Bacteriocinas

INDICE Pág.

I. II.

III.

IV. V.

Introducción Introducción ........ ............. ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ...... .. 1 Antecedentes Antecedentes generales.. generales...... ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ....... ... 2 2.1. Definición ............................................................................................. ....2 2.2. Detección de cepas productoras de Bacteriocinas............................. Bacteriocinas............................. 2 ............ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ...... ........ ............ ......... ......... .... 3 2.3. Espectro de acción ........ ............. ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ .... ........ ............ ........ ........ .... 4 2.4. Clasificación ........ 8 2.5. Mecanismo de acción........................ acción..................................... ......................... .......................... ........................ .......... 9 2.6. Síntesis de Bacteriocinas por po r Bacterias Acido Lácticas..................... Lácticas..................... 2.7. Producción de Bacteriocinas ....................... ................................... ......................... ......................... .............. 10 2.8.Métodos de Adición de Bacteriocinas en Alimentos.................... Alimentos............................ ........ 11 2.9. Legislación....................... Legislación................................... .......................... .......................... ........................ ......................... ................. .... 11 2.10. Ventajas y desventajas........................ desventajas..................................... ......................... ......................... ......................... ............13 Aplicación Aplicación de las bacteriocin bacteriocinas as en alimentos.. alimentos...... ........ ........ ........ ........ ........ ........ ........ ........ ......... ....... 14 14 3.1. Productos lácteos........................ lácteos.................................... ......................... ......................... ......................... .................. ..... 18 3.2. Alimentos enlatados...................... enlatados.................................. .......................... .......................... ........................ ............... ... 3.3. Productos cárnicos.......................... cárnicos...................................... ......................... .......................... ......................... .............. 19 22 3.4. Productos del mar......................... mar..................................... .......................... .......................... ........................ ............... ... 23 3.5. Vino y cerveza.......................... cerveza....................................... ......................... .......................... .......................... ................... ....... 24 3.6. Chucrut........................ Chucrut.................................... .......................... .......................... ......................... ......................... .................... ........ 24 3.7. Otras aplicaciones....................... aplicaciones................................... ......................... ......................... ........................ .................. ...... 27 3.8. Métodos combinados......................... combinados..................................... ........................ .......................... ........................ .......... Expectativas Expectativas futuras... futuras........ ......... ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ......... ........ ........ ........ ......... ....... .. 29 Bibliografía..................... Bibliografía................................. .......................... .......................... ......................... ......................... ......................... ............. 30

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I. INTRODUCCION  Actualmente hay una marcada tendencia de los consumidores a demandar  alimentos alimentos naturales naturales que no hayan sido sometidos sometidos a ningún tipo tipo de procesamiento procesamiento indu indust stri rial al o que que sean sean míni mínima mame ment nte e proce procesa sados dos y que que no cont conteng engan an adit aditiv ivos os químicos. Muchos consumidores consideran que esos procedimientos interfieren con la calidad nutricional de los alimentos y que los aditivos químicos son más peligrosos para la salud que los microorganismos que pretenden controlar (8,21). Para satisfacer las demandas de los consumidores los fabricantes de alimentos están están intere interesado sadoss en produci producirr alimen alimentos tos mínim mínimamen amente te procesa procesados dos,, sin aditiv aditivos os químicos o que contengan la mínima cantidad, e inocuos, para cumplir con los parámetros de calidad y seguridad exigidos por los consumidores. Una de las estrategias propuesta por los investigadores para alcanzar este objetivo, es explorar  la capa capaci cida dad d de los los micr microor oorga gani nism smos os inoc inocuos uos,, natur natural alme ment nte e pres present entes es en los los alim alimen ento toss o artif artific icial ialme ment nte e adic adicio iona nado dos, s, de inhi inhibi birr micr microo oorga rgani nism smos os que que son son indeseables, alterantes y patógenos. Este proceso se denomina Bioconservación y cada vez es más estudiado debido a su enorme potencial de aplicación en una ampl ampliia gama ama de alim alimen enttos. os. Los Los micr microo oorg rgan anis ismo moss más adec adecu uados ados com como bioc biocon onser servan vante tess son son las las bact bacteri erias as ácid ácido o láct láctic icas as (BAL (BAL), ), debi debido do a su uso en alimentos fermentados y a que gozan de la categoría GRAS (21). Las bacterias ácido lácticas (que incluyen los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus) han sido usadas por siglos en fermentaciones para preservar la calidad nutritiva de varios alimentos. Estas bacterias contribuyen a la preservación de los productos fermentados como consecuencia de la producción de metabolitos inhibitorios de la flora acompañante. Estos incluyen productos finales de la fermentaci fermentación ón tales como ácidos ácidos orgánic orgánicos, os, peróxido peróxido de de hidrógeno, hidrógeno, y diacetilo diacetilo,, acetaldehido, reuterina y bacteriocinas (8,20). El término bacteriocina fue acuñado en 1953 específicamente para definir antibióticos proteicos del tipo colicina (producido por E. coli), pero ahora es aceptado para incluir  péptidos inhibidores de cualquier género. El rol de las bacteriocinas en la naturaleza permanece incierto. Lo que sí está claro es que las bact bacteri erias as produ product ctor oras as de esto estoss pépt péptid idos os pued pueden en tene tenerr una una vent ventaj aja a compet competiti itiva va al inhibi inhibirr la flora flora acompa acompañant ñante e no product productora ora de bacter bacterioc iocina ina.. Las bacteriocinas pueden ser explotadas por los procesadores de alimentos para proveer  una barrera adicional al crecimiento de bacterias indeseable en alimentos (20). Las bacteriocinas son producidas por varias especies bacterianas, pero de particular  interés para la industria de alimentos son aquéllas producidas por bacterias ácido lácticas por lo ya señalado (20). El potencial de estos péptidos descansa en la adición al alimento alimento del microorganismo microorganismo productor de bacteriocina o una preparación de ésta, como una barrera adicional en la preservación por métodos combinados (8,15,20). El objetivo objetivo de este seminario seminario es entregar entregar antecedentes antecedentes de las bacteriocinas bacteriocinas y su potencial aplicación en los alimentos.

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II. ANTECEDENTES GENERALES DE LAS BACTERIOCINAS 2.1 Definición

Las Las bacte bacteri rioci ocina nass son son pépt péptid idos os micr microbi obian anos os de reduc reducid ido o tama tamaño ño sint sintet etiz izad adas as ribosomalment ribosomalmente, e, codificadas codificadas por plásmidos plásmidos y liberadas liberadas extracelularm extracelularmente, ente, las cual cuales es tien tienen en un efec efecto to bact bacter eric icid ida a o bact bacter erio iost stát átic ico o sobr sobre e otra otrass espe especi cies es (usualmente (usualmente familiares) familiares) (20). Las bacteriocinas bacteriocinas han sido encontradas encontradas en todos los linaje linajess de bacterias bacterias y más recient recienteme emente nte han sido descrita descritass como como produci producidas das universalment universalmente e por algunos algunos miembros de Archaea. Archaea. De acuerdo con Klaenhammer  Klaenhammer  cit, cit, por (12) (12) el 99% de todas todas las las bact bacter eria iass pued pueden en elab elabor orar ar al menor menor una bacteriocina y la única razón por la que no se han aislado más es debido a la carencia de investigaciones. 2.2. Detección de cepas productoras de bacteriocinas

La forma más fácil de identificar identificar cepas cepas productoras productoras de bacteriocinas bacteriocinas es a través de la técnica de doble capa, que consiste en inocular las bacterias potencialmente productoras de bacteriocinas en placas placas con el medio más adecuado (cruz o gota), y una vez que han crecido crecido se cubren con una sobrecapa sobrecapa (6-8 ml) del mismo mismo medio con 0,8% de agar, previamente inoculado con la bacteria indicadora y se deja crecer  una noche para observar halos de inhibición de crecimiento, esta técnica técnica detección en inglés de denominada “spot -on -the lawn” (Fig.1)

Fig. 1: Ejemplo de zonas de inhibición utilizando la técnica de “spot on the lawn” Fuente: BURTNESS, J., 2001: “Searching for BLIS Bacteriocin-Like Inhibitory Substances”

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2.3. Espectro de Acción La mayoría de las bacteriocinas son bactericidas contra bacterias relacionadas cercanamente. Sin embargo, actualmente se ha visto que la mayor parte de las bacteriocinas producidas por bacterias lácticas exhiben actividad bactericida más allá de las especies relacionadas cercanamente o confinadas dentro del mismo nicho ecológico que la productora de bacteriocina (4). La actividad inhibitoria de estos péptidos está confinada a bacterias Gram-positivas y la inhibición de bacterias Gram-negativas no ha sido demostrada, esto puede ser  explicado por un análisis y comparación detallada de la composición de la pared celular de ambos tipos de bacterias. En ambos la membrana citoplasmática está rodeada por una capa de peptidoglicano la cual es significativamente más gruesa en las bacterias Gram-positivas. Las bacterias Gram-negativas poseen una capa adicional, denominada membrana externa la cual es impermeable a la mayoría de las moléculas. La presencia de poros en esta membrana permitirá la libre difusión de moléculas con un peso molecular inferior a 600 Da, sin embargo, la bacteriocina más pequeña producida por bacterias ácido lácticas (BAL)tienen una masa molecular  de 3 kDa y son por lo tanto muy grandes para alcanzar su objetivo (1). Es interesante notar que las bacterias Gram negativas son solo inhibidas por purificados de bacteriocinas de bacterias lácticas provistos de condiciones que debilitan la integridad de la pared celular, como la presencia de agentes químicos (Ej. Ácidos orgánicos, EDTA y otros quelantes o condiciones medioambientales estresantes (Ej. pH, congelación, calentamiento suave o alta presiones hidrostáticas) permitiendo que la bacteriocina acceda a la membrana citoplasmática (1,4,5,20). En general se puede decir que las bacteriocinas producidas por las bacterias Gram (+) tienen un espectro de acción más amplio que las producidas por las bacterias Gram (-) y son a menudo activas contra un amplio rango de bacterias Gram (+) y algunas veces contra unas pocas bacterias Gram-negativas (18). La hetereogenidad en el espectro antimicrobiano de las bacteriocinas permite establecer tres grupos1 (4): 



1

Bacteriocinas con un estrecho espectro de acción: Restringido a cepas dentro de la misma especie productora de bacteriocina, tales como lactococina A (Holo et al., 1991) y caseicina 80 (Rammelsberg et la., 1990), o a especies dentro del mismo género, tales como lactocina 27 (Upreti,1994) y lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1983) Bacteriocinas con espectro de actividad intermedio : Además inhiben otros géneros de bacterias lácticas y bacterias Gram (+), incluyendo los patógenos L. monocytogenes, S.aureus, C.  perfringens y C. botulinum . Este grupo incluye, entre otras, lactacina F (Muriana y Klaenhammer,1987), lacticina 481 (Piard et.al., 1990), plantaricina C (González et.al, 1994) y plantaricina S y T (Jiménez - Díaz et.al ., 1993)

Las citas mencionadas a continuación provienen del J. Food Sci Tech Int 2001; 7(4):281-305

5 

Bacteriocinas de amplio espectro antimicrobiano: Inhibe un amplio rango de bacterias Gram (+) incluyendo además de los géneros mencionados arriba, Propionibacterium spp. Y Bacillus spp. Representativos de este grupo son la Nisina A y Z, las cuales también inhiben la germinación de esporas de Clostridium spp. y Bacillus spp. ( Hurst, 1981; Harris et.al., 1992; Vanerbergh,1993; Cintas 1995; Cintas et.al., 1992), leucocina S (Lewus et.al., 1991) y enterococina L50 (Cintas et.al., 1995; 1998).

2.4. Clasificación

 A pesar de la hetereogenidad fisicoquímica de las bacteriocinas de las bacterias lácticas, éstas pueden ser dividas en cuatro clases (L.M.Cintas, 2001; 2 Klaenhammer, 1993 ) .En la tabla siguiente se muestra la clasificación de las bacteriocinas, sus características generales y ejemplos respectivos (4, 20, 21).

Tabla 1: Clasificación de las bacteriocinas Clase Subclase Características generales Ejemplos Clase I: Péptidos de pequeño tamaño molecular  Lantibióticos (< 5kDa), resistentes al calor,modificadas postransduccionalmente que contienen aminoácidos no usuales tales como dehidroalanina, dehidrobutirina, lantionina y b.metillantionina. Subclase Ia Péptidos catiónicos e hidrofóbicos que forman Nisina, lactacina poros en membrana objetivo, moléculas más 481, carnocina UI49 flexibles en comparación a Ib. y lactocina S Subclase Ib Péptidos globulares que no tienen carga neta o Mersacidina carga neta negativa Clase II: Pequeños péptidos <10kDa, termoestables que no contienen lantionina, no modificados transducionalmente, hidrofóbicos, con un alto contenido de aminoácidos pequeños tales como glicina, usualmente catiónicos y a menudo anfóteras. Dentro de esta clase pueden ser definida 3 subclases. Subclase IIa Péptidos activos contra Listeria con una Pediocina PA-1, Bacteriocinas secuencia N-terminal común. sakacinas A y P, como leucocina A, Pediocina bavaricina MN y curvacina A Subclase IIb Péptidos formadores de poros en membrana Lactococina G y M, celular, constituidos de 2 subunidades lactacina F importantes para la actividad Subclase IIc Péptidos activados por el grupo tiol, que Lactacina B requieren residuos de cisteína reducida para tornarse activos. Clase III Péptidos de gran tamaño molecular (>30 kDa), Helveticina V-1829, termolábiles acidofilina y lactacina A y B. Clase IV Bacteriocinas complejas, compuestas por una Plantaricina S, fracción proteica y una fracción lipídica u Leuconocina, S, glucídica. lactocina 27 y pediocina SJ1.

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E.De Martinis et.al, 2002 op.cit.

6 Debido a su abundancia y posibles aplicaciones en la industria de alimentos, las bacteriocinas pertenecientes a las dos primeras clases son las más estudiadas. A continuación se entregará un mayor detalle de estas dos clases (8).

Clase I: Lantibióticos Los lantibióticos son producidos por BAL y también por otros géneros de bacterias. El principal lantibiótico producido por BAL y mejor conocido a la fecha, es la nisina, la cual se tratará a continuación con mayor detalle (8). La nisina es una proteína que consiste de 34 aminoácidos, la cual es estable a altas temperatura. La nisina es rápidamente inactivada en el intestino por enzimas digestivas y no es detectable en la saliva humana después de 10 minutos del consumo . Es producida por ciertas cepas de Lactococcus lactis subesp. lactis, inhibe un amplio rango de bacteria Gram (+) incluyendo cepas o especies de estreptococos, estafilococos, lactobacilos, micrococos, Listeria y la mayoría de las especies formadoras de esporas de Clostridium y Bacillus. Las bacterias Gramnegativas, levaduras y mohos normalmente no son afectados. La nisina es un lantibiótico (tabla I), tiene un efecto bactericida sobre células sensibles, efectuando una rápida muerte dentro de un minuto de adición. El objetivo de la nisina y moléculas relacionadas ha mostrado ser la membrana citoplasmática de células sensibles. La adsorción no parece involucrar receptores específicos proteicos (como es el caso de colicinas), pero involucra la interacción directa entre la molécula de nisina y la membrana. La acción de la nisina se debe a la inserción y formación de poros (8, 20). La nisina fue originalmente propuesta para uso como antibiótico, pero debido a su rango de inhibición limitado, fue juzgado como no apropiada para uso terapéutico. Sin embargo, la nisina es completamente degradada en el tracto digestivo y por lo tanto puede ser usada con seguridad como aditivo en alimentos. Su uso potencial como preservante en alimentos fue demostrado por primer vez en la manufactura de un queso tipo-suizo utilizando un cultivo productor de nisina (15). La forma de nisina más comúnmente utilizada por procesadores de alimentos es manufacturada por Aplin&Berret en Dorset, Inglaterra, y es comercializada bajo la marca Nisaplin , la cual tiene una alta y consistente actividad. Las propiedades fisicoquímicas de la nisina hacen que la estabilidad, solubilidad y actividad sean mayores a bajo pH. Varios estudios han demostrado que debido a la naturaleza catiónica de la nisina, su actividad in vitro es mayor en la presencia de un alto porcentaje de lípidos de membrana cargados negativamente. La nisina es principalmente usada para prevenir la germinación de esporas principalmente de Bacillus y Clostridium en una amplia variedad de alimentos (la aplicación de la nisina y otras bacteriocinas será tratada en la sección III ). Algunas especies formadoras de esporas son más sensibles que otras, por ejemplo B. stearothermophilus es más sensible que B. cereus, B. megaterium o B. polymyxa. Además la nisina es efectiva en prevenir la germinación de esporas de Clostridium botulinum tipo A, B y E, pero los tipos proteolíticos son más resistentes que los no proteolíticos. La sensibilidad incrementa mientras menor es el pH, mayor la temperatura, mayor el tiempo de

7 shock térmico y menor es la carga de esporas. La nisina es esporicida mas que esporastático (20).

Clase II: Bacteriocinas pequeñas estables al calor  La lactococina A, es quizás la mejor estudiada de las bacteriocinas clase II. Es producida por cepas de Lactoccus lactis, que además pueden producir lactococina B y M. La lactococina A madura es un péptido hidrofóbico de 54 aminoácidos, bactericida contra otras cepas de lactococos. El modo de acción es similar al de la nisina, actuando sobre la membrana citoplasmáticas de las células sensibles. La molécula más probablemente interactúa con un receptor de membrana específico y se agrega para formar poros. A diferencia de la nisina, la lactococina es independiente del voltaje al otro lado de la membrana objetivo. Otro grupo de inhibidores pequeños estables al calor son las bacteriocinas como pediocina. Esta clase de bacteriocina comparte un número de propiedades con la pediocina PA-1 y pediocina AcH. Una de las características de este grupo es su alto grado de actividad contra la Listeria monocytogenes. Todos los péptidos son lineales (36-44 aminoácidos) , y comparten una región específica de aminoácidos N-terminal en la bacteriocina madura . Se ha demostrado que cuatro residuos de cisteína en pediocina PA-1 , forman dos puentes disulfuro, dando a la molécula un grado de estructura secundaria. Cuando esos puentes se rompen , toda la actividad se pierde. Sólo dos de los cuatro residuos de cisteína de pediocina PA-1, se conservan en las otras bacteriocinas como pediocina, y al menos en la sakacina A y P, se cree que la formación de puentes disulfuro no estarían involucrados. En recientes estudios se ha confirmado que la pediocina PA-1 también forma poros en la membrana citoplasmática de cepas sensibles. Este dato sugiere que su actividad es voltajeindependiente, y depende de un receptor de membrana específico, aunque no identificado (8). Las pediocinas son bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas (BAL) del género Pediococcus. El primer reporte sobre la producción de pediocina data de 1975, cuando se encontró que P. pentosaceus inhibía el crecimiento y la producción de ácido de L. plantarum, y competidores indeseables en pepino fermentado en una mezcla de salmuera. El agente activo, denominado como pediocina A, inhibía un amplio rango de BAL como también varios clostridios, S.aureus, y B.cereus. Se han estudiado varias aplicaciones de la pediocina con respecto a la seguridad de los alimentos. En una sección posterior se verán algunas de sus aplicaciones (15). Las sakacinas, son un grupo de bacteriocinas producidas por Lactobacillus sake, su descubrimiento se debió a la búsqueda intensiva por componentes antimicrobianos naturales capaces de incrementar la vida útil de carnes crudas por inhibición del crecimiento de los microorganismos de deterioro y el control de L. monocytogenes. Varios antimicrobianos diferentes son producidos por cepas de L.sake, las cuales residen normalmente e los productos cárnicos. Esas cepas están bien adaptadas a las condiciones en carnes y son los mejores competidores en este tipo de alimento (8).

8 En la tabla 2, se muestra una lista de bacteriocinas caracterizadas a la fecha (1999) pertenecientes a las clases I y II.

Tabla 2: Bacteriocinas caracterizadas a la fecha (1999) provenientes de bacterias lácticas de las clases I y II. BACTERIOCINA

PRODUCTOR

ESPECTRO DE TAMAÑO INHIBICION

FUENTE

Clase I: Lantibióticos

Nisina (A y Z) Lacticina 481 Lactocina S Carnocina U149 Variacina

Lactococcus lactis Lactococcus lactis Lactococcus sake Carnobacterium piscicola Micrococcus varians

Amplio Amplio Amplio

34 27 37

Leche

Amplio Amplio

35-37 25

Pescado Carne fermentada

54 47 48 57,48

Queso Queso Queso

32 31

Leche cruda Carne molida

41 41

Carne Salsa fermentada

53,46 44 37

Carne Carne Carne Carne y fermentada

Salsa fermentada

Clase II: No lantibióticos, pequeños, estables al calor 

Lactococina A Lactococina A Lactococina M Lactacina F

Lactococcus lactis Estrecho Lactococcus lactis Estrecho Lactococcus lactis Estrecho Lactococcus johnsonii Estrecho Leuconostoc Mesenterocina 52 B mesenteroides Estrecho Curvaticina FS47 Lactobacillus curvatus Medio bacteriocinas como Pediocina Sakacina A Lactobacillus sake Medio Sakacina p Lactobacillus sake Medio Carnobacterium Carnobacteriocina A, B piscicola Medio Pediocina ACPA-1 Pediococcus acidolactis Medio Leucocina A-UAL-187 Leuconostoc gelidum Medio Enterocina 1146/A

Enterococcus faecium Medio 47 Carnobacterium Piscicolina 126 piscícola Medio 44 Leuconostoc Mesenterocina Y105 mesenteroides Medio 27 Fuente: http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/BACTERIOCINS.doc

leche

Jamón Leche de cabra

9 2.5. Mecanismo de Acción

Las bacteriocinas pueden poseer un modo de acción bactericida o bacteriostático sobre células sensibles, esta distinción depende fuertemente de varios factores, tales como dosis y grado de purificación de bacteriocina, estado fisiológico de las células objetivo (Ej. Fase de crecimiento) y condiciones experimentales (Ej. Temperatura, pH, presencia de agentes desestabilizadores de la integridad de la pared celular y otros componentes antimicrobianos, etc.). La mayoría de las bacteriocinas ejercen un modo de acción bactericida contra los microorganismos sensibles, aunque la lactocina 27, leucocina A-UAL 87 y leucocina S se ha visto que ejercen una acción bacteriostática. La actividad bactericida de bacteriocinas puede estar acompañada por lisis de células sensibles ( bacteriocinas bacteriolíticas), como es el caso de nisina A, plantaricina C y enterococina EFS2. Las bacteriocinas que no provocan lisis bacteriana son las más abundantes en la naturaleza (4). Las bacteriocinas ejercen su modo de acción bactericida por desestabilización y permeabilización de la membrana citoplasmática (Fig. 2). El mecanismo de acción primario de las bacteriocinas consiste en la formación de complejos poros transitorios o canales iónicos en la membrana citoplasmática de células sensibles. El contacto primario establecido entre bacteriocinas y células sensibles toma lugar a través de interacciones no específicas con polímeros aniónicos superficiales (ácidos teico y ácido lipoteico) usualmente constituyentes de la pared celular de bacterias Gram positivas. Varios autores han postulado que luego de las interacciones no específicas, los no lantibióticos requieren de la presencia de receptores específicos en la membrana citoplasmática, sin embargo con respecto a este punto hay controversia. La composición y distribución de los fosfolípidos de la membrana (Ej. Composición de las cabezas polares y cadenas hidrocarbonadas) influencian significativamente la eficacia de la asociación de las bacteriocinas con la membrana citoplasmática, su inserción y la subsiguiente formación de poros (4). La formación de poros y la consecuente pérdida de la integridad de la membrana provoca una difusión pasiva hacia el exterior de moléculas pequeñas, tales como iones (Ej. potasio y fosfato), aminoácido y ATP, a través de la bicapa lipídica, lo cual resulta en la reducción o disipación de la fuerza motriz de protones, o al menos de uno de sus componentes ( ∆ψ potencial de membrana, ∆ pH gradiente pH). Los bajos niveles de ATP intracelular y la ausencia de iones y cofactores resultan en la inhibición de la síntesis de macromoléculas tales como DNA, RNA, proteínas y polisacáridos, lo cual junto con la imposibilidad de mantener el transporte activo de nutrientes conduce a la detención del crecimiento microbiano y a la subsiguiente muerte celular. Con respecto al modo de acción secundario, luego de la despolarización de la membrana por formación de poros habría in ingreso de agua osmoinducido a través de los poros, lo cual conduciría a un incremento en la presión osmótica que fomentaría subsecuentemente la lisis celular por shock osmótico.

10 Estudios sugieren que para que la nisina forme poros, requiere que la célula objetivo tenga un ∆ψ ( interior negativo) y un ∆pH (interior alcalino) (Okereke y Monteville, 1992)3. Existe debate con respecto al tipo de poros formados por la nisina, pero la mayoría coincide con los modelos “barrel stave” o “wedge like” (Fig.3).. En el modelo “barrelstave” , cada molécula de nisina se orienta así misma perpendicular a la membrana, formando un canal iónico que atraviesa la membrana (Ojcius y Young, 1991)3. En el modelo “wedge like”, después de un número crítico de moléculas de nisina asociadas con la membrana, ellas se insertan concurrentemente, formando una cuña (5) En un estudio realizado por R.O.Benecht y colaboradores, 2002, sugieren distintos modos de acción para la nisina Z, que puede ser específico para el género y/o especie y puede incluir objetivos intracelulares nisina- específicos, esto demostraría las diferencias en la susceptibilidad y respuesta a la nisina Z en diferentes grupos bacterianos testeados, entre ellos la L. innocua (1).

Fig. 3: Interacción de monómeros de bacteriocina (forma oval) con la membrana citoplasmática a) mecanismo de formación de poros b) modelo de acción detergente. (Montville et.al., 1995)

Fuente: http://www.biotecnologia.com.br/bio29/alimentos.html

Fig. 4: Modelos de formación de poros a) “wedge- like” b) “barrel-stave” (adaptado de Moil et.al., 1999) Fuente: http://www.biotecnologia.com.br/bio29/alimentos .html

2.6. Síntesis de bacteriocinas por BAL

Los genes para la producción de bacteriocinas activa están usualmente en agrupaciones de operón. Los operón que contienen los genes para la producción de lantibióticos están bien estudiados. Los genes que codifican la producción de bacteriocinas pueden estar localizados en el cromosoma o en un plásmido o transposon. Típicamente los microorganismos poseen genes que codifican la estructura del péptido (Rauch y de Vos, 1992)4, proteína que ayudan en la síntesis 3

J.Cleveland and et al. , 2001

3

4

Cleveland, J et al., 2001

11 de la forma activa del péptido(Engelke et al., 1992) 4, proteínas que ayudan en el transporte de la bacteriocina para que ésta cruce la membrana(Klein et al., 1992) 4, proteínas regulatorias (Klein et al., 1993) 4 y proteínas que confieren inmunidad al microorganismo productor de bacteriocina ( Diet et al., 1996; . Engelke et al., 1994:; Klein y Entian, 1994; Qiao et al., 1996) 4. Debido a que las bacteriocinas son codificadas por un gen estructural, los sitios activos y la relación función- estructura, pueden ser examinadas por manipulación genética. Técnicas moleculares permiten producir bacteriocinas análogas con actividad incrementada y con especificidad alteradas. Además estas técnicas permiten traspasar los genes que codifican las bacteriocinas y le otorgan inmunidad a la bacteria productora de bacteriocina a otra cepa no productora de bacteriocina por un proceso conocido como conjugación (5) 2.7. Producción de Bacteriocinas

Se deben desarrollar procesos rentables económicamente en la producción de bacteriocinas. Para lo cual es necesario optimizar la producción y aumentar la estabilidad y actividad de las bacteriocinas. Además, si se aumenta la capacidad de producción de bacteriocinas “in situ” y la estabilidad de éstas en los cultivos starter  productores de bacteriocina adicionados a los alimentos, se mejorará la eficaciaen la prevención del crecimiento de microorganismos alteradores y patógenos. Las fermentaciones debieran estar basadas sobre sustratos baratos, y estrategias de procesamiento apropiadas y de bajo costo a lo largo de la cadena productiva, para producir bacteriocinas tanto para uso directo como biopreservante de alimentos, como en biomasa para ser utilizada como cultivo starter para la producción de la bacteriocina in situ. La mayoría de las bacteriocinas son producidas durante la fase de crecimiento logarítmico pero a menudo hay una disminución pronunciada en la actividad al final de la fase logarítmica debido a la degradación proteica, adsorción a la superficie celular, agregación proteica, formación de complejos, etc. Cantidades máximas de bacteriocinas pueden ser cosechadas recolectando éstas en el pick de la actividad o usando condiciones que minimizan la adsorción, por ejemplo bajando el pH. Las bacteriocinas pueden ser removidas de la fermentación ya sea en forma continua utilizando adsorbentes o por batch. La producción de bacteriocinas parece ser estimulada por factores de stress tales como la baja temperatura y competencia de microorganismos. Mientras más baja es la tasa de crecimiento específico de las BAL la producción de acidez probablemente será menor y la competencia será menos exitosa necesitando de otros factores para competir como la producción de bacteriocinas. Un protocolo ideal para la producción de bacteriocina es aquel aplicable para la purificación de bacteriocina a gran escala, teniendo bajos costos de producción y bajos niveles de recuperación, que resulten en una producción superior a 50% y pureza mayor a 90% (20). 2.8. Métodos de adición de Bacteriocinas en alimentos 4 4

12 Las bacteriocinas se pueden aplicar por cuatro métodos (10,20): 







 Aplicación de un cultivo puro de BAL viables productor de bacteriocinas. El éxito de esta aplicación depende de la habilidad de la BAL de crecer y producir la bacteriocina en la dosis requerida en el sistema alimenticio, bajo las condiciones extrínsecas e intrínsecas reinantes (Ej. temperatura, pH, etc.)  Aplicar una preparación semi-purificada de la bacteriocina. En este caso la dosis de bacteriocina puede ser más precisa y por lo tanto su efecto es más predecible. Sin embargo, las preparaciones semi-purificadas están limitadas por las regulaciones nacionales respecto al uso de aditivos alimenticios. Preparación cruda de bacteriocina, la cual es obtenida por crecimiento de la BAL productora de bacteriocina sobre un sustrato complejo natural (Ej. leche). Este método evita el uso de un componente purificado y por otro lado permite el uso de una preparación de actividad conocida y constante. Este método es ahora empleado para producción a escala industrial de nisina.  Adición de bacteriocina en películas plásticas para envasado (biofilms) lo cual permite una lenta liberación o incorporación al alimento de la bacteriocina.

2.9. Legislación

La legislación existente en la mayoría de los países no favorece el uso de componentes naturales purificados obtenido desde fuentes naturales, a menos que esos componentes tengan la categoría GRAS.  Actualmente la nisina es la única bacteriocina explotada comercialmente a gran escala, aprobada en 1988 por la FDA en USA , aunque ésta ya se estaba usando en Europa ( La OMS aprobó el uso de nisina en 1961) (T. O’Keeffe y C.Hill, 1999), y permitida en al menos 50 países para la inhibición de clostridios en quesos y alimentos enlatados. Ninguna de las otras bacteriocinas conocidas a la fecha tienen un estatus legal aprobado completamente como aditivo de alimentos, aunque la aplicación de una cepa productora de pediocina ( P.acidolacti) ha sido aprobado por  la USDA para uso en tocino reducido en nitrito en la prevención de producción de toxina por germinación de esporas de C. botulinum (15) . El uso de un cultivo starter productor de bacteriocina como ingrediente puede no requerir consideración especial en los EE.UU. si el microorganismo es reconocido generalmente como seguro (GRAS) . Si un purificado de bacteriocina es usado como preservante, la sustancia debiera ser justificada como GRAS por la propia compañía de acuerdo al Código de Regulación Federal , pero la FDA se reserva el derecho de requerir justificación de la aseveración. Con la formación de la Unión Europea, a los aditivos de alimentos se le ha asignado la letra E. La nisina está en la lista E234, y pueden también ser etiquetados como ”preservante nisina” o “preservante natural”.

13 La USDA publica guías para estimar la seguridad de nuevos preservantes. Para aprobar que la bacteriocina sea aprobada como aditivo de alimentos, ésta debe ser  identificada químicamente y caracterizada, y su uso y eficacia deben ser demostrado. El proceso de manufactura debe ser descrito y se deben entregar los métodos usados para la cuantificación y estandarización del péptido. Datos toxicológicos y el destino de la molécula después de la ingestión también deben ser presentados (5). En la tabla siguiente se muestran los máximos niveles de nisina en diferentes países y los alimentos en que está permitido su uso. Tabla 3: Ejemplos de usos de nisina en diferentes países. País  Argentina  Australia Chile Estados Unidos Francia Gran Bretaña México Rusia Unión Europea

Fuente: J. Cleveland et al., 2001.

Alimento en el cual la nisina Nivel máximo (UI/g) es permitida Quesos procesados 500 Quesos, quesos procesados, Sin límite conservas de tomates Queso 12.5 (mg/kg) Quesos untables procesados 10.000 pasteurizados Queso procesado Sin límite Queso, conservas y crema Sin límite Nisina es permitida como aditivo 500 Quesos procesados dietéticos y 8.000 conservas de hortalizas E234, puede también ser   Varios de acuerdo al producto y etiquetado como al estado miembro preservante natural

14 2.10.- Ventajas y Desventajas de las Bacteriocinas VENTAJAS Pueden reemplazar o permitir el uso de niveles más bajos de i) preservantes químicos que pueden ser considerados como no naturales, ii) antimicrobianos derivados de plantas tales como los aceites esenciales que se encuentran en el ajo que puede introducir fuertes sabores al alimentos y iii) antibióticos administrados en animales para la prevención y/o tratamiento enfermedades. Preservantes naturales producidos principalmente por BAL, las cuales tienen una categoría GRAS.

DESVENTAJAS Un inconveniente en el uso de bacteriocinas es que estas son moléculas hidrofóbicas y por lo tanto pueden separar la fase grasa del alimento limitando su uso en alimentos . Sin embargo mientras la mayoría de las bacteriocinas son ciertamente muy hidrofóbicas, ellas son moléculas relativamente pequeñas y por lo tanto pueden rápidamente difundir hacia la fase acuosa del alimento.  A menudo se observa la unión a la superficie del alimento y pobre actividad cuando cepas productoras de bacteriocinas son adicionadas al alimento. No tóxicas. No se han reportado efectos tóxicos Dependiendo de la matriz alimenticia las de las bacteriocinas. Estudios de toxicidad para bacteriocinas pueden tener otros inconvenientes nisina fueron llevados a cabo utilizando como pobre solubilidad, distribución no homogénea cantidades muy superiores a las que debieran de las moléculas de bacteriocinas, sensibilidad a ser usadas en alimentos, sin encontrar efectos las enzimas del alimento, y el impacto negativo de tóxicos. altas concentraciones de sales u otros ingredientes adicionados que afectan la actividad o la producción de la bacteriocina. Constituyentes normales de la dieta normal del La aparición espontánea de cepas objetivo hombre y animales, donde los productos mutantes resistentes a la bacteriocina. Mutantes cárnicos y lácteos son especialmente ricos en resistentes a la nisina de L.monocytógenes BAL bacteriocigénicas. aparecen con una frecuencia de 10 -6 a 10-8 . Sin embargo en alimentos pobremente procesados tales niveles elevados no debieran ser encontrados. Posibilidad de transpasar los genes productores La renuencia de la industria a incorporar nuevas de bacteriocina y de la inmunidad a cepas metodologías, particularmente si ellas implican starter no productoras para la producción in situ llevar a cabo costosos y sustanciales programas de la bacteriocina, lo cual es posible debido a toxicológicos que pueden ser necesarios para la que las bacteriocinas mejor conocidas están introducción de un nuevo antimicrobiano como un bien caracterizadas genéticamente. aditivo purificado. Inactivadas por proteasas de origen gástrico o pancreático durante el paso a través del tracto gastrointestinal. Por lo tanto no deberían alterar  la ecología del tracto digestivo o resultar en riesgos relacionados con el uso de antibióticos comunes. Buena estabilidad térmica de la mayoría de la bacteriocinas pudiendo permanecer activas después del proceso térmico de los alimentos. Estabilidad de algunas bacteriocinas a las bajas temperaturas y a pH bajo, pudienso ser útil en alimentos ácidos y/o productos mantenidos o procesados a temperaturas bajas. Efectividad de las bacteriocinas en una amplia gama de alimentos, incluyendo quesos con alto contenido graso y carnes. Multipropósito. Las bacteriocinas pueden ser  adicionadas a los alimentos para mejorar la calidad de éstos, alargar su vida útil y/o asegurar la inocuidad de éstos. Fuente: http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/BACTERIOCINS.doc HILL, C., 1999; SMID AND GORRIS, 1999.

15

III. APLICACIÓN DE BACTERIOCINAS EN ALIMENTOS 3.1. Productos Lácteos En quesos fermentados es difícil asegurar una distribución pareja de un inhibidor a menos que este sea adicionado mientras la leche está aún liquida. Uno de los problemas que se presentan al usar bacteriocinas de amplio espectro tales como nisina en productos fermentados es que los microorganismos starter probablemente serán inhibidos al igual que los microorganismos de deterioro y patógenos. Este problema puede ser remediado utilizando cultivos starter resistentes a la nisina, si la nisina es adicionada como un preservante exógeno, o usando starter como bacterias productoras de nisina con inmunidad innata (8). La nisina es usada en quesos procesados, pasteurizados para prevenir la germinación de esporas tales como la del Clostridium tyrobutyricum que puede sobrevivir a tratamientos térmicos tan altos como (85-105°C). Uno de los efectos más impresionantes es la prevención del “gas tardío” debido a la germinación de esporas de clostridios. Esto ha sido reportado como un problema particular en quesos Suizo y quesos semi-duro Dutch, principalmente debido a la esporulación de C. butyricum y C. tyrobutyricum (8). El uso de nisina permite además que esos productos puedan ser formulados con altos niveles de humedad y bajos contenidos de NaCl y fosfato, y también permite el almacenamiento a cabinas sin refrigeración sin riesgo de deterioro. El nivel de nisina usado depende de la composición del alimento, probablemente de la carga de esporas, vida útil requerida y la temperatura de almacenamiento (20). EL queso Cheddar reducido en grasa manufacturado con un productor de lacticina 3147 puede ser madurado a temperaturas elevadas debido a que la vasta mayoría de bacterias ácido lácticas no-starter causantes de deterioro son inhibidas por  lacticina 3147, lo cual puede ser difícil de alcanzar con cultivos starter tradicionales debido al deterioro por poblaciones microbianas no-starter (22) Una cepa productora de lacticina 3147 fue usada como starter en queso Cottage al cual se le inoculó 104 ufc/g de L. monocytogenes .La actividad de la lacticina 3147 fue detectada a lo largo de los 6 días de almacenamiento y fue asociada con una reducción de 103 en el número de listerias en queso almacenado a 4°C y la velocidad de muerte fue mayor en quesos almacenados a temperaturas mayores. Esos resultados demostraron la efectividad de la lacticina 3147 como un inhibidor de L. monocytogenes en un sistema alimenticio donde la contaminación postmanufactura por este microorganismo puede ocurrir. También se comprobó la efectividad de una cepa productora de lacticina 3147 en inhibir L. monocytogenes en quesos madurados por mohos Esta cepa se inoculó sobre la superficie de los quesos, los cuales pueden constituir in riesgo de contaminación con listeria y permitir  el crecimiento, ya que el pH de la superficie de los quesos madurados puede exceder a 7 (Fig.4). En quesos el control de las bacterias ácido lácticas no-starter (BALNS) es deseable ya que estas han sido implicadas en el desarrollo de sabores extraños. Ensayos usando starter productores de bacteriocinas demostraron que después de 6 meses

16 de maduración de los quesos, los recuentos BALNS estaban en un nivel bastante bajo que no interferían con el desarrollo del sabor (Fig.5). Las bacteriocinas además ayudan a acelerar la maduración de los quesos. Quesos Cheddar manufacturados con un nuevo sistema starter utilizando una cepa productora de bacteriocina (lactococina A, B y M) junto al starter, exhibieron una mayor concentración de enzimas intracelulares, indicando que la lisis de células starter habría ocurrido durante la manufactura y maduración del queso. Esos quesos también exhibieron mayores niveles de aminoácidos libres, indicando un mayor  grado de proteolisis secundaria. Además los quesos Cheddar manufacturados con el nuevo sistema starter recibieron mayor puntaje organoléptico que el queso control (22). En quesos fermentados puede ser preferible usar bacteriocinas con un rango de actividad altamente específico que no afecte la flora natural del queso incluyendo. Por ejemplo, enterocina 1146 (Enterococcus faecium) como varias de las bacteriocinas como-pediocina tales como sakacinas A y P (Lactobacillus sake), Leucocina A (Leuconostoc gelidium) son extremadamente activas contra la L. monocytogenes en niveles que no afectan los cultivos starter. En productos lácteos los cuales no requieren bacterias starter, bacteriocinas de amplio espectro serán preferidas (8) La nisina es también usada para extender la vida útil de postres lácteos los cuales no pueden ser completamente esterilizados sin dañar su apariencia, sabor o textura. La nisina puede incrementar significativamente la vida útil de tales productos pasteurizados. La nisina es aplicada a la leche en la mitad Este donde tienen problemas de vida útil debido al clima cálido, la necesidad de transportar leche a largas distancias y debido a las pobres instalaciones de refrigeración. La nisina puede doblar la vida útil de tales productos a temperaturas de refrigeración, ambiente y elevadas, y prevenir  la germinación de esporas termofílicas resistentes al calor que pueden sobrevivir a la pasteurización. La nisina también puede ser usada en leche evaporada (20). Benech, R. et al., (2002) compararon la actividad antibacteriana en queso Cheddar  madurado por 6 meses a 7°C de nisina Z encapsulada en liposomas versus la producida in situ por un starter compuesto de Lactococcus lactis productor de nisina, dos cepas de lactoccoccus tolerantes a la nisina y L. casei subesp. casei como flora secundaria. Los resultados mostraron que después de 6 meses se mantenía el 90% de la actividad inicial de la nisina Z encapsulada (280+/- 14 UI/g) mientras que sólo el 12% para la nisina producida in situ por el starter nisinogénico (300+/- 15 UI/g). Los investigadores concluyeron que la nisina contenida en liposomas puede proveer una herramienta útil para mejorar la estabilidad, distribución y disponibilidad de la nisina en quesos, y mejorar el control de bacterias indeseables en alimentos almacenados por largos periodos. La pediocina PA-1, producida por Pediococcus acidilacti se ha demostrado que inhibe L.monocytogenes en productos lácteos tales como queso crema, helado,

17 leche en polvo reconstituida (20). Pediocina PA-1 inhibió Listeria monocytogenes inoculada en queso cottage y queso crema por una semana a 4°C, mientras se observó un rápido crecimiento hasta una alta densidad celular en las muestras control (sin bacteriocina). La actividad de la bacteriocina no fue afectada por la grasa o proteínas presentes en el alimento, mientras se observó una acción sinérgica entre el efecto de la bacteriocina y el ácido láctico (15). En un estudio realizado por Joosten, H y Nuñez, M. (1996), se investigó la prevención de la formación de histamina en quesos por bacteriocinas producidas por  BAL. Se emplearon como starter (separadamente) en la elaboración de quesos dos cepas de enterococos productores de bacteriocinas y una cepa de Lactococcus lactis productora de nisina . Los resultados obtenidos mostraron la inhibición casi completa de L. buchneri (productor de histamina) el cual había sido inoculado previamente a la leche en niveles de hasta 190 CFU/g . No hubo formación de histamina en los quesos elaborados con starter productores de bacteriocinas, en cambio en los quesos control (sin bacteriocina) el L. buchneri alcanzó niveles de hasta 1.1x108 CFU/g, y 200 mg de histamina por Kg. después de cuatro meses de maduración a 14 °C. Esos resultados mostraron que es posible prevenir la formación de histamina en quesos utilizando starter productores de bacteriocina (Tabla 5) . La lacticina 3147 es una bacteriocina de amplio espectro contra un rango de estafilococos y estreptococos causantes de mastitis. En un estudio llevado a cabo por Ryan, M. et al. (1998) se evaluó in vitro la actividad de la lacticina 3147 contra patógenos causantes de mastitis incorporando ésta en un sellante intra mamario. El sellante conteniendo lacticina 3147 exhibió excelente actividad antimicrobiana (Fig. 6 ) contra los patógenos causantes de mastitis, por lo tanto el uso de estos sellantes podría mejorar los tratamientos de prevención de mastitis en vacas que no están produciendo leche y reducir o eliminar el uso de antibióticos.

Fig. 4: Inhibición de L.monocytogenes sobre queso madurado con mohos en presencia y ausencia de lacticina 3147.

18

Fig.5: Inhibición de BALNS en queso Cheddar manufacturado en la presencia y ausencia de un cultivo starter productor de lacticina 3147. Bac. +; S.dysgalactiae M

10    )    l   m 8    /    U 6    F    C    ( 4   g   o 2    L

Bac -; S.dysgalactiae M Bac. -; S.aureus

0

0

5

15

30

45

60

90

120

Bac. +; S.aureus

Tiempo (min.)

Fig. 6: Efecto bactericida de lacticina 3147 sobre Streptococcus dysgalactiae M y S.aureus. Lacticina 3147 fue adicionada a cultivos de Streptococcus dysgalactiae M a una concentración final de 10.240  AU/ml y a 10 cultivos de S.aureus en una concentración final de 1.280 AU/ml, Tabla 5: Inhibición de formación de histamina en queso por starters productores de bacteriocina L. buchneri St2A Starter productos de Histamina Histidina Inoculob Densidad máximac bacteriocina (mg/kg)a (mg/kg)a (CFU/ml) (CFU/g) E. faecalis INIA 4-07 1,9 < 102 < 10 273 2 19 < 10 < 10 234 8 190 2 x 10 < 10 250 2 E.faecalis EFS 2 1,9 < 10 < 10 475 2 19 < 10 < 10 470 2 190 < 10 < 10 443 2 L. lactis ESI 561 1,9 < 10 < 10 167 2 19 < 10 < 10 173 2 190 < 10 < 10 213 d 6 Ninguno 1,9 1,5 x 10 177 63 7 19 3 x 10 194 21 8 190 1,1 x 10 214 < 10 a

Concentraciones de histamina e histidina fueron determinadas después de 4 meses de maduración en leche. c en queso b

el queso control fue elaborado con el starter regular, MAO11. 3.2. Alimentos enlatados d

19 La nisina ha sido usada con éxito en conservas de baja acidez (pH>4.6) y alta acidez (pH<4.6) para prevenir la germinación de esporas de clostridios (15). La nisina puede ser adicionada en conservas en niveles de 100-200 UI/g. Para controlar  termófilos formadores de esporas tales como Bacillus stearothermophilus y Clostridium thermosaccharolyticum, los cuales pueden sobrevivir y crecer en conservas almacenadas en altas temperaturas. Esta también permite una reducción en los tratamientos térmicos mejorando por lo tanto la apariencia y sabor del producto final sin comprometer la seguridad de los productos y (8, 20). Esta es usada en conservas de papas, champiñones, guisantes, sopas y pudines de cereales. Debido a la actividad incrementada de la nisina a bajos niveles de pH, es idealmente apropiada para conservas de bajo pH tales como las conservas de tomates, para inhibir la flora de deterioro ácido-tolerante tales como B. macerans y C. pasteurianum (20) . La nisina también se ha usado en conservas para prevenir el agriado plano producida por especies de Bacillus (8).

3.3. Productos cárnicos La carne tiene un número de propiedades intrínsecas las cuales hacen que el uso de bacteriocinas sea más problemático que en alimentos líquidos. En particular es difícil alcanzar una distribución homogénea, puede haber problemas de solubilidad, las bacteriocinas pueden separar la fase grasa, o simplemente ligarse a las proteínas cárnicas (8) Bacteriocinas producidas por BAL asociadas con carnes y carnes fermentadas tales como Pediococcus, Leuconostoc, Carnobacterium y Lactobacillus spp. probablemente tendrán un potencial mucho mayor como preservantes cárnicos (Stiles y Hasting, 1991; Shahidi, 1991;Yousef et.al., 1991) 6 Se han realizado estudios con nisina con el objetivo de reducir el nivel de nitritos en carnes. Sin embargo, los resultados muestran que se requieren altos niveles de nisina para alcanzar un buen control de Clostridium botulinum, lo cual puede deberse a la unión de la nisina con partículas cárnicas, distribución no homogénea, pobre solubilidad en sistemas cárnicos o posiblemente a la interferencia en la actividad de fosfolípidos cárnicos (8,20). Sin embargo, se han obtenido mejores resultados que el uso convencional de 156 ppm de nitrito combinando niveles reducidos de nitrito (120 ppm) con 100-250 ppm de nisina A (1). Luckansky et al. (1992) 5 inoculó una cepa productora de pediocina y otra no productora de pediocina en pasta de vienesa la cual fue subsecuentemente inoculada con un cóctel de 4 cepas de L. monocytogenes . El número de listerias permanecieron altos (105/g) en las vienesas que contenían la cepa no productora de pediocina, mientras que la vienesa que contenía la cepa productora de pediocina el número de listerias descendió a menos de 10 2/g. Además, la pediocina producida sobrevivió al proceso de cocción al final de la fermentación y fue detectable a lo largo de los 60 días de almacenamiento a 4°C. Estos mismos investigadores 5

Hill, C., 1999.

20 desarrollaron una forma de gelatina de pediocina, producida por una bacteria ácido láctica, que protege a los hot-dog de la contaminación con Listeria (15). Inóculos de bajo nivel de Pediococcus lactis productor de pediocina PA-1 se han usado en bacón reducido en nitrito para prevenir la germinación de esporas de Clostridium botulinum y la subsiguiente producción de toxina (20) Sakacina A, una de las bacteriocinas como pediocina , también ha sido usada para controlar el crecimiento de L. monocytogenes en carne molida pasteurizada (Schillinger, 1994)6. La presencia de un cultivo productor de sakacina A previno el crecimiento de un alto inoculo de L. monocytogenes a 8°C, mientras en la ausencia del productor de sakacina A los niveles incrementaron desde 10 5 a 10 9/g en 10 días. Resultados similares se encontraron en paté de cerdo inoculado con un cóctel de listerias (8). La leucocina A, cuyo productor fue aislado desde carne, tiene aplicaciones potenciales en carnes envasadas al vacío. Tales productos son almacenados a bajas temperaturas en condiciones anaeróbicas, posiblemente con adición de ácidos orgánicos. Sin embargo, las bacterias alterantes de la carne son psicrótrofas, anaerobias facultativas y ácido tolerantes; por lo tanto es necesario controlarlas utilizando “hurdles” adicionales, tales como el uso de bacterias lácticas bacteriocigénicas, las cuales deben ser capaces de competir con la carga microbiana indígena relativamente alta de la carne cruda. La ventaja de la leucocina  A sobre la nisina, es la estabilidad en sistemas cárnicos y que puede ser producida durante el almacenamiento refrigerado sin cambios organolépticos indeseables bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas por largos periodos de tiempo. Esta previene el deterioro debido a la producción de sulfuro por Lactobacillus sake (20). MING, X. et.al. (1997), produjeron polvos lácteos ricos en bacteriocina para aplicarlos en film de envasado para alimentos. La disponibilidad de estos polvos hace posible cubrir envolturas celulósicas y bolsas plásticas ampliamente utilizadas en productos cárnicos con una delgada capa de film antimicrobiano. El envasado vacío y humedad de las carnes al interior de las bolsas hace posible un excelente contacto entre la superficie cárnica y la bacteriocina. En la figura 7 se muestra la inhibición por polvos de pediocina en una concentración de 7.75 mg/cm2 aplicados en bolsas de envasado de carne inoculada con L. monocytogenes. Los resultados mostraron que las bolsas cubiertas con pediocina fueron efectivas en inhibir L. monocytogenes en productos frescos y procesados . El crecimiento fue diferente (p<0.05) entre las muestras control y las muestras tratadas después de 2 semanas a 4°C. La L.monocytogenes inoculada no creció en bolsas cubiertas con pediocina, mientras el mismo inóculo creció hasta 10 6 en muestras control. Lactobacillus sake Lb674, una BAL aislada originalmente de carne que produce la bacteriocina sakacina 674, la cual es idéntica a la sakacina P y muy similar a la pediocina PA-1 fue inoculada en niveles de 10 5-106 CFU/g en vienesa tipo – Bologna envasadas al vacío almacenadas a 7°C, L.sake Lb674 produjo cantidades detectables de bacteriocina y retrasó completamente el crecimiento de L.monocytogenes, mientras las BAL no productoras de bacteriocina no inhibieron el crecimiento de este microorganismo (Fig.8). El uso de sakacina 674 purificada

21 exhibió un marcado efecto inicial contra L.monocytogenes e inhibió su crecimiento durante el almacenamiento de esta carne fermentada (1). Scannel, A., (2000) estudió el efecto de lacticina 3147 y nisina sobre la vida útil de vienesa de cerdo fresca y la habilidad que tienen para controlar patógenos (C. perfringens DSM 756, Salmonella Kentuchy AT1) y no patógenos (L. inonocua DPC 1770). Los resultados obtenidos mostraron que no había diferencia significativa en la actividad de ambas bacteriocinas contra las cepas objetivo usadas, ambas bacteriocinas fueron significativamente mejor que metabisulfito de sodio contra cepas Gram-positivas. Además los resultados indicaron sinergia de ácidos orgánicos con bacteriocina contra Salmonella Kentuchy y L.innoccua, siendo particularmente más efectivo en la inhibición de C.perfringens. Además, lacticina 3147 combinada con citrato de sodio (CS) o lactacto de sodio (LS) obtuvieron RT en placa significativamente menores durante el periodo del ensayo (Fig 9 y10). El estudio sugirió que lacticina 3147 combinado con LS o CS puede ser utilizado como un efectivo preservante contra patógenos de origen alimenticio, y puede funcionar como una alternativa al metabisulfito de sodio. Debido a que la lacticina 3147 es estable al calor, permanecería activa después de la cocción de la vienesa y la protegería de la contaminación y proliferación de un amplio rango de patógenos y microorganismos alterantes. Lo cual es particularmente importante en casos donde la vienesa cocinada es mantenida por algún tiempo antes del consumo (Ej: Establecimientos de catering e instituciones). Además la lacticina 3147, combinada con LS o CS mantiene bajos los recuentos totales a lo largo del almacenamiento, extendiendo la vida útil sin comprometer la seguridad microbiológica del producto. La pediocina AcH (PA-1) se ha demostrado que controla exitosamente el crecimiento de L. monocytogenes en pollo crudo. El uso de 2.400AU/g de pediocina resultó en 2.8 log CFU/g de L. monocytogenes después de 28 días de almacenamiento a 5°C, mientras que el pollo control tenía una carga de 8.1 log CFU/g. La pediocina se liga al pollo crudo, pero no al cocinado. Sin embargo, cuando al pollo crudo con pediocina es cocinado, la actividad de la pediocina es retenida. Los autores sugieren que la pediocina debiera ser aplicada al pollo antes de ser  cocinado para que la efectividad sea máxima (Goff et al., 1996) 6 En la Universidad de Melbourne en Australia, Berrie Davidson ha investigado la acción de la piscicolina producida por una BAL sobre Listeria. La piscicolina ha sido patentada, y pronto será usada en productos cárnicos y como enjuague para ensaladas verdes o piezas de pollo (15).

6

J.Cleveland et al., 2001

22

Figura 7: Inhibición de L.monocytognes inoculada en carne por efecto de polvos de pediocina aplicado en las bolsas de envasado. Promedio de determinaciones en triplicado en una muestra de carne. Promedio de diferentes carnes control y tratadas (p<0,05) después de un tiempo de almacenamiento igual o superior a 2 semanas a una temperatura de 4°C.

Figura 8: Crecimiento de L.monocytogenes en vienesa tipo Bologna a 7°C en la presencia de BAL no productoras de bacteriocinas (bac -) y BAL productoras de bacteriocinas (L bac +), y la progresión del pH durante el almacenamiento. La vienesa fue artificalmente inoculada con un pool de 4 servares diferentes de L.monocyttogenes . BAL bac -: un pool de 20cepas BAL no productoras de bacteriocinas aisladas de muestras de carne. BAL +: sakacinas 674 producida por la cepa L.sake Lb674

23

3.4. Productos del Mar  Taylor et al., (1990) 7 demostró que el tratamiento con nisina A de bacalao, arenque, y filetes de caballa ahumada inoculado con esporas de Clostridium botulinum retrasaba la producción de toxina en 5 días a 10 °C, pero sólo en medio día a 26 °C. El tratamiento con nisina no interfería con el crecimiento de las bacterias no patógenas y en todas las muestras la toxina botulínica fue formada antes que el deterioro fuera evidente (1). El efecto de la nisina Z, carnocina UI49 y bavaricina A sobre el crecimiento bacteriano y vida útil de camarón en salmuera fue evaluado y comparado con el efecto de una solución de sorbato/potasio y control sin preservantes (Einarsson y Lauzon, 1995). Típicamente este producto contiene 3 a 6% de sal y concentraciones de ácido sórbico y benzoico de 0.05% a 1%, con pH entre 5 a 6, y es almacenado a temperaturas entre 0 a 6°C. La solución de sorbato/benzoato preservó el camarón en salmuera por un periodo 59 días a 4.5°C. La vida útil de camarón en ausencia de preservantes fue de 10 días. De las tres bacteriocinas la más efectiva fue la nisina Z tanto cruda como purificada extendiendo la vida útil del camarón en salmuera a 31 días. Estos resultados indican que es posible preservar camarones en salmuera bajo refrigeración utilizando preservantes naturales tales como la nisina Z por un periodo de 3 a 4 semanas, protegiéndolo además de la posible contaminación con L.monocytogenes (7). Duffes, F., (1999) estudió la inhibición de L. moncytogenes en salmón ahumado en frío refrigerado envasado al vacío por bacteriocinas semi-purificadas y producidas “in situ” por Carnobacterium spp. Los resultados obtenidos demostraron que C. piscicola V1 ejerce un efecto un bactericida contra L. monocytogenes a temperaturas de refrigeración de 4 y 8°C, siendo la cepa más efectiva de las utilizadas (C. piscicola V1, C.divergens V41 y C. piscicola SF668). Además no se obsevó deterioro debido al uso de las cepas productoras de bacteriocinas, lo que quedó demostrado por los buenos resultados del análisis sensorial y una baja producción de aminas biogenas (Fig. 11). El estudio concluyó que cepas bacteriocigénicas de Carnobacterium pueden ser utilizadas en el futuro para controlar el crecimiento de L. monocytogenes debido a su habilidad para crecer y producir bacteriocinas bajo las condiciones reinantes en el alimento. Además los resultados mostraron que la aplicación de divercina V41 (producida por C. divergens V41) como único aditivo para controlar L.monocytogenes es prometedora. Las bacteriocinas también se pueden utilizar para mejorar la seguridad y alargar la vida útil de salmón fresco refrigerado. La combinación de nisina y Microgard (MG)  junto con un pH de 4,2 redujo la población aeróbica total de salmón fresco refrigerado en 2 log.(p<0.05) e incrementó su vida útil a 6°C en 3-4 días en comparación al control. También se redujo el crecimiento de L.monocytogenes inoculada en salmón congelado-descongelado e incrementó su vida útil de 5 a 10 días a 6°C. El tratamiento con bacteriocina no afectó el pH superficial o color del pescado (Fig.12). 7

Abee, T., et al., 1995

24

Fig. 12: Evaluación del tratamiento óptimo de bacteriocina sobre L.monocytogenes (CFU/g) en salmón fresco almacenado a 6°C envasado al vacio y sin vacio. El salmón fue tratado 6 días después de la captura.Vacío (V).Control: ♦; V-Control: ▲; Mg + Nis.: ж;; V-MG +Nis: Ο.

Fig. 11:: Eficacia de C. piscicola V1 y piscicocina, adicionada como substancia semipurificada, contra L.monocytogenes en salmón ahumado en frío refrigerado envasado al vacío almacenado a 8°C (a) y 4°C (b). ●, L. monocytogenes sola (control); ▲, L. monocytogenes en cocultivo con C.piscicola V1; ♦, L. monocytogenes en presencia de piscicocinas; ▼, < (10 UFC/g). Cada punto es el promedio de tres determinaciones. Las barras indican las desviaciones estándar .

3.5 Vino y Cerveza La resistencia de las levaduras a la nisina permite que ésta pueda ser usada para controlar el deterioro por BAL en cervezas y vinos (20) La fermentación maloláctica es una importante característica de algunos vinos. Esta fermentación debe ser controlada para alcanzar una alta calidad del producto. En varios vinos tintos la conversión de malato dicarboxílico a lactato monocarboxílico es una consecuencia deseable del crecimiento de las bacterias ácido lácticas tales como Leuconostoc oenos o Pediococcus damnosus. Esta conversión puede conducir  a una elevación del pH entre 0,1-0,3 unidades, y también tiene un efecto sobre las características sensoriales del vino. Donde la fermentación maloláctica es deseada el vino puede ser inoculado con cepas seleccionadas de Leuconostoc oenos. Sin embargo en ciertos vinos blancos esta misma fermentación tiene un efecto negativo sobre la calidad del vino y es indeseable. La nisina puede ser usada para promover  la calidad de ambos tipos de vinos (Daeschel et al., 1991) 8. Por ejemplo, se puede 8

HILL, C., 1999

25 adicionar al vino después de la fermentación por levaduras, nisina y Leuconostoc. oenos resistente a la nisina. La nisina prevendrá el crecimiento de todas las BAL indeseables, no interfiriendo en la fermentación maloláctica debido a la adición deliberada del starter resistente a la nisina. Alternativamente, la nisina sola puede ser adicionada para prevenir el crecimiento de todas las BAL, y por lo tanto asegurar  la ausencia de fermentación maloláctica en el desarrollo del vino. Un beneficio adicional en ambos casos, es que la fermentación del vino por BAL salvajes es prevenida, ya que esta fermentación indeseada puede ser una causa de defectos tales como mucosidad y exceso de acetato (8). La nisina puede también ser usada para reducir la cantidad de dióxido de azufre usado en la elaboración del vino para controlar las bacterias causantes de deterioro (20) El crecimiento de lactobacilos y pediococos en cerveza es una de las principales causas de deterioro, que conducen a una cerveza con demasiado desarrollo de acidez y con sabores extraños debido a la producción de diacetilo. Se ha demostrado que la nisina puede ser usada para controlar este problema sin tener un efecto adverso sobre la calidad de la cerveza. La nisina además puede reducir los tiempos de pasteurización e incrementar la vida útil de las cervezas (8,20).

3.6. Chucrut La utilización de cepas productoras de nisina puede tener una aplicación potencial en la producción de chucrut. Se han aislado dos cepas productoras de nisina desde chucrut comercial. Las cepas productoras de nisina fueron utilizadas en fermentaciones modelo de chucrut, junto con Leuconostoc mesenteroides resistente naturalmente a la nisina. La fermentación del chucrut es secuencial y depende del crecimiento inicial de L. mesenteroides heterofermentativo, seguido por lactobacilos y la producción adicional de ácido (8). Productores de nisina fueron exitosos en retrasar el inicio del crecimiento de Lactobacillus spp., sin afectar el crecimiento de L.mesenteroides (Harris et.al , 1992) 9

3.7. Otras aplicaciones Cepas bacteriocigénicas como Lactocococcus lactis ESCC 146 y P. pentosaceus  ATCC 43200 pueden ser utilizadas para mejorar la seguridad y extender la vida útil de alimentos cocinados refrigerados. El color, palatabilidad, textura, sabor y general la aceptabilidad completa de comida sois-vide no se ven afectados por la presencia de los cultivos (11). En un estudio con puré de papas pasteurizado se vio la efectividad de la nisina en el control del deterioro por Bacillus y Clostridium. Se inoculó un cóctel de esporas de C. sporogenes y C. tyrobutiricum en puré de papa cocinado envasado al vacío y pasteurizado e incubado a 8°C y 25°C. La vida útil del puré se extendió a 25°C en al menos 58 días con la adición de 6.25 ug /g . En muestras control (sin nisina) almacenadas a 8°C el Bacillus contaminante natural creció, pero las cepas de Clostridium no crecieron hasta que la temperatura fue elevada a 20°C después de 39 días. Mientras que en las muestras que contenía nisina no hubo crecimiento, y la 9

HILL, C., 1999

26 vida útil fue extendida al menos en 30 días con la adición de 6.25 ug/g de nisina. En ensayos con un cóctel de cepas de B.cereus y B.subtilis, 6.25 ug/g de nisina extendió la vida útil al menos en 27 días en puré no envasado al vacío almacenado a 8°C, una extensión similar en la vida útil se observó a 25°C utilizando 25 ug/g de nisina.  Además se observó que se mantuvieron niveles efectivos de nisina después del proceso de elaboración y una buena retención de nisina a lo largo de toda la vida útil. En otro estudio se vio la efectividad de nisina preparada en laboratorio y nisina comercial sobre C. botulinum en papas cocinadas. La nisina preparada en laboratorio disminuyó los recuentos de C. botulinum en 2-3 log en 3 días de almacenamiento comparado al control. Bajo condiciones similares una solución de nisina comercial (20 UI/ml) disminuyó los recuentos en 3-4 log. Estos resultados sugieren que las bacteriocinas son potencialmente útiles en inhibir C. botulinum en hortalizas listas para comer y que pueden extender la vida útil de esos productos cuando ocurren abusos de temperatura (16). Las bacterias lácticas junto con sus bacteriocinas son potencialmente útiles para garantizar la inocuidad de frutas y hortalizas mínimamente procesadas, especialmente cuando ocurren abusos de temperatura. Vescovo et.al (1996) 10 aisló una serie de cepas de BAL psicrótrofas desde ingredientes de ensaladas de hortalizas. De esas cepas se seleccionaron aquellas productoras de bacteriocinas activas contra una variedad de patógenos Gram –negativos y Gram-positivos. Las cepas seleccionadas luego fueron utilizadas en un test de desafío en ensaladas con  A. hidrófila, L.monocytogenes, Salmonella typhimurium y S.aureus. Mientras todos los patógenos fueron capaces de crecer en las ensaladas (con un inóculo inicial aproximado de 105 ufc/g) en 6 días, ninguno fue detectado en 6 días en aquellas ensaladas inoculadas con las BAL productoras de bacteriocinas (3). Las bacteriocinas son también útiles en controlar el crecimiento de contaminantes Gram (+) en fermentaciones que dependen de microorganismos Gram-negativos u hongos, por ejemplo la producción de ácidos orgánicos, polisacáridos, aminoácidos y vitaminas (20). En la tabla 6 se muestra un resumen de algunas sugerencias de aplicaciones de bacteriocinas en alimentos y en la tabla 7 se muestran ejemplos de uso efectivo de nisina en alimentos.

Tabla 6: Bacteriocinas como preservantes en alimentos: ejemplos de aplicaciones sugeridas 10

BREIDT, F. Y FLEMING, H., 1997

27

Bacteriocina Aplicación

Conclusión

Nisina A

Referencia

Incorporación de nisina al La adición de nisina puede reducir  interior de ingredientes bacterias indeseables en productos ligantes de carne (Fibrimex) cárnicos reestructurados. Pediocina AcH Uso de pediocina Ach El spray previene el crecimiento de producida por L..plantarum L. monocytogenes y puede ser  WHE 92 para rociar la usado como un tratamiento superficie de queso Munster al antilisterial comienzo del periodo de maduración Enterocina 4 Uso de Ent. faecalis productor  El uso de Ent. faecalis INIA4 como de enterocina como cultivo starter inhibe L.monocytogenes starter para la producción de Ohio, pero no L. monocytogenes queso Manchego. Scott A. Linocina M-18 Uso de Bre. lines como cultivo Reduce en 2 ciclos logarítmicos L. starter en la producción de ivanovi y L. monocytogenes queso untable rojo Nisina A Uso de nisina para controlar L. La nisina inhibe efectivamente L.. monocytogenes en queso monocytogenes por 8 semanas Ricota Piscicolina 126 Uso de piscicolina 126 para Más efectiva que bacteriocinas controlar L. monocytogenes disponibles comercialmente en pasta de jamón condimentada Leucocina A Uso de Leu. gelidum UAL 187 La inoculación de carne de vacuno productor de leucocina para envasada al vacío con el cultivo controlar deterioro en carne productor de bacteriocina retrasa el deterioro por L. sake hasta 8 semanas. Lactocina 705 Uso de lactocina 705 para Lactocina 705 inhibe el crecimiento reducir el crecimiento de L. de L. monocytogenes en carne monocytogenes en carne molida molida Pediocina AcH El uso de P. acidilacti La adición de P. acidilacti (Ped +) productor de pediocina inhibe como cultivo starter contribuye a L. monocytogenes una reducción efectiva de L. monocytogenes durante la manufactura de vienesa de pollo en verano Pediocina Expresión de operón en S. Aplicación potencial en la cerevisiae preservación de productos horneados y vinos. Pediocina AcH Adición de pediocina en la Controla el crecimiento de L. preparación de pollo crudo monocytogenes por 28 días a 5 °C Pediocina PA-1 Uso de una cepa de P. Pediocina contribuye efectivamente acidilacti (Ped. +) como a la inhibición de L. cultivo starter en fermentación monocytogenes de vienesa Enterocina Adición de enterocina a Control del crecimiento de L.  jamón, chancho, pechuga de monocytogenes bajo diferentes pollo, paté y vienesa inoculada condiciones Fuente: J. Cleveland et al., 2001

Cutter y Siraguza, 1998 Ennahar et al., 1996

Nunez et al., 1997 Eppert et al., 1997 Davies et al., 1997 Jack et al., 1996 Leisner et al., 1996

Vignolo et al., 1996 Baccus-Taylor  et al., 1993

Schoeman et al., 1999 Goff et al., 1996 Foegeding et al.,1992  Aymerich et al., 2000a,b

Tabla 7: Ejemplos de uso efectivo de nisina en alimentos Alimento

Microorganismo objetivo

Concentración efectiva de nisina

Referencias

28 (UI/ml) Queso Cottage Queso Ricota Leche descremada Vienesa tipo Bologna

L. monocytogenes L. monocytogenes Esporas de B. Cereus L. sake y L. curvatus Bro. thermosphacta

Vacuno magro

2.000 100 4.000 1.000

Ferreira y Lund, 1996 Davies et al., 1997 Wandling et al., 1999 Davies et al., 1999

400

Cutter y Siraguza, 1998

Fuente: J. Cleveland et al., 2001

3.8. Uso de Bacteriocinas en Métodos Combinados o Tecnología “Hurdle” La tecnología “hurdle” combina diferentes métodos de preservación para inhibir el crecimiento microbiano. La tabla muestra que las bacteriocinas a menudo ejercen sinergia con otros tratamientos, y pueden ser usadas como una barrera para mejorar  la seguridad de los alimentos. Una comprensión del modo de acción de cada barrera individual permite la combinación más efectiva de tratamientos. Por ejemplo la aplicación de campos de pulsos eléctricos (PEF), que incrementa la permeabilidad de la membrana célula, ha sido usado junto con nisina, la cual también actúa a nivel de membrana celular (Terebiznik et al., 2000) 11.  Aunque las bacterias Gram-negativas, levaduras y mohos no son sensibles en general a la acción de bacteriocinas de BAL, en presencia de agentes quelantes, surfactantes o shock osmótico (alta concentración de sal) pueden volverse sensibles. Utilizando nisina en métodos combinados apropiados se puede inactivar Salmonella y otras especies Gram-negativas (4, 8,15, 20)

Tabla 8: Uso de bacteriocinas en Métodos Combinados. Bacteriocina Nisina A 11

Otros factores N2;CO2;bajas

CLEVELAND, JENNIFER, 2001

Efecto Referencias Efecto sobre L.monocytogenes;incremento Szabo y

29 temperaturas Pediocina AcH

Nisina A

en la fase lag (400 UI/ml);inhibición del crecimiento (1250 UI/ml) . Presión Combinación de presión (345 MPa), hidrostática y altas temperaturas (50 °C) y bacteriocinas temperaturas actúan sinérgicamente en la inhibición de S.aureus, L. monocytogenes , E. coli O157:H7, L.sake y Leuc. Mesenteroides.

Cahill,1998

Lactoperoxidasa de leche (LP) y baja temperatura

Rodriguez et.al., 1997

Nisina A

Nisina producida por L. lactis actúa sinérgicamente con LP en la reducción de L. monocytogenes.

Gel de alginato de Nisina inmovilizada en gel es liberada Calcio más efectivamente que nisina pura y suprime el crecimiento de Bro. thermosphacta sobre carcasas de carne vacuna. Pediocina AcH Diacetato de sodio Combinación de Pediocina y diacetato de sodio trabaja sinérgicamente contra L.monocytogenes tanto a temperatura ambiente como a bajas temperaturas. Nisina Esteres de Sinergia contra L. monocytogenes, S. sucrosa de ácidos aureus, B.cereus y L. plantarum grasos Nisina Dióxido de  Acción sinérgica contra L. monocytogenes Carbono resistente y no resistente a nisina. Nisina Campo de pulsos  Acción sinérgica contra B.cereus (0.06 eléctricos ug/ml) de nisina y 16.7 kV/cn, 100 us duración de PEF) Nisina Envasado en Combinación fue más efectiva que atmósfera tratamiento sólo en prevenir crecimiento modificada (AM) de L. monocytogenes. Pediocina Ach Emulsificador  Pediocina AcH posee mayor actividad /Tween 80) o listericida en leche descremada, encapsulación de mantequilla o carne cuando está presente pediocina en en forma encapsulada o actúa en la liposomas. presencia de Tween 80 Fuente: J. Cleveland et al., 2001

Kalchayanand et al.,1998

Cutter y Siragusa,1998

Schlyter et al., 1993 Thomas et.al., 1998 Nilsson et.al., 2000 Pol et.al , 2000 Fang y Lin, 1994 Degnan et al., 1993

V. EXPECTATIVAS FUTURAS 

El uso de bacteriocinas no debería ser visto como una forma primaria de preservación de los alimentos, sino más bien, como una barrera adicional en el

30 crecimiento de los microorganismos, tanto alteradores como patógenos, en la preservación por métodos combinados. Las bacteriocinas sirven como una barrera bactericida ayudando a reducir los niveles de contaminación bacteriana, mientras que la aplicación de métodos de preservación bacteriostáticos como el uso de envasado en atmósfera modificadas o la reducción de la actividad de agua ayuda a inhibir la flora resistente a la bacteriocina (8, 20). El uso de bacteriocinas en alimentos probablemente dependerá de la economía de la producción de bacteriocina a una escala industrial. Por ejemplo, no es difícil imaginar la aplicación de bacteriocinas de BAL en productos fermentados, pues ésta puede ser introducida al alimento a cero o bajo costo a través del uso de un starter  productor de bacteriocina. Además, esta aplicación tiene las ventajas de: asegurar  una distribución uniforme a través de todo el alimento, obtener probablemente un pH inferior a 5.5 en el producto asegurando una mayor efectividad para la mayoría de las bacteriocinas (las cuales actúan mejor a pH ácidos), y por último las BAL tienen una categoría GRAS en la producción de alimentos fermentados. En cambio, es más difícil imaginar instancias donde el efecto protector de la bacteriocina adicionada en forma purificada sea costo-efectivo, además de la dificultad de asegurar una distribución homogénea a través de todo el alimento. Sin embargo, tales aplicaciones han sido identificadas para la nisina, y por lo tanto son también posibles para otros purificados de bacteriocina. El uso actual de Microgard (derivado de leche fermentada) como un ingrediente en alimentos en base a leche, es un ejemplo de la adición de bacteriocinas a bajo costo. Análisis genéticos de “operón” de bacteriocina continuarán abriendo caminos en la aplicación de bacteriocinas, ya que la habilidad de sobreproducir el inhibidor tendrá impacto en términos de costo-eficiencia. Ciertamente el futuro de las bacteriocinas no consistirá en descubrir la bacteriocina perfecta para todas las aplicaciones, sino más bien en identificar nuevas bacteriocinas para tareas específicas, con estabilidad, espectro de acción y modo de acción característicos (8). Entre las áreas de estudio actuales y futuras para aplicaciones potenciales y uso seguro de las bacteriocinas en la preservación de alimentos, podemos mencionar (1): a) Estudios continuos de las propiedades físicas y químicas, modo de acción, relación estructura-función de las bacteriocinas. b) Investigaciones adicionales de la presencia natural de cepas bacteriocigénicas en alimentos y estudios toxicológicos, que provean bases más sólidas para el uso seguro de bacteriocinas en la cadena alimenticia. c) Investigaciones acerca de la acción sinérgica de estos componentes con tecnologías avanzadas (como por ejemplo, campos de pulsos eléctricos y altas presiones hidrostáticas) pueden resultar en reemplazo de preservantes químicos, o permitir procesamientos menos severos (Ej. calor), manteniendo la calidad e inocuidad de los alimentos.

31

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