INSTITUTO TECNOLÓGICO DE LOS MOCHIS
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
Microbiología
Anteproyecto:
“Aislamiento y cultivo de microorganismos amilolticos! Integrantes: Soto Luque Carlos Manuel Valdez Fonseca Dalia Zuzet Mendoza ra!eda "es#s $% &i'era "es#s &osario L(pez Di)as Carlos
M%C% $c*oa +ern,ndez María
Los Moc*is- Sinaloa a ./ de )arzo de ./01%
Introducción Los microorganismos amilolíticos tienen un gran impacto en el ambiente donde se encuentren, ya que son capaces de degradar grandes cantidades de almidón. El almidón es un polisacárido de alto peso molecular ramificado, es una fuente energética pura de vegetales, principalmente, los tubérculos. eneralmente se sabe que los microorganismos con capacidad degradante amilolítica son las bacterias, !ongos y levaduras. El microorganismo !uésped se selecciona de un grupo formado por las levaduras de los géneros Sacc*aro)yces, Sc*izosacc*aro)yces, Sc*2annio)yces o 3luy'ero)yces o las bacterias del género Zy)o)onas o los mo!os del género Aspergillus "#oraya, et. al. $%%&'. En el presente traba(o se reali)a el estudio de cepas microbianas de un nic!o ecológico muy presente en nuestra región, siendo el suelo agrícola, productoras de en)imas amilolíticas. Los criterios utili)ados para el aislamiento y cultivo de las cepas, son el crecimiento sobre los medios preparados manualmente con almidón y la positividad frente al test de lugol.
*b(etivos • •
Aislar y culti'ar )icroorganis)os a)ilolíticos de suelo agrícola% Identi4icar )icroorganis)os aislados%
+ustificación En la industria alimentaria, la utili)ación en en)imas en la producción de alimentos es, !oy en día, un recurso indispensable. Las en)imas son las encargadas de transformar moléculas grandes en compuestos de menor tamao o viceversa pero con la finalidad de apresurar procesos químicos. El uso de en)imas amilolíticas se aplica mayormente en la producción de (arabes o productos de alto contenido de a)-car, incluso en edulcorantes. El aislamiento de microorganismos amilolíticos permitirá dar el paso para la producción y obtención masiva de en)imas degradadoras de almidón a partir de cepas puras, con la confiabilidad de que la etracción de estas es segura para su consumo. /ic!o eso, la misma producción de en)imas con organismos biosintésicos es un método de a!orro en costos para las industrias o usos domésticos. 0ambién aplica la investigación de estos microorganismos si resultan ser patógenos para el suelo en donde se encuentren, aprovec!ándose de especies ricas en almidón.
1ntecedentes En $%%&, investigadores del Instituto de 2iencia 1nimal, 2uba, reali)aron un proyecto de aislación y selección de microorganismos con capacidad degradante de almidón. 3e utili)ó como medio de cultivo, boniato fresco rallado. Este es conocido como batata o papa dulce, en nuestra región se conoce como camote. 3e a(ustó el medio a distintas variaciones de p4 colocándose en cuatro ambientes distintos por un periodo de 5 días. 3e reali)aron etracciones de los microorganismos aerobios y se sembraron en un medio, cuya -nica fuente energética era el almidón. 6osteriormente se incubaron a 7%82 por siete días. 3e seleccionaron las cepas con mayor crecimiento y se determinó su capacidad amilolítica por la formación de !alos de digestión, después de una tinción de lugol en el medio. Los microorganismos se compararon con cepas de referencia, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger . /e proyecto se obtuvieron 7$ cepas puras, de ellas 79.$ con mayor capacidad amilolítica que las de referencia. Los !ongos fueron los que presentaron mayores índices de potencia, en segundo lugar, estuvieron las bacterias y las levaduras mostraron potencia como las cepas de referencia. En $%%;, el departamento de %% ml de solución salina !asta !omogenei)ar reali)ando diluciones seriadas en tubos que contenían > ml de agua peptonada. 2on base en el crecimiento sobre los medios modificados con almidón, la positividad frente al test de Lugol, y los aspectos morfológicos de los microorganismos, se !i)o el aislamiento de las cepas. 3e sembraron por agotamiento en el medio sólido en el que anteriormente se !abía de(ado y se incubaron por $; !oras a 7%82. Las cepas positivas fueron sembradas en 5 ml de respectivo medio líquido e incubadas a 7%82 por $; !r. ? posteriormente se crioconservaron en glicerol al 7% a @$%82.
Aaterial y método 3e tomará una muestra de apro. 5% gr de suelo agrícola en donde se siembre papa. 2on una balan)a granataria se pesará 9% gr del suelo y se colocará en un matra) Erlenmeyer con >% ml de agua estéril. Esto se agitará ;% veces o !asta que tenga una apariencia !omogénea. 3e preparará una serie de diluciones desde 9% @9 !asta 9%@5, para esto, se dispondrá de 9% ca(as de 6etri estériles y ; tubos de ensayo "etiquetados de 9% @$ a
9%@5 respectivamente'. /el matra) "marcado como 9% @9', con una pipeta de 5 ml se tomará 7 ml de la solución, de los cuales $ ml se utili)arán para dos ca(as de 6etri "9 ml cBu' y el mililitro restante se aadirá a un tubo de ensayo con > ml de agua estéril tapado con tapón de algodón "etiquetado: 9% @$', este se agitará ;% veces y de él se tomará 7 ml con una pipeta, repitiendo los pasos anteriores para todos los tubos y ca(as de 6etri. Las ca(as de 6etri serán destinadas para los medios de cultivo. =na de las dos ca(as de cada tubo o del matra), se utili)ará para un medio de cultivo a base almidón@agar para bacterias, y la segunda ca(a, para el mismo tipo de medio de cultivo pero este se acidificará con ácido tartárico para el aislamiento de !ongos. 6ara la elaboración de los medios de cultivo agar@almidón, se preparará manualmente con etracto de carne "7 gr.' o triptona "9% gr.', almidón soluble "9% g.', Ca2l "5 gr.' y agar "9$ gr.' en 9 %%% ml de agua destilada. 3e disolverán los componentes en un matra) con los 9 %%% ml de agua aadiendo al final el agar, agitando ligera y constantemente. 1l !ervir durante 9 minuto, el medio se autoclavará a 9$982 durante 95 minutos y al retirar de la autoclave se dispondrá de las ca(as 6etri con la muestra del suelo disuelto en ellas para su rápida preparación evitando por muc!o tiempo el contacto con el ambiente. Los medios de cultivo ya preparados se incubaran a 7D82 durante 5 días. 6ara la determinación de si una colonia es amilolítica, se colocará una gota de lugol directamente para observar el vire de color. 3i la )ona de la colonia es incolora resulta positivo ante acción amilolítica y si la )ona vira a a)ul@p-rpura, es negativo a dic!a acción. 3e aislará una cepa pura de una colonia de cada medio de cultivo en un tubo de agar@almidón inclinado para observar directamente la morfología colonial y microscópica individual de cada colonia. 6ara la morfología microscópica se tomará una pequea muestra con un asa bacteriológica y en un portaob(etos con una gota de agua se me)clará la muestra y se !ará un frotis en este. 3e secará al aire e inmediatamente se fi(ará a la flama !asta una temperatura soportable en el dorso de la mano. 3e aplicará la tinción de ram para la observación. 6ara esto, al fi(ar a la flama, se le colocará una gota de cristal@violeta a la muestra y se de(ará reposar durante 9 minuto. 3e lavará indirectamente y se le aplicará 9 gota de Lugol, de(ando reposar un minuto y se en(uagará. 1 continuación, se le aplicará 9 gota de alco!ol@cetona para desecar la muestra durante 9 minuto y se en(uagará. 6or -ltimo, se le aplicará 9 gota de 3afranina a la muestra de(ando actuar durante 9 minuto, se en(uagará y se observará al microscopio con el ob(etivo 9%% utili)ando aceite de inmersión. 3e evidenciará lo observado y se describirá la morfología microscópica de cada colonia destacable en los medios de cultivo.
3e determinará e identificará, mediante bibliografía y comparación, las especies aisladas en los medios, las que sean amilolíticas.
•
•
•
5uintero- &%- 607789% Aplicaciones de la iotecnología en la industria ali)entaria% Medellín- ;ni'ersidad de Antoquia% .0/ pp% S,nc*ez- C%- y C%- Figueroa% 6.//<9% =roducci(n de )altode>trinas a partir de al)id(n de yuca- utilizando la enzi)a al4a a)ilasa% Ingeniería 5uí)ica% =p <0?% S,nc*ez- C%- Me!ía- C%- Figueroa- M%- @squi'ia- M%- Agudelo- L%- Zapata- % y M%- ()ez% 6.//<9% @studio de cepas nati'as a)ilolíticas Ben línea% &ecuperado el ./ de )arzo de ./01 de *ttp:222%scielo%org%copd4'itae'0.n.'0.n.a/E Zoraya&odríguez- &%- oucourt- "%- &odríguez- %- Albelo- $%- uGez- F%- y &%- +errera 6.//?9% Aisla)iento y selecci(n de )icroorganis)os con capacidad de degradar el al)id(n% &e'ista Cubana de Ciencia Agrícola'ol%
