5.2 ANALISIS DE POLISACARIDOS POLISACARIDOS
5.2.1 Extracción selectiva de almidón Los dos tipos de moléculas que se pueden encontrar en el almidón diferen apreciablemente en sus solubilidades en disolventes acuosos, por ejemplo, la extracción en agua caliente removerá una parte considerable de amilosa y dextrinas, dejando una parte de amilopectina. (Soutgate, !""!# $.%.!.! &on cloruro de calcio La extracción con cloruro de calcio a sido utili'ada ampliamente en el análisis de almidones en cereales por métodos polarimetritos, dando resultados reproducibles. reproducibles. tros polisacáridos son solubles en este reactivo y es necesario tener cuidado en la aplicación de este método a otros tipos de alimentos. (Soutgate, !""!# $.%.!.% &on ácido perclórico )l almidón se extrae de una muestra seca con ácido perclórico y se precipita como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se idrolice el almidón. (Soutgate, !""!# $.%.!.* &on etanol y ácido perclórico )l método se dise+ó originalmente para cereales y envuelve la extracción de a'ucares libres con etanol acuoso y la extracción del almidón con ácido perclórico del residuo, con métodos como el de antrona. (Soutgate, !""!# $.%.!. &on dimetil sul-óxido (/S# )l almidón se dispersa en /S y luego se convierte cuantitativamente en 0glucosa con α0amilasa termoestable, llevando a cabo la polimeri'ación y de polimeri'ación del almidón. 1na glucoamilasa completa la acción de la α0amilasa para determinar la 0glucosa usando un reactivo contiene una parte incolora que se oxida a un compuesto colorido por medio del peroxido de idrogeno proveniente de la glucosa. (2ielsen, !""3# 10.2.2 ALMIDÓN !4.%.%.! )xtracción selectiva de almidón (Soutgate, !""!# !4.%.%.!.! &on cloruro de calcio (recomendado para el análisis polarométrico del almidón#.
&olocar %0$4g de muestra en un matra' )rlenmeyer y -ormar una pasta con !4 mL de agua. 5dicionar $4 mL de solución de cloruro de calcio ácida (6%4 g &a&l% 67% en !34 mL de agua, con !3 g de acetato de sodio triidratado en %4 mL de agua, ajustar el p7 a %0* con ácido acético# y calentar en autoclave a !%4 8& por !4 min. )n-riar la me'cla en un ba+o de agua -r9a y trans-erir a un matra' a-orado de !44 mL, utili'ando solución de cloruro de calcio asta un volumen cercano a "4 mL. 5dicionar % mL de reactivo de &arre' : y me'clar bien, adicionar % mL de solución de &arre' ::, agitar nuevamente y llevar a la marca con solución de cloruro de calcio. ;iltrar a través de papel <atman 2o $!, el fltrado debe ser claro. )n esta solución se encuentra el almidón disuelto.
!4.%.%.!.% &on ácido perclórico (recomendado para la -ormación de un complejo insoluble con yodo#.
&olocar $40%$4 mg de muestra seca en un tubo de ensaye con un poco de arena y adicionar mL de agua. &alentar en un ba+o de agua irviendo el tubo por !$ min., asta gelatini'ar el almidón. )n-riar el tubo a temperatura ambiente y adicionar rápidamente con agitación * mL de solución de ácido perclórico al =%>. ispersar la muestra con una varilla de vidrio durante un minuto, repetir la operación eventualmente durante !$0%4 min. )njuagar con %4 mL de agua la varilla, recuperando en el tubo, centri-ugar y decantar el sobrenadante. ?eali'ar una ve' más la extracción en el residuo, con mL de agua y * mL de ácido perclórico. &ombinar los sobrenadantes y llevarlos a un volumen de $4 mL con agua. Se recomienda anali'ar inmediatamente. !4.%.%.!.* &on etanol y ácido perclórico (recomendado para reali'ar una reacción con antrona o -enol0sul-@rico#
Aesar aproximadamente 4.% g de muestra sólida fnamente molida y colocar en un tubo de centr9-uga de $4 mL, adicionar dos gotas de etanol al 34> (vBv# para umedecer la muestra. 5dicionar $ mL de agua y agitar. 5dicionar %$ mL de etanol al 34> caliente, agitar y dejar reposar $ min. &entri-ugar, decantar el sobrenadante y repetir la extracción con *4 mL de etanol al 34>. )n solución se encuentran los a'@cares y para su análisis es necesario eliminar el alcool por evaporación a presión reducida. 5dicionar $ mL de agua a la porción insoluble, posteriormente 6$ mL de solución de ácido perclórico al $%> (vBv#, agitar la me'cla. &ontinuar la agitación por !$ min., después adicionar %4 mL de agua, centri-ugar. ecantar el sobrenadante en un matra' a-orado de !44 mL y re0extraer el residuo como se indico previamente. /e'clar los extractos y llevar a la marca con agua, fltrar la solución si presenta part9culas. Las soluciones obtenidas pueden ser anali'adas con métodos como el de antrona para cuantifcar los carboidratos totales, adjudicando el valor del extracto con ácido perclórico al almidón y el obtenido con etanol a los a'ucares solubles. !4.%.%.!. &on dimetil sul-óxido (/S# (recomendado para preparar extractos sometidos a idrólisis con amiloglucosidasa#
/e'clar porciones de aproximadamente !44 mg de muestra fnamente dividida con %4 mL de /S y $ mL de 7&l 3/, calentar en un ba+o de agua a 648& por *4 min. iluir a $4 mL con agua y neutrali'ar con 2a7 $/. )n-riar a temperatura ambiente y a-orar a !44 mL. ;iltrar si la solución no es clara. )sta solución puede ser utili'ada directamente para tratamiento con amiloglucosidasa para cuantifcar la glucosa -ormada.
!4.%.%.% &uantifcación de almidón ( ielsen, !""3# !4.%.%.%.! Aor idrólisis ácida directa
)ste procedimiento puede ser usado cuando se sabe que sólo se encuentran presentes almidón (y dextrinas# y cuando se permite un bajo nivel de precisión. La muestra debe estar fnamente molida o dispersa, para que se puedan tomar al9cuotas representativas. )s recomendable eliminar la posible presencia de a'ucares, por lo que se puede utili'ar el residuo insoluble en etanol al 34>. &olocar !440$44 mg de muestra en un matra' de bola de -ondo plano de !L y agregar $4 mL de una solución de ácido sul-@rico 4.!3/. &olocar a ebullición en reCujo por rs., asegurando que todas las part9culas se encuentran inmersas en la solución de ácido, para ello a los *4 min enjuagar las paredes del matra' con la solución, reali'ar agitación leve, repetir esta operación las veces que sean necesarias. )n-riar a temperatura ambiente una ve' concluida la idrólisis y neutrali'ar parcialmente con una solución de idróxido de sodio !4/ (aprox. !$ mL#, llevar a un volumen de $44 mL. ;iltrar y neutrali'ar completamente con carbonato de sodio sólido. &uantifcar la glucosa liberada por la idrólisis. !4.%.%.%.% Aor precipitación de complejos con yodo
Se recomienda utili'ar el extracto obtenido por solubili'ación con ácido perclórico. Drans-erir una porción del extracto de ác. perclórico (! a !4 mL# a un tubo calibrado a !4, !$ y %4 mL, y diluir a !4 mL. 5dicionar % mL de una solución de cloruro de sodio %4> (pBv#, seguida de % mL de solución de :BE: al *>. ejar reposar %4 min. &entri-ugar y eliminar el sobrenadante. ?esuspender el precipitado en $ mL de solución de cloruro de sodio alcoólica y lavar por centri-ugación. )l almidón se cuantifca gravimétricamente o descomponiendo el complejo en medio alcalino y cuantifcando con un método como el de antrona o -enol0sul-@rico. 5s9 mismo el almidón liberado puede ser sometido a idrólisis en'imática con amiloglucosidasa y cuantifcar la glucosa liberada. !4.%.%.%.* Aor reacción colorida con yodo
)ste procedimiento @nicamente puede ser utili'ado cuando el almidón se encuentra completamente disuelto (gelatini'ado#. &olocar % mL de la solución de almidón en un tubo de ensayo y adicionar *mL de una solución de :BE: preparada diluyendo % mL de solución de yodo a !44 mL con agua. /edir la intensidad del color a'ul producido en un espectro-otómetro a 644 nm, -rente a un blanco de reactivos. &alcular la cantidad de almidón presente en la muestra a partir de una curva patrón preparada en el intervalo de 4.4%04.% mg de almidón solubleBmL, tratada de la misma manera que el problema.
Los resultados de esta determinación son relativos, ya que no todas las -uentes de almidón -orman el mismo complejo colorido con yodo. 10.2.3 ANÁLISIS DE E!"INAS #Nielsen$ 1%%&' &olocar * g de muestra desengrasada, de pre-erencia con etanolBbenceno, en un embudo con fltro de vidrio poroso y extraer con una solución al 4.$> (pBv# de oxalato de amonio durante % . a 3$8&. ?epetir la extracción veces. &ombinar los fltrados y acidifcar ligeramente con 7&l !/. 5dicionar vol@menes de etanol con agitación y dejar sedimentar el precipitado. ecantar el sobrenadante sobre un embudo con fltro de vidrio poroso previamente colocado a peso constante. Dransfera el precipitado al embudo y lave con etanol al =4> ligeramente acidifcado con 7&l, seguido de etanol y terminando con acetona. &olocar el embudo en la estu-a a !448& asta secar completamente, en-riar y pesar. )l residuo corresponde a las sustancias pécticas.
