BAB I PENDAHULUAN
Proses pemeriksaan laboratorium pada umumnya dibagi dalam tiga tahapan, yaitu tahap praanalitik, analitik, dan pascaanalitik. Untuk mendapatkan hasil yang teliti, tepat, cepat, dan dapat dipercaya, ketiga tahap tersebut harus dilakukan dengan baik menurut prosedur yang telah ada, dalam waktu dan biaya yang optimal.1 Tahap
praanalitik
dimulai
sejak
identifikasi
dan
persiapan
pasien,
pengambilan, penampungan, pengiriman, dan penyimpanan bahan. Salah satu bagian yang penting dalam tahap ini yaitu pemilihan antikoagulan yang tepat untuk penampungan, penyimpanan dan pengiriman bahan. 1 Antikoagulan adalah zat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah dengan cara mengikat kalsium atau dengan menghambat pembentukan trombin yang diperlukan untuk mengkonversi fibrinogen menjadi fibrin dalam proses pembekuan.2 Zat ini akan mencegah penggumpalan jika dicampur dengan darah dalam proporsi yang sesuai. 3 Ada berbagai macam antikoagulan, dengan kelebihan dan kekurangan masing-masing untuk berbagai jenis pemeriksaan hematologi. hematologi. Pada kesempatan ini akan dibahas mekanisme kerja dan penggunaan empat macam antikoagulan, yaitu EDTA, sitrat, heparin, dan natrium fluorida.
1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 PENGERTIAN
Antikoagulan adalah zat yang mencegah penggumpalan darah dengan cara mengikat kalsium atau dengan menghambat pembentukan trombin yang diperlukan untuk mengkonversi fibrinogen menjadi fibrin dalam proses pembekuan.2 Jika tes membutuhkan darah atau plasma, spesimen harus dikumpulkan dalam sebuah tabung yang berisi antikoagulan dengan komposisi yang sesuai. Spesimen dan antikoagulan harus dicampur hingga homogen segera setelah pengambilan spesimen untuk mencegah pembentukan klot/mikroklot. Pencampuran dengan perlahan sangat penting untuk mencegah hemolisis. 2,3 Untuk kepentingan pemeriksaan hematologi, antikoagulan yang dipakai harus memenuhi kriteria sebagai berikut:4 1. Tidak merubah bentuk sel darah merah 2. Tidak menyebabkan hemolisis 3. Dapat meminimalkan agregasi trombosit 4. Dapat meminimalkan gangguan pewarnaan dan bentuk leukosit 5. Mudah larut dalam darah 2.2 MEKANISME KERJA ANTIKOAGULAN
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antikoagulan yang sering digunakan dalam pemeriksaan laboratorium dikelompokkan dalam 2 kelompok, kelompok, yaitu:2 1. Zat yang mengikat kalsium 2. Zat yang menghambat aktifitas thrombin
2
2.2.1 Antikoagulan Pengikat Kalsium
Sebagian besar antikoagulan yang digunakan di laboratorium bekerja dengan mengikat kalsium dan membentuk garam insoluble atau insoluble atau garam soluble garam soluble un-ionized . Seperti diketahui bahwa kalsium esensial dalam berbagai tahap pada mekanisme pembekuan, maka ikatan kalsium pada antikoagulan dapat mencegah pembekuan darah.5 Yang termasuk zat pengikat kalsium antara lain EDTA (ethylene ( ethylene diamine tetraacetic acid ), ), sitrat, oxalate, dalam berbagai bentuk garamnya. 5
2.2.2 Zat yang Menghambat Trombin
Yang termasuk dalam kelompok ini antara lain heparin, hirudin. 2 Sebagai antikoagulan, heparin bekerja dengan: 2 1. Menghalangi pembentukan trombin 2. Mempercepat
pembentukan
kompleks
antitrombin
III
dengan
menginaktifkan faktor Xa dan mencegah pembentukan trombin dari protrombin 3. Menginaktifasi faktor XIIa dengan cara mencegah terbentuknya fibrin stabil
2.3 EDTA
Antikoagulan EDTA (ethylen ( ethylen diamine tetraacetic acid ) adalah antikoagulan yang paling sering dipakai. Tersedia dalam beberapa bentuk garamnya, yaitu natrium (Na2EDTA), dipotasium (K2EDTA), tripotasium (K3EDTA). Bentuk garam potasium lebih banyak digunakan untuk kepentingan komersial karena lebih
mudah
larut.
Serbuk
K2EDTA
adalah
jenis
antikoagulan
yang
direkomendasikan oleh ICSH ( International Counsil for Standardization in Haematology) Haematology) dan NCCLS( National Committee for Laboratory Standards Standards). ).2,6
3
Garam litium juga memiliki efek antikoagulan yang efektif, namun daya larutnya lebih rendah. Kelebihan garam litium ini adalah dapat digunakan untuk pemeriksaan kimia.6 EDTA merupakan asam poliprotik yang terdiri dari empat gugus asam karboksilat dan dua gugus amin dengan muatan negatifnya. 7 EDTA sebagai antikoagulan mengikat kalsium dan membentuk garam kalsium yang tidak larut, dengan ikatan kelasi stoikiometrik. Ikatan ini lebih kuat dan lebih irreversible dibanding ikatan kalsium dengan sitrat. 1 Gambar 1. Reaksi pengikatan ion kalsium oleh EDTA
Garam EDTA + Ca2+
CaEDTA + 2 ion garamnya dengan muatan (+)
Perbandingan garam EDTA anhydrous yang anhydrous yang digunakan adalah 1,2 mg per ml darah. Untuk garam dipotasium sebanyak 1,5 – 2,2 2,2 mg per ml darah. 6 EDTA sangat ideal untuk pemeriksaan hematologi, karena memenuhi berbagai kriteria sebagai antikoagulan, yaitu tidak merubah bentuk SDM, tidak menyebabkan
hemolisis,
dapat
meminimalkan
agregasi
trombosit,
dapat
meminimalkan gangguan pewarnaan pada pemeriksaan apusan, serta mudah larut dalam darah. 1,4,7 Penggunaan EDTA antara lain untuk pemeriksaan hemoglobin (termasuk elektroforese haemoglobin dan estimasi HbF), hematokrit, laju endap darah (LED), hitung sel (trombosit, leukosit, retikulosit), apusan darah. Selain itu, dapat
4
juga digunakan dalam fibrinogen, glukosa,
pemeriksaan mikrofilaria,
BUN, protein plasma,
1,3,4,7
Coomb’s test .
Stabilitas parameter hematologi dalam darah EDTA untuk hitung sel darah optimal dalam 8 jam setelah pengambilan sampel, 48 jam untuk pemeriksaan hemoglobin, dan 24 jam untuk parameter SDM yang menggunakan teknologi impedance. impedance.6,7 Retikulosit bertahan hingga 72 jam pada suhu 4 0C, tapi pada suhu ruang, hanya bertahan selama 6 jam. 6 Leukosit stabil dalam 24 jam pada suhu 4 0C, demikian juga untuk hitung jenisnya. Tetapi pada suhu kamar, leukosit (juga trombosit) hanya bertahan selama 2 jam. Setelah itu, jumlahnya akan turun drastis, terutama untuk limfosit. 6,7
Efek penyimpanan juga berpengaruh pada monosit yaitu terbentuknya vakuole dalam sitoplasma. Limfosit juga akan membentuk vakuole, inti tampak lebih homogen pada pewarnaan, dan nukleusnya membentuk budding sehingga tampak seperti dua atau tiga lobus. 6 Bagaimanapun juga, EDTA masih mempunyai beberapa kekurangan, yaitu: 1,3,4,5,6,8
1. Konsentrasi EDTA yang berlebihan dapat a. menyebabkan sel darah merah (SDM) dan leukosit mengecil dan menyebabkan kesalahan dalam pemeriksaan MCV dan MCHC. Walau tidak mempengaruhi konsentrasi hemoglobin. b. menyebabkan pembengkakan trombosit sehingga tampak adanya trombosit raksasa yang pada akhirnya mengalami fragmentasi membentuk fragmen-fragmen yang masih dalam rentang pengukuran trombosit oleh alat hitung otomatis. Jadi dapat terjadi peningkatan palsu jumlah trombosit. c. Tidak dapat memperlihatkan basophilic stippling. 2. Pada pemeriksaan limfosit, setelah beberapa jam, dapat terbentuk vakuole dalam limfosit, sehingga menyerupai monosit.
5
3. EDTA mengganggu pemeriksaan sebagai berikut: a. Menyebabkan peningkatan palsu kadar alkalin fosfatase dengan mengikat Mg++ b. Menurunkan daya ikat CO2 oleh hemoglobin, sehingga tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan analisa gas darah. c. Mengganggu reaksi Jaffe pada pemeriksaan kreatinin d. Karena EDTA tersedia dalam bentuk garam sodium dan potasium, serta mengikat kalsium dalam plasma, maka konsentrasi Na+ dan K + dalam plasma seolah-olah meningkat. Sedangkan pada pengukuran kadar ion kalsium, maka akan sangat rendah karena diikat oleh EDTA. 4. Menyebabkan aglutinasi leukosit (netrofil dan limfosit). 5. Dapat menyebabkan perlekatan trombosit pada netrofil. 6. Pada pengukuran aktivitas monosit (melepaskan faktor jaringan dan faktor nekrosis tumor), akan lebih rendah dibandingkan pada pengukuran dengan antikoagulan sitrat dan heparin. 7. Hasil yang lebih rendah pada pengukuran aktivasi netrofil yaitu pengukuran laktoferin yang pelepasannya diinduksi oleh lipopolisakarida. 8. EDTA tidak cocok untuk pemeriksaan fungsi trombosit dan uji koagulasi. EDTA dapat mensupresi degranulasi trombosit. 9. Tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan ion dalam plasma. EDTA cenderung mengikat ion-ion positif.
2.4 SITRAT
Tersedia dalam bentuk trisodium sitrat dihidrat 3,2% dan 3,8%. Selain itu, sitrat juga dapat dicampur dengan dextrose menjadi ACD ( acid citrate dextrose) dextrose) atau CPD (citrate (citrate phosphate dextrose). dextrose).
4
Bentuk trisodium sitrat 3,2% direkomendasikan oleh ICSH, International Society for Trombosis and Hemostasis, Hemostasis , dan CAP (College ( College of American Pathologist ) untuk pengujian koagulasi dan agregasi trombosit serta morfologi
6
trombosit. Perbandingan yang digunakan adalah 1 bagian sitrat 3,2% dalam 9 bagian darah. 1,4 Trisodium sitrat 3,8% digunakan untuk pemeriksaan LED cara westergren dengan perbandingan 1 bagian sitrat dalam 4 bagian darah.
4,5
larutan ini
digunakan karena nilai referensi sebagai standard pemeriksaan dibuat berdasarkan darah yang terdilusi. 9 ACD adalah antikoagulan pilihan untuk darah transfusi.
4,5
Namun kemudian
dikembangkan lagi dalam bentuk CPDA (citrate ( citrate phosphate dextrose adenine). adenine). 5 Mekanisme kerjanya dengan membentuk garam kalsium sitrat yang tidak larut. 4 Ikatan sitrat dengan kalsium merupakan ikatan ionik yang tidak stabil. 1 Gambar
Garam sitrat
2.
Reaksi
+
pengikatan
3Ca++
ion
Ca3sitrat
Beberapa kekurangan antikoagulan sitrat, yaitu:
kalsium
+
3H+ +
oleh
sitrat
3ion garamnya
1,4,5
1. Mengganggu hasil pemeriksaan kimia.
Pemeriksaan sodium: hasil akan meningkat palsu karena tingginya kadar sodium dalam garam trisodium sitrat.
Pemeriksaan ion kalsium: hasil akan sangat rendah palsu karena ion kalsium diikat oleh sitrat.
Pemeriksaan kimia lain: hasil akan lebih rendah dari yang sebenarnya, karena efek dilusi dari cairan sitrat.
7
2. Hanya bertahan beberapa jam. 3. Cenderung menyebabkan ukuran sel mengecil. 4. Umumnya tidak digunakan untuk hitung sel, karena darah yang digunakan sudah diencerkan.
2.5 HEPARIN
Heparin merupakan antikoagulan alami dalam tubuh manusia. Ditemukan di hati, basofil, dan sel mast. Antikoagulan heparin tersedia dalam bentuk cairan maupun sediaan kering, yaitu bentuk garamnya dengan sodium, kalsium, ammonium, dan litium.
4
Mekanisme kerja heparin adalah dengan menghambat pembentukan atau aktivitas trombin dan faktor-faktor pembekuan (IX, X, XI, XII).
2,4
Konsentrasi optimum sebagai antikoagulan adalah 0,1-0,2 mg/ml darah.
4,5
Heparin merupakan antikoagulan pilihan untuk pemeriksaan PH darah dan analisa gas darah untuk keseimbangan asam-basa.
4,5
Hal ini karena heparin relatif
tidak mempengaruhi PH. Sedangkan antikoagulan lain (misalnya EDTA dan sitrat) dapat menurunkan PH karena sifatnya yang sedikit asam. 10 Heparin tidak merubah volume SDM, bahkan dalam jumlah yang berlebihan, sehingga cocok untuk pemeriksaan fragilitas osmotik dan imunofenotiping. Antikoagulan ini juga dapat digunakan untuk pemeriksaan enzim SDM seperti G6PD dan PK.
1,4,5
Beberapa kekurangan heparin, yaitu:
1,4,5,7
1. Menyebabkan clumping leukosit dan trombosit, sehingga tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan hitung sel. 2. Mengganggu hasil pewarnaan leukosit. 3. Merupakan antikoagulan yang paling mahal. 4. Darah akan beku dalam 8-12 jam, karena heparin bukan mencegah pembekuan, melainkan menunda pembekuan. pembekuan. 5. Tidak cocok untuk pemeriksaan aglutinasi dan koagulasi maupun determinasi fibrinogen plasma.
8
6. Pada pemeriksaan kimia, hasil-hasil tertentu akan dipengaruhi (sesuai dengan bentuk garam heparin), yang memberikan memberikan hasil tinggi yang palsu. 7. Tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan PCR karena heparin menghambat aktivitas enzim.
2.6 NATRIUM FLUORIDA
Natrium fluorida (NaF) mempunyai peran sebagai antikoagulan (namun merupakan antikoagulan yang lemah) dan antiglikolitik. NaF cocok untuk pemeriksaan gula darah karena menghambat enzim glikolitik. 4,5 Sebagai antikoagulan, dua molekul NaF akan berikatan dengan satu ion kalsium membentuk CaF 2 dan melepaskan dua ion Na +. Sedangkan sebagai antiglikolisis, NaF bekerja dengan menghambat enzim enolase dalam jalur glikolitik.11 Konsentrasi fluorida yang digunakan adalah 2,5 mg per ml darah. 11 Beberapa kekurangan NaF, yaitu: 4 1. Beracun. 2. Tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan alkalin fosfatase, amilase, dan asam urat karena NaF menghambat kerja enzim.
9
BAB III SIMPULAN
Untuk mendapatkan hasil pemeriksaan laboratorium yang bermutu, sangatlah penting untuk menggunakan menggunakan antikoagulan yang tepat. Hingga saat ini, belum ada antikoagulan yang ideal untuk semua jenis pemeriksaan laboratorium, sehingga perlu diketahui kelebihan dan kekurangan masing-masing antikogulan untuk masing-masing jenis pemeriksaan yang diperlukan.
10
DAFTAR PUSTAKA
1. Ochei J, Kolhatkar A. Medical Laboratory Science, Theory and Practice. 1st ed. New Delhi: Tata McGraw-Hill Publishing Company Limited; 2000. 2. Tahono, Sidharta BRA, Pramudianti MID. (eds). Buku Ajar Phlebotomy. Surakarta: Sebelas Maret University Press; 2012. 3. Sood R. Text Book of Medical Laboratory Technology. New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd; 2006. 4. Anonym. Anticoagulants. Available from URL: http://compepid.tuskegee.edu/syllabi/pathobiology/pathology/clinpath/cha pter1.html.. pter1.html 5. Nayak R, et al. Essentials in : Hematology & Clinical Pathology. 1st ed. New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd; 2012. 6. Bain JB, et al. Dacie and Lewis: Practical Haematology. 11th ed. Churchill Livingstone: Elsevier; 2012. 7. Banfi G, et al. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 2007;45(5):565-76. Available from URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17484616.. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17484616 8. Garza D, McBride KB. 6th ed. Phlebotomy Handbook. New Jersey: Pearson Education Inc; 2002. 9. Jou JM, et al. ICSH review of The Measurement of The Erytrocyte Sedimentation Rate. International Journal of Laboratory Hematology. 2010. Available from URL : http://www.islh.org/web/downloads/ICSH_Standards/Sed%20Rate%20IJL H%202011.pdf . 10. Sood P, et al. interpretation of Arterial Blood Gas. Indian Journal of Critical Care Medicine. 2010:14(2):57-64. Available from URL: http://www.ijccm.org/article.asp?issn=09725229;year=2010;volume=14;issue=2;spage=57;epage=64;aulast=Sood.. 5229;year=2010;volume=14;issue=2;spage=57;epage=64;aulast=Sood 11. Guder WG, et al. 3 rd revised ed. Samples: From the Patient to the Laboratory. Germany: wiley-VCH verlag gmbh & co; 2003.
11
