2.1 Agr Ag r obacte cter ium tume umefacie faciens ns
Species Agrobacterium Agrobacterium tergolong bakteri gram negatif yang tergolong bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 – 1,0 µm sampai 1,5 – 3,0 µm, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28°C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. Gall. Agrobacterium tumefaciens tumefaciens dan spesies Agrobacterium Agrobacterium lainnya telah dikenal luas sebagai patogen bagi tanaman sejak awal abad ke-20. Namun, dalam dua dekade terakhir, kemampuan yang dimiliki Agrobacterium
untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman telah
banyak dimanfaatkan untuk keperluan rekayasa genetik khususnya pada tanaman.
Gambar 6. Agrobacterium tumefaciens
(sumber: http://www.bio.davidson.edu )
Agrobacterium tumefaciens tumefaciens adalah bakteri yang secara alami dapat menginfeksi tanaman dengan penyakit crown gall tumor (tumor mahkota empedu) pada tanaman-tanaman dikotiledon. Penyakit ini dinamakan demikian karena terdapatnya tumor besar yang membengkak yang terdapat pada tanaman. Penyakit ini adalah salah satu penyakit yang paling umum diketahui karena perubahan yang ditimbulkannya pada sistem biologis tanaman. Secara mendasar, ketika bakteri ini menginfeksi tanaman, sebagian dari materi DNA-nya dipindahkan ke genom tanaman yang akhirnya menyebabkan tumor dan perubahan pada sistem metabolisme tanaman. Hal ini dapat terjadi karena materi genetik yang diberikan kepada tanaman salah satunya mengandung gen pengkode hormon pertumbuhan tanaman yang dalam jumlah berlebih akan menyebabkan pertumbuhan tidak terkendali dan pada akhirnya menyebabkan kanker atau tumor. Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, Agrobacterium tumor, Agrobacterium tumefaciens harus tumefaciens harus menempel terlebih
dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon, tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebutelah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.
Gambar 7. Siklus Penyakit Crown Gall
(Sumber : https://www.cals.ncsu.edu/ ) Sifatnya yang unik ini membuat bakteri Agrobacterium tumefaciens digunakan sebagai alat pada proses pengembangbiakan tanaman. Gen yang diinginkan, seperti gen insectisidal toxin genes atau herbicide-resistance dapat dimasukan ke dalam DNA bakteri dan kemudian dimasukan ke dalam genom tanaman. Penggunaan bakteri ini tidak hanya memperpendek waktu pengembangbiakan tanaman, tetapi juga memungkinkan tanaman untuk memiliki sifat baru yang tidak dimiliki tanaman pada umumnya. Transformasi menggunakan Agrobacterium ternyata lebih disenangi dibandingkan dengan metode lain karena memilikin keunggulan antara lain 1). Efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal lebih tinggi, 2). Dapat dilakukan dengan peralatan laboratorium yang sederhana, dan 3) Ekspresi gen transfer yang stabil cukup banyak. Gen dengan salinan tunggal lebih mudah dianalisa dan biasanya bersegregasi mengikuti pola pewarisan Mendel. Infeksi Genetik Ke Tembakau Dengan Menggunakan Agrobacterium
Tembakau merupakan tanaman dikotil dan inang alami untuk A. tumefaciens (Mayo et al., 2006). Nicotina tabacum (Mayo et al., 2006; Bhatti dan He, 2009) dan Nicotina benthamiana (Anggraito, 2012) merupakan jenis tembakau yang sering digunakan dalam transformasi genetik. Pada jenis N. tabaccum seperti Samsun (Stanic et al., 1999), SRI (Bhatti dan He, 2009), Bright yellow (An, 1985), Xanthi (Su, 2012), dan Kasturi (Miswar, 2005), telah berhasil dilakukan transformasi melalui perantara A. tumefaciens. Daun muda (Jones, 1996; S u et al., 2012) dan suspensi sel (An, 1985; Mayo
et al., 2006) merupakan eksplan yang telah berhasil diintroduksi gen asing. Keberhasilan transformasi genetic tembakau telah digunakan untuk berbagai tujuan seperti mengungkap regulasi sistem biologi tanaman (Langbecker et al., 2004), bioremediasi untuk merkuri (He et al., 2001), tanaman model untuk pengujian cekaman biotik (Waigman et al., 2000), dan abiotic (Rizhsky et al., 2002). Tabel 1. Sejumlah Keterlibatan Tembakau dalam Perkembangan Tanaman Transgenik Tahun 1982
Peristiwa
Tanaman transgenik yang pertama dihasilkan
berupa
tembakau
resisten antibiotik 1986
Tanaman transgenik pertama kali diuji coba langsung di Prancis dan AS,
berupa
tembakau
tahan
herbisida 1987
Tanaman tahan serangga berupa tembakau yang tersisipi gen Bt pertama kali dihasilkan oleh Plant Genetic System
1992
Tanaman transgenik pertama kali diperkenalkan
di
Cina
dalam
bentuk tembakau tahan virus 1994
Tanaman transgenik pertama kail dikomersialkan di Eropa dalam bentuk tembakau tahan herbisida bromoxynil
Beberapa tahap – tahap ini umumnya dilakukan dalam proses transformasi genetic pada Tembakau dengan Agrobacterium. Umumnya pada proses ini menggunakan Agrobacterium tumefaciens dan dilakukan dengan metode leaf disk
Gambar 21. Pembuatan Planlet Daun Hasil Infeksi Agrobacterium
(Sumber: Primrose, et al , 2001) 4.1 Persiapan Agrobacteri um dan Tembakau
Sebelum A. tumefaciens yang telah disipi gene of interest menginfeksi tembakau, dilakukan preparasi koloni A. tumefaciens dalam medium Saint et al (1994) maupun medium Susanto et al (2011) dan Waluyo et al (2013). Saint et al (1994) [sebagaimana diuraikan oleh Santoso et al (2000)] menumbuhkan A. tumefaciens dalam medium cair Luria – Bertani (LB) yang mengandung antibiotic untuk seleksi A. tumefaciens yang telah tersisipi gen/plasmid yang diinginkan (biasanya kanamisin). Susanto et al (2011) dan Waluyo et al (2013) menumbuhkan A. tumefaciens dalam dalam media YEP (yeast extract pepton 10 g/l pepton, 10 g/l kamir dan 5 g/l NaCl) yang ditambahkan antibiotik sebagai kanamisin. Keduanya ditumbuhan selama 24 – 48 jam pada suhu 28°C dengan pengocokan 150-200 rpm. Kultur dilakukan hingga OD600 = 0,5. Pada medium Saint et al (1994), kultur A. tumefaciens dilakukan dalam keadaan gelap dan dikulturkan kembali selama sekitar tiga jam pada kondisi yang sama setelah diencerkan 100 – 1000 kali dengan medium yang sama. Tembakau yang umumnya disiapkan untuk transformasi genetic biasanya diambil dari daun tembakau muda (umumnya dari hasil perkecambahan in vitro) yang telah disterilkan. Daun tembakau yang diambil dipotong dengan ukuran 5 mm x 10 mm kemudian diprekultur selama 60 menit untuk dijadikan sebagai eksplan. 4.2 Inokulasi dan Kokultivasi
Inokulasi dilaksanakan dengan merendam eksplan tembakau dalam suspensi A. tumefaciens selama 30 menit. Setelah inokulasi, eksplan diletakkan di atas kertas saring hingga kering, kemudian eksplan ditanam di media kokultivasi berupa MS (Murashige-Skoog), asetosiringon, serta nutrisi tambahan dan diinkubasi pada kondisi gelap pada suhu 28°C selama 2-3 hari. Asetosiringon ditambahkan untuk merangsang transkripsi gen vir agar proses transfer T-DNA ke tumbuhan berlangsung lebih cepat.
4.3 Seleksi dan Regenerasi
Eksplan dipindahkan ke media seleksi yang berupa medium MS, antibiotic atau herbisida untuk menentukan sel tembakau yang telah tersisipi gene of interest (umumnya antibiotic kanamisin) dan antibiotic pembunuh A. tumefaciens (seperti sefotaksim dan karbenisilin untuk membunuh bakteri Gram-negatif). Komposisi media dasar MS seperti pada pustaka. Kultur pada media seleksi diinkubasi pada ruang kultur dengan suhu 27°C dengan fotoperiodisitas cahaya 16 jam terang. Eksplan disubkultur setiap 4-6 minggu.
Tabel 2. Komposisi Medium MS (Murashige-Skoog)
(Sumber: Maeda et al, 1985)
Penanda bahwa telah terjadi perpindahan T-DNA ke dalam kromosom tanaman adalah gen resisten antibiotik. Dalam T-DNA disisipi gen resisten zat kimia tertentu, sehingga, apabila penanda ini telah masuk ke dalam kromosom tanaman, tanaman tersebut akan tahan zat kimia itu. Berikut beberapa penanda (selected marker) yang lazim digunakan
Tabel 3. Selectable Gene
(Sumber: Primrose et al, 2001)
Eksplan/kalus yang bertunas dipindahkan ke media pemanjangan tunas dengan medium dan penambahan yang sama seperti media seleksi. Tunas yang terbentuk pada media pemanjangan tunas dipisahkan dari kalus dan dipindahkan ke media perakaran beruma medium MS disertai penambahan antibiotic seleksi dan nutrisi tambahan pada botol selai. Planlet yang terbentuk siap untuk dipindahkan ke medium tanah
