AMİNOASİTLERİN RENK REAKSİYONLARI : NİNHİDRİN REAKSİYONU Amaç : Amino asitlerin ninhidrin ile kalitatif ve kantitafif analizi. Kuramsal Bilgiler : Ninhidrin amonyak, primer amin veya sekonder aminlerin varlığını belirlemek için kullanılan bir ayraçtır. Reaksiyon esnasında verdiği renk değişimleri izlenir.Beyaz bir katı olan ninhidrin [1, 2, 3 – trian hidrat ] etonol veya aseton içerisinde çözülür. Ninhidrin proteinlerin aminoasit analizinde kullanılır. Protein asidik ortamda parçalanarak aminoasitlerine ayrılır. Hidroliz için HCl, H2SO4 gibi kuvvetli asitler veya pepsin, tripsin veya kimotripsin gibi enzimler gerekir. Bu tür enzimler proteaz grubu enzimlerdir. Hidroliz edilen aminoasitler pH 5,5 de asidik, bazik ve nötr durumda ayrılırlar. Daha sonra uygun bir kromatografik yöntemle bu aminoasitler saflaştırılırlar. Üzerlerine ninhidrin çözeltisi ilave edilir ve bir süre ısıtılarak renklerinin açıklık veya koyuluklarıyla kalitatif tayinler yapılır. Daha sonra bilinen derişimlerde hazırlanan bir seri aminoasit çözeltisine de üzerine ninhidrin ilave ederek yine bir süre ısıtılır ve oda sıcaklında soğutulur. Daha sonra 570nm de bu bir seri çözeltinin absorbans değerleri ölçülür. Derişime karşı ölçülen absorbans değerleri grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği oluşturulur. Elde edilen kalibrasyon grafiğine derişimi bilinmeyen aminoasitlerinin de ölçülen absorbans değerleri grafikte yerine konularak derişimleri bulunur. Ninhidrin reaksiyonu ile aminoasit tespitinde en önemli ve kolay yöntemlerden biridir. Bu yöntemle mikrogram miktarı aminoasit miktarı belirlemek mümkündür. Ninhidrin ile aminoasitler ile reaksiyona girdiğinde CO2 gazı oluşur. CO2 oluşumu aminoasitlerin karboksil karbonlarondan kaynaklanır. Yalnız pirolin ve hidroksi pirolin ile sarı bir renk verir. Çünkü ninhidrinin indirgenmesi pirolin halkasından dolayı tamamlanamadığı için. Ninhidrin reaksiyonu ;
Ninhihrin karsinojen ve kuvvetli oksitleyici özellikte bir maddedir. Yutulması halinde zararlıdır. Deride ve gözde tahrişe neden olur. Cilde temas ettiyse bol su ile yıkanmalı. Kıyafete temas ettiyse kirlenen giysi çıkarılmalıdır. Göze temas ettiyse bol su ile yıkanmalı. Nefes yoluyla yutulduysa iyice havalandırılmalıdır. Madde ile çalışıldıktan sonra eller ve yüz iyice yıkanmalıdır.
Ninhidrin sayesinde parmak uçlarından kalan proteinler tespit edilerek suçluların bulunmasını sağlar. Amino asitlerin ninhidrin dışında da reaksiyonları vardır. Bu reaksiyonlar ;
Aminoasitlerin amino gruplarıyla verdikleri reaksiyonlar 1.) Sanger Tepkimesi : Aminoasitlerin amino grubu 1-floro-2,4-dinitrobenzen ile açık sarı renkte 2,4-dinitrofenilamino asit maddesini oluşturur. 2.) Van Slyke Tepkimesi : Aminoasitler nitröz asitle reaksiyona girerek azot gazı açığa çıkararak diazo ürünleri oluştururlar. Bu reaksiyon ile alfa-amino gruplarının tayini yapılabilir. Ama pirolin ve hidroksi pirolin bu reaksiyonu vermez. 3.) Sörensen Titrasyonu : Aminoasitler nötr yada hafif bazik ( alkalik ) ortamda formaldehit ile reaksiyona girerek mono- veya dimetilol türevleri oluştururlar. 4.) Aldehitlerle Shift Bazı Oluşumu : Aminoasitler aldehitlerle reaksiyona girerek shift bazı oluştururlar.
Aminoasitlerin karboksil gruplarıyla verdikleri reaksiyonla 1) Tuz Oluşumu : Aminoasitte bulunan karboksil grubundaki hidroksil hidrojeninin yerine Na+ iyonlarının geçmesiyle oluşur. 2) Amid Oluşturma : Aminoasidin karboksil grubundaki hidroksil yerine amino grubunun bağlanmasıyla oluşur. 3) Ester Oluşumu : Aminoasitlerin alkolle birlikte susuz HCl ile birlikte reaksiyona girmesi sonucu esterler oluşur. Aminoasitlerin –R yan gruplarıyla oluşturdukları tepkimeler Bu tepkimelerin çoğunun ürünleri renkli bileşiklerdir. 1) Millon Tepkimesi : Yapısında fenil grubu bulunduran aminoasitler örneğin; fenilalenin, tirozin gibi aminoasitler nitrik asitte çözünmüş cıva ile birlikte ısıtıldığında kırmızı renkli çözelti oluştururlar. 2) Kurşun Sülfür Oluşumu Tepkimesi : Yapısında tiyol veya disülfit gurbu bulunduran örneğin; sistein gibi aminoasitler NaOH ile ısıtıldığında H2S veya Na2S oluşur. İçerisine kurşun asetat çözeltisi ilave edildiğinde siyah renkli PbS çöker.
3) Pauly Tepkimesi : Fenilalenin, tirozin, histidin gibi aminoasitler sülfanilik asit ile ve sodyum nitrit ile tepkimeye girerek kırmızı rekli bir çözelti oluştururlar.
Kullanılan Madde ve Malzemeler : Pipet, puar, beher, erlen, deney tüpleri, Glisin, alanin, prolin, aspartik asit, saf su, etonol, ninhidrin
Deneyin Yapılışı : Kalitatif Analiz : Beş test tüpüne % 0,1 lik aminoasit çözeltilerinden 2 şer ml alındı. Üzerlerine 0,4 ml ninhidrin çözeltisi edildi. Tüpler karıştırılarak ağızları kapatıldı. Kaynar su banyosunda 10 dk bekletildi. Amino asitlerin renk değişimleri gözlemlendi.
Kantitatif Analiz : Kapaklı 5 test tüpüne 1mM stok glisin çözeltisinden 0,2 - 0,4 – 0,6 – 0,8 – 1,0 ml eklenir. Bu çözeltilerin üzerine, her birinin son hacmi 2 ml olacak şekilde saf suyla üzerleri tamamlandı. Elde edilen standartların konsantrasyonları tüplerin üzerine yazıldı. Kör için 2 ml saf su üzerine 2 ml ninhidrin eklendi. Ayrıca numune konsantrasyonu bilinmediğinden dolayı seyreltmeye ihtiyaç duyulacağı için numunenin kendisi ve iki seyreltmesi ( ½ ve 1/5 ) hazırlandı ve tüm tüpler kaynar su banyosunda 15 dk bekletildi. Tüpler oda sıcaklığına kadar soğutuldu. Üzerlerine 3 er ml %50 lik etonol çözeltisi eklenir. Tüpler karıştırılırak 570 nm dalga boyunda absorbansları okundu. Bu absorbans değerleri konsantrasyona karşılık grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği oluşturuldu.
Ölçüm ve Hesaplamalar : %0,1 100ml lik glisin, sistein, prolin, aspartik asit, alanin çözeltileri ; 1.) 0,1 gr glisin tartıldı, balonjojeye boşaltıldı. Üzerine bir miktar saf su eklenerek çözüldü daha sonra üzeri 100ml olacak şekilde saf suyla tamamlandı. 2.) %0,1 gr sistein tartıldı, balonjojeye boşaltıldı. Üzerine bir miktar saf su eklenerek çözüldü daha sonra üzeri 100ml olacak şekilde saf suyla tamamlandı. 3.) %0.1 gr prolin tartıldı, balonjojeye boşaltıldı. Üzerine bir miktar saf su eklenerek çözüldü daha sonra üzeri 100ml ye olacak şekilde saf suyla tamamlandı. 4.) %0,1 gr aspartik asit tartıldı, bolonjojeye boşaltıldı. Üzerine bir miktar saf su eklenerek çözüldü daha sonra üzeri 100ml olacak şekilde saf suyla tamamlandı. 5.) %0,1 gr alanin tartıldı, balonjojeye boşaltıldı. Üzerine bir miktar saf su eklenerek çözüldü daha sonra üzeri bir 100ml olacak şekilde saf suyla tamamlandı.
%50 500ml lik etanol çözeltisi ; 250ml etonol bir balonjojeye alındı. Üzerine bir miktar saf su eklendi iyice kariştırıldı. Sonra üzerine 250ml ye tamamlanacak şekilde saf su eklenerek iyice karıştırıldı.
1mM stok glisin çözeltisi ( 0,1M 500ml pH 5,5 asetat tamponu karışımında) ; 1. M1 x V1 = M2 x V2 1mM x 0,2ml = M2 x 2ml
M2 = 0,1mM
2. M1 X V1 = M2 x V2 1mM x 0,4ml = M2 x 2ml
M2 = 0,2mM
3. M1 x V1 = M2 x V2 1mM x 0,6ml = M2 x 2ml
M2 = 0,3mM
4. M1 x V1 = M2 x V2 1 mM x 0,8ml = M2 x 2ml
M2 = 0,4mM
5. M1 x V1 = M2 x V2 1mM x 1,0ml = M2 x 2ml
M2 = 0,5mM
%0,1 lik 500ml ninhidrin çözeltisi (%60 aseton %40 asetat tamponu karışımında)
½ lik glisin çözeltisi; 1ml 1 mM lik glisin çözeltisinden alındı ve 1ml saf su eklenerek hazırlandı.
1/5 lik glisin çözeltisi; 0,4ml 1 mM lik glisin çözeltisinden alındı ve 1,6 ml safsu eklenerek hazırlandı. Ölçülen absorban değerleri ve oluşturulan kalibrasyon grafiği; Derişim
Absorbans
0,1
0,174
0,2
0,392
0,3
0,5226
0,4
0,7831
0,5
0,8661
y = 1,7753 x + 0,015 R2 = 0,9809 1/5 lik glisin çözeltisi için okunan absorbans değeri 0,3112 olduğuna göre; 0,3112 = 1,7753 x + 0,015 X = 0.166mM ½ lik glisin çözeltisi için okunan absorbans değeri 0,9109 olduğuna göre; 0,9109 = 1.7753 x + 0,015 X = 0,504mM Sonuç ve Tartışma : Yapılan deneyde aminoasit çözeltilerinin ninhidrin varlığında renklerini inceleyerek derişimleri hakkında fikir edinildi. Aminoasitlerin derişimleriyle ninhidrin ile reaksiyon ürününün derişimleri ve renklerinin doğru orantılı olduğu görüldü. Reaksiyonun hızı da takip edilerek aminoasitlerin molekül yapıları hakkında düşünülmesi ve arasındaki ilişki düşünüldü. Yapısında halka bulununan aminosaitlerin reaksiyon hızının yavaş olduğu görüldü. Çünkü bu aminoasitlerin yapısında bulunan fenol halkasının elektron yoğunluğu çok olduğu için reaksiyona girmesi yavaştır. Deneyde hazırlanan aspartik asit çözeltisi ninhidrinle reaksiyon vermediği görüldü. Fakat aspartik asit ninhidrin ile pembe renkte reaksiyon ürünü oluşturur. Bunun sebebi çözeltinin yanlış hazırlanmasından değil; aspartik asitin bozunmuş olabileceğinden kaynaklanır. Çünkü eğer hazırlarken pipetleme yada fazla veya az madde tartımı olmuş olsaydı ninhidrinle reaksiyonu sonucu çözeltinin reginde derişimiyle doğru orantılı olarak fark oluşurdu. Ama ninhidrinle hiç reaksiyon vermedi. Öyleyse bunun cevabı aspartik asitin bozunmuş olamasıdır.
Oluşturulan kalibrasyon eğrisinde R2 değeri 0,98 bulunmuştur. Buna göre çözeltilerin hazırlanmasında çok fazla pipetleme veya tartım hatası yapılmadığı anlaşıldı. Yalnız 1/5 seyreltmeyle hazırlanan glisin çözeltisinin absorbans değeri kalibrasyon eğrisinin y=mx + n denkleminde yerine konulduğunda derişiminin 0,166 mM oldğu görüldü. Ama 1/5 seyreltmeye göre M1 x V1 = M2 x V2 formülünde yerine koyarak hesaplandığında derişiminin 0,20mM olması gerekir. Demek ki bu çözeltiyi hazırlarken ufak pipetleme veya tartım hatası yapıldığı anlaşıldı.
