Extracción DNA Plasmídico

Práctica 2: extracción de ADN plasmídico

Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosomal los cuales están present presentes es en alguna algunass célula célulass bacter bacterian ianas, as, levadur levaduras as y hongos. hongos. Los mismos mismos poseen ADN de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han encontrado encontrado plásmidos lineales. La replicación replicación de los plásmidos es independient independiente e de la replicación del cromosoma del huésped ya que los plásmidos poseen su propio origen de replicación. l n!mero de copias de un plásmido en la célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regul regulaci ación. ón. n a"os a"os recie recient ntes es se han han iden identiti#i#ica cado do en una gran gran vari varied edad ad de bacterias un gran n!mero de plásmidos inusuales o raros. $or e%emplo, se han encon encontr trad ado o  plásmidos lineales de doble doble caden cadena a en Borre Borreli lia a y Streptomyces& estos plásmidos tienen estructuras moleculares muy parecidas a las de virus anim animal ales es.. n bact bacter eria iass tan tan dive divers rsas as como como E. coli y myxo myxoba bact cter eria iass se ha encontrado ADN de hebra sencilla multicopia 'msDNA( con A)N unido al extremo *+& dado que las técnicas que se han utiliado para detectar este tipo de plásmidos no son son muy muy comu comune ness 'por 'por e%em e%empl plo o elec electr tro# o#or ores esis is de camp campo o puls pulsan ante te(( su #recuencia y distribución a!n no se conoce. Los plásmidos generalmente no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una venta%a competitiva a las células que los poseen, dado a que los plásmidos poseen genes que le con#ieren caracter-sticas selectivas a su huésped tales como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, #actores de virulencia y producción de toxinas entre otros. Aquellos plásmidos de los que a!n no se ha encontrado un  beneficio/ #enot-pico son denominados crípticos. Los plásmidos poseen un interés singular en 0ngenier-a 1enética por ser  uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. 2n vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un #ragmento de ADN que se pretende clonar& en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un ADN vector vector con el ADN de inte interés rés 'deno 'denomi mina nado do enton entonces ces 3ins 3insert erto3( o3( se denom denomin ina a molé molécu cula la de vect vector  or  recombinante. xisten unos requerimientos básicos que un plásmido debe poseer  para que sea un buen vector al aplicar su uso en la biolog-a molecular. Debe poseer un origen de replicación, un gen para un marcador de selección 'ya sea resistencia a alg!n antibiótico( y un lugar de clona%e m!ltiple '456(. l 456 es una región donde pueden digerir varias enimas de restricción pero solamente una 2n requisito obvio para la clonación o experimentación en plásmidos es la puri#ic puri#icaci ación ón del ADN ADN plasmplasm-dic dico o ' ADNp  ADNp(. 2no de los parámet parámetros ros import important antes es durante la puri#icación es la lisis de las bacterias. 2na lisis incompleta o la disolución total de la célula, trae como resultado muy ba%os rendimientos en la recuperación de ADNp. La situación ideal ocurre cuando cada célula está lo

su#icientemente rota para que salga el ADNp pero no permita la contaminación con  ADN genómico ' ADNg (. l método más com!n y popular para preparar ADNp es el que desarrollaron 7irnboim y Doly en 89:9. ste método se basa en el hecho de que a p; 8<.= > 8<.* el ADN lineal se desnaturalia y no as- el ADN circular, los cuales son los plásmidos que se puri#ican. Las células que contienen plásmidos son tratadas con lisoima para romper la pared celular& posteriormente son lisadas con hidróxido de sodio y 6D6. l ADNg permanece como moléculas de alto peso molecular pero desnaturaliado. Después de la desnaturaliación el ADNg se renaturalia y se agrega en una red insoluble al agregar acetato de sodio ácido. Al mismo tiempo, la alta concentración de acetato de sodio causa la precipitación de los comple%os prote-na>6D6 y A)N de alto peso molecular. Debido a que el p; del paso de desnaturaliación alcalina ha sido controlado cuidadosamente, el ADNp permanecen en estado nativo y en solución mientras que las moléculas contaminantes co>precipitan. l precipitado puede eliminarse mediante centri#ugación y el plásmido puede concentrarse por precipitación con etanol o isopropanol. Objetivo.

xtraer el ADN plasm-dico de un cultivo de E. coli  D;*?.

Protocolo para la purificación de ADNp Obtención de células.

8. 5recer * mL de cultivo de E. coli  en medio L7 con 8== ug@mL de ampicilina la noche anterior 'la cepa de E. coli  se proporcionará en ca%a para su cultivo( <. 5entri#ugar  mL de cultivo a 8==== rpm durante  min. isis.

. Decantar el sobrenadante y resuspender el botón celular en la gota que queda. B. A"adir 8== uL de solución 0 'glucosa *=m4@DCA 8=m4@Cris <*m4 p; .=( y de%ar * min a temperatura ambiente. *. A"adir <== uL de solución 00 e invertir el tubo * veces. 0nmediatamente después poner en hielo * min. NE FE)CGA). $)5A250HNI el tiempo no debe ser  mayor ya que se degradará el ADNp. J. A"adir 8*= uL de solución 000 en#riada en hielo 'acetato de sodio 4 p; *.<( y meclar por inversión varias veces hasta que se #orme un precipitado blanco. :. 0ncubar en hielo B min. Puri!icación.

. 5entri#ugar  min a 8==== rpm y colectar los *=KL superiores del sobrenadante. ". A#adir $ u de %m&'m (NAsa A e incubar %$ min a )*+, -si a/0.

8=. ;acer 8 extracción con 8 vol de #enol@cloro#ormo@alcohol isoam-lico '<*I
1oluciones:

>6olución 0 M 7u##er de resuspensiónI <* m4 Cris>;5l 'p; (, *= m4 glucosa, 8= m4 DCA. Almacenar a B5 >6olución 00 M DesnaturaliaciónI =.< N NaE;, 8.= 6D6. Almacenar a temperatura ambiente. >6olución 000 M )enaturaliaciónI acetato de sodio  4 p; *.<.

,uestionario.

8. O$ara qué se adiciona ampicilina en el medio de cultivo de las bacteriasP <. OQué #inalidad tiene la neutraliación en el método de lisis alcalina/P . O$or qué la alcaliniación en presencia de 6D6 a#ecta menos a los plásmidos que al DNA cromosómicoP B. O5uáles son las  di#erentes con#ormaciones que pueden adquirir los plásmidosP *. OQué di#erencias existen entre un protocolo de extracción de DNA plasm-dico bacteriano y uno genómico bacterianoP J. OQué #unción cumple la )NAsa A en el protocoloP :. Ruera del método de extracción por desnaturación alcalina, Oqué otros métodos existen para la extracción de ADN plasm-dicoP