilización más usado, debido a su flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones de reacción (en el caso de polímeros naturales).
Inmovilización por crecimiento de células previamente inmovilizadas
En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es utilizada para aumentar la concentración de células dentro del carrier, por lo que, evidentemente, sólo sirve para inmovilización de células. Permite inmovilizar células que contienen sistemas multienzimáticos, ya sea en estado estacionario o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en caso de células libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas. Generalmente se realiza por entrampamiento en redes iónicas. Es posible restaurar la actividad catalítica, e inclusive aumentarla. Es un método útil para obtener células difíciles de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio celular. La técnica en este caso consiste en la inmovilización de esporos en matrices insolubles, los cuales originarán micelio una vez inmovilizados en la matriz.
Tipos de Carriers
Desde el punto de vista químico, las sustancias usadas para soportar a los biocatalizadores pueden ser divididas en inorgánicas u orgánicas, y el origen de las mismas puede ser natural u obtenido por síntesis.
a).- Inorgánicos: - Naturales: arena, silicatos, arcillas. - Sintéticos: vidrios de porosidad controlada, cerámicas.
b).- Orgánicos: - Naturales: virutas de madera, antracita, colágeno, celulosa, alginatos, carragenatos, albúmina. - Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio iónico, epóxidos, poliuretanos.
La selección del material se realiza siguiendo algunos criterios
heurísticos:
materiales de alta disponibilidad y bajo costo
materiales que permitan un proceso de inmovilización simple y
efectivo respecto de la retención de la actividad.
materiales con alta capacidad y eficiencia
materiales que permitan un diseño de reactores sencillo.
Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que permitan técnicas de inmovilización por adsorción. Los dos últimos criterios dirigen la elección hacia carriers orgánicos complejos. Obviamente la elección final deberá tener en cuenta el biocatalizador a utilizar, el proceso en el cual va a participar y, fundamentalmente, el producto que se desea obtener.
De todos los métodos mencionados se hará especial énfasis en aquellos que involucran la formación de redes poliméricas a partir de prepolímeros de cadena larga, tales como alginatos y kappacarragenatos (K-carragenatos). La variedad de sistemas de este tipo es tan grande que pueden subdividirse según los mecanismos de formación de las redes poliméricas:
1. Precipitación: formación de red sin reacción química, por separación de fases. 2. Gelificación: formación de redes sin reacción química, por transición de fase debida a cambios de pH, temperatura, etc. 3. Gelificación ionotrópica: formación de redes con reacción química (intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas poliónicas con contraiones multivalentes. 4. Entrecruzamiento covalente: formación de redes con reacción química debida al entrecruzamiento de polímeros multifuncionales entre sí o con reactivos bifuncionales de bajo peso molecular.
III.
MATERIALES
-
Agar agar
- Agua destilada
- Levadura
-
Jeringas de 10 - 20 ml
- Beakers
- Autoclave
-
Baño María.
- Cocinilla eléctrica
-
- Termómetro
-
- Colador
- Aceite
Refractómetro -
Balanza analítica, Erlenmeyers
-
Probetas
IV. PROCEDIMIENTO Para el Soporte -
Pesar 2 g de agar, colocar en beaker y añadir 80 ml de agua destilada.
-
Calentar en cocinilla eléctrica hasta completa disolución. (60 – 70°C)
-
Dejar enfriar hasta Tº de trabajo. (45°C)
Para la solución de levadura - Pesar 2 g de levadura, colocar en beaker y añadir 20 ml de agua destilada (activar la levadura)
Para la inmovilización -
Cuando el soporte este a Tº de trabajo añadir la levadura
-
Mezclar hasta homogeneidad y coloque rápidamente en las jeringas
-
Adicione lentamente el contenido de las jeringas sobre la solución de ClCa2
Para la Evaluación Adicione perlas a una solución de glucosa y verifique al día siguiente la presencia de burbujas (o los ºBrix).
V. -
RESULTADOS Represente en un flujo las operaciones desarrolladas
PARA EL SOPORTE:
PARA SLN DE LEVADURA:
PESADO DEL AGAR
PESADO DE LA LEVADURA (2 g)
MEZCLADO (agar + agua destilada)
MEDICION DEL AGUA DESTILADA 20 ml
CALENTADO DE LA MEZCLA MEZCLADO ( levadura + agua destilada)
ENFRIADO
ADICION DE LEVADURA EN EL SOPORTE
MEZCLADO
COLOCACION EN JERINGAS
ADICION SOBRE SOLUCION DE ClCa2
VERIFICAR LA PRESENCIA DE BURBUJAS
Calcule la cantidad en peso de levaduras por perla
-
Indique los ºBrix de la solución al inicio y al final (y/o verifique presencia de burbujas)
Datos: -
Peso de agar: 2.0127g (T°63)
-
Peso de levadura: 1.0340 g (T°40)
-
ml de solución de ClCa2: 60 ml (T°42)
-
Peso azucar: 20.3700 g
Datos de los pesos del día siguiente:
VI.
-
Peso de solidos de ClCa2: 4.4371 g
-
Peso de solidos de azúcar: 4.6584g
-
Grados Brix: 15
-
Temperatura: 20.1 C
CONCLUSIONES
- Se logró conocer el procedimiento adecuado para la inmovilización de
células o enzimas - Además se logró evaluar la capacidad fermentativa de las levaduras
inmovilizadas.
VII. -
DISCUSION La inmovilización de levaduras disminuye la mayoría de los problemas que plantea la fermentación utilizando células libres. Este sistema tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previaal inicio de la fermentación. Además, facilita el sistema de operación del proceso de fermentación continua, evitando el paso de eliminar las levaduras del fermentador. La inmovilización celular desacopla el crecimiento microbiano de los procesos metabólicos de
interés industrial. Es así, que diversos grupos de investigación han empleado este sistema de levaduras inmovilizadas.
VIII.
CUESTIONARIO
1. ¿Por es importante la inmovilización de las células?
-
Porque facilita el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, además de lograr un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. los materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas y la incorporación de levaduras en matrices sólidas.
2. Efectos de la inmovilización de las células
-
La inmovilización enzimática produce cambios en la actividad de preparación con respecto a la actividad de la forma natural, estos cambios se refieren a la alteración del comportamiento de las enzimas. Tras una inmovilización, la actividad puede disminuiré incluso perderse por diversas razones como la unión al soporte, reacción de los grupos reactivos con algún aminoácido del centro activo, cambios conformacionales o desnaturalización de la proteína. Para evaluar los resultados de la inmovilizaciones necesario estudiar la cinética de las reacciones enzimáticas para lo que se emplea el modelo me Michaelis – Menten.
3. Mencione el uso de las levaduras en la industria alimentaria
Las
levaduras
son
responsables
de
los
procesos
de
fermentación alcohólica, a partir de azúcares y en ausencia de oxígeno las levaduras generan alcohol, dióxido de carbono y aromas. Este proceso bioquímico es imprescindible para la producción de alimentos consumidos diariamente por millones de personas en nuestro planeta:
el vino,
el pan y
la cerveza.
Se tiene constancia del uso de levaduras por parte de los egipcios en la fabricación de pan y cerveza, hace más de 5.000 años. Por otro lado se han encontrado restos de vino en recipientes que datan del neolítico. La producción de vino, pan y cerveza ha sido, es y será uno de los usos de los microorganismos que más beneficios ha reportado a la calidad de vida de los seres humanos. En industria alimentaria y restauración se utilizan desde hace tiempo los extractos de levadura, empleados como fuentes de aroma y sabor en salsas y platos preparados.
Hoy en día, se sigue investigando en el uso de variedades de levaduras más eficientes y adaptadas a los nuevos métodos de producción de estos alimentos. En el caso del pan destaca el uso de levaduras adaptadas especialmente a la producción de panes congelados y panes de molde, a la producción de bollos y pasteles, a la producción de panes artesanales más aromáticos, etc. Destacar también las líneas de investigación encaminadas a dar las levaduras nuevos usos que incrementen la biodisponibilidad de vitaminas y minerales presentes en el pan, lo que permitirá un mejor aprovechamiento de este alimento básico. En el caso del vino mencionar
las líneas de investigación dedicadas a seleccionar levaduras que aporten aromas específicos de las distintas zonas de producción de uva, con el fin de potenciar el carácter local de los caldos. Las levaduras como pro-bióticos Desde hace algunos años es conocido el papel de la levadura como alimento probiótico, tanto en seres humanos como en animales. Una vez ingeridas, ya dentro del sistema digestivo del animal, las levaduras desarrollan altamente
beneficiosa:
una
acción
favorecen
el
equilibrio de la flora intestinal, favorecen la sensación de bienestar, potencian el sistema inmunológico, mejoran el estado fisiológico y el tracto del sistema digestivo, etc. Relacionado con el equilibrio de la flora intestinal, es destacable el papel de las levaduras no solo favoreciendo el crecimiento de bacterias beneficiosas para el organismo, sino también impidiendo el acceso de patógenos a ciertos tejidos, efecto barrera, y la inactivación de ciertas toxinas generadas por microbios indeseables.
En relación con la potenciación del sistema inmunológico y la mejora del estado fisiológico y el avanzando
en
tracto
digestivo, los
la decodificación
del
investigadores están
“diálogo”
y
las
relaciones
bioquímicas que se establecen entre las levaduras, la flora intestinal y el propio sistema digestivo del animal. Estas relaciones y “diálogos” tienen implicaciones en ciertas enfermedades y los avances en este campo son una auténtica revolución tecnológica.
El efecto pro-biótico de las levaduras es especialmente beneficioso en la producción ganadera desde hace años. Incluir levaduras en l a dieta de vacas lecheras ayuda a mejorar significativamente el bienestar de los
animales y la calidad y cantidad de leche producida. El uso de levaduras en la dieta de lechones y pollos potencia su crecimiento y su salud, reduciendo los costes de producción y evitando el uso de antibióticos que pueden provocar resistencias posteriores en seres humanos.
Reseñar por último el uso de levaduras como aditivo en alimentos para perros y gatos, su uso favorece el proceso digestivo, incrementando el aprovechamiento de los alimentos y reduciendo las diarreas. También incrementa la vitalidad de las mascotas y su resistencia a enfermedades.
Las levaduras en nutrición y salud Las levaduras han formado parte de la dieta de
los
seres
humanos
animales desde composición
hace
nutricional
y
de
siglos.
los Su
es excepcional.
Tanto las levaduras en si, como partes de sus células o las moléculas por ellas sintetizadas, presentan un gran interés en salud
y
nutrición
animales,
de
plantas
e
seres
humanos,
incluso
otros
microorganismos. Cada
vez
son
más
importantes
los
descubrimientos relacionados con el uso de levaduras en la fertilización y protección de cultivos. Estos avances permiten reducir el uso de fertilizantes y fitosanitarios de síntesis química en agricultura. El uso de levaduras para controlar diversas enfermedades de los cultivos es ya hoy en día una realidad. La utilización de levaduras para evitar el desarrollo de hongos en los frutos representa también una alternativa importante a los tratamientos anti-fúngicos tradicionales. Ciertas levaduras mejoran la capacidad de las plantas en el proceso de absorción de nutrientes del suelo, favoreciendo con ello su crecimiento y permitiendo mejorar los rendimientos agrícolas.
El uso de levaduras en nutrición humana, bien como suplemento dietético o como alimento funcional, es ampliamente conocido. Los nutricionistas aseguran que el alto contenido en proteínas, enzimas, minerales como el zinc, cromo, selenio… y vitaminas de los grupos B y D hacen a los suplementos dietéticos de levadura especialmente atractivos en dietas vegetarianas o situaciones de carencia en alguno de esos nutrientes. También indican que es interesante el consumo de levaduras para asegurar una buena salud del cabello, uñas y piel. Por otro lado, el consumo de levaduras enriquecidas en determinados nutrientes, como el selenio, incrementa la biodisponibilidadde este mineral cuya presencia en la dieta de humanos o animales presenta múltiples beneficios para el sistema inmunológico, tejido muscular, corazón, mantenimiento de las membranas celulares, como antioxidante, etc.
IX.
BIBLIOGRAFÍA - http://www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%206/5.ht
ml -
https://es.calameo.com/read/00342856905dda8f3beaf
- https://www.lesaffre.es/levaduras-nuevos-usos/
