18_paskaita_PGR

Paskaita “PGR “PGR”” ir kiti NR amplifikacijos metodai

2011.05. 17 Julius Gagilas [email protected] UAB Fermentas

Polymerase Chain Reaction PCR=PGR PCR= PGR Polimerazės Grandininė Reakcija

Turinys - klausimai  DNR amplifikacija – in vivo, in vitro  PGR reakcija, ciklai, automatizavimas  PGR reikalingi komponentai  PGR klaidos, užterštumas  PGR produktų klonavimas  PGR metodo variacijos  Tikro laiko PGR  Karšto starto PGR  Kitos PGR varijacijos  PGR pritaikymas  Kiti in vitro amplifikacijos metodai  RCA – besisukančio rato amplifikacija

DNR amplifikacija – padauginamas DNR kiekis

  

In vivo Genas gali būti toksiškas Reikia gryninti nuo genominės DNR ir vektoriaus

 



In vitro Daugumoje metodų yra ribotas DNR ilgis 20-40kB Galima padauginti genomo, chromosomos, ar geno regioną

Amplifikacija in vitro Amplifikacijos metodai

Naudojama temperatūra, °C

Amplifikacijos laipsnis

Taikinio Polimerazės grandininė reakcija (PGR) 50-98 ciklai amplifikacijos Nukleino rūgščių seka pagrįsta 42 izoterminis metodai amplifikacija - Nucleic Acid Sequence-Based

1012 1010

Amplification (NASBA, 3SR)

37 izoterminis

107

Besisukančio rato amplifikacija - Rolling 30 izoterminis

109

Grandinės nustūmimo amplifikacija Strand Displacement Amplification (SDA)

Circle Amplification (RCA) Lamp – loop mediated isothermal amplification

Zondų Ligazės grandininė reakcija (LGR) amplifikacijos Ligase Chain Reaction (LCR) metodai Qβ replikazės amplifikacija

60-65 izoterminis

n.d.

50-98 ciklai

105

37 izoterminis

109

Adaptuota iš: Cantor, C.R., Smith, C.L., Genomics: The Science and Technology Behind the

Amplifikacija in vitro – DNR padauginama mėgintuvėlyje

Kleppe

Khorana

Pirmą kartą nukleorūgščių amplifikacija in vitro buvo aprašyta 1971m.- tRNR geno sintezė, panaudojant specifinį pradmenį. Amplifikacija nebuvo eksponentinė. (Kleppe, K., Khorana, H.G., et al, Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases, J. Mol. Biol., 56 (2), 341-61, 1971.)

1983m Kary Mullis paskelbė polimerazės grandininės reakcijos (PGR) idėją. Ši idėja buvo teorinė iki 1985metų, kol Saiki publikavo pirmąjį PGR pritaikymą praktikoje. (Saiki, R.K., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science, 230 (4732), 1350-4, 1985.)

Nuo to laiko atsirado daug alternatyvių nukleorūgščių amplifikacijos metodų ir PGR tapo vienas svarbiausių metodų molekulinėje biologijoje.

PGR Istorija 1944m 12.28 Lenoir miestelyje (Šiaurės Karolina, JAV) gimė Kary Mullis. Baigęs Džordžijos Technologijos Institutą, ir tapęs PhD Kalifornijos Universitete, 1979m įsidarbino Cetus korporacijoje.

46.58

K. Mullis, PGR išradėjas. Tris kartus vedęs ir išsiskyręs. Turi tris vaikus, neskaitant tų, kurie gimė jam dalyvaujant spermos donoro programoje.

1983m vieną gegužės penktadienio vakarą važinėdamas po Kaliforniją su Jennifer Barnett su savo Honda Civic išrado PGR

Kodėl PGR? K. Mullio komentaras.

Cetus jam sumokėjo $10,000. Cetus uždirbo $300,000,000 –pardavė Roche.

1993m Nobelio premija

1993m Kary B. Mulis buvo apdovanotas Nobelio premija chemijos srityje už PGR metodo išradimą.

If you get a good idea – make sure you fully exploit it!

Istorija

PGR principas

DNR molekulių teorinis kiekis PGR metu + Ciklų Visų DNR kopijų Amplikonų skaičius skaičius skaičius

Ilgesnių DNR molekulių skaičius

1

2

0

2

2 3 5

4 8 32

0 2 22

4 6 10

10

1 024

1 004

20

15 20

32 768 1 048 576

32 738 1 048 536

30 40

25

33 554 432

33 554 382

50

30

1 073 741 824

1 073 741 764

60

n

2n

2n-2n

2n

PGR reakcijos etapai – eksponentinė amplifikacija s u i č i a k s ų j i p o k o t k u d o r p R G P

0000000

0000000 Teorinis

0000000 Praktinis

0000000

000000

0 0

0

0

0

0

00 00 00 00 00 00 00 00 00 00

Ciklų skaičius

Ką apie tai pasakytų K. Mullis?

1 2 4 8 16 32 64 128 2n

PGR reakcijos etapai: denatūracija  

DNR denatūruojama, kad būdama viengrandė vėliau galėtų prisijungti pradmenis Denatūracijos temperatūra priklauso nuo DNR G+C sąstato

PGR reakcijos etapai: denatūracija 

Jei G+C 55%, denatūracijai naudojama 94-95 C temperatūra



Pradinė denatūracija vykdoma 3-5 min. , siekiant pilnai denatūruoti taikinio DNR. Vėliau, kiekvieno ciklo metu, denatūracijai užtenka 30-45 sek.



Jei G+C ≥ 55%, naudojamos termostabilesnės Archebakterijų DNR polimerazės ir aukštesnės temperatūros (iki 98 °C), arba dedama priedų (betaino, DMSO).

PGR reakcijos etapai: Pradmenų prilydymas

Prilydymo temperatūra yra 3-5 mažesnė už lydymosi temperatūrą. O kas yra lydymosi temperatūra?


. v . o , 0 6 2

A s i t r e g u S

Dvigrandė DNR

Temperatūra, C

Tm - Temperaturemelting

Viengrandė DNR

PGR reakcijos etapai: Pradmenų prilydymas 

 

Pradmenys turi būti specifiški DNR. Kuo ilgesnis pradmuo – tuo didesnis specifiškumas. Paprastai naudojami 18-25nt ilgio oligonukleotidai, pradmenų ilgis neturi skirtis daugiau nei 3nt Pradmenų G+C sąstatas 40-60 Pradmenų lydymosi temperatūros (T m) apskaičiavimas  Kompiuterinių programų pagalba  Wallace taisyklė (12-20nt ilgio oligonukleotidams):







Bolton ir McCarthy taisyklė (14-70nt ilgio pradmenims)

Prilydymo temperatūra paprastai būna 3-5 C mažesnė už Tm Pradmenys neturi būti komplementarūs patys sau (>3nt), 3’ gale paprastai būna G arba C (bet ne GC ar CG)




 

Pradmenų prilydymo temperatūra apskaičiuojama kompiuterinių programų pagalba, pvz.: Vector NTI. Galima naudotis interneto svetainėse pateikiamomis pradmenų T m skaičiuoklėmis, pvz.:  http://www.operon.com/oligos/toolkit.php  http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

PGR reakcijos etapai: Polimerizacija (filmas)

PGR reakcijos etapai: Polimerizacija (filmas)  





Atliekama Taq DNR pol optimalioje temperatūroje: 72-78 °C Taq DNR pol polimerizacijos greitis ~2000bp/min. Polimerizacija vykdoma 1min, kiekvienam 1000bp. Paskutinio ciklo metu dažnai naudojamas 3X ilgesnis polimerizacijos laikas, kad pilnai užbaigti DNR kopijas

Ciklų skaičius: 25-30 Denatūracija, 95°C

Polimerizacija, 72 °C

Pradmenų prilydymas, 50-60°C

PGR naudojama įranga Pipečių antgaliai su Naudojami PGR ruošimui, apsaugai filtrais nuo pašalinės DNR patekimo iš DNR mėginio į pipetę ir atvirkščiai iš pipetės į PGR ar jos komponentus. PGR produktų analizei post-PGR etapuose gali būti naudojami paprasti pipečių antgaliai.

PGR naudojama įranga Plonasieniai 0,2; 0,5ml mėgintuvėliai

98, 384 šulinėlių plokštelės

Naudojami plonasieniai polipropileno mėgintuvėliai. Plonos sienelės užtikrina geresnį šilumos laidumą, greičiau keičiasi reakcijos mišinio temperatūra. PGR atliekamas plokštelėse, kai yra naudojami dideli mėginių kiekiai. Jei atliekama tikro laiko PGR, plokštelės uždengiamos skaidria plėvele, kuri netrukdytų fluorescencijos matavimams reakcijos mišiniuose.

PGR naudojama įranga Vienkartinės pirštinės PGR ruošimui geriau naudoti pirštines be talko, kuris patekęs į reakciją inhibuoja PGR. PGR produktų elektroforezinei analizei geriau naudoti nitrilines pirštines, kurios yra nelaidžios etidžio bromidui.

Šaltį palaikantys stoveliaiSpecialūs stoveliai, atšaldomi šaldytuve, naudojami kambario temperatūroje. Juose kambario temperatūroje ruošiamų PGR mėginių temperatūra gan ilgą laiką gali būti palaikoma ~2-8 °C. Tokioje temperatūroje DNR polimerazės nėra aktyvios ir taip išvengiama nespecifinių pradmenų pailginimų.

PGR naudojami termocikleriai

Pirmosios PGR būdavo atliekamos naudojant tris termostatus

Ependorf „Mastercycler“

Applied Biosystems

Bio-Rad „iCycler“

Roche „Lightcycler“, amplifikacija vykdoma kapiliaruose

Applied Biosystems modelis

Mikrokapiliariniai ir lustiniai PGR įrenginiai (deMello 2003 Schneegab 2001)

PGR gali būti atliekamas plokštelėse su 1536 šulinėliais. Tokią

PGR reakcijos komponentai  

    

Termostabili DNR polimerazė Pradmenys, komplementarūs taikinio DNR (Tiesioginis ir Grįžtamasis) dNTP mišinys Dvivalenčių metalų jonai (Mg 2+) Buferinė sistema (Tris-HCl, pH 8.3-9.5) DNR matrica Priedai

DNR polimerazės Naudojamos termofilinių ir hypertermofilinių eubakterijų ir archebakterijų DNR polimerazės 

DNR polimerazės

1967.07.23. Yellowstone nacionalinis parkas, Grybo versmė. Iš jos tekančiame upelyje paimtamame mėginyje 1966.09.05 buvo

Taq DNR polimerazė 

PGR pirmiausia buvo naudojama E. coli DNR polimerazės didysis domenas – Klenovo fragmentas. Kiekvieno ciklo metu reikėdavo įdėti šviežią porciją fermento, nes denatūracijos metu DNR polimerazė denatūruodavo. Su šia DNR polimeraze paprastai pavykdavo sėkmingai padauginti iki 400nt ilgio amplikonus.



Taq DNR polimerazė išlieka stabili denatūracijos metu, todėl PGR galima atlikti viename mėgintuvėlyje sudėjus visus reikiamus reagentus. Svarbiausia PGR buvo galima automatizuoti. Taq DNR polimerazės panaudojimas padidino PGR specifiškumą, nes aukštesnėje temperatūroje pradmenys hibridizuojasi žymiai specifiškiau. Padidėjo PGR išeiga, gaunama daugiau produkto ir su Taq DNR polimeraze galima amplifikuoti žymiai ilgesnius – iki 10kb ilgio DNR fragmentus





Taq DNR polimerazė 

T hermus aq uaticus DNR polimerazė I

5’-3’ DNR polimerazė  5’-3’ egzonukleazė  neturi 3’-5’ egzonukleazinio aktyvumo  3’ gale įjungia papildomą A nukleotidą  klaidos 1.7× 10-4-5× 10-6 per nt, per ciklą 

PGR reakcijoje naudojama 0.5-2.5v (50µl) t.y. ~2-10× 1012 Taq DNR pol molekulių  Labai termostabili: T 1/2 (95°C)~40min  Aprašyta 1988m, iki tol buvo naudojama DNR pol I ( E.coli ) ir kiekvieno ciklo metu reikėdavo įdėti.  1989m Science žurnalas paskelbė metų molekule. 

PGR naudojamų DNR polimerazių tipai E u Thermus genties ir kitų bakterijų DNR Thermus aquaticus - Taq, b a polimerazės, priskiriamos DNR (Fermentas  k t www.fermentas. e polimerazių A šeimai. Dauguma jų r i j neturi 3‘ egzonukleazinio aktyvumo ); Thermus thermophilus – ų

(išskyrus Tma) ir pasižymi 5‘ egzonukleaziniu aktyvumu.

Tth, Thermus flavus – Tfl ; Thermus filiformis – Tf i, Thermotoga matitima - Tma ir

kt.

A r Euryarchėjų DNR polimerazės, Pyrococcus furiosus – Pfu; c h priskiriamos B šeimai. Jos pasižymi (Fermentas  ė j ų www.fermentas. 3‘ egzonukleaziniu aktyvumu ir 6-

10 kartų didesniu sintezės tikslumu nei Taq, neturi 5‘ egzonukleazinio aktyvumo ir yra jautrios uracilui esančiam DNR sudėtyje.

); Pyrococcus kodakaraencis – KOD, Pyrococcus woesei – Pwo, Thermococcus litoralis – Tli ir kt.

PGR naudojamų DNR polimerazių tipai D N 1. Mišiniai su dUTPaze. dUTPazė PfuUltra, PfuTurbo ir kt. R suskaldo dUTP, susidariusį dėl Stratagene firmos DNR p o aukštoje temperatūroje PGR metu polimerazės su ArchaeMaxx l i m vykstančio dCTP dezamininimo. faktoriumi (  e r Uracilas, esantis DNR, slopina archėjų www.stratagene. a z ). ė DNR polimerazes. s s 2. Mišiniai su praimaze. Praimazė AccuPrimeTM Taq DNR u p padidina pradmens prilydymo polimerazė, (Invitrogen,  r i specifiškumą e www.invitrogen. d a ) i s

3. Mišiniai su viengrandę DNR Olszewski 2005 surišančiu SSB baltymu – sumažina pradmenų dimerų susidarymo tikimybę. 4. Mišiniai su RecA baltymu – padidina Shigemori 2005 pradmenų specifiškumą, kuris svarbus

PGR naudojamų DNR polimerazių tipai

P o Taq DNR polimerazės ir archėjų l i m DNR polimerazių, turinčių 3‘ e r egzonukleazinį aktyvumą, mišiniai. a z Žymiai efektyviau, nei vien su Taq i ų m DNR pol, vyksta ypač ilgų DNR i fragmentų amplifikacija. Taq DNR š i n polimerazė negali „pratęsti“ i a i pradmens po klaidingų nukleotidų

įjungimo. Naudojant polimerazių mišinį archėjų DNR polimerazės pašalina klaidingus nukleotidus ir leidžia Taq DNR polimerazei toliau amplifikuoti DNR.

Mišiniai ilgai PGR (Fermentas, 

www.fermentas.co

); Mišiniai tiksliai PGR (Fermentas,

 www.fermentas.co

)

PGR naudojamų DNR polimerazių tipai H i DNR polimerazės Pfx50TM DNR polimerazė – Thermococcus b r i sulietos su DNR zilligii sulieta su pagalbiniu baltymu (Invitrogen, d i n ė surišančiais baltymais. www.invitrogen.com ) TM DNR polimerazė – Pfu tipo DNR s Tai padidina DNR Phusion D polimerazė sulieta su Sulfolobus Solfataricus N polimerazių R procesyvumą ir Sso7d DNR surišančiu baltymu (NEB,  p o tikslumą. Tikslumas ~50 www.neb.com; Finnzymes  l i www.finnzymes.com) m kartų didesnis už Taq e DNR pol, procesyvumas PfuUltra II fusion HS DNR polimerazė – Pfu r a z ~ 10 kartų didesnis nei DNR polimerazė sulieta su DNR surišančiu ė baltymu (Stratagene,  www.stratagene.com) s Pfu DNR pol.

iProof DNR polimerazė - Pfu tipo DNR polimerazė sulieta su Sulfolobus Solfataricus Sso7d DNR surišančiu baltymu (Bio-Rad  www.bio-rad.com/ )

DNR polimerazės DNR Polimerazė

3’-5’ Savybės egzonukleazė

Thermus aquaticus,

-

Eubakterinė polimerazė, klaidos 1.7× 10-4-5× 10-6 per nt, per ciklą; T1/2 (95°C)~40min

Pyrococcus furiosus,

+ +

Termostabilesnė nei Taq, archėjinė polimerazė, tikslumas didesnis už Taq 610 kartų

Taq

Pfu

Hibridinės polimerazės (Phusion, iProof, PfuUltra II Fusion)

Didesnis procesyvumas už Pfu ~10kartų, tikslumas didesnis už Taq ~50kartų

DNR surišantis baltymas

DNR Polimerazė

DNR polimerazės

950 bp ilgio fragmento amplifikacijos efektyvumo priklausomybė nuo DNR polimerazės kiekio . A – Taq DNR polimerazės, B – Pfu DNR polimerazės skirtingi kiekiai 50µl reakcijos tūryje. M – DNR ilgio standartas „100bp ladder plus“ (Fermentas).

Pradmenys • PGR naudojamas didelis pradmenų perteklius, kad po denatūracijos būtų didesnė tikimybė hibridizuotis pradmenims su taikiniu, o ne DNR grandinėms tarpusavyje. • Optimali pradmenų koncentracija PGR yra 0,1-1,0µM • Užsakomi iš kompanijų, gaminančių pradmenis cheminės sintezės būdu. Pagrindinės kompanijos, iš kurių perkami pradmenys yra Metabion (  www.metabion.com), MWG (  www.mwgdna.com)

Deoksiribonukleozidtrifosfatai (dNTP) • DNR „statybinė medžiaga“ • 200µM kiekvieno nukleotido dATP, dTTP, dCTP ir dGTP koncentracija • Kuo didesnė nukleotidų koncentracija, tuo efektyviau vyksta PGR, tačiau mažėja polimerazių sintezės tikslumas • dNTP yra pardavinėjami kaip paruošti naudoti 2mM, 10mM, 25mM koncentracijų tirpalai. Šiuose tirpaluose nukleotidai sumaišyti vienodais moliariniais santykiais

Dvivalenčių metalų jonai • Daugeliu atveju PGR su Taq DNR pol tinka 1,5mM MgCl2, o su Pfu DNR polimeraze – 2,0mM MgSO4 koncentracijos

Buferinė sistema 10 Taq DNR polimerazės buferiai Su KCl

Su amonio sulfatu

10 Pfu DNR polimerazės buferis

100mM Tris-HCl 750mM Tris-HCl (pH 200mM Tris-HCl (pH 8,8; (pH 8.8; 25°C), 8,8; 25°C), 25°C), 500mM KCl, 200mM (NH4)2SO4, 100mM (NH4)2SO4, 0,8% (v/v) 0,1% (v/v) Tween 20. 100mM KCl, Nonideto P40. 1% (v/v) Tritono X-100, 1mg/ml BSA ir 20mM MgSO4. PGR pagerinančios medžiagos: Nejoniniai detergentai: Tritonas X-100, Nonidetas P-40 ir Tween 20 (0,05-0,1%), DNR polimerazę stabilizuojančios medžiagos: betainas (1-3M), glicerolis (5-20%), BSA (0,01-0,1 mg/ml), želatina (0.1mg/ml). Tirpumą didinantys reagentai: DMSO (1-10%), acetamidas (1– 10%). Hidrofiliniai polimerai: polietilenglikolis (5-15% PEG).

Taikinio DNR • PGR naudojamos DNR kiekis priklauso nuo to, kokio dydžio yra tiriamo objekto genomas. • Nepriklausomai nuo genomo dydžio, PGR yra svarbus pradinis taikinio molekulių skaičius , kuris paprastai būna 104-105. • 50µl reakcijoje naudojama: 0,1-1,0µg žmogaus genominės DNR (paprastai 0,1µg pakanka); 0,01-1ng plazmidžių ar fagų DNR; 1-10ng bakterijų (E. coli ) ar mielių genominės DNR.

PGR atlikimas

PGR optimizavimas

Mg2+ jonų koncentracija, pradmenų prilydymo temperatūra, polimerizacijos laikas (denatūracijos,

PGR problemos (1): Užteršimas DNR DNR iš ankstesnių PGR reakcijų  Dulkės, plaukai, epitelis ir kt. 

Problemos sprendimas: Reakcija ruošiama Laminariniuose boksuose, naudojami pipečių antgaliai su filtrais  PGR reakcijos ruošiamos atskiruose izoliuotuose kambariuose, o amplifikuojama ir analizuojama kituose kambariuose.  Reakcijos mišinio apšvitinimas UV, prieš dedant DNR. Nelabai gerai, nes: 



dNTP absorbuoja UV  Taq DNR pol inaktyvuojama 

Uracil DNR glikozilazės panaudojimas 

U pradmenyse  U amplikone

Uracil DNR glikozilazė (UNG, UDG)

Uracil DNR glikozilazė (UNG, UDG)

PGR problemos (2): Klaidos Taq DNR pol neturi 3’-5’ egzonukleazinio aktyvumo  Klaidų dažnis 1.7 × 10-4-5× 10-6 per nt, per ciklą. Labiausiai priklauso nuo: 



dNTP koncentracijos  DNR sekos  Mg jonų koncentracijos

Ar PGR klaidos yra svarbu? Taip jei amplifikuotas genas yra klonuojamas  Ne, jei amplifikuotas genas yra sekvenuojamas arba karpomas restrikcijos endonukleaze

1000bp fragmente po amplifikacijos su Taq DNR polimeraze gaunama 0.15-5 klaidingi nukleotidai

Problemos sprendimas: Naudojamos DNR pol, turinčios 3’-5’ egzonukleazinį aktyvumą (Pfu DNR pol) 

PGR produktų klonavimas

PGR metodo variacijos Kiekybinė PGR (Tikro laiko PGR – quantitative, real time PCR)  Ciklinė sekoskaita - Cycle sequencing (linear amplification)  Karšto starto PGR - Hot start PCR  Lizdinė PGR - Nested PCR  Ilga ir tiksli PGR - Long (and accurate) PCR  Vienpusė PGR - Single sided PCR  AT-PGR ( Atvirkštinė transkripcija)- RT-PCR  Nutūpimo PGR - Touch-down PCR  Multipleksinė PGR - Multiplex PCR  Inversinė PGR - Inverse PCR  Imuno PGR (IPGR)  klaidingoji PGR - epPGR 

qPCR – quantitative PCR – kiekybinė PGR kinetic PCR – kinetinė PGR Real-time PCR – tikro laiko PGR Matuojamas fluorescencijos intensyvumas po kiekvieno PGR ciklo (t.y. real time). Fluorescencijos intensyvumas proporcingas amplifikuotos DNR kiekiui. Nustatoma KADA, o ne KIEK susidaro PGR produkto.  Galima įvertinti absoliutų DNR kiekį  Galima įvertinti santykinį DNR kiekį (genų raišką) 

Kas yra fluorescencija? Kas yra FRET? “Real time PCR” frazės paieškos Pubmed publikacijų duomenų bazėje

Fluorescencija = fotoliuminescencija, kai šviečianti medžiaga sužadinama šviesos pagalba Fosforas švyti ne dėl fosforescencijos ar fluorescencijos

Kalcio fluoridas nefluorescuoja, fluorescuoja jame esančios priemaišos. Fluoras taip pat neturi nieko bendro su fluorescencija, lot. fluere – lengvai besilydantis – fluoridai palengvindavo metalų lydymą.

Fluorescencija = fotoliuminescencija, kai šviečianti medžiaga sužadinama šviesos pagalba

Fluorescencija = fotoliuminescencija, kai šviečianti medžiaga sužadinama šviesos pagalba

Fluorescencija yra reiškinys, kai molekulė sugeria tam tikro ilgio elektromagnetines bangas, pereina į nestabilią sužadintą būseną ir išspinduliuoja mažesnės energijos – ilgesnes elektromagnetines bangas. Molekulės, kurios sugeria šviesą, vadinamos chromoforais Molekulės, kurios sugeria ir išspinduliuoja šviesą, vadinamos fluorochromais, arba fluoroforais

FRET- Fluorescence Resonance Energy Transfer DNR detekcijai kiekybinėje PGR dažnai naudojamas FRET tarp 2 fluoroforų arba tarp fluoroforo ir nefluorescuojančio slopintojo (quencher) esančio 10-100A atstumu

Didžiausia FRET tikimybė esant tam tikram atstumui tarp donoro ir

Spektrai turi persidengti

Kiekybinė PGR Matuojamas fluorescencijos intensyvumas po kiekvieno PGR ciklo (t.y. real time). Fluorescencijos intensyvumas proporcingas amplifikuotos DNR kiekiui. KADA, o ne KIEK? 

CT=Cq=Cp TOP – takeoff point CT –threshold cycle – slenkstinis ciklas; Cycle of quantification; crossing point

Kiekybinė PGR 

Kuo daugiau yra DNR kopijų, tuo CT mažesnis

Rn- r atio normalized- santykinė fluorescencija, normalizuojama prieš bazinę liniją arba standartinį fluorofuorą (reference dye), dažniausiai ROX (rodaminas X). 106 – 101 DNR kopijų į reakciją a j i c n e c s e r o u l F

M 1500 4 850

1 5

2 6

3

400 200 50 /bp

1,2,3 4 5 6

Ct

Slenkstinė linija

NTC

Ciklų skaičius

Log10N

Kiekybinė PGR Galutinio produkto kiekis gali varijuoti, tačiau C T visada priklauso nuo DNR matricos kiekio.  Amplikonų ilgis 100-250bp, kad būtų juo didesnis efektyvumas 

DNR nustatymo būdai Su DNR susirišantys (interkaliuojantys) fluoroforai  TaqMan zondai (Probes)  Hibridizacijos zondai  Plaukų segtuko strukrūros zondai, Molecular beacons  MGB zondai  Amplifluor pradmenys  Scorpions (pradmenys)  ir kiti 

http://www.gene-quantification.info/

1. Su DNR susirišantys fluoroforai Fluoroforai jungiasi su dvigrande DNR ir kelis šimtus kartų padidėja jų fluorescencijos intensyvumas. Kuo daugiau DNR, tuo didesnė fluorescencija

1. Su DNR susirišantys fluoroforai Fluoroforas

Struktūrinė formulė

Literatūra

Etidžio bromidas (EtBr)

Higuchi 1993

Yo-Pro-1 (3imetil-2-[[1-[3-(trimetilamonio) propil]-1,4-dihidrochinolin-4iliden]metil] benzo-1,3-oksazolo dioksidas)

Ishiguro 1995 Tseng 1997

SYBR Green I

Morrison 1998

BOXTO

Eriksson 2003; Lind 2006.

SYTO9

n.d.

Monis 2005

EvaGreen

n.d.

Wang 2006  http://www.biotium.com/

1. Lydymosi kreivė

Problemos: Detektuojami specifiniai ir nespecifiniai PGR produktai  Kuo ilgesnė DNR, tuo stipresnis signalas  Reikalinga optimizacija, kad nesusidarytų pradmenų dimerai ir kt. 

1. Su DNR susirišantys fluoroforai: Kada jie naudojami? 1. Reakcijose, kai nereikia labai didelio specifiškumo, koks gali būti pasiekiamas naudojant zondus. Naudojama, kai reikia detektuoti tūkstančius molekulių. 2. Bendram tikro laiko PGR pradmenų ir sąlygų optimizavimui prieš pereinant prie zondų. 3. Kai tikro laiko PGR sistema yra pilnai optimizuota: nesusidaro nei pradmenų dimerai, nei nespecifiniai amplikonai.

Problemos: Detektuojami specifiniai ir nespecifiniai PGR produktai  Kuo ilgesnė DNR, tuo stipresnis signalas  Reikalinga optimizacija, kad nesusidarytų pradmenų dimerai ir kt.  Didesnės koncentracijos inhibuoja DNR polimerazę 

2. Hibridizacijos zondai (Hybprobes, Hybridization probes, kissing probes) Su DNR hibridizuojami du oligonukleotidai, prie vieno iš jų yra prijungtas fluoroforas donoras (D), prie kito fluoroforas akceptorius ( A). Kai šie oligonukleotidai atsiduria vienas šalia kito hibridizuoti su taikinio DNR, vyksta FRET ir stebima akceptorinio fluoroforo A fluorescencija

3. 5’ nukleazės zondai, TagMan zondai Taq DNR polimerazės 5’ egzonukleazė hidrolizuoja hibridizuotą su taikinio DNR hibridizuotą zondą. Reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo fluorescencijos slopiklio (S), nebevyksta FRET ir stebima reporterinio fluoroforo fluorescencija 3’ gale yra fosfatas, arba ddNMP kad nevyktų polimerizacija  ilgis 20-40nt  Tm mažiausiai 5 laipsniais didesnė už pradmenų T 

3. 5’ nukleazės zondai, TagMan zondai

“TagMan pavadinimas kilęs nuo 1979m. japonų sukurto kompiuterinio žaidimo PacMan.

4. Plaukų segtuko struktūros oligo zondai, molekuliniai švyturėliai (molecular beacons) Zondas hibridizuojasi su taikinio DNR. Hibridizacijos metu reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo fluorescencijos slopiklio (S), nebevyksta FRET ir stebima reporterinio fluoroforo fluorescencija.

5. MGB (minor groove binder) Eclipse zondai Su mažuoju DNR grioviu sąveikaujanti medžiaga (MGB), esanti zondo 5’ gale, jungiasi su taikinio DNR, kuri komplementari zondui. Susijungus su DNR, zondas stabilizuojamas, reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo slopiklio (S) ir nebevyksta FRET. Stebima reporterinio fluoroforo fluorescencija. (Afonina, 2002)  http://www.epochbio.com/

5. Fluorescuojantis amplikonas, detekcijai naudojamas pradmuo 1. Saulėtekio pradmenys; Sunrise primers, Amplifluor hairpin primers. Naudojamas pradmuo turintis plaukų segtuko struktūrą. Po to, kai pradmuo įjungiamas į amplikoną, sintetinant komplementarią DNR grandinę, plaukų segtuko struktūra yra išardoma ir reporterinis fluoroforas (R) nutolsta nuo slopiklio (S). Reporterinio fluoroforo fluorescencijos intensyvumas atspindi amplikono kiekį

5. Fluorescuojantis amplikonas 2. Skorpiono pradmenys

„Skorpiono“ pradmenys turi DNR sintezės blokatorių, todėl komplementari grandinė sintetinama tik iki blokatoriaus ir lieka išsikišęs už blokatoriaus esantis pradmens fragmentas, kuris yra komplementarus šalia esančiam amplikonui. Įvykus komplementarių fragmentų hibridizacijai, stebima reporterinio fluoroforo (R) fluorescencija

Zondai ir fluorescuojantys pradmenys naudojami: 1. Jautriose tikro laiko PGR reakcijose, kai nustatoma šimtai kopijų DNR. 2. Alelių diskriminacijos kiekybinėje PGR. 3. Multipleksinėse reakcijose, kai tame pačiame mėgintuvėlyje tiriama ir lyginama žinomo (housekeeping) ir tiriamo genų raiška. 4. Genų, kurių raiška silpna, raiškos tyrimams. 5. Mažų patogenų kiekių nustatymui. 6. Tiksliam absoliutaus DNR kopijų kiekio nustatymui, naudojantis standartine kreive. 7. Santykiniam kiekybiniam DNR kiekio įvertinimui be standartinės kreivės, sulyginus C T reikšmes.

Kiekybinės PGR efektyvumas

Kiekybinės PGR efektyvumas Tarkime (CTB - CTA) = 4. Vadinasi, B mėginyje buvo 2 4= 16 kartų mažiau taikinio DNR. Tarkime, kad PGR efektyvumas buvo 90% ir jei mėginių A ir B C T skyrėsi 4 ciklais, tada (1+0.9) 4=13. Taigi gauname, kad B mėginyje taikinio DNR yra 13, o ne 16 kartų mažiau Kiekybinės PGR efektyvumas apskaičiuojamas pagal tiesės polinkio koeficientą

Kiekybinės PGR įranga

Kiekybinės PGR įranga

Abi Prism 7000 optinės sistemos veikimas: Volframo lempos šviesa apšviečia PGR plokštelę ir sužadina ten esančius fluoroforus, kurie pradeda fluorescuoti. Fluorescencijos šviesa per veidrodžius ir optinius filtrus patenka į CCD (charged coupled device) kamerą, kuri užfiksuoja fluorescencijos intensyvumą. Duomenys apdorojami kompiuterine

Kiekybinė PGR

Kiekybinė PGR

Karšto starto PGR - Hot start PCR

• Kuo yra aukštesnė temperatūra, tuo geresnis „partneris“ yra surandamas. • Kambario temperatūroje pradmenų fragmentai, pvz.: jų 3‘ galinės dalys gali hibridizuotis su amplifikuojama DNR

Karšto starto PGR - Hot start PCR

Hot start PCR – karšto starto PGR Mechaninės priemonės

DNR polimerazė įdedama į PGR po DNR denatūracijos.  Reakcija pilstoma šaldymo blokuose ir įdedama į karštą termociklerį.  Naudojamas vaškas (ampliwax), kuris lydosi 53-55°C, kurio nors komponento atskyrimui. 

Modifikuojama DNR polimerazė

Naudojami MAK, inhibuojantys DNR pol aktyvumą. Aukštoje temperatūroje antikūnai denatūruojasi ir “paleidžia” DNR polimerazę.  Naudojama grįžtamai chemiškai modifikuota DNR polimerazė.  Polimerazę surišantys oligonukleotidai – aptamerai. J. Mol. Biol. 264:268 1996. 1996.  Naudojama mutantinė DNR polimerazė, kuri žemoje temperatūroje mažiau aktyvi. 

Nucleic Acids Res., 31, 6139-6147, 2003.

Modifikuojami arba specialiai parenkami pradmenys

Pradmenys turintys plaukų segtuko struktūrą. Nuc. Acids. Res. 28:94 2000. Naudojami pradmenų dimerai. Biotechnol. Lett. 26:277 2004. Naudojami 3’ gale blokuoti pradmenys ir tik aukštoje temperatūroje veiki antis tuos blokus pašalinantis fermentas – Enzystart sistema 

Modifikuojami Mg jonai Naudojami 167-171, 2002.

išsodinti Mg jonai, kurie aukštoje temperatūroje ištir psta. Mol. Cell. Probes, 16,

Hot start PCR – karšto starto PGR

Karšto starto PGR su TrueStart DNR polimeraze (chemiškai modifikuota) ir įprastos PGR su paprasta Taq DNR polimeraze palyginimas. Amplifikuotas 2kb žmogaus beta-globino geno

Atvirkštinės transkriptazės PGR – RT-PGR (reverse transcription PCR)

Touchdown PCR – nutūpimo PGR

• Keičiama

pradmenų lydymosi temperatūra nuo ~3 °C didesnės už Tm iki paskaičiuotos: • skirtinguose mėgintuvėliuose • skirtingų ciklų metu Kai pradmenys parenkami pagal amino r. seką  kai amplifikuojamos DNR vienos organizmo rūšies, naudojant pradmenis parinktus kitos rūšies DNR.  kai amplifikuojamos genų šeimos ir kt. 

Lizdinė PGR - Nested PCR

Seminested PCR; Heminested PCR – Pusiaulizdinė PGR, kai antroje amplifikacijoje paliekamas vienas pradmuo tas pats iš pirmosios amplifikacijos, ir pridedamas tik vienas naujas pradmuo.

Ilga ir tiksli PGR. Long (and accurate) PCR (LA-PCR) Ilgos DNR sunkiau denatūruojamos - pridedama denatūrantų, pvz. DMSO (dimetilsulfoksido). Gali vykti DNR depurinizacija – padidinamas pH  Prailginamas polimerizacijos laikas  Naudojami DNR polimerazių mišiniai Taq DNR pol + 3’-5’ egzonukleazinį aktyvumą turinti DNR polimerazė ( Pfu- Pyrococcus furiosus)  Vykdoma 20-40kB DNR amplifikacija 

Ilga ir tiksli PGR. Long (and accurate) PCR (LA-PCR)

Efektyviau vyksta trumpų amplikonų padauginimas

Inversinė PGR - Inverse PCR

Multiplex PCR – multipleksinė PGR 

Kai naudojamos 2 ir daugiau pradmenų porų

Multipleksinis PGR su Accuprime DNR polimeraze

Imuno PGR (IPGR) 

Baltymų detekcija PGR pagalba, pirmą kartą publikuota 1992m.

Science. 1992 Oct 2;258(5079):120-2

Naudojami Antikūnų – DNR konjugatai  Naudojama klinikinėje diagnostikoje, imunologijoje 

tumor necrosis factor

Skaitmeninė PGR (digital, dPCR) Reakcijos mišinys padalintas į daugybę mažų reakcijų – 1 DNR molekulė vienoje reakcijoje  Kiekvienos mažos reakcijos rezultatas “0” arba “1”  Kiekvienoje mažoje reakcijoje nustatoma ar susidarė produktas 

Skaitmeninė PGR (digital, dPCR) Reakciją galima dalinti į 96, 384 šulinėlius  Fluidigm technologija  QuantaLife technologija – amplifikacija emulsijose 

Skaitmeninė PGR (digital, dPCR)

Kitos PGR Greitoji PGR (angl. fast PCR ) – atliekama pakeitus PGR ciklų parametrus. Yra nustatomas nulinis denatūracijos laikas, o prilydymas ir polimerizacija atliekama trumpesnį laiką. Visiems etapams įvykti užtenka laiko, kol termocikleryje keičiama temperatūra, esant optimizuotoms PGR sąlygoms (“GeneJET Fast PCR” sistema:  

www.fermentas.com/catalog/pcr/g

). Lyginant su tradicine PGR, greitoji PGR užtrunka kelis kartus trumpiau.

Klaidingoji PGR (angl. epPCR – error prone PCR ) – naudojama atsitiktinei mutagenezei. Naudojamos PGR sąlygos (Mn2+ jonai vietoj Mg2+; nenatūralūs nukleotidai: dPTP, 8-oxo-dGTP, specialios DNR polimerazės), kuriomis DNR polimerazės daro daug sintezės klaidų. Klaidingoji PGR naudojama evoliucijos in vitro eksperimentuose. 

PGR su degeneruotais pradmenimis Degeneruoti pradmenys. Kas jie tokie? Pradmenys, kurie keliose vietose turi galimybę hibridizuotis su įvairiomis sekomis taikinio DNR sekoje. pvz: 5’-TCG AAT TCI CCY AAY TGR CCN T-3’ Y = pYrimidines = C / T (degeneracija = 2X) R = puRines = A / G (degeneracija = 2X) I = Inosine = C / G / A / T N = Nucleotide = C / G / A / T (degeneracija = 4X) Kam... Naudojami degeneruoti pradmenys? • Konservuotų organizmo genomo geno ar genų sekų amplifikacijai (“žvejojimui”) • Kai norima amplifikuoti baltymo geną pagal nusekvenuotas kelias amino rūgštis.

PGR pritaikymas

Kuris iš įtariamųjų nusikaltėlis?

1. Specifinių sekų padauginimui ar nustatymui. 2. Nežinomų sekų analizei: padauginimui ir sekoskaitai. 3. Dirbtinių DNR sekų surinkimui – genų sintezei. 4. Taškinei ir atsitiktinei mutagenezėms. 5. REazių taikinių, starto, stop kodonų įvedimui konstruojant DNR sekas. 6. Klonų analizei – kolonijų PGR. 7. Genų raiškos analizei – informacinės RNR amplifikacija AT-PGR būdu. 8. Nukleorūgščių kopijų skaičiaus nustatymui – kiekybinė PGR. 9. Specifinių baltymų nustatymui – imuno PGR

PGR pritaikymas Kuris vaiko (V) tėvas tikras T1 ar T2?

Quantifying viruses Pathogen detection Gene expression Drug therapy DNA damage Immune response Genotyping

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: Besisukančio rato amplifikacija Roling circle amplification

(templiphi animacija)

RCA pirmą kartą buvo aprašyta 1995m. (Fire, A, Xu, S-Q, Rolling replication of short DNA circles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4641-4645, 1995)

RCA atlikti nereikia specialios aparatūros temperatūrai kaitalioti, kaip tai yra būtina PGR atveju. RCA idėja paremta apskritimo pagrindine apvalumo savybe. RCA idėja yra išreikšta kai kurių menininkų darbuose. Salvadoro Dali ir Maurito Kornelio Eshero piešiniuose yra RCA metodo iliustracijų.

Escher’s “Ascending and Descending”, 1960

Maurits Cornelis Escher or Mauk (1898-1972) is one of the world's most famous graphic artists from the Netherlands.

The closed staircase going on endlessly up or down, depending on a viewpoint. Starting at some place on these stairs, one will interminably turn around similar to the RCA performing enzyme that reads a circle of DNA over and over again

Escher’s “Möbius Strip II”, 1963

Maurits Cornelis Escher or Mauk (1898-1972) is one of the world's most famous graphic artists from the Netherlands. The Möbius loop was discovered in 1858 by August Ferdinand Möbius, a German mathematician and astronomer. Dutch artist M. C. Escher, produced a series of drawings based on the Möbius strip, one of which portrays ants crawling over the folded and twisted trip of paper. Ants acts like DNA polymerase in rolling circle amplification moving always in one direction.

Dali’s “Exploding Raphaelesque Head”, 1951

Salvador Dali (190489) Spanish painter, sculptor, graphic artist, and designer

The picture portrays a hollow spherical object resembling a female head that blows up into the numberless similar fragments rotating around some central point. These fragments are

Besisukančio rato amplifikacijos būdai Naudojant vieną pradmenį, arba linijinė RCA. Monotoniškai sintetinama ratu ilga pasikartojanti viengrandės DNR seka. Palaipsniui kaupiasi RCA produktai. Naudojant du pradmenis, arba geometrinė, geometrinė , taip pat vadinama hiperšakota, ramifikacija, arba kaskadinė RCA (Demidov, V., Rolling –circle amplification in DNA diagnostics: the power of simplicity, Expert Rev., Mol., Diagn., 2 (6), 89-95, 2002).

Naudojant atsitiktinės sekos pradmenis, arba daugybinio nustūmimo amplifikacija - MDA (multiple displacement amplification), kuri yra naudojama efektyviai viso genomo amplifikacijai - WGA (whole genome amplification). (Dean, F.B., et al., Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5261-5266, 2002).

Besisukančio Rato Amplifikacija

Reakcija prasideda ant viengrandės žiedinės DNR, arba dvigrandės denatūruotos DNR. Atsitiktinės sekos pradmenys prilimpa ant viengrandės DNR.






phi 29 DNR polimerazė yra unikali, ji labai efektyviai ima nustūminėti DNR, kai pasiekia anksčiau susintetintą DNR grandinę.


• phi 29 DNR polimerazė yra unikali, ji labai efektyviai ima nustūminėti DNR, kai pasiekia anksčiau susintetintą

DNR grandinę. • Nustumtos DNR grandinės yra viengrandės ir prie jų gali jungtis pradmenys, kuriuos pratęsia Phi29 DNR



DNR grandinę. grandinę. • Nustumtos DNR grandinės yra viengrandės ir prie jų gali jungtis pradmenys, kuriuos pratęsia Phi29 DNR





pakartoti • phi 29 DNR polimerazė yra unikali, ji labai efektyviai ima nustūminėti DNR, kai pasiekia anksčiau susintetintą


Besisukančio Rato Amplifikacija • Įvairios DNR polimerazės, įskaitant ir termofilines gali vykdyti RCA:  Phi 29 DNR polimerazė  Sequenase™ (GE Healthcare [Amersham Biosciences]) – modifikuota bakteriofago T7 DNR polimerazė.  Klenow DNR polimerazė (DNR polimerazės I didysis fragmentas.  Vent™ exo- DNR polimerazė – mutantinė Thermococcus litoralis DNR polimerazė.  Bst DNR polimerazės didysis fragmentas – iš Bacillus stearothermophilus. • Efektyviausia RCA yra phi 29 DNR polimerazė

didžiausias procesyvumas didžiausias DNR grandinės nustūmimo aktyvumas iš visų žinomų DNR polimerazių.  labai tiksli, klaidų dažnis 3-5x10 -6, žymiai mažesnis nei Taq DNR polimerazės. (Esteban, J.A., et al, Fidelity of phi29 DNA polymerase, J.  

Biol. Chem., 268 (4), 2719-2726, 1993).

phi29 DNR Polimerazė phi29 DNR Polimerazė – tai B šeimos DNR polimerazė, turinti labai procesyvų DNR polimerazinį aktyvumą, grandinės nustūmimo aktyvumą ir 3’ egzonukleazinį aktyvumą (1-3).

Bacillus subtilis phage φ 29

References: 1. Blanco, L., Salas, M., Characterization and purification of a phage phi29 - encoded DNA polymerase required for the initiation of replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325-5329, 1984. 2. Blanco, L., et al., Highly efficient DNA synthesis by the phage phi29 DNA Polymerase, Symmetrical mode of DNA replication, J. Biol.Chem., 264, 8935-8940, 1989. 3. Garmendia, C., et al., The bacteriophage phi29 DNA Polymerase, a Proofreading enzyme, J. Biol.Chem., 267, 2594-2599, 1992.

Besisukančio Rato Amplifikacija, RCA apibendrinimas •Tai naujas žiedinės DNR ir ilgos linijinės DNR , pvz genominės DNR, BAC, in vitro

amplifikacijos metodas. Amplifikuojamos DNR ilgis yra neribotas. • Izoterminis metodas, nereikia termociklerio •Vienodai efektyviai amplifikuoja įvairias sekas

ir prisintetinama mikrogramai DNR

Amplifikuota lašišos DNR

RCA paprastai nereikalauja jokios optimizacijos, nesudėtingas atlikimo protokolas.

Besisukančio Rato Amplifikacija, taikymas

Nustatymo riba 10 fM (t.y. 6 amol 600 µl mėginyje)

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: izoterminė sekos savireplikacija, NASBA

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: amplifikacija grandinės pakeitimu, SDA

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: ligazės grandininė reakcija

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: Q beta replikacija

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: Naudojant nikazę

Kiti in vitro amplifikacijos būdai: LAMP 





LAMP (Loop- mediated isothermal amplification)- tai metodas leidžiantis, panaudojant dvi arba tris specialiai parinktų pradmenų poras, specifiškai amplifikuoti norimą DNR seką izoterminėmis sąlygomis. Metodas pagrįstas auto- cikline grandinės nustūmimo DNR sinteze (auto- cycling strand displacement DNA synthesis), kur naudojamos termofilinės (Bst, Bsm) DNR polimerazės, pasižyminčios grandinės nustūmimo aktyvumu ir specialūs pradmenys: du vidiniai (FIP ir BIP) ir du išoriniai (F3 ir B3)1 LAMP amplifikacija naudojama klinikinėje diagnostikoje virusų, bei bakterijų nustatymui

LAMP

100x skiesta DNR

1000x skiesta DNR 10000x skiesta DNR

Vizuali detekcija

–

+

Vaizdas apšvietus UV - Neigiama kontrolė, + Įvykusi LAMP amplifikacija

– + Vaizdas dienos šviesoje

Literatūra (1) Afonina, I.A., et al, Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence, Biotechniques , 32, 940-949, 2002. Ausubel, F.M., et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, NY, 15.1-15.7, 2005. Bagasra, O., Hansen, J., In situ PCR techniques, John Wiley & Sons, Inc., 1-142p, 1997. Barnes, W.M. an dRowlyk, K.R., Magnesium precipitate hot start method for PCR, Mol. Cell. Probes, 16, 167-171, 2002. Bartlett, J.M.S., and Stirling, D., Methods in Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second Edition, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003. Blanco, L. and Salas, M., Characterization and purification of a phage phi29 - encoded DNA polymerase required for the initiation of replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325-5329, 1984. Blanco, L., et al., Highly efficient DNA synthesis by the phage phi29 DNA Polymerase, Symmetrical mode of DNA replication, J. Biol. Chem., 264, 8935-8940, 1989. Bowien, B., Durre, P., Nucleic acids isolation methods, American Scientific Publishers, 1-184p, 2003. Brock, T. D., The road to Yellowstone - and beyond, Annu. Rev. Microbiol., 49: 1-28, 1995. Brock, T.D., The value of basic research: discovery of Thermus aquaticus and other extreme thermophiles, Genetics, 146, 1207-1210, 1997. Bush, C.E., et al, Detection of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma samples in high risk pediatric patients by using the self-sustained sequence replication reaction, J. Clin. Microbiol., 30, 281-286, 1992. Cantor, C.R., Smith, C.L., Genomics: The Science and Technology Behind the Human Genome Project, John Wiley & Sons, Inc, 98130, 1999. Dang, C., et al, Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR, J. Mol. Biol., 264, 2, 268-278, 1996. Dean, F.B., et al., Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5261-5266, 2002. deMello, A.J., DNA amplification moves on, Nature, 422, 28-29, 2003. Demidov, V., Rolling –circle amplification in DNA diagnostics: the power of simplicity, Expert Rev., Mol., Diagn., 2 (6), 89-95, 2002. Eriksson, M., et al, Groove-binding unsymmetrical cyanine dyes for staining of DNA: dissociation rates in free solution and electrophoresis gels, Nucleic Acids Res., 31, 21, 6235-6242, 2003. Esteban, J.A., et al, Fidelity of phi29 DNA polymerase, J. Biol. Chem., 268 (4), 2719-2726, 1993. Fire, A, Xu, S-Q, Rolling replication of short DNA circles, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4641-4645, 1995. Garmendia, C., et al., The bacteriophage phi29 DNA polymerase, a proofreading enzyme, J. Biol. Chem., 267, 2594-2599, 1992. Gosden, J.R., PRINS and in situ PCR protocols, Methods in molecular biology, 71, Humana Press Inc., 1-180p., 1996. Guatelli, J.C., et al, Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modelled after retroviral replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1874-1878, 1990.

Literatūra (2) Guyer, R.L. and Koshland Jr, D.E., The molecule of the year, Science, 246, 1543-1546, 1989. Higuchi, R., et al, Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions, Bio/Technology , 11, 1026-1030, 1993. Ishiguro, T., et al, Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercaler, Anal. Biochem., 229, 207-213, 1995. K. Mullis Biographical essay. Kabolev, O.K., et al, PCR hot start primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure), Nucleic Acids Res., 28, 21, e94, 2000. Kermekchiev, M.B., et al, Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR, Nucleic Acids Res., 31, 61396147, 2003. Kleppe, K., Khorana, H.G., et al, Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases, J. Mol. Biol., 56 (2), 341-61, 1971. Kong, D., et al, PCR hot-start using duplex primers, Biotechnol. Lett., 26, 4, 277-280, 2004. Kubista, M., The real-time polymerase chain reaction, Mol. Aspects Med., 27, 95-125, 2006. Lind, K., et al, Combining sequence-specific probes and DNA binding dyes in real-time PCR for specific nucleic acid quantification and melting curve analysis, Biotechniques, 40, 315-319, 2006.

Literatūra (3) Mackay, I.M., et al, Real-time PCR in virology. Survey and summary, Nucleic Acids Res. , 30, 6, 1292-1305, 2002. Marras, S.A.E., et al, Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes, Clin. Chim. Acta , 363, 4860, 2006. Monis, P.T., et al, Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for real-time polymerase chain reaction and investigation of the effect of dye concentration on amplification and DNA melting curve analysis, Anal. Biochem., 340, 24-34, 2005. Moore, P., PCR: replicating success, Nature, 435, 235-238, 2005. Morrison, T.M., et al, Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification, Biotechniques , 24, 954962, 1998. Mullis, K.B., The unusual origin of the polymerase chain reaction, Sci. Am., 262, 56, 36-43, 1990. Niemeyer, C.M., et al, Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification, Trends Biotechnol., 23, 4, 208-216, 2005. Nolan, T., et al, Quantification of mRNA using real-time RT-PCR, Nature Protocols, 1, 3, 1559-1582, 2006. Ochman H., et al, Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction, Genetics, 120, 621-623, 1988. Olszewski, M., et al, Application of SSB like protein from Thermus aquaticus in multiplex PCR of human Y-STR markers identification, Mol. Cell. Probes, 19, 203-205, 2005. Ranasinghe, R.T. and Brown, T., Fluorescence based strategies for genetic analysis, Chem. Commun., 5487-5502, 2005. Saiki, R.K., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anaemia, Science, 230 (4732), 1350-4, 1985. Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular cloning: a laboratory manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, v2, Chapter 8, 2001. Schneegab, I. and Kohler, J.M., Flow-through polymerase chain reactions in chip thermocyc lers, Reviews in molecular biotechnology, 82, 101-121, 2001. Shigemori, Y., et al, Multiplex PCR: use of heat-stable Thermus thermophilus RecA protein to minimize non-specific PCR products, Nucleic Acids Res., 33, 14, e126, 2005. Stahlberg, A., et al,. Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification. Clin. Chem., 50, 3, 509–515, 2004. Tseng, S.Y., et al, A homogeneous fluorescence polymerase chain reaction assay to identify Salmonella, Anal. Biochem. , 245, 207-212, 1997. Valasek, M.A. and Repa, J.J., The power of real-time PCR, Adv. Physiol. Educ. , 29, 151-159, 2005. Vincent, M, et al, Helices-dependent isothermal DNA amplification, EMBO reports, 5, 795-800, 2004. Walker, G.T., et al, Isothermal in vitro amplification of DNA by restriction enzyme/DNA polymerase system, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392396, 1992. Walker, N.J., A technique whose time has come, Science, 296, 557-559, 2002. Wallace, R.B., et al, Hybridization of synthetic oligoribonucleotides to phi X174 DNA: the effect of single base mismatch, Nucleic Acids Res. , 6, 3543-3557, 1979. Wang, W., et al, DNA quantification using EvaGreen and real-time PCR instrument, Anal. Biochem. , 356, 303-305, 2006. Wilhelm, J. and Pingoud, A., Real-time polymerase chain reaction, ChemBioChem, 4, 1120-1128 2003. Wu, D.Y. and Wallace, R.B., The ligation amplification reaction (LAR) – amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation, Genomics, 4, 560-569, 1989. Wu, D.Y., et al, The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity an efficiency of amplification by polymerase chain reaction, DNA Cell Biol. 10, 233-238, 1991. Zaccolo et al, An approach to random mutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues, J. Mol. Biol. 255,

Iš Nature methods, v2, No4, 2005, 305-312

PAPILDOMA INFORMACIJA

The PCR Song by Scientists for Better PCR There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. (Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polymerases too. Denaturing, annealing, and extending, Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do. [Chorus] PCR when you need to detect mutation (detect mutation) PCR when you need to recombine (recombine) PCR when you need to find out who the daddy is (who’s your daddy?) PCR when you need to solve a crime (solve a crime)



18_paskaita_PGR

Recommend Documents