10. Tehnici cromatografice METODE DE CHIMIE ANALITICA APLICATE IN CERCETAREA CRIMINALISTICA
MASTER: CRIMINALISTICA ANUL UNIVERSITAR UNIVERSITAR 2012-2013 2012-2013 SEMESTRUL II Conf. Dr. Cecilia ARSENE/ ARSENE/ Conf. Dr. Romeo Romeo Iulian OLARIU FACULTATEA DE CHIMIE LABORATORUL DE CHIMIE ANALITICA 1
Aspe As pect cte e ge gene nera rale le
botanistul rus Mikhail Semanovich Tswett „părinte intele le”” crom cromat atog ogrrafie afiei,i, prin prin studi tudiul ul fenomenului de adsorbţie în coloane cu umplutur ă, dezvoltat în jurul anilor 1900 pe o coloană împachetată, cercetătorul sepa epara extr extra acte cte din din pigm pigmen enţii frunzelor, precum clorofila şi xantofil spiriloxantina separa „carotenul” (zonă galben roşie), xantofilul (zonă galbenă) (carotinoida oxigenată la C40) şi clorofila (zonă verde) pe o coloană umplută cu inulină (C6H10O5H2O, o polizaharidă solubilă, alcătuită din grupări fructoză, ce apare în diferite plante ca rezervă de hrană)
Mikhail Semano Mikhail Semanovich vich Tswet Tswettt, (1872–1919), parintele cromatografiei
foloseste foloseste ligroin ligroin ca solvent solvent (un amestec amestec de hidrocarburi cu p.f. 70-120 °C) cromatografie (grecescul „chroma” pentru culoare şi „graphein” pentru pentru sc scrie riere) re)
2
Aspe As pect cte e ge gene nera rale le
pas important înregistrat în 1931 când Kuhn (laureat al premiului Nobel în 1938) şi Lederer au separat în scop preparativ carotenul din morcovi (morcovi roşii) în două hidrocarburi alfa şi beta caroten (C40H56), prin adsorb ţie pe coloane umplute cu oxid de aluminiu
alfa-caroten
beta-caroten
în aceeaşi perioadă, Winterstein separa pe o coloan ă cu umplutur ă de CaCO3 (cu diametru de 7 cm) dou ă xantofile, violaxantina (pigment xantofilic de culoare portocalie care protejeaz ă plantele de eventualele distrugeri foto-oxidative) şi luteina (carotenoid natural cu ac ţiune antioxidantă)
luteina
violaxantina
3
Aspecte generale
1903 Tswett: Fenomenul de adsorb ţie în coloană cu umplutur ă 1931 Kuhn, Lederer, Winterstein: Primele separ ări semnificative din punct de vedere preparativ
1937 Tiselius: Electroforeza solu ţiilor libere într-un tub
1938 Izmailov, Shraiber: Cromatografia în strat sub ţire (TLC)
1941 Martin, Synge: Cromatografia de partitie/repartiţie (liquid chromatography, LC)
1944 Consden, Gordon, Martin: Cromatografia pe hârtie (planar chromatography, PC) 1949 Spedding, Tompkins: Cromatografie de schimb ionic (ionic exchange chromatography, IEC)
1952 James, Martin: Cromatografia de gaze (gas chromatography, GC)
1957 Galay: Cromatografia de gaze cu coloane capilare (CGC)
1959 Parath, Fladin: Gel cromatografia - gel filtrarea
1966 Piel: Cromatografia de lichide de înalt ă performanţă (high performance (pressure) liquid chromatography, HPLC) 1969 Klesper: Cromatografia de fluide supercritice (supercritical fluid chromatography, SFC) 1981 Nakagawa: Cromatografia electrocinetic ă
4
Aspecte generale
In 1952, A.J.P. Martin si R.L.M. Synge au primit premiul Nobel pentru cercetările lor in descoperirea cromatografiei de partiţie
Synge spunea
“While still at school I heard tell of the science of biochemistry, which should draw together two aspects of nature into a common study. I had long been fascinated by living things (particularlly the
wilde plants) and more recently by chemistry”.
5
Aspecte generale Clasificare funcţie de natura fazelor implicate în procesele cromatografice Clasificare generală
Metoda specifică
Faza staţionar ă
Cromatografia de lichide (faza mobilă lichid)
Lichid-lichid sau parti ţie
Lichid adsorbit pe un Parti ţie/reparti ţie/distribuţ ie solid între lichide nemiscibile Specii organice legate la Parti ţie/reparti ţie/distribuţ ie o suprafa ţă solidă între lichid ş i suprafaţa legată Solid Adsorbţ ie
Fază cu lichid legat Lichid solid sau adsorbţie Schimb ionic Excluziunea mă rimii
Cromatografie de gaz (faza mobilă gaz)
Gaz lichid Fază cu gaz legat Gaz solid
Cromatografia cu fluide supercritice
Tipul de echilibru
Răş ini schimbătoare de Schimb ionic ioni Lichid în intersti ţiile unui Parti ţie/reparti ţie/distribuţ ie polimer solid Lichid adsorbit pe un Parti ţie/reparti ţie/distribuţ ie solid între gaz şi lichid Specii organice legate la Parti ţie/reparti ţie/distribuţ ie o suprafa ţă solidă între lichid ş i suprafaţa legată Solid Adsorb ţ ie Specii organice legate la Parti ţie/reparti ţie/distribuţ ie o suprafa ţă solidă între fluidul supercritic şi suprafaţ a legată 6
Distributia solutului (analitului) între două faze
Distribuţia solutului (analitului) între faze concept de bază în cromatografie Dezvoltarea conceptelor termodinamice care guvernează separarea cromatografică are la bază folosirea noţiunilor de
fază staţionar ă (sa fie sub formă de solid
sau gel)
fază mobilă (să fie lichid)
Existenta celei de-a treia faze care contine ANALITUL (SOLUT)
Inceperea procesului de partitie/distributie a analitului intre fazele mobila si stationara
analit analit Faza I (stationara)
Faza I (mobila)
Distribuţia analitului între fazele aflate în contact.
7
Procesul de distributie a solutului/analitului
Faza mobila
uB
u A
Spre detector
(u) B Injectie A + B
A
u - viteza liniara a fazei mobile
Solutul i (A sau B) se distribuie intre faze
i M iS
Elutia solutilor tr,A < tr,B Faza mobila Faza stationara 8
Distributia solutului (analitului) între două faze Coeficient de distribuţie (partiţie/reparti ţie) notat KD
K D = C S CM CS denotă concentraţiile solutului în faza staţionar ă CM concentraţiile solutului în faza mobilă La distribuţia solutului determinată pe criterii statistice KD are intotdeauna valoare unitar ă
Procesul este însoţit (biased) de procesele chimice suplimentare ale celor două faze şi, din acest motiv, KD este diferit de valoare 1 Pentru sistemele în care solutul are afinitate mare pentru faza staţionar ă, KD poate avea valori mari (KD >1) Pentru sistemele în care solutul prefer ă faza mobilă, KD ia valori foarte mici (KD < 1)) 9
Separarea cromatografică a solutului (analitului) Echilibrul - timpul mediu petrecut de o moleculă de solut în una din cele două faze
Analiţii A şi B, caracterizaţi de KDA < KDB, analitul A faţă de B va petrece o fracţie mai mică a timpului în faza staţionar ă Ambii analiţi eluează din coloană şi funcţie de viteza de deplasare din faza staţionar ă se pot obţine separ ări par ţiale sau picuri suprapuse Faza mobila Zona pentru B Zona pentru A
A
B
Timp sau Volum D
Separarea cromatografică a două specii A şi B. KDB > KDA ş i de aceea B este eluat cu întârzâiere faţă de A.
10
Tipuri de izoterme si forma picurilor în cromatografie
Procesul de separare cromatografică - echilibre interfazice sucesive Valorile lui KD - estimate cu uşurinţă atunci când se cunosc coeficienţii de activitate pentru un domeniu larg de concentraţii al analitului în ambele faze Idealitatea atribuita din izotermele de distribuţie valabile
Izotermele de distribuţie caracterizează procesul de separare şi descriu modul în care coeficientul de distribuţie KD (CS/CM) variază la echilibru
11
Tipuri de izoterme si forma picurilor în cromatografie - funcţia care raportează concentraţiile mult multic icom ompo pone nent nt într între e dou două faze la temperatur ă constantă Izoterma
sistem
(coloana comportarea ideală liniara cromatografică str ăbătută cu o viteză independentă de concentraţia analitului in ce cele
B
doua doua faze faze;; KD = 1)
A
izot iz oter erme me ne neli lini niar are e de tip tip c con onve vex x sau sau co conc ncav av (constanta de distribuţie depinde de concentraţia solutului în faza mobilă) izot iz oter erme mele le neli nelini niar are e co conv nvex exe: e: viteza de str ăbatere a co coloa loanei mai mare la la co concentraţii
mici (KD > 1)
unui
izotermele neliniare concave: viteza este mai mică la concentraţii mici (KD < 1)
C Concentratia in faza mobila
Tipu Tipuri ri de izoter izoterme me pent pentru ru distribuţia unei specii între două faze.
12
Tipuri de izoterme si forma picurilor în cromatografie La eluţia unui amestec de componenţi ce prezintă mobilităţi cromatografice apropiate şi izoterme de distribuţie curbe (convexe) apar dificultăţi comparativ cu un amestec ce prezintă izoterme liniare Dificultăţi:
- dispersie dispersie mai mare mare a zonelor cromato cromatografi grafice ce - suprap suprapune unerea rea par ţială a zonelor - lărgirea exagerată a benzilor (anvelopare)
A
Distanta
B
Distanta
C
Distanta
Picuri distorsionate. Profilul concentra ţiei unui analit de-a lungul coloanei funcţie de distanţa parcursă de la intarea în coloan ă. A, profil pentru K D constant. B, profil pentru izoterma de tip B. C, profil pentru izoterma de tip C.
13
Distribuţia benzilor cromatografice. L ărgirea benzilor cromatografice
Lăţire ire sau sau lar largir girea pic picuril urilo or - pr proc oces es in inev evit itab abil il în cr crom omat atog ogra rafi fie e
atunci ci când când se are are în vede vedere re sepa separa rare rea a unor unor picu picuri ri mult multip iple le De nedorit atun
Picu Pi curi rile le ob obli lice ce su sunt nt ne nedo dori rite te
Cu câ cât izoterma este mai convex ă (concavă), cu atât efectul va fi mai pronun ţat şi mai dăunător Exa Examina inarea picu picurrilo ilor dintr intr-o -o cro cromatog atogra ram m ă reliefează similarităţi cu o curbă de distribuţie Ga Gaus ussi sian ană
Cmax
0,607C max 0,5Cmax
2σ w1/2
w
Diverse metode de a determina devia ţia standard din curba Gaussiana: w1/2=2,354σ; w=4σ.
14
Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogram ă tR
Profilul unei cromatograme obţinută prin reprezentarea grafică a dependenţei semnalului înregistrat func ţie de timpul de înregistrare a cromatogramei w – latimea picului la baza
tM W 0 0
Timp
Parametrii cantitativi înălţimea picului (h) aria picului cromatografic (A) iar
Parametrii calitativi timpii de retenţie (tR = L/v unde L este lungimea coloanei şi v este viteza de elu ţie a unui component) volumele de reten ţie
Timpul mort, tM, este timpul necesar eluentului sau unui component nereţinut de faza staţionar ă să ajungă la detector Timpul de reţinere, tR, reprezintă timpul necesar componenţilor să ajungă la detector
15
Informaţii ce se pot obţine dintr-o cromatogram ă
Alţi parametri specifici separ ărilor cromatografice includ eficienţa şi selectivitatea coloanelor cromatografice care se determină în funcţie de: N – numărul talerelor teoretice H - înălţimea unui taler teoretic α – factorul de selectivitate N, H sunt mărimi caracteristice zonelor cromatografice
N = L/H H are semnificaţia unei lungimi din coloană, pe care se realizează echilibrul complet al componenţilor în cele două faze Estimarea lui H se poate face din:
teoria talerelor teoretice: H = L/N
din teoria cinetică:
H = A +
B
H
dispersiei
+ C⋅u
u A, B, C – constante u – viteza liniar ă de deplasare a fazei mobile sau eluentului A – contribuţia difuziei turbulente (Eddy difussion) B – contribuţia difuziei moleculare longitudinale C – contribuţia transferului de mas ă între faze
L
Tratarea ipotetică a unei coloane.
16
Overview pentru parametrii cu care se operează A faza mobila ↔ A faza stationara
Coeficientul de parti ţ ie C KD = S CM
Timpul de retenţ ie
parametrul calitativ care redă timpul necesar după efectuarea injecţiei pentru ca picul analitului să ajungă la detector (tR) Timpul mort (aferent noţiunii de void volume) timpul necesar speciilor nereţinute de coloană să ajungă la detector (tM) Viteza liniar ă medie v (deplasarea analitilor)
v=
Viteza liniar ă medie u (deplasarea moleculelor fazei mobile) u =
L tR L tM
L - lungimea coloanei 17
Overview pentru parametrii cu care se operează
Factorul de capacitate k A’
parametru important folosit pentru descrierea vitezelor de migrare a anali ţilor prin coloană funcţie de tipul cromatografiei implicate, de adsorb ţie, de schimb ionic, de excluziune sterică, factorul a fost denumit coeficient de adsorbţie, de distribuţie ionică, respectiv de difuziune. pentru o specie oarecare A, factorul de capacitate k A’ definit prin relaţia: K V k A' = A S VM 1 C M VM 1 1 = × v u v = u× = u× = u× 1 + k A' C M VM + C S VS 1 + C S VS / C M VM 1 + KVS / VM
factor de capacitate mare indic ă o reţinere mai puternică în coloană a unui component cuprinşi între 1 şi 5 L L 1 = × tR t M 1 + k A'
k A' =
tR − tM tM
k’ k’
=0 =1
18
Overview pentru parametrii cu care se operează
Factorul de separare (selectivitate) α descrie diferenţele ce apar între vitezele de migrare specifice componen ţilor trebuie să fie întotdeauna mai mare decât 1 este definit prin raportul dintre coeficientul de parti ţie dintre componenta mai puternic reţinută (B) şi coeficientul de partiţie pentru specia mai puţin reţinută sau mai rapid eluată (A)
α =
KB K A
k A' =
K A VS VM
α =
k B' k A'
k A' =
tR − tM tM
α=
t R(B) − t M t R(A) − t M 19
Overview pentru parametrii cu care se operează
Rezolu ţi a (R)
termenul cel mai adesea utilizat 2(V2 − V1 ) 2 t R 2 − t R 1 = R= pentru a descrie calitatea separ ării w1 + w 2 w1 + w 2 cromatografice furnizează o măsur ă cantitativă a capacităţii sale de a separa doi analiţi V1 si V2 sunt volumele de eluent folosite pentru eluţia a doi analiţi adiacenţi w1 si w2 sunt lăţimile picurilor la bază, determinate prin trasarea tangentelor la punctele de inflexiune ale picurilor (∆Z = tR2 – tR1)
RS =
∆Z
W A /2 + WB /2
=
2[(t R )B − (t R ) A ] 2 ⋅ ∆Z = W A + WB W A + WB
V1
V2
W1
W2
Rezoluţia la separarea a doi analiţi printr-o coloană cromatografică.
20
Rezolutie si eficienta in separarile cromatografice
Eficienta scazuta Rezolutie slaba
Eficienta crescuta Rezolutie buna
Picurile sunt rezolvate in totalitate atunci cand nu se suprapun Eficienta este o masura a capacitatii coloanei de a rezolva intre doua picuri 21
Rezolutie si suprapunerea picurilor
Rs
=
∆t
R
w
( t ) − ( t ) = 0.5 ( w + w ) R
R
B
A
A
B
Rezolutie Rs ≥ 1.5
Rezolutii ≥ 0.8 sunt necesare pentru a obtine arii de incredere ale picurilor cromatografice
22
Migrarea solutilor si largirea benzilor
Odata cu migrarea solutilor prin coloana • are loc separarea • intervine efectul de largire a benzilor cromatografice
Daca efectul de largire este marcant, este posibil ca separarea sa nu aiba loc. De aceea, efectul de largire trebuie minimizat. 23
Eficienta coloanei sau inaltimea unui taler, H Dispersia pe unitatea de lungime Dispersare: Imprastiere. Deviatia standard (σ) este o masura a dispersiei
e l u c e l o m r a m u N
Profilul analitului la sfarsitul coloanei
Inaltimea unui taler 2
H
=
σ
L
Distanta migrata Umplutura
Proba in
Detector
Pentru a minimiza efectul de largire • minimizarea dispersiei ( σ) • minimizarea lui H 24
Calculul numarului de talere si a inaltimii unui taler
Punct de inflexiune
t ⎞ ⎛ N = 16 ⎜ ⎟ ⎝ w⎠ r
t r si w
2
H =
L N
trebuie sa aiba aceleasi unitati (timp sau distanta) 25
Teorii care guverneaza separarile cromatografice
Teoria talerelor
Teoria cinetică
Eficienţa coloanelor cromatografice creşte odată cu creşterea numărului talerelor şi odată cu scăderea înălţimii talerului Eficienţa, în termeni de num ăr de talere, poate varia de la câteva sute la câteva sute de mii, în timp ce, în ălţimea unui taler poate varia de la câteva zeci la o mie µm, sau chiar dimensiuni mai mici.
26
Teoria talerelor
Nu reprezintă o teorie cromatografic ă propriu-zisă Este mai mult o adaptare analogică pentru procesul cromatografic A fost dezvoltată de către Martin si Synge faza mobila faza stationara
0
1
2
3
n
Sistemul anterior prezentat include o serie de talere pe parcursul c ărora conţinutul fazei mobile din talerul 0 este transferat în talerul 1, ulterior 2, în timp ce con ţinutul corespunz ător fazei staţionare r ămâne stabil. Se poate considera o molecul ă care se află în talerul 0. După echilibrare, faza mobil ă din talerul 0 este transferat ă în talerul 1 cu o probabilitate p. În alte cuvinte, se poate spune c ă un transfer va permite deplasarea moleculei printr-un num ăr de p talere astfel încât, num ărul etapei (M) în care molecula se află cu cea mai mare probabilitate dup ă un număr de r transferuri va fi dat de rela ţia M = r×p. Pentru un număr mare de molecule, talerul M este talerul în care concentra ţia moleculelor va fi maxim ă. Limitari ale teoriei talerelor: are capacitate redusă de a prezice valori reale poate oferi o rela ţie de legătur ă credibilă între lărgimea benzii şi lungimea acesteia nu poate furniza o modalitate de prezicere a mărimii dispersiei nu pot fi prezise efectele modific ării unor variabile cum ar fi debitul sau dimensiunea particulei, întrucât nu se ţine cont de aceşti factori Avantaj - simplitatea abordării
27
Teoria cinetică şi variabile cinetice care afecteaz ă lărgirea benzilor
Cauze care conduc la largirea benzilor: echilibrul de distribuţie al solutului între faze nu se stabileşte instantaneu în toate punctele coloanei apar modificări în structura solidelor din faza staţionar ă datorită diferenţelor dintre faza mobilă şi faza staţionar ă curgerea fazei mobilă are loc în mod întâmplător prin canale de lungimi diferite şi direcţii diferite antrenând moleculele de solut cu viteze diferite (proprii cromatogramelor ideale) faza staţionar ă solidă reţine o parte din faza mobilă care r ămâne fixată în micropori, participând în final la procesul de separare distribuţia fazei staţionare lichide sub formă de filme neuniforme în jurul granulelor de suport (solid inert)
Eficienţa unei coloane cromatografice poate fi aproximat ă de expresia H = B/u + Csu +CMu (ecuaţia lui Van Deemter)
Eficienţa coloanei controlata prin:
diametrul particulelor umpluturii
diametrul coloanei
Contribuţiile coeficienţilor transferului de masă la înălţimea talerelor, H.
H CSu
CMu B/u Viteza liniara a fazei mobile, u, cm s
-1
28
Cromatogr af af ia ia
Tipuri de cromatografii dupa natura fazelor mobila si stationara 1. Cromatografia lichid-lichid
2. Cromatografia lichid-solid
3. Cromatografia gaz-lichid/gaz-solid
29
Cromatogr af af ia ia
Cromatografia lichid-lichid Faza stationara: lichid Faza mobila: lichid
Tehnici: 1. Cromatografia pe hartie
30
Cromatogr af af ia ia
Cromatografia solid-lichid Faza stationara: solid Faza mobila: lichid
Tehnici: 1. Cromatografia pe coloana 2. Cromatografia in strat subtire (TLC) 3. Cromatografia secventiala pe coloana 4. Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
31
Cromatogr af af ia ia
Cromatografia gaz-lichid Cromatografia gaz-lichid
Faza stationara: lichid/solid Faza mobila: gaz
Tehnici: 1. Cromatografia de gaze
32
Cromatogr af af ia ia Adsorbenti utilizati in cromatografie
Actiunea selectiva a unui adsorbent se datoreaza atractiilor intermoleculare de tipul:
fortelor Van der Waals
atractiilor dipol-dipol
legaturilor de hidrogen
interactiilor de coordinare
formarii de saruri
33
Cromatogr af af ia ia Interacţii intre moleculele analitului ş i fazele mobilă şi staţionar ă
Interacţii Van der Waals
Interacţii dipol-dipol
Legături de hidrogen Legături de hidrogen 34
Cromatogr af af ia ia Interacţii intre moleculele analitului ş i fazele mobilă şi staţionar ă
Legătura covalentă (formare de saruri) reprezintă cea mai puternică interacţie molecular ă (200-800 kJ/mol) este de dorit ca aceasta să nu intervină în procesele cromatografice deoarece poate conduce la absorbţii ireversibile
Interacţiile ionice interactiile dintre doi ioni de sarcină opusă prezintă de asemenea o tărie crescută (40-400 kJ/mol)
Interactiuni tip dipol-dipol sau dipol-dipol indus sunt interactii slabe cu rază medie de acţiune
For ţele Van der Waals caracterizate ca interacţiuni de rază redusă între dipoli permanenţi sau induşi într-o altă moleculă alăturată, dar şi for ţe dispersive între moleculele neutre
35
Cromatogr af af ia ia Adsorbenti uzuali folositi in cromatografia pe coloana
Cresterea puterii de adsorbtie pentru molecule polare
Alumina Carbune activat Silicat de magneziu Silica gel Carbonati anorganici Celuloza, sucroza
In general, 20-30 g de adsorbent pe gram de proba Inaltimea coloanei ar trebui sa fie de cel putin 10 ori diametrul sau
36
Cromatogr af af ia ia Cel mai des utilizate solide: Silica gel sau acid silicic Alumina Al2O3·xH2O
δ-
R
δ+
Al
C
O
R
R
Si O
R
Si O
O
O δ+
SiO2·xH2O
δ−
dipol-dipol
δ-
O
RO
O H
OH
OH
HO
R
Si O
R
O R
O
δ+
Al
O
δ+
legaturi de H 37
Cromatogr af af ia ia
O
+ δ-O δAl
δ-
O δ-
R N H2 interactii de coordinare
+ O H O
Al
RCOO
-
O formare de saruri
Taria interactiilor pe silice sau alumina: formare de saruri > legaturi de H > dipol-dipol > Van der Waals
38
Cromatogr af af ia ia
Ordinea de elutie asteptata a claselor de compusi organici
rapid
Numele clasei
Formula generala
alcani alchene eteri hidrocarburi halogenate
RH R2C CR2 R2O RX
hidrocarburi aromatice cresterea polaritatii
lent
CH3 , etc
aldehide si cetone
RCH O and R2C O
esteri alcooli amine
O RCOR ROH RNH2, R2NH, R3N
acizi carboxilici
O RCOH 39
Cromatogr af af ia ia
Solventii utilizati in separarile cromatografice
Solventii sunt compusi organici Actiunea unui solvent, sau a unei serii de solventi, poate fi utilizata pentru a realiza o separare Polaritatea solventului nu trebuie modificata rapid
40
Cromatogr af af ia ia Solventi utilizati in cromatografia pe coloana
creste polaritatea
Nume
Structura
alcani (eter de petrol hexan) benzen toluen hidrocarburi halogenate (diclorometan, cloroform) dietil eter
C6H6 C6H5CH3 CH 2Cl2, CHCl3 (CH3CH2)2O O
etil acetat acetona alcooli
CH3COCH2CH3 (CH3)2C O CH3OH,CH3CH2OH O
acid acetic
CH3 COH
41
Cromatografia planara
Cromatografia pe hartie
Cromatografia in strat subtire
42
Cromatografia pe hârtie (paper chromatography, PC)
bazata pe distribuirea/repartizarea diferenţiată a componenţilor amestecului de separat între două faze
una staţionar ă lichidă (apa sau un alt electrolit fixat pe hârtia cromatografică)
o fază mobilă care poate fi un solvent organic sau un amestec de solvenţi
folosită la separarea coloranţilor, separarea aminoacizilor şi peptidelor, analiza hidraţilor de C, studiul diverselor substanţe organice (acizi graşi), etc funcţia de separare/distributie, in cazul repartiţiei solutului între două faze lichide, devine echivalent cu coeficientul de distribuţie dat de raportul D =
CS CM
43
Cromatografia pe hârtie Funcţie de sensul de migrare a fazei mobile de-a lungul fazei staţionare
cromatografia descendentă – faza mobilă migreaz ă în sensul for ţelor de gravitaţie
cromatografia ascendentă – faza mobilă migreaz ă prin for ţe capilare în sens invers
for ţei de gravitaţie
cromatografia radială, circular ă sau pe discuri – faza mobil ă migrează din centrul
discului de hârtie de filtru în direc ţie radială
Funcţie de numărul de coordonate faţă de care se face separarea
cromatografie unidimensională (migrare pe o singur ă direcţie folosind un solvent s-au
amestec de solvenţi unici)
cromatografie bidimensională (migrarea se realizeaz ă pe două direcţii, în acelaşi
amestec de solventi în ambele direc ţii sau, mai performant, în amestecuri diferite se solvenţi pentru fiecare direcţie)
44
Cromatografia pe hârtie
principalul material folosit este hârtia cromatografică poate fi o hârtie de filtru obişnuită sau o hârtie de filtru cu o serie de caracteristici de puritate, porozitate, granulaţie, omogenitate, rezistenţă mică, stabilitate mare in general hârtia cromatografică conţine
o cantitate mică de grupe carboxilice care determină o încărcare negativă a celulozei în soluţii apoase ş i eventuale proprietăţi de schimb de ioni substanţe lipofile care pot stânjeni determinarea substanţelor cu Rf ridicat ioni de Mg2+, Co 2+, Cu 2+, Fe 3+ în propor ţiile 0,04 – 0,07 % ceea ce conduce la o serie de erori în separare
H
H
OH
OH
H
O
H
H
O CH2OH celuloza
m
H
OH
OH
H
O
H O CH2OCOCH3
celuloza monoacetat
m
45
Cromatografia in strat subtire Una dintre cele mai populare metode de analiza Avantaje
1. Usor de utilizat 2. Gama larga de aplicatii la un numar mare de probe 3. Sensibilitate ridicata 4. Viteza la separare 5. Cost relativ scazut Tehnica analitica calitativa utila in:
1. Verificarea puritatii unui compus 2. Determinarea numarului de componenti dintr-un amestec 3. Identificarea solventului potrivit pentru cromatografie 4. Verificarea initiala a identitatii unui compus necunoscut 46
Cromatografia în strat sub ţire
are drept scop separarea şi concentrarea cantităţilor mici de substanţă din amestecuri complexe
bazele tehniciii TLC au fost puse de Izmailov şi Schreider (1939) care au folosit extracte de plante medicinale, iar ca suport Al2O3 zece ani mai târziu Mainhard şi Hall au folosit această tehnică pentru separarea unor ioni anorganici folosind ca adsorbant alumina, ca liant amidonul iar ca suport solid lamele de microscop mai târziu Kelles (1951) foloseşte ca suport silicagelul, iar ca liant ipsosul
47
Adorbenţi folosiţi în TLC
Condiţii pentru adsorbent:
să nu reacţioneze cu substanţa de separat, cu solvenţii sau cu reactivii folosiţi pentru vizualizarea spoturilor
să fie rezistenţi la temperaturi înalte
să aibă o suprafaţă activă şi specifică
să aibă o granulaţie cât mai fină şi un număr mare de pori cu diametru mic şi controlat (de aceeaşi dimensiune).
Adsorbenţi
geluri de silice cum ar fi silicagel G care este un silicagel cu liant (ipsos), silicagel cu indicator de fluorescenţă adsorbenţi anorganici de tipul aluminei (Al2O3)
48
Adorbenţi folosiţi în TLC
+
SILICAGELUL
+
Si
adsorbentul cu cea mai larg ă utilizare (caracter
OH
Si -
O
polar, slab acid)
O
O
-
este produsul de policondensare a cidului orto-silicic OH
OH
Si
Si
Si
O H
a) legături
O
b) grupe silanolice hidratate ce pot apare într-
O
O
O
Si
o anumită propor ţie chiar după uscare. Se prefer ă această formă pentru compuşii polari deoarece are suprafaţă de contact
Si
mare.
O Si
CH3 Si OH
O
prin
aceste grupări.
H H
obţinute
dehidroxilarea unei anumite cantităţi din
Si O
H
siloxanice
Si OH
+ H3C
Si CH3
O- + H+
Si
OH
CH3 H N
Si
O
Si
Si
O CH3
O
O
Si
Si
Si
CH3
CH3 H3C
CH3 H3C CH3
CH3
H3C
O Si
Si O CH3
49
Adorbenţi folosiţi în TLC
ALUMINA
caracter bazic si mult mai reactiva decat silica gelul
după natura grupărilor funcţionale superficiale pe care le prezint ă alumina există trei tipuri de faze staţionare pe baza de alumina OH Al
OH O
Al O
Al O Na +
Al
O
O
Al O-Na+
Al
a) Alumină acidă b) Alumină neutr ă obţinută prin dehidroxilare c) Alumină bazică
50
Interactii si mecanisme de actiune în TLC Deplasarea analitilor are loc sub actiunea fortelor capilare. Compusi distincti se deplaseaza cu viteze diferite, functie de fortele intermoleculare dintre analit si faza stationara de silica gel si component si faza mobila. Faza stationara este SiO2 si este foarte “ polara”.
http://www.instructables.com/id/EW1YDCYF4REC0IU/
Este capabila de interactii puternice dipol-dipol and legaturi donor-acceptor de H cu “analitii . Analitii foarte polari interactioneaza mult mai puternic cu faza stationara si se deplaseaza foarte incet in directia vertical in sus de-a luncul placutei de TLC. Faza mobila folosita este mai putin polara (nepolara) si este capabila sa interactioneze cu analitii prin forte London puternice, sau prin interactii dipoldipol si legaturi de H. Analitii nepolari interactioneaza slab cu silica gelul polar si mult mai puternic cu faza mobila si se deplaseaza pe o distanta mai mare de-a lungul placutei TLC.
51
Interactii si mecanisme de actiune în TLC
Adsorbtia solutilor/analitilor
Intensitatea adsorbtiei compusilor creste cu cresterea polaritatii grupelor functionale, asa cum este aratat mai jos: -CH=CH2, -X, -OR, -CHO, -CO2R, -NR2, -NH2, -OH, -CONR2, -CO2H. (slab adsorbiti) (puternic adsorbiti) (nepolari) (mult mai polari)
52
Interactii si mecanisme de actiune în TLC
Puterea de elutie a fazei mobile (ε)
Puterea de elutie este considerata a fi echivalenta cu polaritatea . Puterea de elutie a unui solvent depinde de fortele intermoleculare dintre solvent si analiti si dintre analiti si faza stationara. Un solvent de elutie polar sau mai puternic polar va deplasa intr-o oarecare masura toti analitii fata de un solvent mai putin polar. De exemplu,
puterea de elutie a hexanului este foarte scazuta; ε = 0.01. puterea de elutie a acetatului de etil este ridicata; ε = 0.45 puterea de elutie a etanolului este foarte ridicata; ε = 0.68
53
Proprietatile solventilor si puterea de elutie Solvent
MF MW
o
Bp ( C) Density (g/mL)
Hazards*
Dipole
Hexane CH3(CH2)4CH3
C6H14 86.17
68.7 0.659
Flammable Toxic
0.08
Elution Stength ( ) 0.01
Toluene C6H5CH3
C7H8 92.13
110.6 0.867
Flammable Toxic
0.31
0.22
Diethyl ether CH3CH2OCH2CH3
C4H10O 74.12
34.6 0.713
Flammable Toxic, CNS Depressant
1.15
0.29
Dichloromethane CH2Cl2
CH2Cl2 84.94
39.8 1.326
Toxic, Irritant Cancer suspect
1.14
0.32
Ethyl Acetate CH3CO2CH2CH3
C4H8O2 88.10
77.1 0.901
Flammable Irritant
1.88
0.45
Acetone CH3COCH3
C3H6O 58.08
56.3 0.790
Flammable Irritant
2.69
0.43
Butanone CH3CH2COCH3
C4H8O
80.1 0.805
Flammable Irritant
2.76
0.39
72.10
1-Butanol CH3CH2CH2CH2OH
C4H10O 74.12
117.7 0.810
Flammable Irritant
1.75
0.47
Propanol CH3CH2CH2OH
C3H8O 60.09
82.3 0.785
Flammable Irritant
1.66
0.63
Ethanol CH3CH2OH
C2H6O 46.07
78.5 0.789
Flammable Irritant
1.70
0.68
Methanol CH3OH
CH4O 32.04
64.7 0.791
Flammable Toxic
1.7
0.73
Water HOH
H2O 18.02
100.0 0.998
1.87
>1
54
Solventi
Solventii se aleg functie de polaritatea compusilor Slab polari Eter de petrol Ciclohexan Toluen Cloroform Acetona Etanol
Puternic polar
Metanol
55
Dezvoltarea cromatogramei şi detecţia (localizarea) analiţilor pe cromatoplacă
Pentru separ ări se folosesc cromatoplaci activate (introducerea în etuv ă la o temperatur ă în jur de 100 oC, timp de 45 minute – 1 or ă) Pentru localizarea spoturilor (vizualizare) dup ă realizarea separ ării se pot folosi atât reactivi anorganici cât ş i organici Metodele de localizare a spoturilor pot fi sistematizate în orice caz dup ă cum urmează:
folosirea caracteristicilor de luminiscenţă a analitului (fenomenul de fluorescenţă pentru compuşi organici ş i fenomenul de fosforescenţă pentru compuşi anorganici) impregnarea stratului fazei staţionare cu o substanţă indicatoare fluorescentă (ca substanţe indicatori se pot folosi derivaţii de piren, fluoresceina, morina sau rodamina B) spray-ere cu un oxidant pouternic nespecific (HNO3, KMnO4, H 2SO4). Apar spoturi negre la oxidarea compyşilor organici spray-ere cu soluţii de reactivi specifici (ninhidrina pentru a vizualiza gruparea NH2 conform reactiei de mai jos)
O
O
C
OH C
C O ninhidrina
OH
O
C R-NH2
C
N
C O
O
produs albastru colorat
Formarea produsului colorat în albastru din reacţia dintre ninhidrină şi grupările NH2. 56
Vizualizarea
Metode destructive Pulverizarea placutei cu H2SO4, urmata de uscare la 110 ºC pentru 15-20 minute. Compusii vor fi distrusi dar toate spoturile vor fi vizibile Metode nedestructive – datorita utilizarii luminii UV
probele nu vor fi distruse. In orice caz, nu toate spoturile de pe placuta vor fi vizibile.
Lungimi de unda lungi UV Lungimi de unda scurte UV Vizualizare semi-destructiva
57
Definiţia şi metodele de calcul pentru factorul R f Rf – factor de retardare/intarzaiere/retentie
A= distanţa parcursă de solut B= distanţa parcursă de solvent
R f =
A B
Figura 5.1: Principiul determinării factorului Rf . 58
Valorile specifice factorului Rf
Valorile factorului Rf trebuie sa fie intre 0,0 si 1,0
daca valoarea este peste 0,0 sau mai mica decat 1,0, se considera ca exista o greseala de calcul
Daca valorile factorului Rf sunt mai mari de 0,8 sau mai mici de 0,2 valorile sunt greu de interpretat, ceea ce poate conduce la erori Valorile optime pentru Rf trebuie sa fie intre 0,3 si 0,6
59
Separarea unui amestec de ciclohexan pe o placuta TLC
butil
amina
si
Aspecte de avut in vedere: 1. Polaritatea fiecarui compus din amestec
Butil amina este polara; ciclohexanul este nepolar 2.
Polaritatea fazei stationare
3.
Silica gel (sau alumina) este polar – inseamna ca butil amina va interactiona cu faza stationara mult mai puternic Polaritatea fazei mobile - solventul: se determina ce solvent se foloseste H2 C
H2C H2C
Predictii:
Ciclohexanul va elua primul/mai rapid prin faza stationara Butil amina va elua ultima/mai incet
C H2
CH2
-
O +
Predictii la folosirea unei faze mobile nepolare:
CH2
-
N
+
O
Si
H
H Ciclohexanul si butil amina vor fi transportate de faza mobila Ciclohexanul va elua primul/mai rapid prin faza stationara Butil amina va elua ultima/mai incet deoarece interactionaeaza si cu silica gelul pe masura ce se deplaseaza
60
Separarea unui amestec de analgezice pe o placuta TLC Ac As C I Aspirin spot Spotul aspirinei
placuta TLC (etichetata) cu probele incarcate
Caffeine spot Spotul cafeinei
Spotul acetaminofenului Aceaminophen spot
PREZICETI ORDINEA ELUTIEI ACESTOR COMPUSI PE O PLACUTA De SILICAGEL FOLOSIND CA ELUENT…..
Spotul ibuprofenului Ibuprofen spot
pencil mark 1 cm Linia de baza la 1 cm de la from bottom
Niveluloffazei mobile depth mobile phase
partea inferioara
OH
O
CO2H O
H3C
CH3 O
Aspirin Aspirina
HN
CH3 N
N
O O CH3
Acetaminophen Acetaminofen
CO2H
Ibuprofen Ibuprofen
N
N
CH3
Caffeine Cafeina 61
Pros si cons pentru TLC
PROS
Sensibilitatea Viteza Costuri relativ scazute
CONS
Cantitati prea mici din probe Cantitati prea mari din probe Subiectiva
62
Cromatografia de lichide (faza mobila lichid, faza stationara solid)/clasificare dupa principiul de separare
Cromatografia de partiţie/repartiţie
cromatografie de repartiţie directă (cu faze normale – clasică) cromatografia de reparti ţie cu faze inversate – metoda preferat ă în prezent – pe care se realizează cele mai numeroase separ ări
Cromatografia prin schimb ionic
Cromatografia de afinitate
cromatografie de transfer cu schimb ionic clasic în procesul de baz ă din coloana cromatografic ă cromatografie prin perechi de ioni (substan ţe ionice sau ionizabile) foloseşte faze staţionare capabile să fixeze ioni de semn contrar (derivă din LC) afinitatea specifică a unor molecule cu alte molecule fixate pe suport
Cromatografia de excluziune
efectul indus de mărimea moleculelor, ceea ce înseamn ă că molecule de o anumită dimensiune nu pot intra în porii unui sorbent utilizat şi sunt excluşi în raport cu molecule de dimensiuni mai mici Principiul separ ării în cromatografia de adsorbţie (a), de partiţie (b), prin schimb ionic (c), de excluziune (d) şi prin electroforeză (e). ● semnifică un component mai puternic reţinut. 63
Chromatografia de lichide pe coloana Proba continand analiti/soluti
Faza mobila
Faza mobila
Separare in acord cu: -masa moleculara/marime -sarcina -hidrofobicitate -afinitate
Timp
1
2
3
4
5 64
Scopul cromatografiei de lichide de înaltă Cresterea polaritatii performanţă Solubili in apa
Insolubili in apa
Popularitatea metodei data de sensibilitate capacitatea de a fi adaptată la determinări cantitative acurate potrivită pentru separarea speciilor nevolatile sau instabile termic folosită în analiza amino acizilor, proteinelor, acizilor nucleici, hidrocarburilor, carbohidra ţilor, medicamentelor, terpenelor, pesticidelor, antibioticelor, steroizilor, speciilor organometalice, şi a unei varietăţi mari de substanţe anorganice
Ionici
Nepolari Polari neionici Partitie 102
Schimb ionic
Adsorbtie
Partitie cu faze Partitie normala inversate 103
104 Excluziune 105 Permeatie prin gel
Filtrare prin gel
106 65
Aplicaţiile cromatografiei de lichide.
Instrumente folosite în cromatografia de lichide de înaltă performanţă
Componentele unui cromatograf de lichide
Rezervor pentru mediul de eluţie conţinând solventul pentru faza mobil ă Coloana de separare în care materialul de umplutur ă este păstrat prin intermediul unor frite Seringă sau valvă de injecţie pentru introducerea probei Colector de fracţiuni prin intermediul căruia câţiva mL de eluat din coloană sunt colectaţi automat
Valvă partiţionare solvent
Amortizare pulsuri
Injector, tip “6 căi”
Pompă Pre-coloană
ă
n a o l o C
Rezervoare fază mobilă
Detector
Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern.
66
Faza mobila in cromatografia de lichide
conditii faza mobila
vâscozitate coborâtă capacitate de dizolvare a componen ţilor iner ţie fizico chimică asupra funcţionării coloanei şi detectorului
convex liniar concav
alegerea fazei mobile se face în concordanţă cu faza stationar ă,
tip scara
deoarece eluentul în LC nu reprezint ă un mediu inert precum gazul purtator din GC, depinzând de tipul interac ţiunilor componentelor separate cu faza sta ţionar ă din coloană
modalitati de operare
eluţie isocratică (faza mobile de
concentratie constanta pe parcursul achizitiei unei cromatograme) eluţia în gradient (faza mobila de concentratie variabila pe parcursul achizitiei unei cromatograme)
Timp Forme de distribuţie a gradientului pentru eluenţi combinaţi în regim binar din metanol şi apă.
67
Caracteristici faze mobile
Tăria relativa a celor mai comune faze mobile (monocomponente) utilizate în cromatografia de repartitie cu faze normale sau inversate. Faze normale
↓
Solventi ciclohexan n-hexan tetraclorur ă de carbon toluen dietil eter tetrahidrofuran etanol etil acetat dioxan metanol acetonitril apa
Index polaritate (P’) 0.04 0.1 1.6 2.4 2.8 4.0 4.3 4.4 4.8 5.1 5.8 10.2
Ecranare UV (nm) 210 210 265 286 218 220 210 255 215 210 190 —
Faze inversate
↑ 68
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă performanţă
proprietăţile unei faze staţionare sunt determinate de natura grupărilor alchil organo-silanice (R este o grupare funcţională polar ă, atunci faza staţionar ă va fi polar ă)
faze staţionare polare, cand R conţine grupări
diol (–(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH) cian (–(CH2)3C=N) amino (–(CH2)n NH2 cu n = 3 sau 4) scade polaritatea dimetil amino (-CH2)3N(CH3)2) diamino (-(CH2)3NH(CH2)2NH2) fazele staţionare nepolare folosesc cel mai des un organoclorosilan
pentru care gruparea R este un lanţ de n-octil (C8) sau n-octildecil (C18) deoarece substratul de silice în soluţii bazice poate suferi hidroliză, pH-ul fazei mobile trebuie să fie mai mic de 7,5
69
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă performanţă
Silicagelul (SiO2) - materialul cel mai important utilizat ca fază staţionar ă în tehnica HPLC
indi indife fere rent nt de form formă, granulaţia trebuie să fie uniformă (se elimină partea fină) - cara aracter cteris istticil icile e curg curger eriiii elue luentul ntului ui sun sunt mult ult îmb îmbunătăţite structur ă tridimensională cu o reţea de bază, tridimensională, formată din legături Si-O-Si iar pe suprafaţa porilor sau cea exterioar ă mai prezintă grup grupe e sila silano nol,l, ≡Si-OH
(a)
(b)
Aspectul granulelor de silicagel folosite frecvent la umplerea coloanelor în HPLC (a) şi aspe aspect ctu ul unei unei granule granule sferice sferice cu fază staţionar ă chim chimic ic lega legattă pe supr supraf afa aţa supo suport rtul ului ui (b). (b).
70
Faze stationare în cromatografia de lichide de înaltă performanţă
realiz izat ate e din din ace acele lea aşi mate materi riii prim prime e ca ca şi la sil silic icag agelu elull Coloa Co loanel nele e mon monoli olitt - real sferic
colo coloan ana a este este form format ată direct direct în în tubul tubul rigid rigid (metal (metalic) ic),, de unde unde ş i num numele se pot obţine coloa coloane ne cu perfo perform rman anţe supe superi rioa oare re faţă de cele cele umplu umplute te cu granul granule e
tipu tipuri ri de grup grupe e sila silano noll supe superf rfic icia iale le I – leg legate ate II – reac reactitive ve III III – libe libere re in funcţie de tehn tehnol olog ogia ia de obţiner inere e dife difer r ă şi poro porozi zita tate tea a inte intern rnă, suprafaţa specifică, rezistenţa la com compr pres esiu iune ne şi pola polari rita tate tea a
(a)
(b) Aspectul coloanelor monolit monolit (a) şi principalele tipuri de grup ări silanolice superficiale (b).
71
Cromatografia cu faze normale si faze inversate
tipu tipuri ri de crom cromat atog ogra rafi fiii de lich lichid ide e dupa dupa modu modull de oper operar are e
cromatografia de repartiţie normală (faza directă) - faza staţionara polar ă, pentru o fază mobilă nepolar ă cromatografie de repartiţie cu faze faze inve inverse rse (faza (faza indire indirect cta) a) - folosi folosirea rea unei unei faze faze sta staţionare nepolar ă şi a unei faze mobile polar ă
72
Cromatografia de lichide cu faza stationara de polaritate normala
Faza stationara din alumina sau silice prezinta locatii polare care vor interactiona cu molecule polare silice O Grupa polara HO Si O
Componentii Componentiielueaza elueazain in ordinea ordineacresterii cresteriipolaritatii polaritatii Cel mai polar…….Mai putin polar 73
Cromatografia de lichide cu faza stationara de polaritate inversata Daca faza stationara din alumina sau silice prezinta locatii polare blocate de grupari nepolare, acestea vor interactiona foarte puternic cu molecule nepolare silice faza C18
Me
O Si O Si Me O
Componentii Componentiielueaza elueazain in ordinea ordineascaderii scaderiipolaritatii polaritatii Mai puternic nepolar…….Mai putin nepolar 74
Detectori utilizaţi în HPLC
nu există detectori care să fie universal aplicabili sistemul de detecţie trebuie să fie foarte sensibil deoarece coloanele de separare performante au capacităţi de încărcare mici, iar volumul de probă redus (5-20 µl), impune detectori cu volume adecvate pentru sesizarea continuă a picului cromatografic
tehnica derivatizarii se poate practica înainte de introducerea probei în coloană, dar şi după ieşirea componentelor separate din aceasta
75
Detectori spectrofotometrici în UV-VIS
bazati pe tranzitiile electronice dintr-o molecula disponibilitatea compuşilor separaţi cromatografic de a absorbi lumina pe domeniul lungimilor de undă ale detectorului, în timp ce eluentul trebuie să fie practic transparent pe acelaşi domeniu spectral substanţele organice, ce conţin legături duble (electroni π), respectiv au grefate funcţiuni organice cu electroni neparticipanţi, absorb lumina în UVVIS
hidrocarburile olefinice ş i aromatice derivaţii tuturor hidrocarburilor cu diferite func ţiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH2), enzime, acizi nucleici etc.
celula de detecţie - spectrofotometru miniatural cu un volum de 1-10 µl, respectiv un diametru interior de 1 mm la o lungime a celulei de 10 mm fiind insensibil la micile variaţii de debit şi temperatur ă
drumul optic variază între 2 – 10 mm
pentru măsur ători în UV fereastra trebuie să fie din quartz 76
Detectori spectrofotometrici în UV-VIS Lampa UV
Lampa
Ferestre
Lentilă
Celulă de referinţă
Intrare
Celulă probă
Fotocelulă
Celula de fluorescenţă Ieşire
Ferestre Fotocelule
Lumina Lumina UV fluorescentă
Schema bloc a unui detector cu dou ă compartimente (stânga), şi a unuia de fluorescenţă HPLC (dreapta).
Detector spectrofotometric specific sistemului HPLC.
77
Alţi detectori LC specifici Alţi detectori utiliza ţi în LC şi limite de detec ţie şi pentru detectorii menţionaţi.
Absorbanţă
100 pg – 1 ng
LOD(state of art) (daca volumul injectat este mai mic) 1 pg
Fluorimetrici
1 – 10 pg
10 fg
Indice de refracţie
100 ng -1 µg
10 ng
Electrochimici
10 pg - 1 ng
100 fg
100 pg – 1 ng
1 pg
1 µg
100 ng
10 µg
500 ng
Detectori LC
Spectrometria de masa (MS) FT-IR Difuzia luminii
Limita de detectie*
Activitate optica
1 ng
Elemente selective
10 ng
Fotoionizare
Caracteristici
Sensibilitate 10- 10 M Este necesara uneori derivatizarea Sensibilitate 10- 10 M Compusi oxidabili sau reductibili Coloane capilare, pulverizare Absorbiţie IR Adecvati pentru macromolecule Pentru substante optic active Doar pentru ioni sau compusi ionizabili
1 pg – 1ng 78
Aplicatii ale tehnicii HPLC Standarde 8 7 6 2-NP
5
2,4-DNP
4
4-NP
3
3-NP 2,5-DNP
2
amestec nitrofenoli
50
Blanc
1 40
0 -500
-1 0
500
1000
1500
2000
2500
3000 30
20
10
0 -5
0
5
10
15
20
25
79 -10
Aplicatii ale tehnicii HPLC Mediu
Fenoli in apele potabile Identificarea difenhidraminei in probele de sedimente Biomonitorizarea poluarii cu hidrocarburi aromatice policiclice in lacurile montane de la mare altitudine prin analiza fierii pestilor Estrogeni in apele de coasta Toxicitatea tetraciclinei si a produsilor de degradare ai tetraciclinei asupra bacteriilor Atribuirea toxicitatii TNT asupra sedimentelor Criminalistica
Cu un HPLC portabil la diferite petreceri – identificarea si cuantificarea direct la locatie a drogurilor Ecstasy Identificarea steroizilor anabolici in ser, urina, transpiratie si par Analiza criminalistica a colorantilor textili Determinarea cocainei si a metabolitilor in meconiu Cuantificarea simultana a drogurilor psihoterapeutice in plasma umana Clinic
Cuantificarea DEET un urina umana Analiza antibioticelor Excretie urinara intensificata a aquaporin 2 la pacientii cu ciroza hepatica Detectarea neuropeptidelor endogene in fluidele extracelulare din creier Alimente si aromatizanti
Asigurarea consistentei si calitatii bauturilor racoritoare Analiza dicetonelor vicinale in bere Analiza zaharurilor in sucurile din fructe Analiza hidrocsarburilor aromatice policiclice in legumele si fructele Braziliene Analiza urmelor de agenti chimici folositi in agricultura Stabilitatea aspratamului in prezenta glucozei si a vanilinei
80
Cromatografia ionica
faza staţionar ă - r ăşină polimerică interlegat ă (divinil benzen interlegat cu polistiren) cu grup ări funcţionale ionice ataşate covalent
stiren divinil benzen Locaţie pentru schimb ionic
Interlegătur ă
Structuri ale stirenului, divinil-benzenului şi un copolimer modificat de stiren-divinil-benzen pentru a fi folosit ca r ăşină schimbătoare de ioni. Site-ul pentru schimb este de obicei în pozi ţia para şi nu este neapărat necesar să fie legat la toate unit ăţile de stiren. R- poate fi –SO3-H+, COO-H+, -NH3+OH- sau –N(CH3)3+OH-.
81
Schimbătorii de ioni cromatografia ionica
ca
faze
stationare
in
materiale solide - derivaţi ai unor polimeri reticulaţi (poroşi), obţinuţi prin legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funcţionale
Tipuri de schimbători de ioni.
Tip Schimbători cationici puternic acizi
Grupare funcţional ă Acid sulfonic
Schimbători cationici slab acizi
Acid carboxilic
Schimbători anionici puternic bazici
Amine cuaternare
Schimbători anionici slab bazici
Amine
Exemple -SO 3-CH2CH2SO3-COO -CH2COO-CH 2N(CH3)3+ -CH2CH2N(CH2CH3)3+ -NH 3+ -CH2CH2NH(CH2CH3)2+
82
Mecanisme de separare
amestec de Na+ şi K+ pe o coloana umplută cu un cationit
R-H + Na+ R-Na + H+ R-H + K+ R-K + H+
eluent prin coloana, (HCl diluat), ionii H+ din acid, fiind în concentraţie mai mare, vor deplasa ionii fixaţi, prin echilibre ionice similare spre o por ţiune inferioar ă iar aceştia se vor putea fixa din nou, puţin mai jos, pe alte centre de schimb din coloană
R-Na + H+ R-H + Na+ R-K + H+ R-H + K+ migrarea ionilor prin coloană
repetarea procesului
afinitatea sporita a grupărilor funcţionale tip -SO3- pentru K+ faţă de Na+ migrarea diferentiata separarea ionilor
83
Detectori conductometrici de supresie
detectorii conductometrici
sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici specifici ş i suficient de sensibili (500 pg – 1 ng) sisteme caracterizate de sensibilitate ridicat ă, stabilitate, flexibilitate, acurate ţe şi reproductibilitate, şi de capacitate mare de a furniza date de încredere
la ieşirea din coloana cromatografică ionii nu pot fi detectaţi suficient de sensibil pe cale conductometrică în mod direct (concentraţii coborâte, conţinuţi în eluentul format dintr-un electrolit cu o concentraţie comparabilă sau chiar mai mare) autosupresorul transforma eluentul (un acid sau o bază tare) în apă
eluent acid (acidul clorhidric) coloana supresor umplut ă cu o r ăşină schimbătoare de anioni cu formula generală R-OH, caracterizat ă de capacitate de schimb mare coloana de separare redat ă ca RH coloana de supresie redata ca ROH eluentul care conţine acid clorhidric diluat de exemplu, la ie şirea din coloana de separare va pătrunde în coloana supresor unde se va petrece reac ţia: R-OH + (H+ + Cl-) → R-Cl + H2O sărurile speciilor ionice de interes se transformă în hidroxizii corespunzători: R-OH + (Na+ + Cl-) → R-Cl + (Na+ + OH-) R-OH + (K+ + Cl-) → R-Cl + (K+ + OH-)
84
Supresorul electrochimic
procesul de schimb ionic în cromatografele moderne este accelerat prin electrodializă (s-a mărit viteza procesului şi s-a micşorat volumul mort; a crescut durata de funcţionare a detectorului) tr ăsături care furnizează stabilitatea liniei de bază (se elimină influenţa curentului indus de temperatur ă care este întîlnită la alte tipuri de
detectoare)
celula detectorului este localizată într-o incintă specială de reglare a temperaturii, care are rolul de a izola celula detectorului de fluctuaţiile externe de temperatur ă
un schimbător de căldur ă unic, încălzeşte faza mobilă şi proba înainte ca acestea să ajungă în celula detectorului
85
Supresorul electrochimic
sistemul de supresie cu autoregenerare, înlocuie şte ionii de sodiu, Na+, (şi alţi cationi) din eluent ş i îi transportă odată cu ionii hidroniu (H+ sau H3O+) din apa folosită ca regenerant ionii hidroniu se combină cu ionii hidroxid (OH-) rezultaţi din eluent ş i formează apa, care are o conductivitatea mult mai mic ă decât a hidroxidului de sodiu folosit ca eluent conductivitatea analitului este intensificată deoarece anionii analitului se asociaz ă cu ionii hidroniu care sunt mult mai conductivi Eluent (NaOH)
Probă (F-, Cl-, SO4
-
Separare f ăr ă supresie µS
Coloana analitică
Ionii interferenţi F-
SO4
-
Cl-
Ti NaF, NaCl, Na 2SO4, în H2O Separare prin supresie Sistem de supresie cu regenerare
Reziduuri H2O
µS
Cl-
SO4
-
F-
HF, HCl, H2SO4, în H2O
Reprezentarea schematică a procesului de îmbunătăţirea a raportului semnal-zgomot
86
Supresorul electrochimic
Anod +
Analit Na+OH- eluent
Reziduuri
Reziduuri
Catod -
Na+OH- şi H2
H2O şi O2
OHH+ H+ + O2
Autosupresia într-un sistem de supresie cu autoregenerare cationică. Anod +
Analit + - -+ Na OH MSA H eluent
Reziduuri
Catod Reziduuri
-
Na+ +
-
H + OH =H2O
H2 + OH-
H+MSA-şi O2
H2O şi H2
H+ MSA-
H2O
H2O +
H+ + OH-=H2O
H2O
Membrană schimbătoare de cationi
Spre detector
H2 + OH-
H + O2
Analit şi H2O
H2O
OH-
H2O
H2O Analit şi H2O
Membrană schimbătoare de cationi
Autosupresia într-un sistem de supresie cu auto-regenerare anionică.
H2O
Membrană schimbătoare de anioni
Spre detector
H2O
Membrană schimbătoare de anioni
87
IC-Dionex-3000
Imagine de ansamblu
Sectiune pompa Sectiune corp coloana/detector/supresor
88
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor ionice F-, Cl-, Br -, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-, C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ Faza mobilă
Solut 1 Solut 2
Faza staţionară
molecu mole cule lele le cu sar sarci cina na ma mare re sunt su nt ma maii pu pute tern rnic ic re reti tinu nute te de faza stationara, se deplaseaza mai incet prin coloana si se elueaza mai tarziu mole mo lecu cule lele le cu sa sarc rcin ina a me medi die e se chilibreaza intre faza sta tati tion ona ara si fa faz za mo mobi bila la mu mult lt maii us ma usor or mole mo lecu cule lele le cu sarcin ina a mi mic ca sunt su nt ma maii sl slab ab ret retin inut ute e de faz faza a stationar stati onara, a, se deplas deplaseaza eaza mai rapid prin coloana si se elue el ueaz aza a ma maii re repe pede de
89
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor ionice F-, Cl-, Br -, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-, C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
faza faza mobi mobila la anion anioni:i: 4,5 4,5 mM Na2CO3 ş i 1,4 mM NaHC aHCO3 cationi cationi:: 6 mM acid metansu metansulfon lfonic ic (CH3SO3H) standa standarde rde primar primare e (exemplu): 7 anioni: F-, Cl-, Br -, NO3-, NO2-, SO42-, PO43 6 cationi: Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ alte alte mate materi rial ale e apă ultra pur ă: 18,2 MΩ.cm rezist rezistivi ivitat tate e ion cromatog cromatograf raf DIONEX ICS-3000 ICS-3000
90
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor ionice F-, Cl-, Br -, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-, C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+ Exemp Exemple le de croma cromatog togram rame e la analiz analiza a cation cationilo ilor/a r/anio nionilo nilor r - catio ationi ni
- anioni
91
IC-Dionex-3000/identificarea şi cuantificarea speciilor ionice F-, Cl-, Br -, NO3-, NO2-, SO42-, PO43-, HCOO-, C2O42-, CH3-COO-, Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+
Cromatograma cu efect de deformare
Cromatograma cu vizualizarea picurilor unor analiti in concentratii mici/sensibilitate scazuta a instrumentului
92
Cromatografia de gaze/Aspecte generale
faza mobilă nu interacţionează cu moleculele analitului şi funcţia sa este doar aceea de a transporta analitul prin coloană se întâlnesc
istoric
cromatografie gaz-solid (gas-solid chromatography GSC) cromatografie gaz-lichid (gas-liquid chromatography GLC) conceptul a fost enunţat pentru prima dată în 1941 de către Martin şi Synge in 1955 a apărut primul aparat comercial şi de atunci utilizarea acestei tehnici a luat o amploare remarcabilă teoria GC capilara (1957) dezvoltata de Golay instrumente GC capilare (1977) coloane capilare din silice topita (1979)
GSC este de folos pentru separarea speciilor care nu sunt reţinute de coloanele gaz-lichid, precum componenţii din aer, H2S, S 2, NOx, CO, CO2 şi gazele rare
se poate efectua atât pe coloane umplute cât şi coloane tubulare deschise coloanele sunt denumite uneori coloane tubulare deschise cu strat poros (porous layer open tubular column, PLOT column)
93
Cromatografia de gaze/Aspecte generale Comparatie: GC & HPLC
HPLC
GC
probe ne-volatile
probe volatile & termic stabile
compusi termic instabili
analiza rapida
macromolecule
rezolutie buna
probe anorganice si probe ionice
interfata simpla la un spectrometru de masa
interfata mult mai complexa la un spectrometru de masa
94
Instrumentaţia cromatografiei de gaze
compuşii amestecului supus separ ării pot fi atât lichide cât ş i solide volatile substanţele de analizat se introduc în coloana de separare, la o temperatur ă superioar ă celei de volatilizare, prin intermediul unui dispozitiv de introducere a probei Debit-metru Control debit Regulator presiune
Bloc injector
Septum
Blocul detector
Cuptor
Faza mobilă
Coloană 95
Schema de principiu a unui cromatograf de gaze
Gazul purtator in cromatografia de gaze
Inert
Heliu
Alegerea dictata de tipul detectorului, cost si disponibilitate Presiunea controlata pentru valoare constanta a presiunii la intrarea in sistem
Debit constant asigurat printr-un sistem de control al debitului
Gaze de puritate cromatografica (puritate foarte ridicata)
96
Sisteme de injecţie
introducerea probei se realizează cu seringi micrometrice la probele lichide volumele se situează în domeniul 0,1 - 10 µL, în timp ce pentru gaze se folosesc seringi ~0,5 mL, sau ventile pentru introducerea probei sistemele de injecţie sunt păstrate de obicei la temperaturi care sunt cu 50 oC mai mari decât punctele de fierbere pentru compuşii cei mai puţin volatili
dispozitivele pentru injecţie au totodată şi rolul volatilizării probei în curentul de gaz purtător cât mai aproape de intrarea în coloana
97
Sisteme de injecţie
dispozitive “split/splitless” cu ajutorul cărora doar o fracţiune din probă (1/20 - 1/500) intr ă în coloană iar restul este evacuată
cea mai utilizata metoda de injectie in coloane capilare adeseori cea mai neinteleasa metoda acelasi sistem de injectie folosit in ambele tehnici controlul electronic printr-o valva solenoida modifica debitul gazului pentru a determina functia de injectie
Septum
Purjare septum
Gaz purtător Ventil split
Etanşare internă
Liner de
sticl ă
Punct de split
Coloană
Diagrama schematică a unui injector “split/splitless”. 98
Injectia split/splitless
Split
Mecanism prin care doar o portiune din solutia injectata este descarcata in coloana (1/1000 1/20 din proba)
Splitless
Utilizata pentru probe concentrate (>0.1%)
Utilizata pentru probe diluate (<0.1%)
Viteza de injectie mica
Nu ar trebui efectuata izoterm
Poate fi realizata izoterm Viteza mare de injectie
Cea mai mare parte a probei transferata catre coloana (85100%)
Contaminarea injectorului si a septumului nu sunt notificabile
Focalizarea solventului este importanta
Control printr-o valva solenoida
Necesita optimizare atenta
99
Alte tipuri de injectii Injectie direct in coloana
Toata proba este transferata in coloana Acul seringii introdus direct in coloana Potrivit pentru Analiza urmelor Compusi termic instabili (pesticide, droguri) Domeniu larg al punctelor de fierbere Masa moleculara mare
Injectia de volume mari
Pentru modificarea sensibilitatii in aplicatiile de mediu. Utilizeaza seringi de 100µL: Injectii de pana la 70 µL Injectii cu viteze mici (temperatura injectorului cu cateva grade sub punctul de fierbere al solventului, debit la 150 mls/ min, optiune de split deschis) Concentrarea analitului
Split inchis Rampa rapida de temperatura la inceputul coloanei +20°C Programarea coloanei functie de necesitati 100
Sisteme de injecţie
Introducerea probelor gazoase – cilindri de un
anumit volum (prevazuti cu robinete)
introducerea probelor lichide – cea mai comuna metoda este utilizarea unei microseringi
metoda “headspace” care se refera la determinarea substanţelor organice volatile din faza gazoasa, care se afla in echilibru cu cele din faza lichida sau solida
Tehnici de introducere a probei prin desorb ţie termica: desorbţia termica a compu şilor volatili re ţinuţi pe materiale cu proprietati de adsorbtie (C18/Tenax, glass beads, etc.).
101
Coloane si faze stationare Materiale utilizate in realizarea coloanelor
metal (1957)
sticla (1959)
silice topita (1979)
aluminiu placat (1984)
materiale inerte (1990)
Alte caracteristici
alegerea fazei stationare determina selectivitatea
sute de faze disponibile
multe faze dau separare similara
aceleasi faze pot avea nume diferite
alegerea fazei stationare pentru coloanele capilare mult mai simpla
asemanator dizolva asemanator
fazele polare se utilizeaza pentru compusi polari
fazele nepolare se utilizeaza pentru compusi nepolari 102
Caracteristicile coloanelor capilare
Caracteristici
lungime (10 m – 50 m)
diametru intern (0,1 mm – 0,53 mm)
faza stationara lichida
grosimea filmului (0,1 µm – 5 µm)
polaritate (nepolar - polar)
103
Criterii de alegere a coloanelor capilare
diametrul intern diametru intern mic rezolutie buna pentru picurile care se elueaza rapid timpi mari de analiza domeniu dinamic limitat diametru intern mare rezolutie scazuta pentru picurile care se elueaza rapid timpi scurti de analiza rezolutie satisfacatoare pentru amestecuri complexe domeniu dinamic bun grosimea filmului cantitatea de faza stationara de acoperire afecteaza retentia si capacitatea filmele groase cresc retentia si capacitatea filmele subtiri utilizate pentru composi cu puncte de fierbere ridicate coloane capilare standard tipice de 0,25 µm 0,53 mm ID (megabore)
grosimea filmului cantitatea de faza stationara de acoperire afecteaza retentia si capacitatea filmele groase cresc retentia si capacitatea filmele subtiri utilizate pentru composi cu puncte de fierbere ridicate coloane capilare standard tipice de 0,25 µm 0,53 mm ID (megabore) lungime in analiza izoterma
in analiza cu temperatura programata
retentia dependenta de lungime dublarea lungimii coloanei dubleaza timpii de retentie rezolutia este o functie de radacina patrata a lungimii coloanei se castiga 41% imbunatatire a rezolutiei retentia mult mai puternic dependenta de temperatura creste timpul de analiza conditiile de operare trebuiesc optimizate
faza 104
Pierderile din coloana
Pierderi intervin la coloanele cu film gros
Coloanele polare au pierderi mai mari
Pierderile sunt excesive atunci cand coloanele sunt distruse sau degradate De evitat acizii si bazele puternice De utilizat in domeniul de temperatura indicat De evitat scapari (lipsa de etansietate)
105
Capacitatea coloanelor
Cantitatea maxima care poate fi injectata deformare/distorsionare semnificativa a picurilor
o
Capacitatea coloanelor creste cu:
fara
grosimea filmului temperatura diametru intern Selectifitatea fazei stationare
Daca se depaseste, rezulta:
efect de largire a benzilor asimetrie
106
Coloane folosite in gaz cromatografie
COLOANE
UMPLUTE
FSOT-fused silica open tubular
CAPILARE
WCOT-wall coated open tubular
SCOT-support coated open tubular
PLOT – porous layer open tubular
Coloanele tip “wide bore, 530 mm”, nu sunt coloane capilare in adevaratul sens al cuvantului si permit folosirea unor debite ale gazului purtător de pana la 15 mL min-1. Au performante superioare coloanelor cu umplutura Coloanele capilare presupun folosirea unor debite de cel mult 1,5 mL min-1 107
Sectiuni prin coloane Coloane capilare
Lungime: 10 m la 100 m Diametre: 180 µm, 250 µm, 320 µm & 530 µm Debite: 1,0 mL/min la 250 µm 1,5 mL/min la 320 µm 2,0 mL/min la 530 µm acoperite cu poliimida polyimide coating capilara din fused silica silicecapillary topita stationary faza phase
stationara
WCOT
Wall Coated Open Tube
PLOT
Porous Layer Open Tube
SCOT
Support Coated Open Tube
Coloane cu umplutura
Lungime: < 2 m Diametre: 1/8” & ¼” 108
Faze stationare Fazele stationare sunt de mai multe feluri: polare (polietilenglicol) nepolare (cauciucuri siliconice) intermediare cu punti de hidrogen specifice (separarea amestecurilor racemice) nepolar
X=0; nepolar X=0,65; intermediar
polar
X=0,1; X=0;
polar polar
polar
109
Faze stationare
R
R
R
R
Si
O Si
O Si
R
R
nR
Faze staţionare folosite în GC: siliconice –nepolare, intermediare şi polare şi polietilenglicolice – polare. Faza staţionar ă
Nume
Polidimetil siloxan
OV-1, SE-30
Poli(fenilmetildimetil)s OV-3, SE-52 iloxan (10% fenil) Poli(fenilmetil)siloxan OV-17 (50% fenil) Poli(trifluoro[propildim OV-210 etil)siloxan Polietilen glicol Carbowax 20 M Poli(dicianoalildimetil) siloxan
OV-275
Temperatura maximă, Aplicaţii o C 350 Fază nepolar ă; hidrocarburi, medicamente aromatice polinucleare, steroizi, PCBs 350 Esteri metilici ai acizilor graşi, alcaloizi, medicamente, compu şi halogenaţi 250 Medicamente, steroizi, pesticide, glicoli 200 Aromate clorurrate, nitroaromate, benzeni alchil-substituiţi 250 Acizi liberi, alcooli, eteri, uleiuri esenţiale, glicoli 240 Acizi graşi polinesaturaţi, acizi liberi, alcooli 110
Detectorii gaz cromatografici
sesizeaza în mod continuu, rapid şi cu o mare sensibilitate, componentele din proba supusă analizei un detector ideal pentru gaz cromatografie are:
sensibilitatea adecvată
stabilitate ş i reproductibilitate
r ăspuns liniar la analiţi care variază într-un domeniu larg de concentraţii
temperaturi de la valori normale la 400 oC
timp de r ăspuns rapid independent de debit
r ăspuns selectiv în raport cu o clasă de compuşi
nedestructiv în raport cu proba
zgomotul de fond apare datorită sensibilităţii metodei ce lucrează la limita unde
interfer ă zgomotul electronic cu cel dat de detector; const ă în perturbaţii minuscule ale liniei de bază având cauze multiple
driftul este devierea liniei de baz ă într-un timp dat (1h) exprimat în unit ăţile de
măsur ă uzuale ale semnalului înregistrat (mV, mA etc)
domeniul dinamic liniar al detectorului - domeniul în care semnalul variaz ă liniar
cu concentraţia (sau cu debitul masei de component) ce trece prin detector 111
Detectorii gaz cromatografici
Limite de detectie şi domeniul dinamic pentru principalii detectori utiliza ţi în GC. Detector
Selectivitate
Sensibilitate (g•mL-1)
Domeniul liniar
FID (flame ionization detector) – cu ionizare în flacăra ECD (electron capture detector) – cu captura de electroni TCD (termal conductivity detetcor) – catarometrul NPD (nitrogen and phosphorus detector) – cu emisie termo-ionică FPD (flame photometric detector) – flamfotometrici PID (photoionization detector) – bazati pe fotoionizare MS - spectrometru de masă
Compuşi organici ce ard în flac ăr ă H2/aer Compuşi cu grupe funcţionale electronegative (X)
10-12
107
10-14
104
Detector universal
10-7
104
Detector specific compuşilor cu atomi de N sau P
10-14
105
Compuşi cu potenţial de ionizare mare Compuşi ionizabili cu radiaţie UV (hidrocarburi aromatice)
10-11
104
10-12
105
Detector universal
10-14
105
112
Detectorii gaz cromatografici
detectori preferaţi
detectorul bazat pe conductibilitate termică (TCD) detectorul cu ionizare în flacăr ă (FID), neselectiv, sensibil la compuşii organici C-H detectorul cu fotoionizare (PID), selectiv la compuşi aromatici ş i nesaturaţi detectorul cu captura de electroni (ECD) sau de conductivitate electrolitică (ELCD), sensibili la compuşii cloruraţi ş i oxigenaţi detectorul azot-fosfor (NPD), selectiv faţă de compuşii cu conţinut de N şi P detectorul flam-fotometric (FPD), selectiv pentru compuşii ce conţin S şi P spectrometrul de masă, universal.
efectul asupra probei poate fi destructiv sau nedestructiv
FID este un detector destructiv TCD este nedestructiv iar proba separată poate fi izolată 113
Detectorul de ionizare în flacara (FID)
Colector
Sursă tensiune Aer
H2 Coloan ă
sensibil la compuşii cu carbon modificarea conductibilităţii electrice a gazelor în prezenţa unor particule încărcate ionizarea moleculelor probei este intensificată de prezenţa unei flăcări de hidrogen (2000 – 2200 oC), care arde într-o incinta aflata în aer moleculele covalente simple: N2, O2, CO, CO2, H2O, CS2, NH3, CCl4, SiCl4, NOx, He şi alte gaze rare, nu pot servi unei analize chimice prin această metodă, prezentând cele mai slabe semnale detectorul nu este sensibil la gaze necombustibile precum SO2, CO2, H2O şi NOx. grupările funcţionale precum carbonilii, alcoolii, halogenii şi aminele formează foarte puţini, sau chiar deloc, ioni în flacăr ă detector cu efect destructiv asupra probei r ăspunsul depinde de numărul de molecule ionizate ce apar în flacar ă cele mai stabile rezultate se obţin pentru alcani iar semnalul scade în general cu creşterea numărului de heteroatomi din moleculă deoarece detectorul FID r ăspunde la numărul de atomi de C care intr ă în detector pe unitatea de timp acesta este un detector sensibil la masă şi nu un sistem sensibil la concentraţie (calculul se poate face în baza numărului de atomi de C din moleculă). are o sensibilitate ridicată (~10-13 g/s), domeniu liniar de r ăspuns mare (~107) şi zgomot scăzut este robust şi uşor de folosit Gaz purtător
114
Detectorul cu captur ă de electroni (ECD)
în detector, gazul purtător (N2) este ionizat de către o sursa ß- radioactivă (câţiva mCi furnizaţi de o sursă conţinând 63Ni sau tritiu adsorbiţi pe o folie de platină sau titan), şi trece printre doi electrozi, între care se asigur ă o cădere de tensiune de 100V in lipsa oricărei molecule organice în gazul purtător există un curent de bază redus datorat azotului molecular (N2) – molecule ionizate negativ la apariţia în detector a unei molecule organice M, care conţine elemente electronegative (Cl, F) cu afinitate pentru electroni, aceasta va “capta” parte dintre electronii radiaţiei ß-, diminuând curentul de recombinare a ionilor de semne contrare prin această ecranare: N2 = N2+ + eCurent de fond M+e =M M- + N2+ = M + N2 Ecranarea curentului de fond din ultimile două reacţii detectorul este unul selectiv, adecvat pentru detecţia compuşilor halogenaţi (pesticide) nu este sensibil la grupări aminice, alcooli ş i hidrocarburi nu afectează proba ca detectorul FID (efect nondestructiv) dezavantaj: domeniul de r ăspuns liniar este limitat la aproximativ două ordine de mărime Electrod +
Ieşire gaz purtător
Intrare gaz purtător
Electrod -
Emiţător β
Principiul detectorului cu captura de electroni (ECD).
115
Cromatografia gaz-lichid/coloane capilare/overview Un amestec este injectat in coloana cromatografica Proba se injecteaza ca gaz sau lichid O componenta solida poate fi dizolvata intr-un solvent dar picul solventului va fi de asemeni observat Injectarea probei Faza mobila gazoasa
Coloana in cuptor la aproximativ 300 oC. Substantele trebuie sa aiba capacitatea sa vaporizeze si sa nu se descompuna Elutie cu un gaz inert
Extrem de sensibil
detector FID
116
Cromatografia gaz-lichid/coloane capilare/overview
Instrumente pentru analiza
Echipamente pentru etapele preparative 117
Cromatograma reala pentru fractiuni petroliere superioare
118
Cromatograma obtinuta la analiza pesticidelor halogenate din apa DDT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
-HCH -HCH -HCH Heptachlor -HCH Aldrin Heptachlor epoxide Endosulfan I 4,4’-DDE Dieldrin Endrin 4,4’-DDD Endosulfan II 4,4’-DDT Endrin aldehyde Endosulfan sulfate Methoxychlor Endrin ketone
4
10
7
11
6 8
12 13 9
14
1 5
15
3
16
17 18
2
2 ppb in Water
119
Cromatograma FID a unei probe reale de aer Analiza calitativa - identificarea componenţilor de interes s-a realizat utilizând amestec de 55 hidrocarburi non-metanice C2-C9 (22964RESTEK, Spectra Gases). Analiza cantitativa – standard de calibrare cu etan, etena, propan, nbutan. e n a x e H n
e n a h t E
l a n g i S D I F
e e n n e e l h y t t E e c A e n a p o r P e n e p o r P
e n a t u B o s i
e n a t u B n
e n a t n e P o s i e n e r p o s I
e n e t u B o s i e n e t u B 1 e n a t u B t
Benzene
e n e t u B 2 s i c
e n a t n e P o l c y C
Toluene
e n a t n e P n
e n e t u B 1 l e y e h n n t a e t e t n M n e e e 2 p n P o l e c t 1 y n e e C e l P n n y - e e t 2 h t t - u t n e B e M P 2 l 2 y s h i t c e e M n e 2 i d a t u B 3 , 1
e n a t n e P l y h t e M - e 2 n a t n e P l y h t e M - e 3 n a x e H n
2,2,-Dimethyl-Butane 2,3-Dimethyl-Butane Cyclohexane
120
Retention time (min)
