UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA CURSO DE FARMÁCIA E BIOQUÍMICA PROFESSOR CARLOS ROBERTO MERLIN
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA II
FLORIANÓPOLIS SEMESTRE 2009.2
Sumário Normas de trabalho no laboratório de microbiologia............................................ 03 Aula 1 – Meios de cultura..................................................................................... 04 Aula 2 – Técnicas de cultivo................................................................................. 06 Aula 3 – Gram – Gram positiva e Gram negativa................................................. 07 Aula 4 – Esterilização e Desinfecção....................................................................09 Aula 5 – Microscopia a fresco.............................................................................. 11 Aula 6 – Antibiograma.......................................................................................... 12 Aula 7 – Cocos Gram positivos............................................................................ 13 Aula 8 – Análise do índice colimétrico da água.................................................... 16 Aula 9 – Enterobactérias.......................................................................................19
2
Normas de trabalho no laboratório de microbi ologia 1. Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na entrada do laboratório, e nunca sobre as bancadas de trabalho; 2. Usar guarda-pó adequado e limpo; 3. Lavar as mãos com detergente antes e depois da aula prática. Se for portador de algum ferimento nas mãos, não participar das atividades práticas; 4. Antes de iniciar os procedimentos, identificar os materiais que serão utilizados nas análises; 5. NUNCA pipetar nada com a boca; 6. Não comer, beber ou fumar no laboratório; 7. Evitar colocar a mão na boca, olhos e ouvidos durante a aula; 8. Prender cabelos longos para evitar exposição ao fogo da chama do bico de Bunsen; 9. Nunca aplicar maquiagem e cosméticos ou retirar lentes de contato no laboratório; 10. Avisar o professor em caso de contaminação acidental, ferimentos ou cortes ocorridos durante a aula; 11. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada; 12. Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 13. Limpar a bancada após finalizar as análises.
3
Aula 1 Meios de Cultura
Meios de Cultura: são substratos adequados ao crescimento, multiplicação e desenvolvimento dos microrganismos fora de seu hábitat natural.
O cultivo dos microrganismos exige que determinadas condições sejam atendidas. As exigências nutritivas e ambientais são variáveis com o tipo de microrganismo, tornando impossível a produção de um único tipo de meio que satisfaça todas as condições de todos os tipos de microrganismos. Por outro lado, é difícil e impraticável a formulação de um meio de cultura ideal para cada tipo de microrganismo.
No preparo de um meio de cultura é necessário conhecer as exigências nutricionais dos microrganismos. São considerados meios essenciais do meio de cultura: - Fonte de energia - Fonte de Carbono - Fonte de Nitrogênio - Fatores de crescimento - Fonte de minerais - Água
Ainda, além dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condições ambientais: - pH - Atmosfera - Pressão osmótica
Classificação dos meios:
1. Quanto à origem: a) Naturais b) Artificiais 2. Quanto à composição: a) Complexos b) Sintéticos 3. Quanto ao estado físico: a) Líquido 4
b) Semi-sólido c) Sólido 4. Quanto à finalidade: a) Meios Básicos b) Meios Seletivos c) Meios Diferenciais d) Meios de enriquecimento e) Meios enriquecidos f) Meios de manutenção g) Meios de transporte
5
Aula 2 Técnicas de Cultivo
A inoculação de microrganismos pode ser em: - Meio líquido - Meio sólido - Meio semi-sólido - Na placa de Petry
Procedimentos
1. Para repique da placa para meio líquido Realizar
o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a contaminação; Esterilizar a alça de platina na chama do bico de Bunsen e esfriá-la em tubo com água destilada ou próximo à chama (ou no próprio meio de cultura líquido); Flambar os bordos da placa na chama do Bico de Bunsen; Abrir a placa de forma que a tampa fique perpendicular ao fundo; Introduzir a alça de platina na placa, tocando a colônia escolhida; Fechar a placa; Retirar a tampa do tubo com meio de cultura líquido, segurando-o com o dedo mínimo; Flambar a boca do tubo e mantê-la próxima ao bico de Bunsen; Introduzir a alça de platina carregada no meio de cultura; Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa; Esterilizar a alça de platina e recolocá-la no suporte; Identificar o material e colocar seu nome e turma; Incubar a 37º C; Realizar a leitura. 2. Para repique do meio líquido para o meio inclinado Realizar
o trabalho próximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que evitem a contaminação; Esterilizar a alça de platina na chama do bico de Bunsen e esfriá-la em tubo com água destilada ou próximo à chama (ou no próprio meio de cultura líquido); Retirar a tampa do tubo contendo a cultura; Flambar a boca do tubo da cultura e recolocar a tampa; Retirar a tampa do tubo com meio de cultura inclinado; Flambar a boca do tubo e mantê-lo próximo do Bico de Bunsen; Introduzir a alça de platina carregada no meio inclinado; Inocular fazendo estrias na superfície do meio, começando do fundo até 2/3 do comprimento da superfície; Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa; Esterilizar a alça de platina e recolocá-la no suporte; Identificar o material e colocar seu nome e turma; Incubar a 37º C e fazer a leitura. 6
Aula 3 Gram – Gram pos iti va e Gram negativa As bactérias coradas pela técnica de Gram pertencem a duas categorias distintas: Gram-positivas e Gram-negativas. As diferenças entre os dois grupos é resultado da estrutura de suas paredes celulares, visto que as paredes das células Gram-negativas possuem um conteúdo lipídico mais elevado que das Gram positivas. Preparação do esfregaço 1. Material: Bico de Bunsen Meio de Cultura (Meio líquido ou sólido) Lâmina LSD Alça de platina 2. Técnica: a) Esterilizar a alça no Bico de Bunsen b) Esfriar a alça c) Meio líquido: pegar 2 alçadas e colocar sobre a lâmina. Meio sólido: encostar levemente a alça sobre a colônia retirando parte da mesma e colocar sobre a lâmina fazendo movimentos circulares. d) Reesterilizar a alça no Bico de Bunsen. e) Fixar o esfregaço aproximando a lâmina na chama do Bico de Bunsen fazendo movimentos lentos, até secagem do mesmo. Técnica de coloração 1. Colocar a lâmina sobre o suporte que está na pia. 2. Pingar sobre o esfregaço a solução cristal violeta cobrindo-o completamente, deixando durante 1 minuto. Retirar o excesso com um filete de água corrente. Os microrganismos adquirem tonalidade azul escura ou púrpura. 3. Recolocar a lâmina sobre o suporte. Cobrir o esfregaço com solução iodoiodetada por 1 minuto. Esta solução mordente fixa o cristal violeta produzindo um complexo violeta-iodo. 4. Descoloração: solução de álcool etílico a 95% juntamente com acetona (700 mL de álcool + 300 mL de acetona) aplicada por gotejamento até que não aja mais desprendimento do corante. As bactérias gram(+) sofrem desidratação dos carboidratos das paredes celulares promovendo a retenção dos corantes. As gram(-) pela dissolução dos lipídeos, tem a porosidade ou a permeabilidade da parede celular aumentada não retendo o corante. 5. Contraste: solução de fucsina (ou safranina) – corante secundário. Aplicar sobre o esfregaço por um período de 30s. Se as células permitem o 7
descoramento pelo álcool, elas fixam a fucsina nesta etapa e parecem vermelhas (gram-negativas), caso contrário, permanecem com a cor azul escura, sendo chamadas Gram-positivas. 6. Lavar, secar e observar ao MO com a objetiva de imersão. Gram + coram de violeta Gram - coram de vermelho
8
Aula 4 Esterilização e Desinfecção Esterilização : é o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de um material, ambiente ou objeto. Este processo inclui os endósporos, que são formas de resistência ao meio. Esta pode ser feita através de diferentes processos, empregando-se agentes físicos (calor, radiação, filtração, gases) e agentes químicos. Os métodos mais utilizados são:
Calor úmido - Autoclavação: desnaturação de proteína - Vapor fluente: desnaturação de proteínas - Tindalização: desnaturação de proteínas
Calor seco - Fornos (forno de Pasteur): oxidação - Flambagem: oxidação - Incineração: oxidação
Radiação ionizante - Radiação gama: destruição de DNA – forma radicais superativos.
Radiação não-ionizante - Lâmpada UV: altera DNA, através da formação de dímeros.
Filtração
Gases: óxido de etileno – Alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e sulfidrilas, inativando enzimas.
Glutaraldeído
Desinfecção: é definida como a eliminação dos microrganismos presentes, capaz de transmitir infecção, patógenos, portanto, em um determinado meio e/ou ambiente, através de um agente desinfetante, reduzindo ou inibindo o crescimento, sendo que, estes podem ser divididos em 3 grupos: agentes químicos, físicos ou quimioterápicos. Para que possamos atingir uma desinfecção correta, deve ser observado a concentração do produto, as condições do ambiente e o tempo de exposição do mesmo.
Grupamentos químicos: álcool, aldeídos e derivados, fenóis e derivados, halogênios e derivados, ácidos inorgânicos e orgânicos, agentes de superfície, biguanidas e agentes oxidantes. 9
Anti-sep sia: Diminuição ou inibição do crescimento de agentes patógenos e outros microrganismos que estão presentes nos tecidos vivos. Assepsia: Ausência de microrganismos em um determinado meio e/ou ambiente com utilização de técnicas assépticas apropriadas. Bacteriostase: Inibição do crescimento bacteriano. Degermação: remoção do microrganismo da pele através de técnica mecânica ou uso de antisépticos. Baixas Temperaturas: efeito microbiostático, onde ocorre a interrupção do metabolismo. Ex. geladeira, congelador, nitrogênio líquido.
10
Aula 5 Microscop ia a fresco Duas técnicas em geral são empregadas em preparações microscópicas: preparações a fresco e preparações fixadas e coradas. A preparação a fresco permite o exame de organismos nas condições normais de vida e são preferencialmente utilizadas:
Quando a morfologia da célula pode estar danificada em preparações fixadas e coradas; Durante a verificação da mobilidade; Observações de processos fisiológicos; Observação de corpúsculos (vacúolos e material graxo).
Ainda, as preparações a fresco podem ser realizadas com ou sem coloração e podem ser realizadas de acordo com as seguintes técnicas: 1. Entre lâmina e lamínula: 1.1 Bactérias cultivadas em meio líquido podem ser avaliadas, colocando-se, com uma alça de platina esterilizada, uma gotícula da cultura no centro da lâmina, recobrindo-a com lamínula. 1.2 Para culturas filamentosas, o procedimento denomina-se “entre lâmina e lamínula comprimida”. É retirado um pequeno fragmento da cultura em meio sólido, que é comprimido entre lâmina e lamínula. 2. Técnica da Gota Pendente: método mais seguro que o anterior leva à diminuição no tempo de observação e a conclusões errôneas, particularmente em relação à mobilidade bacteriana. 2.1 Procedimento: Untar a borda de uma lâmina escavada com vaselina. Transferir uma gotícula da cultura líquida para o centro de uma lamínula, e em seguida unir a lâmina e a lamínula. Examinar ao MO no aumento de 40x para observar o movimento próprio ou direcional, além do movimento brawniano dos microrganismos, sem esquecer de diminuir a intensidade de luz.
11
Aula 6 Antibiog rama A descoberta dos antibióticos foi acompanhada pelo desenvolvimento de técnicas de laboratório que permitiam verificar in vitro seu espectro antimicrobiano. Esses métodos demonstraram que bactérias da mesma espécie, mas de diferentes linhagens, podiam se comportar de modo distinto ante a um mesmo antibiótico. Antibiograma é a determinação in vitro da resistência ou sensibilidade de uma bactéria a um ou vários antibióticos, a qual pode ser realizada, também, para determinar o espectro antimicrobiano de um novo antibiótico. Ressalta-se, que com este teste apenas é possível ver qual o melhor antimicrobiano para ser usado na terapêutica, e não qual a sua dose ideal. A susceptibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente, ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory cincentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 1. Teste quantitativo d e sensibilidade aos antimi crobianos: Método da diluição
Consiste
em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em
meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se o MIC ou MBC. 2. Método de difu são de Bawer e Kirby m odificado
neste teste discos de
papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente e antecipadamente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar. Caso ocorra inibição no crescimento do agente sensível, formará um halo em torno do disco de antibiótico, que deve ser medido pelo seu diâmetro em mm, e comparado com tabelas padronizadas. Meio de cultura ut ilizado: geralmente utiliza-se o meio Müller-Hinton, um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas. Inoculação: saturar um swab de algodão com a suspensão bacteriana, remover o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo. Semear a suspensão sobre a superfície estéril do ágar, em 3 direções para obter um inoculo uniforme, evitando que qualquer superfície do ágar fique isenta do inócuo. Em seguida colocar os discos de antibióticos na superfície do Agar inoculado. Incubar as placas por 24 h a 35 – 37º C. 12
Aula 7 Cocos Gram positivos A identificação bacteriana dá-se pela observação das espécies. Para essa identificação, devem ser observadas características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas, sorológicas, genéticas e de patogenicidade das bactérias. Para obtenção de algumas dessas informações usam-se recursos como testes bioquímicos, além da observação de colônias e de preparações microscópicas realizadas a partir desses. Em um esfregaço corado pelo método de Gram, as células bacterianas apresentam-se coradas em roxo (ou azul), sendo que Staphylococcus ficam agrupados em cachos ou arranjos irregulares e os Streptococcus em cadeias ou aos pares. Meios: Caldo Caldo simples nutriente Ágar sangue Teste de diferenciação entre gêneros: as informações obtidas pela bacterioscopia pelo método de Gram e das características de crescimento em meio ágar sangue, normalmente são suficientes para distinguir os gêneros. Em caso de dúvida, é possível diferenciar os gêneros Streptococcus e Staphylococcus através do teste da catalase. Staphylococcus, ao contrário de Streptococcus, produzem esta essa enzima. Procedimento: em um tubo de ensaio com solução fisiológica colocar uma pequena quantidade da colônia formando uma suspensão bacteriana que será utilizada no teste, e, em seguida adicionar Peróxido de Hidrogênio (H2O2). Resultado: Se houver o aparecimento de bolhas gasosas ou efervescência contínua indicam resultado positivo para o gênero Staphylococcus . Tipos de Hemólise : - Hemólise parcial - Hemólis e total - Não apresenta hemólise Uma vez identificado o gênero Staphylococcus, a diferenciação entre as 3 espécies é feita através de 2 testes: a pesquisa da enzima coagulase e a resistência a novobiocina. As características das colônias também podem ajudar na 13
diferenciação, uma vez que somente a espécie S. aureus pode produzir hemólise em meio ágar sangue, e apresentar colônias de coloração variando do branco ao amarelo fraco.
Gênero Staphylococcus: S. aureus - hemolítico (Staphylococcus coagulase +) S. epidermidis (Staphylococcus coagulase -) S. saprophyticus (Staphylococcus coagulase -)
Teste da coagulase: consiste em verificar a coagulação do plasma, através da ação enzimática ou da aglutinação de bactérias. Esta técnica pode ser feita em lâmina ou em Tubo Teste da Novobiocin a: para diferenciar S. epidermidis e S. saprophyticus, já que S. epidermidis é sensível a nova biocina e S. saprophyticus é resistente. Um halo de
inibição inferior a 16 mm caracteriza resistência. Procedimento: com um swab embebido em suspensão bacteriana, semeia-se uma placa contendo meio ágar nutriente, em 3 sentidos evitando deixar qualquer superfície do meio sem ser semeado. Com a utilização de uma pinça previamente aquecida pegar o disco de novobiocina e colocar no centro da placa dando um leve aperto no disco para que se fixe bem na superfície do meio evitando que ao virar a placa o mesmo caia na tampa, e, incubar a 37º C por 24h. Gênero Streptococcus: S. pyogenes - hemolítico S. pneumoniae - hemolítico
2. Identificação de espécies de Streptococcus Os Streptococcus provocam hemólise em meio ágar-sangue. De acordo com o tipo de hemólise, podem ser classificados em: - hemolíticos hemólise parcial - hemolíticos hemólise total - hemolíticos não apresentam hemólise
Gênero Streptococcus: S. pyogenes - hemolítico S. pneumoniae - hemolítico
- hemolíticos
crescem formando colônias circulares, circundadas por uma zona
marrom-esverdeada. 14
- hemolíticos
provocam aparecimento de uma zona clara ao redor da colônia.
Lancefield dividiu esses microrganismos em grupos sorológicos de A a V. Os estreptococos isolados com maior freqüência são do grupo A, B, C e G. Para a diferenciação dos grupos A e B, 2 testes podem ser realizados: Teste da sensibilidade à bacitracina: o grupo A é inibido por baixas concentrações de bacitracina. Adicionam-se discos de bacitracina sobre a superfície do ágar previamente semeado com a suspensão bacteriana a ser testada, incubando a 37º C por 24h a 48h. Qualquer halo de inibição caracteriza sensibilidade ao antibiótico. Prova do fator CAMP: a proteína CAMP é produzida apenas pelos microrganismos do grupo B. Em uma placa é semeado horizontalmente uma linhagem de Staphylococcus aureus que sabidamente produz - hemolisina. Perpendicularmente
a esta linha de semeadura, semeiam-se amostras de Streptococcus a serem testadas. As duas estrias devem ficar próximas, no entanto sem se tocarem. Incubase por 18/24 h a 37º C. A proteína CAMP liberada pelo grupo B ira lisar as hemácias sensibilizadas pela - lisina estafilocócica. A ação sinérgica entre a proteína CAMP e a - lisina formará uma área de hemólise em forma de seta que indica teste positivo. Grupo A B C D Enterococo Pneumococo
Hemólise
Bacitracin a S R R R R V
CAMP Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo
15
Aula 8 Análise do índice colimétrico da água
A avaliação da qualidade microbiológica da água, seja ela para qualquer fim, é de extrema importância. No caso do Brasil, as análises são feitas adotando os procedimentos do Standard methods for examination of water and wastewater , da American Public Health Association (APHA), podendo estas serem qualitativas ou quantitativas. 1. Cont agem de bactéri as Água com altas populações de microrganismos tem maiores possibilidades de conter organismos patogênicos, podendo indicar também, um alto conteúdo orgânico. Água de boa qualidade para consumo deve ter populações de bactérias inferiores a 100 UFC/mL. Procedimento
Preparar diluição seriada.
Inocular 3 placas com 1 mL, das diluições escolhidas;
Verter nas placas 20 mL do meio ágar triptona glicose extrato de levedura fundido e resfriado a +/- 50ºC;
Misturar e deixar solidificar, identificando as placas com as respectivas diluições;
Inverter a placa e incubar a 35ºC por 48h;
Escolher para a contagem placas que tenham entre 30 e 300 colônias.
Fazer o cálculo Nº de UFC/mL = médias das contagens das placas x diluição. 16
2. Pesquisa de co liformes No que diz respeito à potabilidade, o aspecto mais importante é o caráter qualitativo da população. A maioria das doenças veiculadas pelas águas tem sua origem na contaminação fecal, como é o caso da shigelose, hepatite A, rotavírus, giardíase, entre outras. Como a liberação dos microrganismos algumas vezes pode ser em pequenas quantidades ou de forma descontínua, seria impossível avaliar a presença de todos eles em uma amostra de água. Por isso, escolheu-se um microrganismo que indicasse a contaminação patogênica, a Escherichia coli. Ela é constante no intestino humano e no dos animais de sangue quente, é abundante nas fezes, cresce facilmente em meios de cultura e vive bastante tempo na água. No entanto, apresenta baixa resistência à cloração e menor viabilidade na água do mar. A Escherichia coli faz parte do grupo de microrganismos denominados coliformes, constituindo 95% dos coliformes nas fezes. Além da potabilidade, a qualidade microbiológica da água é que vai decidir sobre seus possíveis usos. 2.1 Pesquisa de Colifor mes tot ais: baseada nas características do grupo bastonete Gram-negativo, que produz ácido e gás através da lactose. 2.1.1 Teste Presuntivo: neste teste, presume-se que os microrganismos que crescem produzem gás a partir de lactose sejam coliformes. Procedimento para análises diversas
Inocular com 10 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl triptose concentrado e tubinhos de Durham invertidos;
Inocular com 1 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl triptose e tubinhos de Durham invertidos;
Inocular com 0,1 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl triptose e tubinhos de Durham invertidos;
Incubar a 37º C por 24 h;
Fazer a leitura, anotando a centena encontrada. NÃO misturar os tubos.
Reincubar os tubos negativos;
Fazer nova leitura.
Usar a tabela para verificar o número mais provável de coliformes por 100 mL.
17
2.1.2 Teste confirmativo: inocular uma alíquota de cada tubo positivo do teste anterior em caldo lactosado bile e verde brilhante. Os sais de bile inibem o crescimento de bactérias não-entéricas e o verde brilhante de bactérias Grampositivos, selecionando, assim, os coliformes. Procedimento
Após o teste presuntivo, transferir com uma alça de platina uma alíquota de cada tubo positivo para tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante e tubinhos de Durham invertidos;
Incubar a 37º C por até 48 h;
Fazer a leitura, obedecendo a centena. Os positivos apresentam gás;
Usar a tabela para verificar o número mais provável de coliformes por 100 mL.
2.2 Pesquisa de Coliformes Fecais: como os coliformes fecais têm em seu ambiente natural temperaturas mais elevadas, podem assim ser diferenciados dos coliformes totais. Procedimento
Após a leitura do teste presuntivo, transferir com a alça de platina uma porção de cada tubo positivo para tubos contendo Caldo EC (Escherichia coli) e tubinhos de Durham;
Incubar a 44ºC por 24 h;
Fazer a leitura. Os tubos com presença de gás são positivos.
Usar a tabela para verificar o número mais provável de coliformes por 100 mL.
18
Aula 9 Enterobactérias Esta família compreende cerca de 80% de todos os bacilos gram-negativos isolados no laboratório clínico, sendo que os demais bacilos Gram-negativos isolados constituem o grupo das chamadas bactérias não-fermentadoras. Enterobactérias são bacilos Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não esporulados, de crescimento rápido que formam colônias distintas em meio seletivo indicador, dependendo da sua capacidade metabólica e dos componentes do meio. Tem como hábitat o intestino grosso, mas também são encontradas fazendo infecção no trato urinário, pulmões, ouvidos, etc. Todas fermentam glicose, reduzem o nitrato a nitrito e são cito cromo ox idase negativas. Alguns gêneros são sempre patogênicos, outros fazem parte da flora normal intestinal, porém se inoculadas em outros locais tais como líquor, peritônio e pulmões de imunodeprimidos podem causar doenças. Semeadura nos meios SS, MC e Teague. 1. Meio Salmonella-Shigella (SS): meio diferencial empregado para isolar Salmonella e Shigella a partir de fezes, urina e alimentos frescos ou enlatados. - As bactérias Gram + são inibidas por uma mistura de sais biliares. - Shigella e a maioria das enterobactérias formam colônias claras e incolores ou transparentes. - E. coli formam colônias pequenas, que vão de rosa a vermelho. - Algumas Salmonellas formam colônias incolores, transparentes com centro negro (H2S). 2. Meio Conkey (MC): meio amplamente utilizado para isolar e identificar seletivamente enterobactérias em amostras biológicas, água, esgoto e alimentos. - A mistura de sais biliares inibe Gram +. - E. coli - colônias vermelhas ou rosadas, devido a fermentação da lactose a diminuição do pH pode fazer com que os meios fiquem rodeados por um precipitado de sais biliares. - Salmonella – colônias incolores, do transparente ao âmbar. - Shigella – colônias incolores, transparentes ou levemente rosadas.
19
3. Meio Teague (EAM): eosina azul de metileno: meio utilizado para isolamento e diferenciação de enterobactérias. Promove uma distinta diferenciação entre as colônias de microrganismos fermentadores de lactose e os que não fermentam lactose. - O meio é ligeiramente inibidor para Gram +. - E. coli – colônias elevadas de 2 a 3 mm de diâmetro. Apresentam um centro azulnegro com borda estreita e clara, e brilho azul metálico azul esverdeado à luz refletida (algumas linhagens podem não ter brilho). - Salmonella e Shigella – colônias ligeiramente elevadas de 1 a 2 mm de diâmetro, transparentes, desde incolor até âmbar. A partir de colônias características e isoladas deste meio, inocular no meio TSI (Tríplice Sugar Iron) com agulha de níquel cromo, por estria de esgotamento e em profundidade. Meio TSI (ágar ferro tríplice açúcar – glicose, sacarose e lactose): é um meio diferencial, recomendado para identificação de bacilos entéricos, baseado na fermentação da glicose, lactose e sacarose e na produção de sulfeto hidrogênio (H2S). Leitura do TSI Local
Ápic e e/ou base
Cor Vermelho forte Vermelho claro Amarelo Amarelo e bolhas Preta
Significado Reação alcalina Reação neutra Reação ácida Formação de gás Produção H2S
Interpretação Ápice e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (+). Ápice vermelho e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (-). Ápice e base vermelho = glicose, sacarose e lactose (-). TSI Lactose Sacarose Glicose Gás H2S
Salmonella
Shigella
E.coli
+ + +
+ -
+ + + + -
20
Provas de Identificação – Testes Bi oquímicos Indol: verificar se a bactéria tem ou não a enzima triptofanase. triptofanase Caldo triptofano -----------------------------------> indol + amônia ác. Pirúvico Interpretação: reativo de Erlich (na parede do tubo) em presença do indol forma um complexo de vermelha vermelho (+) sem alteração na cor (-)
Nitrato: verificar a presença da enzima nitrito redutase Nirtato redutor Nitrato (NO3) -------------------------------------------> Nitrito (NO 2) Reativo de Gries Ilosvay Reativo A: ác. Sulfanílico Reativo B: ác. Naftilamina Interpretação: teste positivo – precipitado vermelho-tijolo teste negativo – sem alteração de cor Citrato: verificar se o citrato é utilizado como única fonte de carbono Interpretação: teste positivo – azul teste negativo – verde Malonato: verificar se o malonato é utilizado como única fonte de carbono Interpretação: teste positivo – azul teste negativo – verde Uréia: verificar a presença da enzima uréase urease uréia -----------------------------> amônia Interpretação: teste positivo – vermelho ou rosa teste negativo – amarelo Fermentação de Carboidratos: determina a capacidade de um microrganismo de fermentar a glicose incorporada a um meio base, produzindo ácido ou ácido com gás.
21
Glicose Lactose Sacarose Maltose
ácidos ou ácidos com gás
Manitol formiase Glicose -----> ác. Pirúvico ----> ác. Fórmico ------------------------> H2 + CO2 Glicose Glicose 6P Frutose 6P Frutose 1,6 PP
Ac, propiônico
Gliceraldeído 3P
Ac. Succínico
Ac. Pirúvico Ac. Lático
Acetaldeído Álcool etílico
Lisina: verificar a presença da enzima lisina carboxilase enzimas Glicose --------------------> ácidos (baixa do pH – coloração amarela (-)) enzimas Lisina ---------------------> cadaverina (diamina) + CO2 (aumenta pH – coloração roxa(+))
Vermelh o de Metila: testa a capacidade de um microrganismo em produzir ácidos orgânicos relativamente estáveis, a partir da fermentação da glicose.
22
ácido láctico enzimas
ácido acético
Glicose ----------------------------> ácido fórmico
pH 4,5
ácido succínico ácido etílico Reagente: solução hidroalcóolica de vermelho de metila (5 gotas) Interpretação: teste positivo – vermelho teste negativo – amarelo
Vogues Proskauer: determina a capacidade de um microrganismo em produzir um composto nitrogenado neutro, o acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose. Glicose 2 ác. pirúvico Acetilmetilcarbinol (acetoína) 40%
0,6 mL de alfa-naftol + 0,2 mL de KOH
Diacetila + núclea guanidina Composto vermelho Interpretação: teste positivo – rosa a vermelho teste negativo – cobre
23
Provas Indol Nitrati Citrato Malonato Uréia Glicose Lactose Sacarose Maltose Manitol Lisina VM VP
Salmonella
Shigella
E. coli
+ + + + + + + -
+ + V + + -
+ + + + + + + + + -
24
Referências Biblio gráficas MURRAY, P.R. et al. Microbiologia médica. 5 ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2006. PELCZAR, M. J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicações . V. 1 e 2. 2 ed. Pearson, 2005. SILVA FILHO, Germano Nunes; OLIVEIRA, Veturia Lopes de. Microbiologia: manual de aulas práticas. 2. ed. rev. Florianópolis: Ed. da UFSC, 2007. 157p. TRABULSI, L. R. Microbiologia 5 ed. Ateneu, 2008
25
